WO2007032359A1 - アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出方法 - Google Patents

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WO2007032359A1
WO2007032359A1 PCT/JP2006/318084 JP2006318084W WO2007032359A1 WO 2007032359 A1 WO2007032359 A1 WO 2007032359A1 JP 2006318084 W JP2006318084 W JP 2006318084W WO 2007032359 A1 WO2007032359 A1 WO 2007032359A1
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WO
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target molecule
aptamer
abutama
probe complex
thrombin
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PCT/JP2006/318084
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazunori Ikebukuro
Koji Sode
Original Assignee
National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the present invention relates to a target molecule detection technique using a novel abutama-probe complex, and more specifically, based on the principle of an aptamer-probe complex, it can be applied to almost all target molecules.
  • High versatility that can be designed and applied to a binding Abutamer, new Abutaman probe complex, target molecule detection method and detection reagent using the aptamer probe complex, detection reagent kit It is about.
  • the present invention relates to, for example, an oligonucleotide in which an abutama that inhibits enzyme activity is cleaved into at least two and divided, and one of them is added with the base sequence of abutama that binds to a target molecule, and the other Using an aptamer-probe complex consisting of two types of oligonucleotide molecules, which are oligonucleotides to which a partial base sequence of an abutama that binds to the target molecule is added, the target molecule is highly sensitive and A new aptamer-probe complex that can be detected with high accuracy, and a new technology related to a method for detecting a target molecule using the aptamer-probe complex are provided.
  • the aptamer was first proposed by Gold et al. In 1990 as a nucleic acid ligand that binds to a specific molecule.
  • the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method and A method for obtaining an aptamer using a so-called technique has been reported (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 examples of aptamer selection and application are reported in detail in other prior literature.
  • the aptamer-beacon method is the fluorescence resonance energy This is a technique for detecting a target molecule by detecting structural changes caused by binding of a target molecule to an abutama that binds to the target molecule using a single transfer method (FRET).
  • FRET single transfer method
  • the aptamer 'probe complex method uses a complex that combines an abutama that binds to a specific protein and changes its properties, and an abutama that binds to a target molecule. In this way, target molecules are detected using changes in protein properties as indicators.
  • the former Abuta-Beacon method uses FRET as a method for detecting a target molecule, and therefore requires an expensive large-scale device such as a fluorometer, Since fluorescence intensity is measured, there are problems such as difficulty in quantifying target molecules.
  • the latter Abtamer-probe complex method uses a change in protein properties as an index, for example, if an Abtamer that inhibits enzyme activity is used, enzyme activity can be measured.
  • the target molecule can be detected with high sensitivity by a simple operation means. Enzyme activity is measured using spectroscopic and electrochemical methods, and the target molecule may be detected, so this method does not require expensive and large equipment for detection. Since the enzyme activity is used as an index, there is an advantage that a highly sensitive detection system may be constructed.
  • Abutaman 'probe complex that has been developed and reported so far, the structure of the Abutaman is stabilized by binding to the partial position of the abutama that binds to the target molecule force and the target molecule.
  • a typical example is a method using a detection system characterized in that the structure of Abutamasa that inhibits activity is stabilized and the ability to inhibit enzyme activity is increased.
  • the prior literature includes, for example, an aptamer that integrally combines an Abutamer that binds to a specific protein and a probe that binds to a target molecule.
  • a probe complex and a method for detecting a target molecule using the aptamer-probe complex has been proposed (Patent Document 1).
  • the prior literature includes Abutama I and Cocaine Abutama I.
  • a method has been proposed in which the target molecule is detected by separating it into two of Nossin Abuta (Non-Patent Document 5).
  • another prior document proposes a method for detecting a target molecule by separating a Tat abutama into two (non-patent document 6).
  • Patent Literature l WO2005 / 049826 Al
  • Non-Special Terms 2 Hermann, et al., Adaptive recognition by nucleic acid aptamers, Scien ce, 287, 820-825 (2000)
  • Non-Patent Document 3 Osborne SE, Ellington AD., Nucleic Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry, Chem. Rev. Apr 1 .; 97 (2), 349-370 (1997)
  • Non-Patent Document 4 Hamaguchi N. et al., Anal. Biochem., 294, 126- 131 (2001)
  • Non-Patent Document 5 Stojanovic et al, J. Am. Chem. So, 122, 11547-11548 (2000)
  • Non-Patent Document 6 Yamamoto et al., Genes Cells, 5, 389-396 (2005)
  • the present inventors used a new abutama-probe complex to which abutama binding to almost all target molecules can be applied.
  • abutama-probe complex to which abutama binding to almost all target molecules can be applied.
  • At least 2 oligonucleotides that have been divided and added with an oligonucleotide base sequence that binds to the target molecule on one side and an oligonucleotide that has a complementary base sequence of a part of the aptamer that binds to the target molecule on the other side. It was found that the intended purpose could be achieved by constructing an Abutaman 'probe complex consisting of a mixture with different types of oligonucleotide molecules, and further research was conducted to complete the present invention.
  • the present invention is based on the principle of an abutama-probe complex.
  • an abutama-in base that binds to a target molecule is cut into at least two abutama-inhibits that inhibit enzyme activity,
  • the purpose is to do.
  • Another object of the present invention is to provide a target molecule detection method for detecting a target molecule by measuring the enzyme activity using the aptamer-probe complex, and a detection reagent / detection reagent kit thereof.
  • the present invention provides a new technique for detecting a target molecule using a novel and versatile probe / antibody complex that can be applied to an antibody that binds to almost all target molecules using these techniques. The purpose is to provide new products.
  • the present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
  • a separable Abuta probe complex for detecting the presence of a target molecule which can bind to an indicator protein and change the properties of the protein by cutting it into at least two At least two types of oligonucleotides, one of which is divided into two oligonucleotides with the base sequence of Abutaman binding to the target molecule and the other of which is added with the partial base sequence of Abutamer binding to the target molecule
  • An abutama-probe complex comprising a mixture of oligonucleotide molecules.
  • the length of the complementary base sequence is such that the stability of the aptamer formed by the complementary base sequence is close to that of the double-stranded structure and is greater than the stability of the double-stranded structure described above.
  • Abutama which binds to the enzyme and inhibits its enzyme activity, is cut into two parts and divided, and the base of Abutama that binds to the target molecule is added to one end of the divided part, and the other end is added.
  • a detection reagent for a target molecule comprising as an active ingredient the abutama-probe complex described in (1) to (7) above.
  • a target molecule detection reagent kit comprising a combination of the detection reagent according to (8) above, an indicator protein, and a reagent for measuring the properties of the indicator protein.
  • (10) A method for detecting the presence of a target molecule in a test sample, wherein the detection reagent comprising the aptamer 'probe complex according to (8) is contacted with a test sample,
  • Indication A method for detecting a target molecule, comprising measuring a change in a property of a protein and detecting the presence of the target molecule in a sample as an index.
  • the abutama 1 'probe complex of the present invention is an abutama that binds to a target molecule by cleaving at least two parts of an abutama that can bind to an indicator protein and change the properties of the protein. It consists of at least two types of oligonucleotide molecules: an oligonucleotide to which one base sequence is added and an oligonucleotide to which the complementary base sequence of a part of the abutama that binds to the target molecule is added. To do.
  • an abutama that inhibits enzyme activity is selected, and this is cut into at least two and divided.
  • the number of divisions of the abutama Appropriately, it is exemplified that the Abutama is divided into two parts.
  • the number of divisions of an abutama greatly depends on the type of abutama, especially its three-dimensional structure, it basically depends on the type of aptamer used. Therefore, in the present invention, the number of divisions of the aptamer is not particularly limited, and can be appropriately divided into any number of three or more according to the type of the abutama used.
  • a force that attaches a probe to a portion of an aptamer that has been cut and divided into two to produce an aptamer-probe complex In this case, of the aptamers that are divided into two
  • the 3'-Abutama 'probe complex is attached to the part of the abutama that binds to the target molecule
  • the 5'-aptamer probe is attached to the other part of the abutama to which the complementary base sequence of the above-mentioned Abutama is added.
  • Each is defined as a complex.
  • “probe” is defined as meaning a substance that binds to a target molecule. Therefore, in the present invention, for example, when the target molecule is DNA, the probe means its complementary DNA, and when the target molecule is a protein, the probe means an abutama that binds to the target molecule.
  • a force that adds a complementary base sequence of a part of the abutama part that binds to the target molecule to one of the abutama parts that have been cut and divided into two complementary bases of the probe to be added The length of the sequence and the region of the complementary base sequence can be arbitrarily designed. In that case, in particular, the length of the probe to be added depends on the stability of the abutama bound to the target molecule and the stability of the double-stranded DNA structure formed by the target molecule-bound abutama and its complementary DNA. It can be arbitrarily determined.
  • the stability of the abutama bound to the target molecule it is important to look at the difference between the stability of the abutama bound to the target molecule and the stability of the double-stranded structure formed by the target molecule-bound abutama and its complementary DNA. It is possible to detect target molecules with high sensitivity and high accuracy by making these stability as close as possible. Since the stability of the double-stranded structure simply depends on the length of the complementary DNA strand, the length of the probe to be added depends on the stability of the oligomer bound to the target molecule and the two strands.
  • the length of the complementary base sequence of the probe to be added is, in particular, the stability after binding of the abutama that binds to the target molecule, and the target molecule-bound abutama and its complementary base sequence. Considering the stability of the double-stranded structure to be formed, it can be arbitrarily designed within the preferred range. This makes it possible to detect target molecules with high sensitivity and high accuracy by observing the competition between these two structures.
