JP2016539639A - キッシング複合体を形成することができる核酸を含むキットオブパーツ及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１と少なくとも１つの核酸分子ＮＡ２を含むキットオブパーツであって、核酸分子ＮＡ１及びＮＡ２がキッシング複合体の形成を介して二本鎖を形成することができるキットオブパーツに関する。本発明はまた、溶液中の関心対象のターゲット分子を検出するためだけでなく、関心対象のアプタマーを選択するための、そのようなキットオブパーツの使用も記載する。

Description

発明の分野
本発明は、キッシング複合体を形成することができる核酸を含むキットオブパーツ及びその使用に関する。

発明の背景
アプタマーは、他の分子に結合するそれらの能力に基づいてランダムプールから選択されたＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーである（Ellington et al (1990) Nature 346 (6287): 818, Robertson and Joyce (1990) Nature 344 (6265): 467, Tuerk and Gold (1990) Science 249 (4968): 505）。現在までに、多くの異なる種類のターゲット：低分子有機化合物、タンパク質、核酸及び複合スキャフォールド（生細胞など）に対して、アプタマーが選択されている（Dausse et al. (2009) Curr. Opin. Pharmacol 9(5): 602, Hall et al. (2009) Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 24, Unit 24 (3)）。これらの分子は、結合特性、認識の特異性、並びに医学及び科学技術における潜在的使用に関して抗体に匹敵する。アプタマーは、一般に、試験管内選択法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）（Gold et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1): 89）によって得られるが、増幅工程を伴わない選択（非ＳＥＬＥＸ）も記載されている（Berezovski M et al. (2006) J Am Chem Soc. 2006 Feb 8;128(5):1410-1, Javaherian et al. (2009) Nucleic Acids Res 37 (8): e62）。

ＲＮＡヘアピンに対するＲＮＡ候補の選択は、そのループがターゲットヘアピンのループと相補的である（したがって、ループ−ループ相互作用を生じる）ヘアピンアプタマーを導く。そのようないわゆるキッシング複合体の安定性は、ループ−ループへリックスのワトソンクリック塩基対に由来するが、ループ−ループモジュールと各ヘアピンパートナーの二本鎖ステムの間の接合部におけるスタッキング相互作用にも由来する。実際に、６塩基対ループ−ループへリックスを生じる、ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化応答（Trans-Activating Responsive）（ＴＡＲ）ＲＮＡ不完全ステムループエレメントのヘアピンアプタマーへの結合は、同じ６塩基対二本鎖を生じる、ＴＡＲとアンチセンスオリゴマー間の複合体の融解温度よりも２０℃高い融解温度によって特徴付けられた。しかしながら、その複合体の融解温度よりも２０℃高い融解温度について折り畳み構造と直線構造とを区別するヘアピンの潜在性はまだ活用されていない。

発明の概要
本発明は、少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１と少なくとも１つの核酸分子ＮＡ２を含むキットオブパーツであって、核酸分子ＮＡ１及びＮＡ２がキッシング複合体の形成を介して二本鎖を形成することができるキットオブパーツに関する。本発明はまた、溶液中の関心対象のターゲット分子を検出するためだけでなく、関心対象のアプタマーを選択するための、そのようなキットオブパーツの使用も記載する。

発明の詳細な説明
キットオブパーツ：
本発明は、少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１と少なくとも１つの核酸分子ＮＡ２を含むキットオブパーツであって：
ａ）第一の核酸分子ＮＡ１が、ＮＳ１−ＮＳＫ１−ＮＳ２のヌクレオチド酸配列を含み、ここで
−ＮＳ１及びＮＳ２が、少なくとも１ヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドからなり、そしてＮＳ１及びＮＳ２が相補的配列を有し；
−ＮＳＫ１が、少なくとも２個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有し、
ｂ）第二の核酸分子ＮＡ２が、ＮＳ３−ＮＳＫ２−ＮＳ４のヌクレオチド配列を含み、ここで：
−ＮＳ３及びＮＳ４が、少なくとも１ヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドからなり、そしてＮＳ３及びＮＳ４が相補的配列を有し；
−ＮＳＫ２が、少なくとも２個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有し、
ｃ）核酸分子（ＮＡ１及びＮＡ２）が共に、適切な条件で、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をぞれぞれ含む少なくとも１つのヘアピンループを形成することができ、そして
ｄ）核酸分子ＮＡ１及びＮＡ２が、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含むヘアピンループ間のキッシング複合体の形成によって二本鎖を形成することができる、キットオブパーツに関する。

本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、限定されないが、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。ヌクレオシドリン酸は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオチド三リン酸であり得る。ヌクレオシドリン酸中の糖部分は、リボースなどの五炭糖であり得、そしてリン酸エステル化部位は、ヌクレオシドの五炭糖のＣ−５位に連結されたヒドロキシル基に対応し得る。ヌクレオチドは、限定されないが、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり得る。ヌクレオチドは、表Ａに記載されるように、アルファベット文字（文字表記）を使用して表され得る。例えば、Ａはアデノシン（すなわち、ヌクレオ塩基アデニンを含有するヌクレオチド）を表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアノシンを表し、そしてＴはチミジンを表す。ＷはＡ又はＴ／Ｕのいずれかを表し、そしてＳはＧ又はＣのいずれかを表す。Ｎは、ランダムヌクレオチドを表す（すなわち、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕのいずれかであり得る）。本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチド類似体」は、天然に存在するヌクレオチドに構造的に類似する修飾化合物を指す。ヌクレオチド類似体は、変化したホスホロチオアート骨格、糖部分、ヌクレオ塩基又はそれらの組み合わせを有し得る。一般に、変化したヌクレオ塩基を有するヌクレオチド類似体は、とりわけ、異なる塩基対合及び塩基スタッキング特性を付与する。変化したリン酸−糖骨格（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡなど）を有するヌクレオチド類似体は、しばしば、とりわけ、二次構造形成などの鎖の特性を改変する。本出願においては、時に、用語「ヌクレオチド類似体」、「ヌクレオチド類似体塩基」、「修飾ヌクレオチド塩基」又は「修飾塩基」は、互換的に使用され得る。