  • a 5'thrombin 'adenosine abutama with a complementary base sequence length of 11, 8, and 4mer added, and a complementary base sequence length An example of the preparation of a 5 'thrombin' PDGF aptamer with a 15-mer base sequence was shown, which specifically describes an example of the preparation of an abutama with a complementary base sequence.
  • an arbitrary kind and length of a base sequence and a complementary base sequence can be added to an arbitrary abutama to produce an abutama / probe complex.
  • the aptamer is basically composed of a stem (double-stranded part) and a loop (single-stranded part).
  • the loop portion of the aptamer is preferred, and the portion of the region excluding the binding portion of the aptamer and the target molecule is preferred.
  • the thrombin aptamer used in the examples described later there are two tt loops and one TGT loop as the loop part, but these do not participate in the binding of the target molecule to thrombin. It is preferable to select the t, t_t norpe part as the cutting position.
  • the cutting position of the abutama can be appropriately selected according to the type of the abutama used.
  • Examples of a method for cleaving Abuta mo at a predetermined cleavage position include a method using a restriction enzyme and a method using a chemical method.
  • a restriction enzyme a known restriction enzyme can be appropriately selected and used depending on the base sequence of the cleavage site of Abama.
  • the treatment steps and treatment conditions with restriction enzymes are not particularly limited, and any treatment steps and treatment conditions can be adopted depending on the types of substrates and restriction enzymes.
  • the stability after binding of the abutama that binds to the target molecule is important, and the method of the present invention provides the stability of the abutama bound to the target molecule and the stability of the target molecule.
  • the stability of the double-stranded DNA structure formed by a child-bound Abutaman and its complementary base sequence It can be said that this is a technique based on detecting a target molecule by the difference. Therefore, in the present invention, it is important to design the base sequence and complementary base sequence of the aptamer to be added so that the stability of these two structures can be controlled.
  • the method of the present invention can detect the presence of a target molecule in a sample with high sensitivity and high accuracy by using the above-mentioned Abutamer-probe complex.
  • a test sample is brought into contact with the abutama-probe complex of the present invention, a change in the characteristics of the indicator protein is measured, and the presence of a target molecule in the sample is detected using this as an index.
  • the change in enzyme activity can be measured by a spectroscopic method or an electrochemical method.
  • examples of the target molecule include nucleic acids, proteins, and small molecules containing an organic compound having a molecular weight of 1000 or less, but are not limited thereto. Is done.
  • an oligonucleotide in which aptamer is cleaved into at least two parts and divided, and the base sequence of aptamer binding to the target molecule is attached to one of them.
  • An oligonucleotide with a complementary base sequence of a part of Abutaman that binds to the target molecule is prepared on the other side, and an Abutaman 'probe complex is constructed using these two types of oligonucleotide molecules. Is done.
  • examples of these oligonucleotide molecules include nucleic acid homologs that are nucleic acid analogs such as DNA, RNA, and PNA.
  • nucleotide molecules can add, delete, and / or substitute bases within the range of their activity, and add any modification to sugar and Z or internucleotide linkage. It is also possible. These operations can be performed using ordinary techniques and are not particularly limited.
  • the abutama 1 'probe complex of the present invention for example, when the target molecule-bound abutama portion is linked to the 3' side of the abutama portion and the target molecule-bound abutama portion and the target molecule are hybridized, the abutama It can be designed so that the binding between the portion and the indicator protein is inhibited.
  • the target molecule-bound Abuta moiety inhibits the binding between the Abuta moiety and the indicator protein.
  • the inhibitory action by the target molecule-bound abutama moiety is reduced, and the binding between the abutama moiety and the indicator protein can be designed to be strong.
  • the indicator protein for example, an enzyme, a fluorescent protein, a receptor, a ligand that binds to a specific receptor, and the like can be used.
  • the indicator protein is exemplified by an enzyme such as thrombin.
  • an enzyme such as thrombin.
  • an abutama that inhibits the activity of any enzyme is obtained, and based on its sequence,
  • the abutama-probe complex of the present invention can be designed.
  • the binding between the target molecule-binding abutama and the enzyme is enhanced by binding of the target molecule to the target molecule. Inhibition of enzyme activity by a portion increases, resulting in a decrease in enzyme activity.
  • binding of the target molecule-bound abutama moiety to the target molecule reduces the binding between the abutama moiety and the enzyme, thereby reducing the inhibition of enzyme activity by the abutama moiety, resulting in an increase in enzyme activity.
  • the presence of the target molecule can be easily detected by measuring the activity of the enzyme that is the indicator protein.
  • the presence of a target molecule in a test sample can be detected using the above-described Abutaman 'probe complex.
  • a test sample is brought into contact with the aptamer-probe complex of the present invention, a change in the characteristics of the indicator protein is measured, and this can be used as an index to detect the presence of a target molecule in the sample. it can.
  • an enzyme is used as the indicator protein, a change in the characteristic of the indicator protein can be easily measured as a change in the enzyme activity.
  • Changes in enzyme activity can be measured by spectroscopic techniques or electrochemical techniques.
  • the activity of thrombin can be determined by measuring the absorbance (410 nm) of liberated p-nitrotropilin using N-benzoyl-Phe-Val_Arg_p-nitrotrolide as the substrate. Or add fibrinogen and thrombin to the plasma so that the final concentration is constant, and fibrinogen by thrombin.
  • the force S can be measured.
  • Blood coagulation is measured, for example, by measuring a change in refractive index by a spectroscopic method, by adding a metal sphere to plasma and observing stoppage of movement associated with blood coagulation, a crystal oscillator, a surface bra Summon resonance, interference amplification reflection method
  • IER Interference Enhanced Reflection
  • preferable examples of the enzyme include luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, alkaline phosphatase, horseradish rust peroxidase, and the like.
  • Examples of the enzyme reaction detection method include a colorimetric method and an electrochemical measurement method.
  • the indicator protein When a receptor is used as the indicator protein, it can be detected by a spectroscopic method. In addition, when a fluorescent protein is used as the indicator protein, it can be detected by its fluorescence characteristics.
  • the binding between the target molecule and the target molecule-bound abutama can be observed by mixing the target molecule and the abutama-probe complex of the present invention.
  • the presence of the target molecule can be detected with a simple operation means with high sensitivity and high accuracy.
  • a detection reagent for detecting the presence of the target molecule is constructed by using the above-described aptamer-probe complex. be able to.
  • a detection reagent kit comprising an indicator protein and a reagent for measuring the properties of the indicator protein can be constructed.
  • the product form and usage of these detection reagents and detection reagent kits are not particularly limited and can be arbitrarily configured.
  • the Abutaman 'probe complex of the present invention can be used, for example, as a recognition element of a sensor for detecting a target molecule.
  • the sensor for detecting a target molecule can be used by mounting the abdomen-probe complex of the present invention on an electrode or a semiconductor chip in order to measure changes in the characteristics of the indicated protein.
  • the general configuration is not particularly limited and can be arbitrarily configured.
  • various aptamer / probe complexes in which an abtamer that inhibits enzyme activity and a probe that binds to a target molecule are combined together are designed and used. ing.
  • the Abama 1 'probe complex that has been developed and reported so far is that the target molecule binds to a part of the abutama.
  • a detection system is used in which the structure of abutama that binds to the target molecule is stabilized, and as a result, the structure of abutama that inhibits enzyme activity is stabilized and the inhibition ability is increased.
  • an abutama that inhibits enzyme activity and a target molecule-binding probe are complexed together, so that an abutama-probe complex can be constructed.
  • the base sequence of the probe that binds to the target molecule is designed and the target molecule does not exist, the structure of the abutama-probe complex forms an unstable structure, and the target molecule binds and becomes stable. It was necessary to design it to change into a structure, which limited the use of only one abutama that binds to a specific target molecule.
  • the Abutaman 'probe complex of the present invention cuts and divides Abutaman 1 that inhibits enzyme activity into at least two, and on one of them, Abutama that binds to the target molecule
  • An aptamer 'probe complex molecule as a mixture consisting of two oligonucleotide molecules with one base sequence and a complementary base sequence of a part of Abutaman binding to the target molecule on the other. Therefore, in the present invention, it is possible to broaden the range of application of the aptamer 'probe complex molecule to the abutama that binds to almost all target molecules. Thus, it is possible to apply the complex design of the present invention, and there is an exceptional effect that cannot be expected from the conventional Abama 1 'probe complex molecule.
  • the present invention is based on the principle of the Abuta-probe complex.
  • the abutama-inhibiting enzyme activity is cleaved into at least two parts and divided into targets. At least two of these are prepared: an oligonucleotide with an abutama base sequence that binds to the molecule, and an oligonucleotide with a portion of the abutama base sequence that binds to the target molecule.
  • the aptamer 'probe complex of the present invention can detect the presence of the target molecule with high sensitivity and high accuracy. It has high technical significance as a simple method.
  • a highly versatile new aptamer-probe complex that can be applied to an abutama that binds to all target molecules can be provided.
  • an abutama that inhibits enzyme activity is cleaved into two parts, and one of them is added with an abutama base sequence that binds to the target molecule, and the other is attached to the target molecule
  • a novel abtamer-probe complex that can detect the presence of a target molecule by measuring the enzyme activity using two oligonucleotide molecules of an oligonucleotide to which a complementary base sequence of a part of the abdomen is added It is possible to provide a method for detecting the presence of a target molecule.