本明細書において使用される場合、用語「ヘアピンループ」は、リボ核酸（ＲＮＡ）二次構造の１つの特徴を指すことを意味する。ヘアピンループは、ＲＮＡがそれ自体でフォールドバックする場合に生じる。二本鎖ステムに沿った塩基対合は、完全に相補的であるか又はミスマッチを含有するかのいずれかであり得る。

本明細書において使用される場合、用語「キッシング複合体」は、ＲＮＡ三次接触の基本形式である、２つのヘアピンの頂点ループ中の相補的配列間の塩基対合を指すことを意味する（Lee et al., Structure 6:993-1005.1998）。この複合体は、ヘアピンループの対合を容易にし、２つの核酸分子が二本鎖を形成することを可能にする。分子動力学、液晶ＮＭＲ分光学及びＸ線結晶学は、キッシング複合体の三次元構造が、ｉ）分子間ループ−ループへリックスを介した１つのステムから他のステムへの擬似連続スタッキング、ｉｉ）安定性に不可欠であると示されたマグネシウムイオンに対する結合部位を構成する可能性が高い、ループ−ループへリックスの主溝をフランキングする２つのリン酸クラスター、ｉｉｉ）スタッキング相互作用及び骨格間Ｈ結合ネットワークなどの非正規相互作用によって特徴付けられることを示した。本発明によれば、キッシング複合体は、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含むヘアピンループの対の間で形成される。

本明細書において使用される場合、表現「適切な条件」は、上に定義したようなキッシング複合体の形成を促す任意の条件を指す。特に、適切な条件は、核酸ＮＡ１及びＮＡ２が正確に折り畳まれる（すなわち、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含む配列を含むヘアピンループが正確に形成される）条件を指す。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、ヘアピン構造中に折り畳まれた第一の核酸分子ＮＡ１を含み、ここで、ＮＳＫ１は、ヘアピン構造中に折り畳まれた第二の酸核酸分子ＮＡ２のループ中に存在する第二の核酸配列ＮＳＫ２と相互作用することができる配列ループによって表される。

いくつかの実施態様において、ＮＫＳ１は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有する。

いくつかの実施態様において、ＮＫＳ２は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有する。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＹＲＹＲ、ＲＹＲＹ、ＹＹＲＹ、ＲＹＲＲ、ＹＹＹＲ、ＹＲＹＹ、ＲＹＹＲ、ＹＲＲＹ、ＹＲＲＲ、ＲＹＹＹ、ＲＲＹＲ、ＲＲＹＹ、ＲＲＲＲ、ＲＲＲＹ、ＹＹＹＹ、ＹＹＲＲからなる群より選択される配列を有する）、及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＫＳ１とキッシング複合体を形成することができる）を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、Ｋ_ｎによって表される）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、Ｋ_ｎ’によって表される）を含み、ここで、Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’は、表Ｂに記述されるように選択される（Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’は、同一であるか又は異なる）。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、Ｋ_ｎによって表される）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、Ｋ_ｎ’によって表される）を含み、ここで、Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’は、表Ｃ１に記述されるように選択される（Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’は、同一であるか又は異なる）。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＣＣＮＹからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＲＮＧＧからなる核酸配列を含む）を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含む）を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含む）を含み、ここで、配列ＮＣＣＮＹＮ及び配列ＮＲＮＧＧＮは、それぞれ、表Ｃ２に記述されるように選択される。

いくつかの実施態様において、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３又はＮＳ４は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、ＮＳ１は、ＵＧＣＵＣＧによって表され、そしてＮＳ２は、ＣＧＡＧＣＡによって表される。

いくつかの実施態様において、ＮＳ３は、ＡＣＧＡＧＣによって表され、そしてＮＳ４は、ＧＣＵＣＧＵによって表される。

いくつかの実施態様において、核酸のループは、特に実施例に提供されるような、Ｄ２１ＤＮＡループを含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、ＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＣＧＣＵＣＧＵ（KG51）によって示される核酸配列を含む第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列を含む第二の核酸分子を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、ＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡによって示される核酸配列を含む第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列を含む第二の核酸分子を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、ＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡによって示される核酸配列からなる第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列からなる第二の核酸分子を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、ＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＣによって示される核酸配列からなる第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列からなる第二の核酸分子を含む。

いくつかの実施態様において、少なくとも１つの核酸分子は、アプタマー、すなわち、ターゲット分子に対して特異性及び親和性を示す核酸分子であり、それによって、このアプタマーのＲＮＡループ部分は、第二の核酸ヘアピンとキッシング複合体を形成することができる任意の核酸配列であり得る。

いくつかの実施態様において、ＮＳＫ１及び／又はＮＳＫ２配列（すなわち、分子のループを形成する配列）は、ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列である。

本明細書において使用される場合、「特異性」は、ターゲット分子と任意の他の分子を合理的で固有の方法で区別する核酸分子の能力を指す。

核酸分子のそのターゲット分子に対する「親和性」は、その２つの間の複合体の安定性に対応し、平衡解離定数（ＫＤ）として表現され得る。親和性を測定するために使用される技術は、当業者に周知である。これらは、例えば、表面プラズモン共鳴であり得る。親和性は、核酸分子及びターゲット分子の性質に依存する。当業者は、試験される核酸分子及びターゲット分子に応じて所望の条件を決定することができる。より正確に言えば、当業者は、所望のアプタマーを得るための十分な親和性レベルを定義することができる。

特に、アプタマーは、種々の有機及び無機物質又は分子をターゲッティングするために使用され得る。典型的には、アプタマーは、核酸分子、脂質、微生物、ウイルス、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、巨大分子、有機小分子などの任意のタイプのターゲットに特異的である。

いくつかの実施態様において、アプタマーは、有機小分子に特異的である。用語「有機小分子」は、医薬において一般に使用される有機分子に相当するサイズの分子を指す。この用語は、生体巨大分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除く。好ましい有機小分子は、最大約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａのサイズの範囲である。

いくつかの実施態様において、アプタマーは、少なくとも１つの芳香族環基を含有する有機小分子に特異的である。本明細書において使用される場合、用語「芳香族環基」は、電子が非局在化又は共鳴された基を指し得、例は、アリール基、ヘテロアリール基などを含み得る。

いくつかの実施態様において、有機小分子に結合するアプタマーは、有機小分子と相互作用することで立体構造変化を受け、それによってキッシング複合体を形成することができるヘアピンループの形成を可能にする。したがって、有機小分子の非存在下では、アプタマーは、キッシング複合体の形成を介してヘテロ二量体を形成することができないが、有機小分子の存在下では、アプタマーは立体構造変化を受け入れ、それによってキッシング複合体の形成を介してヘテロ二量体を形成することができる。

いくつかの実施態様において、アプタマーは、ターゲット分子に対して産生された以前から公知のアプタマー（すなわち、一次アプタマー）から誘導される。本明細書において使用される場合、用語「誘導される」は、一次アプタマーが、キッシング複合体を形成することができる本明細書に記載されるような配列を含むように改変されていることを意味する。典型的には、以前の一次アプタマーは、以前の公知のアプタマーのヘアピンループの配列（例えば、以前から公知のアプタマーの頂点部分を形成する）を、キッシング複合体を形成することができる本明細書に記載されるような配列で置換することによって、キットオブパーツの二次アプタマーに変換される。実施例２は、一次アプタマーが本発明に係る二次アプタマーに変換される１つの例を記載する。

いくつかの実施態様において、本発明のアプタマーは、好ましくは、基礎を成す合成コンビナトリアルライブラリーからＳＥＬＥＸ法によって選択される合成核酸分子である。実際に、当業者は、公知のＳＥＬＥＸ法を、通常の条件下及び好適な親和性で、すなわち、強い親和性を有する核酸分子（出発混合物中の最も強い親和性を有するもの）を含有する候補濃縮混合物を得るために実施することができる。したがって、ＳＥＬＥＸ法は、全てがキッシング複合体を形成することができる本明細書に記載されるような配列を含有しかつターゲット分子に結合する核酸候補の選択とそのような選択された核酸の増幅との組み合わせを包含する。選択／増幅工程の反復サイクルは、膨大な数の核酸を含有するプールからのターゲットに最も強く結合する核酸の選択を可能にする。例えば、ＳＥＬＥＸ法（本明細書で以降、ＳＥＬＥＸと呼ぶ）は、１９９０年６月１１日に出願された表題「Systematic Evolution of Ligands By Exponential Enrichment」の米国出願第07/536,428号（現在は放棄されている）に最初に記載された。表題「Nucleic Acid Ligands」の米国特許第5,475,096号及び表題「Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands」の米国特許第5,270,163号も、基本的なＳＥＬＥＸプロセスを開示している。

本発明に係る方法において使用されるようなＳＥＬＥＸ型プロセスは、例えば、以下の一連の工程によって定義され得る：
ｉ）全てがキッシング複合体を形成することができる本明細書に記載されるような配列を含有する候補核酸の混合物をターゲット分子と接触させる工程；候補混合物と比較してターゲット分子に最も強い親和性を有する核酸が候補核酸混合物の残りから分割され得る。好ましくは、混合物を、選択されたターゲット分子と、それらの間で結合が起こるような好適な条件下で接触させる。これらの状況下で、ターゲット分子とターゲット分子に最も強い親和性を有する核酸との間の複合体が形成され得る。

ｉｉ）ターゲット分子に最も強い親和性を有する核酸を候補混合物の残りから分割する工程。この工程では、ターゲット分子に最も強い親和性を有する核酸が、ターゲット分子により小さい親和性を有する核酸から分割される。

ｉｉｉ）ターゲット分子に最も強い親和性を有する核酸を増幅して、核酸の候補濃縮混合物を生成する工程。この工程では、分割の間にターゲット分子に比較的高い親和性を有するとして選択された核酸が増幅され、ターゲットに比較的高い親和性を有する核酸が濃縮された新たな候補混合物が生じる。