  • the aptamer of the present invention By using the probe complex, the aptamer that binds to almost all target molecules such as nucleic acids, proteins, small molecules, etc. is applied using the characteristics of a specific protein as an index. In addition, it is possible to provide a novel target molecule detection technique capable of easily detecting the presence of these target molecules with high sensitivity and high accuracy.
  • the Abutaman 'probe complex of the present invention is produced by binding the probe to the divided Abutamer 1, the molecular weight of the Aptamer' probe complex can be reduced. Therefore, in the synthesis of the complex, not only the synthesis becomes extremely easy, but also the yield can be greatly improved, and the manufacturing cost for synthesizing the complex can be greatly reduced. Can do.
  • Thrombin Abutama 1 was selected as the enzyme activity inhibiting abutama, and Adenosine Abutama 1 was selected as the target molecule binding abutama that binds to the target molecule, thereby preparing a separated abtamer-probe complex.
  • the 3 ′ T-T loop portion in the G-quartet constituting the thrombin aptamer is divided into two as cleavage sites, the base sequence is specified, and the separation type of the present invention
  • An Abutaman 'probe complex was designed. That is, an aptamer / probe complex (hereinafter referred to as a 3 'aptamer' probe complex) in which a target molecular aptamer, adenosine aptamer 1, is added to one end of the divided aptamer, and the other divided aptamer.
  • An aptamer-probe complex (hereinafter referred to as a 5 'aptamer-probe complex) in which a part of the base of the adenosine aptamer, which is the target molecule aptamer, is added to one end of the aptamer. Designed (see Figure 2).
  • the above-mentioned separated Abama probe probe complex was mixed with a final concentration of 54 nM thrombin solution, a final concentration of 1 mg / ml fibrinogen solution, and a final concentration of 500 ⁇ adenosine and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Five minutes later, the fibrinogen solution was mixed with the thrombin solution, and the enzyme activity inhibition ability was measured. The results are shown in Fig. 4. In addition, the enzyme activity inhibitory ability was measured under the same conditions as described above by changing the final concentration of adenosine in the range of 5. 5. ⁇ -2500 ⁇ 2. Similarly, the enzyme activity inhibition ability in the presence of cytidine as a control molecule was measured. The results are shown in Fig. 5.
  • the enzyme activity inhibitory ability was determined by mixing the thrombin solution with the fibrinogen solution and then setting the time until the solution coagulates as the coagulation time (sec).
  • the clotting time was measured by an automatic blood clotting device (KC4Amicro, AMELUNG).
  • 3 'thrombin' adenosine abutama or 5 'thrombin' adenosine abutama alone does not inhibit thrombin activity, whereas the length of the complementary base sequence with adenosine abutama 1 is 11
  • Ameruma a mixture of mer's 5 'thrombin' adenosine and 3 'thrombin' adenosine, showed high inhibition.
  • the coagulation time does not change even when cytidine, which is a control target molecule, is added, whereas adenosine, which is a target molecule, is added.
  • the clotting time decreased to a final concentration of 1000 ⁇ , and was saturated at higher concentrations. That is, it was shown that adenosine, a target molecule of 50 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ or more, can be detected by measuring the enzyme activity of thrombin using a separated Abutaman 'probe complex with a final concentration of ⁇ .
  • An Abutaman 'probe complex was produced in the same manner as in Example 1 except that the length of the complementary base sequence of adenosine Abutaman added to the divided thrombin Abutaman was changed.
  • the sequence listing shows the base arrangement IJ (SEQ ID NO: 3) of the prepared 5'thrombin'adenosine abutama 'probe complex (8mer).
  • enzyme activity inhibition was carried out in the same manner as in Example 1. Performance was measured. The results are shown in Fig. 4.
  • An Abutaman 'probe complex was prepared in the same manner as in Example 1 except that the length of the complementary base sequence of adenosine aptamer added to the divided thrombin aptamer was changed.
  • the sequence listing shows the base arrangement IJ (SEQ ID NO: 4) of the prepared 5'thrombin'adenosine abutama 'probe complex (4mer).
  • the enzyme activity inhibition ability was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Fig. 4.
  • 1 is only thrombin
  • 2 is 5'thrombin'adenosine abutama (limer)
  • 3 is 3
  • 4 is 5'thrombin'adenosine abutama 1 (llmer) +3, thrombin 'adenosine aptamer 1
  • 5 is 5, thrombin' adenosine aptamer (llmer) +3, thrombin adenosine aptamer " ⁇ hO.
  • 6 is 5 'thrombin ⁇ Adenosine aptamer (8mer) +3 'thrombin.
  • Adenosine abutama 1 is 5' thrombin 'adenosine abutama (4mer) +3' thrombin adenosine aptamer 1
  • 8 is thrombin aptamer 1 Indicates.
  • a DNA aptamer that binds to platelet-derived growth factor AB (PDGF-AB) instead of adenosine abutama as a target molecule-binding abutama (5, CACAGGCTACGGCACG TAGAGCATCACCATGATCCTGTG
  • An aptamer 'probe complex was prepared in the same manner as in Example 1 except that the length of the 15 mer was 15 mer.
  • the 3 ′ T-T norepe site in the G-quartet of the thrombin aptamer is divided into two as a cleavage site, the base sequence is specified, and the separation type of the present invention Designed an abtamer 'probe complex and divided an aptamer' probe complex (3 'thrombin ⁇ DGF aptamer) with the PDGF-AB aptamer, the target molecule abutama, added to one end of the divided abutama
  • PDGF which is the target molecule aptamer
  • PDGF which is the target molecule aptamer
  • sequence listing shows the base sequence of the 3 ′ thrombin / PDGF aptamer / probe complex (SEQ ID NO: 5) and the base sequence of the 5 ′ thrombin / PDGF aptamer / probe complex (SEQ ID NO: 6).
  • the inhibitory ability of aptamer was measured in the presence of PDGF-AB.
  • Thrombin Abutama 1 was selected as the enzyme activity-inhibiting Abutama, and IgE Abutama 1 was selected as the target molecule-binding Abutama that binds to the target molecule, thereby preparing a separate Abama • probe complex.
  • IgE Abutama 1 was selected as the target molecule-binding Abutama that binds to the target molecule, thereby preparing a separate Abama • probe complex.
  • the IgE aptamer which is the target molecule aptamer, was added to one end of the aptamer divided into two with the 3 ⁇ -side T_T loop site in the G-quartet constituting the thrombin aptamer as the cleavage site.
  • Each aptamer-probe complex (5 'aptamer-probe complex) was designed individually (Fig. 8).
  • Abtama powder (produced by Invitrogene Co., Ltd.) having a base arrangement IJ divided into two parts designed as described in (1) above was used, and this was dissolved in water to obtain a buffer aqueous solution.
  • These separate aptamer aqueous solutions were designated as 3′-aptamer aqueous solution and 5′-aptamer aqueous solution, respectively.
  • One 5'-aptamer aqueous solution is mixed with an aqueous solution of IgE aptamer having a complementary base sequence length of 6mer to add an IgE aptamer (6mer) to the 5 'aptamer.
  • a composite was prepared.
  • two types of 5 aptamer-probe complexes were prepared by adding IgE aptamer 1 (4mer) or IgE aptamer 1 (5mer) to 5 ′ aptamer.
  • the 5 'aptamer' probe complex at a concentration of ⁇ was added to the 3 'aptamer' probe complex at a concentration of ⁇ prepared in this way, heated at 95 ° C for 30 minutes, and then over 30 minutes. Then, it was cooled to 25 ° C., and the separation type abutama-probe complex of the present invention was produced.
  • Table 1 shows the prepared 5 'thrombin' IgE aptamer. Probe complex (6mer), 3 'thrombin' IgE aptamer ⁇ . Probe complex (6mer), 5 'thrombin' IgE aptamer ⁇ ⁇ . Probe complex. (4mer) and; ⁇ The sequences of thrombin 'IgE aptamer ⁇ probe complex (4mer) are shown.
  • the 31-mer thrombin aptamer sequences are indicated as lower case and the IgE aptamer sequence is underlined.
  • FIG. 9 shows the reduction rate of clotting time and inhibition when AES with 6-bp, 5-bp, or 4-bp linker DNA is added together with IgE or BSA.
  • lanes 1 to 13 are lane 1: thrombin only, lane 2: thrombin aptamer, lane 3: thrombin aptamer and BSA, lane 4: thrombin aptamer and IgE.
  • Lane 5 thrombin inhibitor aptamer (Linker 6-mer)
  • lane 6 thrombin inhibitor aptamer 1 (Linker 6-mer) and BSA
  • lane 7 thrombin inhibitor aptamer 1 (Linker 6-mer) and IgE
  • Lane 8 Thrombin inhibitor aptamer (Linker 5-mer)
  • Lane 9 Thrombin-inhibiting aptamer (Linker 5-mer) and BSA
  • Lane 10 Thrombin-inhibiting aptamer (Linker 5-mer) and IgE
  • Lane 1 1 Thrombin-inhibiting aptamer (Linker 4_mer)
  • Lane 12 Thrombin-inhibiting aptamer (Linker 4_mer) and BSA
  • Lane 13 Thrombin-inhibiting aptamer (Linker 4_mer) and IgE.
  • Coagulation time and percent reduction in inhibition were each an average of three experiments and displayed an error.
  • FIG. 10 shows an IgE calibration graph using AES as IgE. These experiments were performed at 37 ° C with 250 nMAES, 54 nM ⁇ longbin and 0.34 mg / ml fibrinogen with 4-bp linker DNA. The clotting time is the average of three experiments and the error is displayed. As is apparent from the results in FIG. 10, the clotting time did not change even when BSA, the control target molecule, was added, whereas the clotting time decreased to 500 nM when IgE, the target molecule, was added.