いくつかの実施態様において、上の分割工程及び増幅工程を繰り返す（サイクルする）ことができ、それによって、新たに形成された候補混合物が数種の固有の配列を含有し、ターゲットに対する核酸混合物の平均親和性度が増加する。

「分割する」は、ターゲット分子に結合された核酸候補（本明細書において候補−ターゲット複合体として同定される）がターゲット分子に結合していない核酸から分離され得る任意のプロセスを意味する。分割することは、当技術分野において公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、候補−ターゲット複合体はニトロセルロースフィルターに結合され得るが、未結合の候補は結合されない。候補−ターゲット複合体を特異的に保持するカラムを分割するために使用することができる。また、液体−液体分割を濾過ゲルシフト法、親和性クロマトグラフィー法及び密度勾配遠心分離法と同様に使用することができる。代替的に、分割することは、ターゲット分子の磁気ビーズ上への付着、続く、核酸のターゲット分子への結合及びその後の磁気ビーズ／ターゲット分子／核酸粒子の分離によって実施され得る。磁気ビーズの自動分別のいくつかの異なる方法が当技術分野から公知である。第一の方法は、磁気デバイス又は磁化可能デバイスを、磁気ビーズを含有する媒体に挿入し、磁気ビーズを磁気デバイス又は磁化可能デバイスに結合させ、そして磁気デバイス又は磁化可能デバイスを取り出すことである。第二の方法では、共にピペットチップ中に吸引された媒体と磁気粒子の分離は、ピペットチップに空間的に近接させた磁気デバイス又は磁化可能デバイスによって容易になる。分割方法の選択は、ターゲット及び候補−ターゲット複合体の特性に依存し、当業者に公知の原理に従って行われ得る。

ターゲット分子に結合した候補核酸を未結合のままの核酸から分離した後、分割する工程中の次の工程は、それらをターゲット分子から分離することである。それゆえ、候補核酸を、水中にてその種の分離を可能にするのに十分な温度で加熱することによって分離することができる。代替的に、分離は、変性剤又は分解剤（例えば、酵素）の添加によって達成され得る。結合した候補はまた、遊離ターゲットとの競合によって収集され得る。例えば、候補核酸は、水中にて７５℃で１分間加熱することによって分離され得る。それゆえ、ターゲット分子に対して増加した親和性を有する核酸の混合物が得られる。

分割した後、高い親和性を有する候補核酸が増幅され得る。本明細書において意図するように、「増幅する」は、分子又は分子のクラスのコピーの量又は数を増加させる、任意のプロセス又はプロセス工程の組み合わせを意味する。

増幅工程は、当業者に周知の種々の方法によって実施され得る。ＤＮＡ分子を増幅するための方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり得る。その基本形態では、ＰＣＲ増幅は、一本鎖ＤＮＡの３’及び５’末端に相補的な特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した、所望の一本鎖ＤＮＡ（又はＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の複製の繰り返しサイクル（ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長と、それに続くＤＮＡ変性を達成する）を包含する。１つのプライマーからの伸長によって生成された産物は、他のプライマーからの伸長のための鋳型として役立つ。ＰＣＲ法の記載は、Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354 又はSaiki et al. (1986) Nature 324:163-166 に見出される。ＲＮＡ分子を増幅するための方法は、当業者から周知である。例えば、増幅は、一連の３つの反応：選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製し（逆転写酵素を使用して）、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して各ｃＤＮＡのコピー数を増加させ、そしてｃＤＮＡコピーを転写して選択されたＲＮＡと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得ることによって行われ得る。本発明によれば、候補核酸は、好ましくは、これらの核酸に共通する固定配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの援助によって増幅される。本発明によれば、増幅工程は、優先的には、分割工程の間に得られた増加した親和性を有する核酸の混合物に対して行われ、核酸の候補濃縮混合物を生成する。所望の分割を達成するために用いられる核酸に対するターゲット分子の相対濃度は、例えば、ターゲット分子の性質、結合相互作用の強度及び使用される緩衝液に依存するだろう。所望の分割結果を達成するために必要な相対濃度は、過度の実験なしに、実験的に容易に決定され得る。

分割／増幅手順のサイクリング（繰り返し）は、選択された目標が達成されるまで続けられ得る。例えば、サイクリングは、試験混合物中の核酸の所望の結合レベルが達成されるまで又は混合物の最小数の核酸成分が得られるまで続けられ得る。結合のさらなる改善が達成されなくなるまでサイクリングを続けることが望ましいだろう。行われるべきサイクル数は、好ましくは１００以下、より好ましくは１０以下である。本発明を実施する１つの方法によれば、サイクル数は７である。本発明を実施する別の方法によれば、サイクル数は７未満であり、優先的には、６、５、４、３、２又は１サイクルに等しい。

したがって、いくつかの実施態様において、ＳＥＬＥＸのためのコンビナトリアルランダムライブラリーは、内部可変領域（例えば、１０〜６０個のヌクレオチド）、キッシング複合体を形成することができる本明細書に記載されるような配列を含む領域を有する核酸分子からなり、ここで、２つの領域は、その５’及び３’末端がプライマー領域でフランキングされている。プライマー領域は、ＳＥＬＥＸの増幅工程のためのプライマー結合部位として役立つ。

いくつかの実施態様において、ＳＥＬＥＸのためのコンビナトリアルランダムライブラリーは、少なくとも１つの可変領域（例えば、６〜６０個のヌクレオチド）によってフランキングされたキッシング複合体を形成することができる上述したような配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を含む内部領域を有する核酸分子からなる。

特定の実施態様において、ＮＳＫｎは、ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列である。

したがって、本発明のさらなる態様は、一般式５’−Ｐ１−Ｖ−ＮＳＫ_ｎ−Ｐ２−３’又は５’−Ｐ１−ＮＳＫ_ｎ−Ｖ−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖは、少なくとも２つのヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫ_ｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子を含むライブラリーに関する。

プライマー領域は、ＳＥＬＥＸの増幅工程のためのプライマー結合部位として役立つ。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖは、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；又は３０個のヌクレオチドを含む。

したがって、本発明のさらなる態様は、一般式５’−Ｐ１−Ｖ１−ＮＳＫ_ｎ−Ｖ２−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも５個のヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫ_ｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子を含むライブラリーに関する。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２の各々は、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２は、同じ長さ（すなわち、同数のヌクレオチド）を有するか又は有さない。

したがって、本発明のさらなる態様は、一般式５’Ｐ１−Ｘｎ−Ｖ１−ＮＳＫｎ−Ｖ２−Ｙｎ−Ｐ２（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも５個のヌクレオチドの可変領域を表し、Ｘｎ及びＹｎは、１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表し、かつＸｎ及びＹｎは、ハイブリダイズすることができ、そしてＮＳＫ_ｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子を含むライブラリーに関する。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２は、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２は、同じ長さ（すなわち、同数のヌクレオチド）を有するか又は有さない。

いくつかの実施態様において、Ｘｎは、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す。

いくつかの実施態様において、Ｙｎは、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、化学修飾された少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１及び／又はＮＡ２を含む。

例えば、核酸分子の使用において直面する１つの潜在的な問題は、オリゴヌクレオチドがそのホスホジエステル形態では、所望の効果が現れる前に、生物学的流体（例えば、体液）中で細胞内及び細胞外酵素（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなど）によって素早く分解され得ることである。

そのような修飾の例は、糖及び／又はリン酸及び／又は塩基位置での化学的置換を含む。例えば、米国特許第5,660,985号は、リボースの２’位、ピリミジンの５位及びプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している。米国特許第5,756,703号は、種々の２’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載しており、そして米国特許第5,580,737号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ．ｓｕｂ．２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−ＯＭｅ置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高特異的核酸リガンドを記載している。核酸の２’化学修飾のための技術はまた、米国特許出願第US 2005/0037394号及び第US 2006/0264369号に記載されている。本発明において意図される核酸分子の修飾は、限定されないが、塩基又は核酸分子全体に対して、追加の電荷、分極性、疎水性、感光性、水素結合、静電相互作用、スタッキング相互作用及び流動性を組み込む他の化学基を提供する修飾を含む。ヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌクレオチド集団を生成する修飾はまた、１つ以上の置換ヌクレオチド間連結、変化した糖、変化した塩基又はそれらの組み合わせを含むことができる。そのような修飾は、限定されないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンによる置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルによる置換、骨格修飾、ホスホロチオアート又はアルキルホスファート修飾、メチル化、伸長された芳香族環の使用及び非天然塩基対合の組み合わせ（イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなど）を含む。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾を含むことができる。

いくつかの実施態様において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ若しくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）又は３’−アミン（−−ＮＨ−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−）（式中、各Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ又は置換若しくは非置換アルキルである）に置き換わっている、核酸分子（ＮＡ１及び／又はＮＡ２）が提供される。連結基は、−−Ｏ−−、−−Ｎ−−又は−−Ｓ−−連結を介して隣接ヌクレオチドに接続され得る。オリゴヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。本明細書において使用される場合、ホスホロチオアートという用語は、ホスホジエステル結合中の１つ以上の非架橋酸素原子が１つ以上の硫黄原子に置き換わっていることを包含する。

いくつかの実施態様において、核酸分子（ＮＡ１及び／又はＮＡ２）は、修飾糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上が、ハロゲン、脂肪族基で置き換わっているか、又はエーテル若しくはアミンとして官能化されている。１つの実施態様において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル又はハロ基のいずれかによって置換されている。２’修飾糖の合成の方法は、例えば、Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); 及び Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145 (1973) に記載されている。閉環された糖環（ＬＮＡ）などの他の修飾は、当業者に公知である。

高耐性アプタマーを得るための別の方法は、Ｌアプタマー（左旋性の場合Ｌ、天然エナンチオマーＤの鏡像）の使用である。この戦略は、ターゲットのアデノシン及びアルギニンに対して１９９６年にKlussmann及びNolteによって開発された。

本発明の核酸分子は、当業者にとって日常的な方法によって組換えにより又は合成により生成され得る。例えば、合成ＲＮＡ分子は、米国特許出願公報第20020161219号、又は米国特許第6,469,158号、第5,466,586号、第5,281,781号若しくは第6,787,305号に記載されているように製造され得る。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、標識された少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１及び／又はＮＡ２を含む。用語「標識」は、本明細書において広い意味で使用され、直接的に又はシグナル生成系の１つ以上の追加メンバーとの相互作用を介してのいずれかで、検出可能なシグナルを提供することができる作用物質を指す。本発明によれば、標識は、視覚的、光学的、フォトニック、電子的、音響的、光音響的、質量により、電気化学的、電気光学的、分光法、酵素的、又はそうでなければ化学的、生化学的、流体力学的、電気的若しくは物理的に検出可能である。標識は、例えば、テールドレポーター（tailed reporter）、マーカー又はアダプター分子であり得る。したがって、核酸分子は、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素からなる群より選択される検出可能な分子で標識される。標識の例は、限定されないが、以下の放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、ルミノールなどの発光標識；酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ（acetylcholinestease)）、ビオチニル基（標識されたアビジン、例えば、光学法又は熱量測定法によって検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジンによって検出され得る）、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含む。