  • IgE a target molecule of ⁇ or more
  • IgE a target molecule of ⁇ or more
  • the present invention relates to an abutama probe complex and a method for detecting a target molecule using the aptamer probe complex. It is possible to provide a novel abtamer-probe complex that is highly versatile and can be applied to the abtamer that binds to the target molecule. Further, according to the present invention, for example, an abutama that inhibits enzyme activity is divided into two, one of which is an oligonucleotide with the base sequence of abutama that binds to the target molecule, and the other that binds to the target molecule.
  • FIG. 1 shows the principle of adenosine detection using the aptamer-probe complex of the present invention.
  • FIG. 2 shows an example of an Abutaman 'probe complex of the present invention.
  • FIG. 3 shows the base sequence of thrombin'adenosine abutama.
  • FIG. 4 shows the ability of the novel abutama-probe complex of the present invention to inhibit thrombin
  • FIG. 5 shows the results of detection of adenosine using the novel abutama-probe complex of the present invention.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of thrombin ′ PDGF aptamer.
  • FIG. 7 shows the ability of the novel abutama-probe complex of the present invention to inhibit thrombin.
  • FIG. 8 shows another example of the aptamer 'probe complex of the present invention.
  • FIG. 9 shows the ability of the aptamer-probe complex of the present invention to inhibit thrombin (decrease rate of inhibition of clotting time).

Abstract

　本発明は、標的分子の存在を検出するための新規アプタマー・プローブ複合体、該アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の存在の検出方法及び検出試薬を提供するものであり、本発明は、標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体であって、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分を少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子からなるアプタマー・プローブ複合体、該複合体を用いた標的分子の存在の検出方法及び検出試薬に関する。本発明により、ほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーを応用できる新規標的分子検出技術を提供することができる。

Description

明 細 書
アブタマ一 ·プローブ複合体を用いた標的分子の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、新規アブタマ一 ·プローブ複合体を用いた標的分子の検出技術に関す るものであり、更に詳しくは、ァプタマ一'プローブ複合体の原理に基づき、ほとんど 全ての標的分子に結合するアブタマ一に対して設計、及び適用が可能な汎用性が 高レ、新規アブタマ一 ·プローブ複合体、該ァプタマ一 ·プローブ複合体を用いた標的 分子の検出方法及び検出試薬 ·検出試薬キットに関するものである。
[0002] 本発明は、例えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を少なくとも 2つに切断して分 割し、その一方に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌタレ ォチドと、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付 加したオリゴヌクレオチドの 2種類のオリゴヌクレオチド分子からなるァプタマ一 ·プロ ーブ複合体を用いて、標的分子を高感度にかつ高精度に検出することが可能な、新 規ァプタマ一 ·プローブ複合体、及び該ァプタマ一 ·プローブ複合体を利用した標的 分子の検出手法に関する新技術'新製品を提供するものである。
背景技術
[0003] ァプタマ一は、特定の分子に結合する核酸リガンドとして、 1990年に、 Goldらによ つて初めてその基本概念が提示されたものであり、 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法と呼ばれる手法を用いてァプタマ一を取得 する方法が報告されてレ、る (非特許文献 1)。
[0004] 従来、ァプタマ一が得られているターゲットとして、先行文献には、例えば、各種タ ンパク質、酵素、ペプチド、抗体、レセプター、ホノレモン、アミノ酸、抗生物質、その他 の種々の化合物等が報告されている（非特許文献 2)。また、他の先行文献には、ァ プタマーの選択及び応用に関する事例が詳細に報告されている（非特許文献 3)。
[0005] 標的分子に特異的に結合する核酸リガンドであるアブタマ一を用いて、標的分子を 均一系で検出する方法として、アブタマ一ビーコン法（非特許文献 4)と、アブタマ一' プローブ複合体法が提案されている。ァプタマ一ビーコン法とは、蛍光共鳴エネルギ 一転移法 (FRET)を利用して、標的分子に結合するアブタマ一に標的分子が結合 することによって起こる構造変化を検出することにより標的分子を検出する手法であ る。
[0006] また、ァプタマ一'プローブ複合体法とは、特定のタンパク質に結合してその特性を 変化させることができるアブタマ一と、標的分子と結合するアブタマ一を組み合わせ た複合体を用レ、ることにより、タンパク質の特性の変化を指標として標的分子を検出 する手法である。
[0007] これらのうち、前者のアブタマ一ビーコン法においては、標的分子を検出する方法 として、 FRETを利用しているため、蛍光光度計などの高価な大型機器が必要とされ ること、また、蛍光強度を測定しているため、標的分子の定量が困難であること、等の 問題点がある。
[0008] 一方、後者のアブタマ一 ·プローブ複合体法においては、タンパク質の特性の変化 を指標とする方法であるため、例えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を用いれば、 酵素活性を測定することにより、簡便な操作手段で標的分子を高感度に検出するこ とができる。酵素活性の測定は、分光学的手法や電気化学的手法を用いて測定し、 標的分子を検出できる可能性があるため、この方法は、検出に高価な大型機器を必 要としないこと、また、酵素活性を指標としているため、高感度な検出系が構築できる 可能性があること、等の利点を有している。
[0009] これまでに開発され、報告されているアブタマ一'プローブ複合体では、標的分子 力 標的分子に結合するアブタマ一部位に結合することによって、アブタマ一の構造 が安定化し、その結果、酵素活性を阻害するアブタマ一の構造が安定化し、酵素活 性の阻害能が上昇することを特徴とする検出系を用いる方法が代表的な事例として 例示される。
[0010] このアブタマ一'プローブ複合体法の従来技術として、先行文献には、例えば、特 定のタンパク質に結合するアブタマ一と、標的分子と結合するプローブとを一体的に 組み合わせたァプタマ一 ·プローブ複合体と、該ァプタマ一 ·プローブ複合体を用い て標的分子を検出する方法が提案されている（特許文献 1)。また、アブタマ一を分 離して、利用する事例として、先行文献には、アブタマ一をコカインアブタマ一とアデ ノシンアブタマ一の 2つに分離し、標的分子を検出する方法が提案されている（非特 許文献 5)。更に、他の先行文献には、 Tatアブタマ一を 2つに分離し、標的分子を検 出する方法が提案されてレ、る (非特許文献 6)。
[0011] しかし、これらの方法においては、ァプタマ一.プローブ複合体を構築するためには 、標的分子に結合するアブタマ一の塩基配歹' Jを設計し、標的分子が存在しない場合 は、アブタマ一 ·プローブ複合体の構造が不安定な構造を形成し、標的分子が結合 することにより安定な構造へと変化するように設計しなければならない。そのため、こ れらの方法では、全ての標的分子に結合するアブタマ一を応用することができない 可能性があり、従来のアブタマ一'プローブ複合体は、全ての標的分子に結合するァ プタマーに対して、ァプタマ一の設計が応用できないという点で、汎用性に欠けると レ、う問題点があった。
[0012] 特許文献 l : WO2005/049826 Al
特 3午文献 1 : Tuerk， し. and uold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands tobacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249, 505- 510 (1990)
非特言午文献 2 : Hermann, et al., Adaptiverecognition by nucleic acid aptamers, Scien ce， 287,820-825 (2000)
非特許文献 3 : Osborne SE, Ellington AD. , Nucleic Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry, Chem. Rev. Apr 1.； 97(2), 349- 370 (1997)
非特許文献 4 : Hamaguchi N. et al., Anal. Biochem.,294, 126- 131 (2001)