いくつかの実施態様において、本発明に係るキットオブパーツは、特にマイクロアレイを形成するために固体支持体に固定化された、少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１及び／又はＮＡ２を含む。

いくつかの実施態様において、マイクロアレイは、約１００スポット／cm²を超える、好ましくは約１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００スポット／cm²を超える、さらに好ましくは約９０００、１００００、１１０００、１２０００又は１３０００スポット／cm²を超える密度で高密度であり、これは、支持表面上に核酸分子（ＮＡ１又はＮＡ２）を接着させることによって形成される。

いくつかの実施態様において、マイクロアレイは、比較的少数の核酸分子（ＮＡ１又はＮＡ２）（例えば、１０〜５０個）を含む。

基板又は支持体の特性は、意図する用途に応じて変化し得るが、基板の形状、材料及び表面修飾が考慮されなければならない。基板は、実質的にプラナー又は平坦な少なくとも１つの表面を有することが好ましいが、くぼみ、突起、段部、隆起、段丘なども含み得、任意の幾何学的形状（例えば、円柱状、円錐状、球状、凹面、凸面、糸状又はこれらのいずれかの組み合わせ）を有し得る。例えば、固体支持体は、例えば、シート、ストリップ、膜、フィルム、ゲル、ビーズ、マイクロ粒子及びナノ粒子であり得る。好適な基板材料は、限定されないが、ガラス、セラミック、プラスチック、金属、合金、炭素、紙、アガロース、シリカ、石英、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミド及びゼラチン、並びに他のポリマー支持体、他の固体材料支持体、又はフレキシブル膜支持体を含む。基板として使用され得るポリマーは、限定されないが、ポリスチレン；ポリ（テトラ）フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）；ポリビニリデンジフルオリド；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリラート；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）；ポリプロピレン；ポリエチレン；ポリヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；及び種々のブロックコポリマーを含む。基板はまた、多層構成の材料（透水性であるか否かにかかわらない）の組み合わせを含むことができる。

アッセイ核酸分子を固体支持体に固定化するための多くの確立された方法がある。これらは、非限定的に、ビオチン及びストレプトアビジンのコンジュゲーションを介して固定化された核酸分子を含む。そのようなビオチニル化されたアッセイ成分は、当技術分野において公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェル中に固定化され得る。ある実施態様において、固定化されたアッセイ成分を有する表面があらかじめ調製され、保存され得る。

サンプル中のターゲット分子を検出するための方法：
本発明のさらなる態様は、サンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出するための方法であって、ｉ）ターゲット分子に特異的であるアプタマーである核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２を含む本発明のキットオブパーツを提供する工程、ｉｉ）サンプルをキットオブパーツの核酸分子と接触させる工程、及びｉｉｉ）２つの核酸ＮＡ１とＮＡ２との間に形成される二本鎖の形成を検出する工程からなる工程を含む方法に関する。

いくつかの実施態様において、複数のターゲット分子がサンプル中で検出される。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０又は１００個のターゲット分子がサンプル中で検出される。したがって、本発明のさらなる態様はまた、サンプル中の複数のターゲット分子を検出するための方法であって、ｉ）ターゲット分子に特異的なアプタマーである核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２を含む本発明の複数のキットオブパーツを提供する工程、ｉｉ）サンプルをキットオブパーツの核酸分子と接触させる工程、及びｉｉｉ）２つの核酸によって形成される二本鎖の形成を検出する工程からなる工程を含む方法に関する。

いくつかの実施態様において、ターゲット分子は、有機小分子である。

本明細書において使用される場合、「サンプル」は、ターゲット分子を含有しそうな任意のサンプルを指す。例えば、サンプルは、さらに、個体から単離された任意の生物学的物質、例えば、生物学的組織及び流体（血液、皮膚、血漿、血清、リンパ液、尿、脳脊髄液、涙液、スミア…を含む）であり得る。サンプルはまた、水のサンプル、特に飲料水、地下水、表流水又は廃水サンプルであり得る。サンプルはまた、環境由来物質から調製されたサンプル、臨床検体又は食品サンプルであり得る。

いくつかの実施態様において、サンプルは、かなりの量のマグネシウムを含む（すなわち、キッシング複合体は、マグネシウム感受性である）。

いくつかの実施態様において、ターゲット分子に特異的なアプタマーである核酸分子は、それがターゲット分子に結合する場合にのみ、キットの他の核酸分子との複合体を形成することができる（すなわち、ターゲット分子に結合するアプタマーは、ターゲット分子と相互作用することで立体構造変化を受け、それによってキッシング複合体を形成することができるヘアピンループの形成を可能にする）。