非特許文献 5 : Stojanovic et al , J. Am. Chem. So ， 122, 11547-11548 (2000) 非特許文献 6 : Yamamoto et al. , Genes Cells, 5， 389-396 (2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ほとんど全ての標 的分子に結合するアブタマ一を応用可能な新しいアブタマ一 ·プローブ複合体を用 レ、た標的分子の検出技術を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、特定 のタンパク質と結合してその特性を変化させるアブタマ一を少なくとも 2つに切断して 分割し、一方に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオ チドと、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付カロ したオリゴヌクレオチドの少なくとも 2種類のオリゴヌクレオチド分子との混合物からな るアブタマ一'プローブ複合体を構築することにより所期の目的を達成し得ることを見 出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。
[0014] 本発明は、アブタマ一 ·プローブ複合体の原理に基づき、例えば、酵素活性を阻害 するアブタマ一を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合する アブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合 するァプタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの 2種類のォ リゴヌクレオチド分子からなる新規アブタマ一 ·プローブ複合体を提供することを目的 とするものである。また、本発明は、該ァプタマ一 ·プローブ複合体を用いて標的分子 を酵素活性を測定することによって検出する標的分子の検出方法及びその検出試 薬 ·検出試薬キットを提供することを目的とするものである。更に、本発明は、これらの 手法を用いて、ほとんど全ての標的分子に結合するアブタマ一に応用可能な汎用性 が高い新規アブタマ一 ·プローブ複合体を用いた標的分子の検出手法に関する新 技術'新製品を提供することを目的とするものである。
課題を解決するための手段
[0015] 上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
(1)標的分子の存在を検出するための分離型アブタマ一 ·プローブ複合体であって 、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアブタマ 一を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアブタマ一の 塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一 の一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも 2種類のオリゴヌ クレオチド分子の混合物からなることを特徴とするアブタマ一 ·プローブ複合体。
(2)標的分子が、核酸、タンパク質、又は小分子である、前記（1)に記載の複合体。
(3)指示タンパク質が、酵素である、前記（1)に記載の複合体。
(4)指示タンパク質が、トロンビンである、前記（1)に記載の複合体。
(5)標的分子に結合したアブタマ一の安定性と、標的分子結合アブタマ一とその相 補的塩基配列が形成する 2本鎖構造の安定性が近ぐかつ標的分子に結合したァ プタマーの安定性が、上記 2本鎖構造の安定性より大きくなるように相補的塩基配列 の長さを設計した、前記（1)に記載の複合体。
(6)酵素と結合してその酵素活性を阻害するアブタマ一を 2つに切断して分割し、分 割した部分の一端に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配歹を付加し、もう一端 に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加した、前記（1)に 記載の複合体。
(7)ァプタマ一をァプタマ一のループ（一本鎖部分）の任意のサイトで切断して分割 した、前記（1)に記載の複合体。
(8)前記（1)から（7)のレ、ずれかに記載のアブタマ一 ·プローブ複合体を有効成分と して含むことを特徴とする標的分子の検出試薬。
(9)前記 (8)に記載の検出試薬と、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測 定するための試薬を組み合わせたことを特徴とする標的分子検出試薬キット。
(10)被検試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、前記（8)に記載のァ プタマ一'プローブ複合体を有効成分とする検出試薬と被検試料とを接触させ、指示 タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検 出することを特徴とする標的分子の検出方法。
(11)指示タンパク質が、酵素であり、指示タンパク質の酵素活性の変化を分光学的 手法又は電気化学的手法により測定する、前記（10)に記載の方法。
[0016] 次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のアブタマ一'プローブ複合体は、指示タンパク質と結合してそのタンパク 質の特性を変化させることができるアブタマ一部分を少なくとも 2つに切断して分割し 、その一方に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオチ ドと、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加し たオリゴヌクレオチドの少なくとも 2種類のオリゴヌクレオチド分子からなることを特徴と するものである。
[0017] 本発明においては、例えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を選択し、これを少な くとも 2つに切断して分割する。この場合、アブタマ一の分割の個数については、好 適には、アブタマ一を 2分割することが例示される。しかし、アブタマ一の分割の個数 は、アブタマ一の種類、特にその立体構造に大きく依存することから、基本的には、 使用するァプタマ一の種類に依存する。したがって、本発明では、ァプタマ一の分割 の個数は、特に制限されるものではなぐ使用するアブタマ一の種類に応じて 3分割 以上の任意の個数に分割することも適宜可能である。
[0018] 本発明では、例えば、 2つに切断して分割したァプタマ一部分にプローブを付カロし てァプタマ一 ·プローブ複合体が作製される力 この場合、 2つに分割されたァプタマ 一のうち、標的分子に結合するアブタマ一部分の方を 3 '—アブタマ一'プローブ複 合体、他方の上記アブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したアブタマ一部分 の方を、 5'—ァプタマ一 ·プローブ複合体と各々定義することとする。また、本明細書 において、「プローブ」とは、標的分子に結合するものを意味するものとして定義され る。したがって、本発明において、例えば、標的分子が DNAの場合は、プローブは その相補鎖 DNAを意味し、また、標的分子がタンパク質の場合は、プローブは標的 分子に結合するアブタマ一を意味する。
[0019] 本発明では、 2つに切断して分割された一方のアブタマ一部分に、標的分子に結 合するアブタマ一部分の一部の相補的塩基配列が付加される力 付加するプローブ の相補的塩基配列の長さや相補的塩基配列の領域は、任意に設計することができる 。その場合、特に、付加するプローブの長さは、標的分子に結合したアブタマ一の安 定性と、標的分子結合アブタマ一とその相補的 DNAが形成する 2本鎖 DNA構造の 安定性を考慮して任意に決定することができる。
[0020] 本発明の方法においては、上記標的分子に結合したアブタマ一の安定性と、標的 分子結合アブタマ一とその相補的 DNAが形成する 2本鎖構造の安定性の差を見る ことが重要であり、これらの安定性をなるベく近くすることで高感度かつ高精度の標的 分子の検出が可能となる。上記 2本鎖構造の安定性は、単純に、相補的 DNA鎖の 長さに依存することから、付加するプローブの長さは、上記標的分子に結合したアブ タマ一の安定性と上記 2本鎖構造の安定性が近 かつ標的分子に結合したァプタ マーの安定性が、標的分子結合アブタマ一とその相補的 DNAが形成する 2本鎖構 造の安定性より大きくなるような長さに設計することが好ましい。 [0021] 本発明では、付加するプローブの相補的塩基配列の長さは、特に、標的分子に結 合するアブタマ一の結合後の安定性と、標的分子結合アブタマ一とその相補的塩基 配列が形成する 2本鎖構造の安定性を考慮して、その好適な範囲で任意に設計す ることができる。そして、それにより、これらの 2つの構造の競合を見ることで高感度か つ高精度に標的分子を検出することが可能になる。
[0022] 後記する実施例では、例えば、相補的塩基配列の長さが 11、 8、及び 4merの塩基 配列を付加した 5 'トロンビン'アデノシンアブタマ一の作製例、及び相補的塩基配列 の長さが 15merの塩基配列を付加した 5'トロンビン 'PDGFァプタマ一の作製例を 示したが、これらは、相補的塩基配列を付加したアブタマ一作製の一例を具体的に 説明したものである。本発明では、これらの手法に準じて、任意の種類及び長さの塩 基配列及び相補的塩基配列を任意のアブタマ一に付加してアブタマ一 ·プローブ複 合体を作製することができる。
[0023] 次に、ァプタマ一の切断位置について説明すると、基本的に、ァプタマ一は、ステ ム（2本鎖部分）とループ (一本鎖部分)から構成されてレ、るが、アブタマ一の切断位 置としては、ァプタマ一のループ部分が好ましぐまた、ァプタマ一と標的分子の結合 部分を除いた領域の部分が好ましい。例えば、後記する実施例で使用するトロンビン ァプタマ一には、ループ部分として、 t tループが 2箇所、 TGTループが一箇所存 在するが、これらのうち、標的分子のトロンビンとの結合に関与しなレ、 t_tノレープ部分 を切断位置として選択することが好ましい。これと同様にして、使用するアブタマ一の 種類に応じて、アブタマ一の切断位置を適宜選択することができる。
[0024] アブタマ一を所定の切断位置で切断する方法としては、例えば、制限酵素による方 法、化学的手法による方法等が例示される。制限酵素は、アブタマ一の切断サイトの 塩基配列に応じて公知の制限酵素を適宜選択して使用することができる。また、制限 酵素による処理工程及び処理条件についても特に制限されるものではなぐ基質と 制限酵素の種類に応じて任意の処理工程及び処理条件を採用することができる。
[0025] 本発明では、上述のように、標的分子に結合するアブタマ一の結合後の安定性が 重要であり、本発明の方法は、標的分子に結合したアブタマ一の安定性と、標的分 子結合アブタマ一とその相補的塩基配列が形成する 2本鎖 DNA構造の安定性との 差により標的分子を検出することを基本とする手法であると言える。したがって、本発 明では、これらの 2つの構造の安定性を制御できるように、付加するァプタマ一の塩 基配列及び相補的塩基配列を設計することが重要になる。
[0026] 本発明の方法は、上述のアブタマ一 ·プローブ複合体を利用することで、試料中の 標的分子の存在を高感度かつ高精度に検出することが可能である。この方法では、 例えば、被検試料と、本発明のアブタマ一 ·プローブ複合体を接触させ、指示タンパ ク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出する ことができる。本発明では、指示タンパク質として、酵素を用いることが好ましぐその 場合、酵素活性の変化を、分光学的手法又は電気化学的手法により測定することが 可能である。本発明では、標的分子として、例えば、核酸、タンパク質、分子量 1000 以下の有機化合物を含む小分子が例示されるが、これらに制限されるものではなぐ これらと同等ないし類似のものであれば対象とされる。
[0027] 本発明では、ァプタマ一 ·プローブ複合体の原理に基づき、ァプタマ一を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付 カロしたオリゴヌクレオチドを作製し、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の一部 の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドを作製し、これらの 2種類のオリゴヌ クレオチド分子を用いてアブタマ一'プローブ複合体が構築される。この場合、これら のオリゴヌクレオチド分子としては、 DNA、 RNA、 PNAなどの核酸類似体である核 酸ホモログを例示することができる。また、これらのヌクレオチド分子は、それらの活性 を有する範囲で、塩基を付加、欠失及び/又は置換することが可能であり、また、糖 、及び Z又はヌクレオチド間結合に任意の修飾を付加することも可能である。それら の操作は、通常の手法を用いて行うことが可能であり、特に制限されるものではない
[0028] 本発明のアブタマ一'プローブ複合体を構築する場合、例えば、アブタマ一部分の 3 '側に標的分子結合アブタマ一部分が連結され、標的分子結合アブタマ一部分と 標的分子とがハイブリダィズしたときにアブタマ一部分と指示タンパク質との結合が阻 害されるように設計することができる。また、例えば、標的分子の非存在下において、 標的分子結合アブタマ一部分がアブタマ一部分と指示タンパク質との結合を阻害し 、標的分子結合アブタマ一部分と標的分子がハイブリダィズしたときに、標的分子結 合アブタマ一部分による阻害作用が軽減され、アブタマ一部分と指示タンパク質との 結合が強まるように設計することができる。
[0029] 本発明では、指示タンパク質として、例えば、酵素、蛍光タンパク質、レセプター、 特定のレセプターと結合するリガンド等を用いることができる。好適には、指示タンパ ク質としては、トロンビン等の酵素が例示される。更に、 SELEX法により、所望の酵素 に対して、それに結合するアブタマ一を取得することが可能であるため、任意の酵素 について、その活性を阻害するアブタマ一を取得し、その配列に基づいて、本発明 のアブタマ一 ·プローブ複合体を設計することができる。
[0030] 本発明においては、指示タンパク質として、酵素を用いた場合には、例えば、標的 分子結合アブタマ一が標的分子に結合することにより、アブタマ一部分と酵素との結 合が強まることにより、アブタマ一部分による酵素活性の阻害が増加し、その結果、 酵素活性が低下する。また、標的分子結合アブタマ一部分が標的分子に結合するこ とにより、アブタマ一部分と酵素との結合が弱まることにより、アブタマ一部分による酵 素活性の阻害が軽減され、その結果、酵素活性が高まる。これらのいずれの方法に おいても、指示タンパク質である酵素の活性を測定することによって、標的分子の存 在を容易に検出することができる。
[0031] 次に、本発明では、上述のアブタマ一'プローブ複合体を用いて、被検試料中の標 的分子の存在を検出することができる。この方法では、被検試料と、本発明のァプタ マー.プローブ複合体とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを 指標として、試料中の標的分子の存在を検出することができる。指示タンパク質として 酵素を用いた場合には、指示タンパク質の特性の変化を酵素活性の変化として容易 に測定することができる。
[0032] 酵素活性の変化は、分光学的手法又は電気化学的手法により測定することができ る。例えば、酵素としてトロンビンを用いる場合、基質として N—ベンゾィル一 Phe— V al_Arg_p—二トロア二リドを用レヽ、遊離した p—二トロア二リンの吸光度（410nm) を測定することによって、トロンビンの活性を測定するカ あるいは、血漿に終濃度が 一定になるようにフイブリノ一ゲンとトロンビンを加え、トロンビンによるフイブリノ一ゲン の切断によって開始される血液凝固を測定することによって、トロンビンの活性を測 定すること力 Sできる。
[0033] 血液凝固の測定は、例えば、分光学的方法による屈折率の変化の測定、血漿に金 属球を添加して血液凝固に伴う運動の停止を観察する方法、水晶振動子、表面ブラ ズモン共鳴、干渉増幅反射法
(Interference Enhanced Reflection;IER)等により行うことが可能である。また、酵素と しては、好適には、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフエニコールァセチルトランスフ エラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ヮサビペルォキシダーゼ等が例示される。
[0034] 酵素反応の検出法としては、例えば、比色法や電気化学的測定法が例示される。
指示タンパク質として、レセプターを用いる場合には、分光学的方法で検出すること ができる。また、指示タンパク質として、蛍光タンパク質を用いる場合には、その蛍光 特性で検出することができる。
[0035] 本発明では、標的分子と本発明のアブタマ一 ·プローブ複合体とを混合することに より、標的分子と標的分子結合アブタマ一との結合を観察することができるので、極 めて高感度かつ高精度で、簡単な操作手段で標的分子の存在を検出することがで きる。
[0036] 次に、本発明の標的分子検出用試薬について説明すると、本発明では、上述のァ プタマー .プローブ複合体を利用することにより、標的分子の存在を検出するための 検出試薬を構築することができる。また、本発明では、本発明のアブタマ一'プローブ 複合体に加えて、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測定するための試 薬等からなる検出用試薬キットを構築することができる。これらの検出試薬及び検出 試薬キットの製品形態及び使用態様は、特に制限されるものではな 任意に構成 すること力 Sできる。
[0037] 更に、本発明のアブタマ一'プローブ複合体は、例えば、標的分子検出用センサー の認識素子として使用することができる。この場合、標的分子検出用センサーは、指 示タンパク質の特性の変化を測定するために、電極や半導体チップに本発明のアブ タマ一.プローブ複合体を装着して用いることができるが、その具体的構成について は、特に制限されるものではなぐ任意に構成することができる。 [0038] 従来のアブタマ一'プローブ複合体法では、例えば、酵素活性を阻害するアブタマ 一と、標的分子と結合するプローブを一体的に組み合わせたァプタマ一 ·プローブ複 合体が種々設計され、使用されている。そして、これまでに開発され、報告されている アブタマ一'プローブ複合体は、標的分子がアブタマ一部分に結合することによって
、標的分子に結合したアブタマ一の構造が安定化し、その結果、酵素活性を阻害す るアブタマ一の構造が安定化し、阻害能が上昇する検出系が用いられている。
[0039] しかし、この種の複合体では、酵素活性を阻害するアブタマ一と標的分子結合プロ ーブとが一体的に複合化されているため、アブタマ一 ·プローブ複合体を構築するた めに、標的分子に結合するプローブの塩基配列を設計し、標的分子が存在しない場 合には、アブタマ一 ·プローブ複合体の構造が不安定な構造を形成し、標的分子が 結合することにより安定な構造へと変化するように設計する必要があり、そのために、 特定の標的分子に結合するアブタマ一しか使用できないという制約があった。
[0040] これに対して、本発明のアブタマ一'プローブ複合体は、例えば、酵素活性を阻害 するアブタマ一を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方に、標的分子に結合す るアブタマ一の塩基配列を、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相 補的塩基配列を付加した 2種類のオリゴヌクレオチド分子から構成される混合物とし てのァプタマ一'プローブ複合体分子であるので、本発明では、ァプタマ一'プロ一 ブ複合体分子の設計思想をほとんど全ての標的分子に結合するアブタマ一へ応用 の範囲を広げることが可能であり、ほとんど全てのアブタマ一に対して、本発明の複 合体の設計を適用することが可能であるという、従来のアブタマ一'プローブ複合体 分子からは全く期待し得ない格別の効果が奏される。
[0041] 以上詳述したように、本発明は、アブタマ一 ·プローブ複合体の原理に基づき、例 えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方 に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一 方に標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌク レオチドとを作製し、これらの少なくとも 2種類のオリゴヌクレオチド分子を構成要素と するァプタマ一.プローブ複合体を構築した点、及びこれらの 2種類のオリゴヌクレオ チド分子からなるアブタマ一 ·プローブ複合体を用いて標的分子の存在を検出する 手法を構築した点に最大の特徴を有するものである。
[0042] また、本発明の方法において、上記アブタマ一 ·プローブ複合体を使用する場合は 、上記 2種類のオリゴヌクレオチド分子の混合物を被検試料に混合して使用し、その 酵素阻害能を検出するという簡便な操作手段で標的分子の存在を高感度かつ高精 度で調べることができるので、本発明のァプタマ一'プローブ複合体は、標的分子の 存在を高感度かつ高精度に検出するための簡便手法として高い技術的意義を有す るものである。
発明の効果
[0043] 本発明により、次のような効果が奏される。
(1)全ての標的分子に結合するアブタマ一を応用可能な汎用性が高い新規ァプタ マー ·プローブ複合体を提供することができる。
(2)例えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を 2つに切断して分割し、その一方に標 的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に 標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオ チドの 2種類のオリゴヌクレオチド分子を用いて標的分子の存在を酵素活性を測定 することによって検出できる新規アブタマ一 ·プローブ複合体を利用した標的分子の 存在の検出方法を提供することができる。
[0044] (3)本発明のァプタマ一.プローブ複合体を用いることにより、特定のタンパク質の特 性を指標として、核酸、タンパク質、小分子等のほとんど全ての標的分子に結合する アブタマ一を応用でき、しかも、それらの標的分子の存在を高感度かつ高精度で、簡 便に検出することが可能な新規標的分子検出技術を提供することができる。
(4)本発明のアブタマ一'プローブ複合体は、分割されたアブタマ一にプローブを結 合して作製しているため、ァプタマ一'プローブ複合体の分子量を低下させることが できる。したがって、複合体の合成の際に、合成が極めて容易になることは勿論、そ の収率を大幅に向上させることができ、し力も複合体の合成の際の製造コストを大幅 に低減させることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0045] 次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の例によ つて何ら限定されるものではない。