核酸分子ＮＡ１と核酸分子ＮＡ２との間で形成された複合体（キッシング複合体の形成を介して）の検出は、当技術分野において周知の任意の方法によって実施され得る。

いくつかの実施態様において、検出は、液相中、溶質としての核酸分子を用いて実行され得る。そのようなアッセイでは、複合体（キッシング複合体の形成を介した）は、多数の標準的な技術（限定されないが、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過…を含む）のいずれかによって、個々の未結合成分から分離される。例えば、複合体分子を未結合の分子から分離するために標準的なクロマトグラフ技術を利用することもできる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいてかつカラム形式の適切なゲル濾過樹脂の利用を介して分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体が比較的小さい未結合成分から分離され得る。同様に、未結合成分と比べた複合体の比較的異なる電荷特性を活用することで、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用を介して、複合体が未結合成分から区別され得る。そのような樹脂及びクロマトグラフ技術は、当業者に周知である（例えば、Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D. S., and Tweed, S. A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct. 10;699 (1-2):499-525 を参照のこと）。また、ゲル又はキャピラリー電気泳動を用いて、複合体を未結合成分から分離することもできる（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999 を参照のこと）。この技術では、核酸分子の複合体は、例えば、サイズ又は電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセスの間の結合相互作用を維持するために、典型的には、非変性ゲルマトリックス材料、及び還元剤の非存在下での条件が好ましい。

いくつかの実施態様において、ターゲット分子に特異的なアプタマーではない核酸分子が上述したような固体支持体上に固定化される。実際に、固体支持体上に固定化されたら、核酸分子は、ターゲット分子に特異的なアプタマーである核酸分子に結合することができるバイオセンサー素子として使用され得る。バイオセンサーは、固体表面上に生物学的要素（すなわち、核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２）を統合する分析デバイスであり、被検物質（すなわち、ターゲット分子）とシグナル伝達物質との可逆的な生物特異的相互作用を可能にする。バイオセンサーは、高感度検出システムを達成する高い分析特異性と現代の電子工学の処理能力を併せ持つ。一般に、これらのバイオセンサーは、２つの構成成分：高特異的認識要素と分子の認識事象を定量可能シグナルに変換するトランスデューサーからなる。シグナル変換は、蛍光分析、干渉分析、重量分析を含む多くの方法によって達成され得る。

上で述べたアプローチを用いてアッセイを実行するために、サンプルを、次に、ターゲット分子に特異的なアプタマーではない核酸分子が固定化されたビーズ又はマイクロアレイと接触させる。次いで、キットの固定化されていない核酸分子（すなわち、アプタマー）が加えられる。反応が完了（キッシング複合体の形成を介した、核酸分子間での二本鎖の形成）した後、形成された任意の複合体がマイクロアレイ上に固定化されたままになるような条件下で、未結合成分（無関係なターゲット分子、それらのターゲット分子に結合しなかった核酸分子…）が取り除かれ得る（例えば、洗浄によって）。マイクロアレイに固着された複合体の検出は、最終的に、当技術分野において周知の及び本明細書に記載される多数の方法で達成され得る。

いくつかの実施態様において、マイクロアレイ（micorarray）上に固定化されていない核酸分子（すなわち、アプタマー）は、アッセイの検出及び読み取りの目的で、本明細書で後述する及び当業者に周知である検出可能標識で直接的又は間接的に標識され得る。

例えば、蛍光エネルギー移動又は蛍光異方性の技術（実施例を参照のこと）を利用することによって、いずれかの成分（例えば、アプタマー）のさらなる操作又は標識なしに、複合体形成を直接検出することも可能である（例えば、Lakowicz et al., 米国特許第5,631,169号; Stavrianopoulos, et al., 米国特許第4,868,103号を参照のこと）。第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光で励起することによって、その放射された蛍光エネルギーが第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識に移動し、次いで吸収エネルギーに起因して蛍光を発することができるように選択される。「アクセプター」分子の標識が「ドナー」の標識と区別され得るように、異なる波長の光を発する標識が選択される。標識間のエネルギー移動効率が分子を分離する距離に関係するため、分子間の空間的相関関係が評価され得る。分子間で結合が起こる状況で、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光発光が最大であるはずである。ＦＲＥＴ結合事象は、当技術分野において周知の標準的な蛍光検出手段を介して（例えば、蛍光光度計を使用して）簡便に測定され得る。

いくつかの実施態様において、複合体形成の検出は、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）（例えば、Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 及び Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 を参照のこと）などの技術を利用することによって達成され得る。本明細書において使用される場合、「ＢＩＡ」又は「表面プラズモン共鳴」は、相互作用物のいずれも標識することなく、生物特異的相互作用をリアルタイムで研究するための技術である（例えば、BIAcore）。結合表面での質量変化（結合事象の指標である）は、表面近くの光の屈折率の変動（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）を生じ、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る検出可能シグナルを生じる。

いくつかの実施態様において、検出は、Edwards 及び Leatherbarrow（Edwards and Leatherbarrow, 1997, Analytical Biochemistry, 246 : 1-6）によって又はまたSzabo等（Szabo et al., 1995, Curr. Opinion Struct. Biol., 5(5) : 699-705）によって記載されるような光学バイオセンサーを用いて達成され得る。この技術は、標識された分子を必要とすることなく、リアルタイムでの分子間相互作用の検出を可能にする。この技術は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づくものである。この目的のために、被試験サンプルを含有しない基板の表面領域の側に光学ビームを向け、これを前記表面によって反射させる。ＳＰＲ現象は、角度と波長の特定の組み合わせに伴って反射光の強度の減少を引き起こす。核酸ＮＡ１及びＮＡ２の複合体の形成は、基板表面での屈折率の変化を引き起こし、その変化はＳＰＲシグナルの変化として検出される。この技術は、本明細書の実施例において十分に説明される。