実施例 1
[0046] 酵素活性阻害アブタマ一として、トロンビンアブタマ一、また、標的分子に結合する 標的分子結合アブタマ一としてアデノシンアブタマ一をそれぞれ採択し、分離型アブ タマ一 ·プローブ複合体を作製した。
[0047] (1)分離型アブタマ一'プローブ複合体の設計
上記トロンビンァプタマ一を構成している G—カルテット内の 3'側の T—Tループ部 位を切断部位として 2つに分割して考え、その塩基配列を特定し、本発明の分離型 アブタマ一'プローブ複合体を設計した。すなわち、分割したアブタマ一の一端に標 的分子ァプタマ一であるアデノシンアブタマ一を付加したァプタマ一 ·プローブ複合 体（以下、 3 'ァプタマ一'プローブ複合体という。）と、分割したもう一方のァプタマ一 の一端に標的分子アブタマ一であるアデノシンアブタマ一の一部の相補的塩基を付 加したァプタマ一 ·プローブ複合体（以下、 5'ァプタマ一 ·プローブ複合体という。）を それぞれ別個に設計した（図 2参照）。
[0048] (2)分離型ァプタマ一 ·プローブ複合体の作製
具体的には、トロンビンァプタマ一を構成している G—カルテット内の 3'側の T—T ループ部位を切断部位として、 2つに分割した塩基配列を有するアブタマ一粉末 (ィ ンビトロジヱン社製）を用レ、、これを水に溶かし、緩衝水溶液とした。これらの別個のァ プタマーの水溶液をそれぞれ 3'ァプタマ一水溶液、 5 'ァプタマ一水溶液とした。一 方の 5'ァプタマ一水溶液に相補的塩基配列の長さが l lmerのアデノシンアブタマ 一水溶液を混合することにより、 5 'ァプタマ一にアデノシンアブタマ一（l lmer)を付 加させた 5 'アブタマ一 ·プローブ複合体を作製した
[0049] このように作製した濃度 1 μ Μの 3'ァプタマ一'プローブ複合体に濃度 1 μ Μの 5' ァプタマ一'プローブ複合体を加え、 95°Cで 3分間加熱後、 30分かけて 25°Cまで冷 却し、本発明の分離型アブタマ一 ·プローブ複合体を作製した。配列表に、作製した 3 'トロンビン'アデノシンアブタマ一 ·プローブ複合体の塩基配列（配列番号 1)、及び 5 'トロンビン'アデノシンアブタマ一 ·プローブ複合体（1 lmer)の塩基配列（配列番 号 2)を示す。 [0050] (3)酵素活性阻害能の測定
上記分離型アブタマ一 ·プローブ複合体に終濃度 54nMのトロンビン溶液、終濃度 lmg/mlのフイブリノ一ゲン溶液、終濃度 500 μ Μのアデノシンを混合し、 37°Cで 5 分間インキュベートした。 5分後、フイブリノ一ゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、酵素 活性阻害能を測定した。その結果を図 4に示す。また、アデノシンの終濃度を 5. Ο μ Μ〜2500 μ Μの範囲で変化させて、上記と同様の条件で、酵素活性阻害能を測定 した。同様に対照分子であるシチジンを存在させた場合の酵素活性阻害能を測定し た。その結果を図 5に示す。
[0051] 酵素活性阻害能は、フイブリノ一ゲン溶液にトロンビン溶液を混合し、その後、溶液 が凝固するまでの時間を凝固時間（sec)とし、この値によって酵素活性阻害能を測 定した。凝固時間は、 自動血液凝固装置 (KC4Amicro, AMELUNG)により測定 した。バッファーの終濃度は、 50mM Tris— HC1、 5mMKCl、 PH = 8. 0である。 3 'トロンビン'アデノシンアブタマ一又は 5 'トロンビン'アデノシンアブタマ一単独では、 トロンビンの活性を阻害しないのに対し、アデノシンアブタマ一との相補的塩基配列 の長さが 11
merの 5 'トロンビン'アデノシンアブタマ一と 3 'トロンビン'アデノシンアブタマ一を混 合したアブタマ一は、高い阻害能を示した。
[0052] また、図 5のキャリブレーションカーブの結果からも明らかなように、対照標的分子で あるシチジンを添加しても凝固時間は、変わらないのに対して、標的分子であるアデ ノシンを添加すると、終濃度 1000 μ Μまでは、凝固時間が減少し、それ以上では飽 和していた。すなわち、終濃度 Ι μ Μの分離型アブタマ一'プローブ複合体を用い、 トロンビンの酵素活性を測定することにより、 50 μ Μ以上の標的分子であるアデノシ ンを検出できることが示された。
実施例 2
[0053] 分割したトロンビンアブタマ一に付加するアデノシンアブタマ一の相補的塩基配列 の長さを変化させた以外は実施例 1と同様にして、アブタマ一'プローブ複合体を作 製した。配列表に、作製した 5 'トロンビン'アデノシンアブタマ一'プローブ複合体（8 mer)の塩基配歹 IJ (配列番号 3)を示す。また、実施例 1と同様にして、酵素活性阻害 能を測定した。その結果を図 4に示す。
実施例 3
[0054] 分割したトロンビンァプタマ一に付加するアデノシンアブタマ一の相補的塩基配列 の長さを変化させた以外は実施例 1と同様にして、アブタマ一'プローブ複合体を作 製した。配列表に、作製した 5'トロンビン'アデノシンアブタマ一'プローブ複合体 (4 mer)の塩基配歹 IJ (配列番号 4)を示す。また、実施例 1と同様にして、酵素活性阻害 能を測定した。その結果を図 4に示す。
[0055] 図 4において、 1はトロンビンのみ、 2は、 5'トロンビン'アデノシンアブタマ一（lime r)、 3は、 3，トロンビン'アデノシンアブタマ一、 4は、 5'トロンビン'アデノシンアブタマ 一（llmer) +3，トロンビン'アデノシンアブタマ一、 5は、 5，トロンビン'アデノシンァ プタマー（llmer) +3，トロンビン ·アデノシンァプタマ" ~~ hO. 5mMアデノシン、 6は 、 5'トロンビン ·アデノシンアブタマ一（8mer) +3'トロンビン.アデノシンアブタマ一、 7は、 5'トロンビン'アデノシンアブタマ一（4mer) +3'トロンビン ·アデノシンァプタマ 一、 8は、トロンビンァプタマ一を示す。
[0056] 終濃度 500nMアデノシン存在下における、相補的塩基配列の長さが 11 merの 5' トロンビン ·アデノシンアブタマ一と 3 'トロンビン ·アデノシンアブタマ一を混合したァプ タマ一の阻害能は、アデノシン非存在下と比べ低下した。 3'トロンビン'アデノシンァ プタマーに補的塩基配列の長さが 8、 4
merの 5'トロンビン'アデノシンアブタマ一を混合した場合は、阻害能が低いことから 、アデノシンがアデノシンアブタマ一部位に結合することにより、 3'トロンビン'アデノ シンァプタマ一と 5'トロンビン'アデノシンアブタマ一がハイブリダィゼーシヨンしにくく なり、その結果、アブタマ一の阻害能が低下したと考えられた。
実施例 4
[0057] (1)ァプタマ一複合体の作製
標的分子結合アブタマ一として、アデノシンアブタマ一に代えて血小板由来増殖因 子 AB (PDGF-AB)に結合する DNAァプタマ一（5， CACAGGCTACGGCACG TAGAGCATCACCATGATCCTGTG
3')を採択し（Green et al. Biochemistry 1996, 35， 14413- 14424)、相補的塩基配列 の長さを 15merとした以外は、実施例 1と同様にして、ァプタマ一'プローブ複合体を 作製した。
[0058] すなわち、トロンビンァプタマ一の G—カルテット内の 3 '側の T—Tノレープ部位を切 断部位として 2つに分割して考え、その塩基配列を特定し、本発明の分離型アブタマ 一'プローブ複合体を設計し、分割したアブタマ一の一端に標的分子アブタマ一で ある PDGF—ABァプタマ一を付加したァプタマ一'プローブ複合体（3 'トロンビン · Ρ DGFァプタマ一）を、分割したもう一方のァプタマ一の一端に標的分子ァプタマ一で ある PDGF— ΑΒァプタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したァプタマ一'プロ一 ブ複合体（5 'トロンビン ' PDGFァプタマ一）を作製した（図 6)。配列表に、 3 'トロンビ ン · PDGFァプタマ一 ·プローブ複合体の塩基配列（配列番号 5)、 5 'トロンビン' PD GFアブタマ一 ·プローブ複合体の塩基配列（配列番号 6)を示す。
[0059] (2)酵素活性阻害能の測定
終濃度 ΙΟΟηΜの 3，トロンビン 'PDGFァプタマ一に、終濃度 ΙΟΟηΜの 5 'トロンビ ン 'PDGFァプタマ一を加え、 95°Cで 3分間加熱後、 30分力けて 25°Cまで冷去 Pし、 終濃度 13. 5nMトロンビン、終濃度 lmg/mlフイブリノ一ゲンを用レ、、終濃度 100η M
PDGF— AB存在下において、ァプタマ一の阻害能を測定した。
[0060] その結果、 3 'トロンビン ' PDGFァプタマ一又は 5 'トロンビン ' PDGFァプタマ一単 独では、トロンビンの活性を阻害しないのに対し、それらを混合したアブタマ一は、ト ロンビンの酵素活性を阻害した（図 7)。終濃度 100nMPDGF_AB存在下における 、 5 'トロンビン ' PDGFァプタマ一と 3 'トロンビン 'PDGFァプタマ一を混合したァプタ マーの阻害能は、 PDGF—AB非存在下と比較すると低下した。尚、 5'ァプタマ一. プローブ複合体、又は 3 'アブタマ一 ·プローブ複合体単独では、酵素活性阻害能を 有しないことが示された。
実施例 5
[0061] 酵素活性阻害アブタマ一として、トロンビンアブタマ一、また、標的分子に結合する 標的分子結合アブタマ一として IgEアブタマ一をそれぞれ採択し、分離型アブタマ一 •プローブ複合体を作製した。 [0062] (1)分離型アブタマ一'プローブ複合体の設計
上記トロンビンァプタマ一を構成している G—カルテット内の 3^ 側の T_Tループ 部位を切断部位として 2つに分割したアブタマ一の一端に、標的分子アブタマ一で ある IgEァプタマ一を付加したァプタマ一'プローブ複合体（3' ァプタマ一'プロ一 ブ複合体）と、分割したもう一方のアブタマ一の一端に、標的分子アブタマ一である I gEァプタマ一の一部の相補的塩基を付加したァプタマ一 ·プローブ複合体（5' ァプ タマ一 ·プローブ複合体)をそれぞれ個別に設計した（図 8)。
[0063] (2)分離型アブタマ一'プローブ複合体の作製
上記（1)のように設計された、 2つに分割した塩基配歹 IJを有するアブタマ一粉末 (ィ ンビトロジヱン社製）を用レ、、これを水に溶かし、緩衝水溶液とした。これらの別個のァ プタマーの水溶液をそれぞれ 3' —ァプタマ一水溶液、 5' —ァプタマ一水溶液とし た。一方の 5' —ァプタマ一水溶液に相補的塩基配列の長さが 6merの IgEァプタマ 一水溶液を混合することにより、 5' ァプタマ一に IgEァプタマ一（6mer)を付加させ た 5' アブタマ一'プローブ複合体を作製した。これと同様にして、 5' アブタマ一に I gEァプタマ一（4mer)又は IgEァプタマ一（5mer)を付加させた 2種類の 5 ァプタ マー ·プローブ複合体を作製した。
[0064] このように作製した濃度 Ι μ Μの 3' ァプタマ一'プローブ複合体に濃度 Ι μ Μの 5 ' ァプタマ一'プローブ複合体を加え、 95°Cで 30分間加熱後、 30分かけて 25°Cま で冷却し、本発明の分離型アブタマ一 ·プローブ複合体を作製した。表 1に、作製し た 5' トロンビン 'IgEァプタマ一.プローブ複合体（6mer)、 3' トロンビン 'IgEァプタ マ ~ .プローブ複合体（6mer)、 5' トロンビン 'IgEァプタマ^ ~ .プローブ複合体（4m er)、及び;^ トロンビン 'IgEァプタマ^ ~ ·プローブ複合体（4mer)の配列を示す。
[0065] [表 1] The sequence of the AES for IgE.
5' thro-lgE link 6-mer 5" cactggtaggttqgtqtgatTGAATTGTCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGA 3'
3' thro-lgE link 6-mer 5' AAACGTGACAATTCTtggggccagtg 3'
5' thro-lgE link 4-mer 5' cactggtaggtt qtqtqqtTATTGTCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGA 3'
3' thro-lgE link 4-mer 5' AAACGTGACAATTtggggccagtg 3'
The 31-mer thrombin aptamer sequences are indicated as lower case and the IgE aptamer sequence is underlined.
[0066] また、配列表に、 5' トロンビン. IgEァプタマ一.プローブ複合体（6mer)の塩基配 歹' J (配列番号 7)、 3; トロンビン ' IgEァプタマ一'プローブ複合体（6mer)の塩基配 歹' J (配列番号 8)、 5; トロンビン ' IgEァプタマ一'プローブ複合体（4mer)の塩基配 歹' J (配列番号 9)、及び:^ トロンビン ' IgEァプタマ一'プローブ複合体（4mer)の塩 基配歹 (配列番号 10)を示す。
[0067] (3)酵素活性阻害能の測定
酵素活性阻害能の測定は、 250nMAES、 250nMIgE、 250nMBSA、 54nMトロ ンビン及び 1 . 7mg/mlフイブリノ一ゲンを用いて 37°Cで行った。その結果を図 9に 示す。図 9は、 6— bp、 5— bp、又は 4— bpリンカ一 DNAを有する AESを IgE又は B SAと一緒に添加したときの凝固時間及び阻害の減少率を示す。
[0068] 図中、レーン 1〜13は、レーン 1 :トロンビンのみ、レーン 2 :トロンビンァプタマ一、レ ーン 3 :トロンビンァプタマ一と BSA、レーン 4 :トロンビンァプタマ一と IgE、レーン 5 :ト ロンビン 阻害ァプタマ一（Linker 6—mer)、レーン 6：トロンビン 阻害ァプタマ 一（Linker 6— mer)と BSA、レーン 7 :トロンビン一阻害ァプタマ一（Linker 6— m er)と IgE、レーン 8 :トロンビン 阻害ァプタマ一（Linker 5—mer)、
レーン 9 :トロンビン一阻害ァプタマ一（Linker 5— mer)と BSA、レーン 10 :トロンビ ン一阻害ァプタマ一（Linker 5—mer)と IgE、 レーン 1 1：トロンビン 阻害ァプタマ 一（Linker 4 _mer)、レーン 12 :トロンビン一阻害ァプタマ一（Linker 4 _mer)と BSA、レーン 13 :トロンビン一阻害ァプタマ一（Linker 4 _mer)と IgE、である。凝 固時間及び阻害の減少率は、それぞれ、 3つの実験の平均であり、誤差を表示した。
[0069] 図 10は、 IgEに AESを用いた IgEのキャリブレーショングラフを示す。これらの実験 は、 4— bpリンカ一 DNAを有する 250nMAES、 54nM卜ロンビン及び 0. 34mg/ml フイブリノ一ゲンを用いて 37°Cで行った。凝固時間は 3つの実験の平均であり、誤差 を表示した。図 10の結果から明らかなように、対照標的分子である BSAを添加しても 凝固時間は、変わらないのに対して、標的分子である IgEを添加すると、 500nMまで 凝固時間が減少した。
[0070] すなわち、 250nMの分離型ァプタマ一.プローブ複合体を用レ、、トロンビンの酵素 活性を測定することにより、 Ι ΟΟηΜ以上の標的分子である IgEを検出できることが示 された。このように、 IgEの濃度に依存してトロンビンの阻害活性が変化することが明 らかとなつた。つまり、図 10に示されたように、検量線に従い、トロンビンの酵素活性 力も IgEの濃度を簡易かつ容易に測定できることが示された。
産業上の利用可能性
[0071] 以上詳述したように、本発明は、アブタマ一 ·プローブ複合体及び該ァプタマ一 'プ ローブ複合体を用いた標的分子の検出方法に係るものであり、本発明により、ほとん ど全ての標的分子結合するアブタマ一に対して、設計思想を適用できる汎用性が高 い新規アブタマ一 ·プローブ複合体を提供することができる。また、本発明により、例 えば、酵素活性を阻害するアブタマ一を 2つに分け、その一方に標的分子に結合す るアブタマ一の塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合 するァプタマ一の一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの 2種類のォ リゴヌクレオチド分子を用いて標的分子を検出できる新規アブタマ一 ·プローブ複合 体による標的分子検出方法を提供することができる。更に、本発明のアブタマ一 'プ ローブ複合体を用いることにより、高感度かつ高精度にほとんど全ての標的分子に結 合するアブタマ一を応用可能で、し力も、それらの標的分子を高感度かつ簡便に検 出することができる標的分子の検出手法に関する新技術'新製品を提供することがで きる。
図面の簡単な説明
[0072] [図 1]本発明のァプタマ一 ·プローブ複合体を用いたアデノシン検出原理を示す。
[図 2]本発明のアブタマ一'プローブ複合体の一例を示す。
[図 3]トロンビン'アデノシンアブタマ一の塩基配列を示す。
[図 4]本発明の新規アブタマ一 ·プローブ複合体のトロンビンに対する阻害能を示す
[図 5]本発明の新規アブタマ一 ·プローブ複合体を用いたアデノシンの検出結果を示 す。
[図 6]トロンビン ' PDGFァプタマ一の塩基配列を示す。
[図 7]本発明の新規アブタマ一 ·プローブ複合体のトロンビンに対する阻害能を示す [図 8]本発明のァプタマ一'プローブ複合体の他の一例を示す。
[図 9]本発明のァプタマ一 ·プローブ複合体のト口ンビンに対する阻害能 (凝固時間 阻害の減少率）を示す。
園 10]本発明のアブタマ一'プローブ複合体を用いた IgEの検出結果を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 標的分子の存在を検出するための分離型アブタマ一 ·プローブ複合体であって、 指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアブタマ一 を少なくとも 2つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアブタマ一の塩 基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアブタマ一の 一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも 2種類のオリゴヌク レオチド分子の混合物からなることを特徴とするアブタマ一 ·プローブ複合体。
[2] 標的分子が、核酸、タンパク質、又は小分子である、請求項 1に記載の複合体。
[3] 指示タンパク質が、酵素である、請求項 1に記載の複合体。
[4] 指示タンパク質が、トロンビンである、請求項 1に記載の複合体。
[5] 標的分子に結合したアブタマ一の安定性と、標的分子結合アブタマ一とその相補 的塩基配列が形成する 2本鎖構造の安定性が近ぐかつ標的分子に結合したァプタ マーの安定性が、上記 2本鎖構造の安定性より大きくなるように相補的塩基配列の長 さを設計した、請求項 1に記載の複合体。
[6] 酵素と結合してその酵素活性を阻害するアブタマ一を 2つに切断して分割し、分割 した部分の一端に標的分子に結合するアブタマ一の塩基配列を付加し、もう一端に 標的分子に結合するアブタマ一の一部の相補的塩基配列を付加した、請求項 1に記 載の複合体。
[7] ァプタマ一をァプタマ一のループ（一本鎖部分）の任意のサイトで切断して分割し た、請求項 1に記載の複合体。
[8] 請求項 1から 7のいずれかに記載のアブタマ一'プローブ複合体を有効成分として 含むことを特徴とする標的分子の検出試薬。
[9] 請求項 8に記載の検出試薬と、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測定 するための試薬を組み合わせたことを特徴とする標的分子検出試薬キット。
[10] 被検試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、請求項 8に記載のァプタ マー'プローブ複合体を有効成分とする検出試薬と被検試料とを接触させ、指示タン ノ^質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出す ることを特徴とする標的分子の検出方法。 指示タンパク質が、酵素であり、指示タンパク質の酵素活性の変化を分光学的手法 又は電気化学的手法により測定する、請求項 10に記載の方法。
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