いくつかの実施態様において、検出は、圧電トランスデューサーを用いて達成され得、これは、例えば、複合体が形成されたときの質量変化を検出するＱＣＭセンサー（水晶マイクロバランス）である。水晶振動子の表面での質量変化は、共振周波数の変化を生じ、これを定量化することができる。

いくつかの実施態様において、検出は、キャピラリー電気泳動によって達成され得、これは、複合体が形成されたときの質量変化を電気泳動によって検出する。

いくつかの実施態様において、検出は、アルファスクリーン技術によって達成され得、これは、複合体が形成されたときにルミネッセンス発光を可能にする。

本発明の方法は、制限されないが、食品、水及び環境の分析における使用に特に好適である。本発明の方法はまた、診断目的に特に好適である。特に、本発明の方法は、任意の媒体及び環境中の、特に、水及び他の液体（飲料及び廃水サンプルなどの）中の有機小分子の検出に特に好適である。したがって、ターゲット分子は、代謝物、薬物及び汚染物質からなる群より選択され得る。特定の実施態様において、媒体及び環境は、前記媒体又は環境を本発明の核酸分子、キットオブパーツ又はコンビナトリアルライブラリーと接触させる前に、ＲＮＡｓｅ阻害剤で事前に処理される。

溶液中のＳＥＬＥＸ：
本発明はまた、以下の工程を含む、ターゲット分子に指向するアプタマーを同定するための方法に関する：
ｉ）ターゲット分子を、少なくとも１つの可変領域によってフランキングされた上述したような配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を含む内部領域を有する複数の核酸分子からなる本発明に係るコンビナトリアルランダムライブラリーと接触させる工程
ｉｉ）工程ｉ）の混合物を、対応するＮＳＫ１又はＮＳＫ２を含む核酸と接触させる工程
ｉｉｉ）ターゲット分子に親和性を有する核酸をライブラリーの残りから分割する工程であって、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含む２つの核酸間で形成された複合体の形成の検出がターゲット分子に親和性を有する核酸の存在を示す工程。

いくつかの実施態様において、本方法は、ターゲット分子に親和性を有する核酸の候補濃縮混合物を生成するための親和性を有する核酸を増幅する工程、場合により、ターゲット分子に最も強い親和性を有するアプタマーを選択するための工程ｉ）〜ｉｉｉ）を何回も繰り返す工程並びに最も強い親和性を有するアプタマーを配列決定及び生成する工程をさらに含み得る。

実際に、選択及び増幅のサイクルは、所望の目標が達成される：ターゲット分子に最も強い親和性を有するアプタマーを同定するまで繰り返される。最も一般的な場合では、選択／増幅は、サイクルの繰り返しで結合強度の顕著な改善が達成されなくなるまで続けられる。

本方法は、ターゲット分子に親和性を有するアプタマーが、それがターゲット分子に結合する場合にのみ、対応するＮＳＫ１又はＮＳＫ２を含む核酸との複合体を形成することができる（すなわち、ターゲット分子に結合するアプタマーは、ターゲット分子と相互作用することで立体構造変化を受け、それによってキッシング複合体を形成することができるヘアピンループの形成を可能にする）という原理に依存する。

本発明によれば、ターゲット分子は、ＳＥＬＥＸ（商標）法について古典的に記載されているような固体支持体上に固定化されず、流体サンプル中に遊離する。典型的には、流体サンプルは、水溶液である。

本明細書において使用される場合、「ライブラリー」は、核酸分子の混合物であり、ターゲット分子に潜在的に結合することができるライブラリー「メンバー」とも称される。典型的には、ライブラリーのメンバーは、多数の可能な配列バリエーションがライブラリー内で利用可能なように、配列がランダム化されている。ランダム化された領域は、本質的にはどんな長さであってもよいが、ランダム化されていない挿入物を組み込むことができる最大１００ヌクレオチドの長さが好ましい。典型的には、ランダム化された領域は、２〜６０の間又はそれ以上であろう。

ライブラリーメンバーのランダム化される部分は、多数の方法で誘導され得る。例えば、完全又は部分的な配列ランダム化は、メンバー（又はその部分）の直接化学合成によって、又はメンバー（又はその部分）が適切な酵素の使用によって調製され得る鋳型の合成によって容易に達成され得る。非限定濃度の４種全てのヌクレオチド三リン酸が存在する中でターミナルトランスフェラーゼによって触媒される末端付加は、ランダム化された配列をセグメントに付加することができる。試験核酸中の配列変動はまた、ゲノムＤＮＡ調製物又は細胞ＲＮＡ調製物などの巨大な天然核酸の部分的に消化された（又はそうでなければ開裂された）調製物のサイズ選択されたフラグメントを用いることによって達成され得る。ランダム化された配列は、好ましくは、一連のオリゴヌクレオチドライブラリー中の各ヌクレオチドの合成の間に、４種全てのヌクレオチド（好ましくは、カップリング効率の相違を可能にするため、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔを６：５：５：４の比で）の混合物を使用することによって生成される。しかしながら、上で述べたように、核酸配列は、修飾ヌクレオチドを含むことができる。そのような修飾の例は、上述したような糖及び／又はリン酸及び／又は塩基位置での化学的置換（例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位及びプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体）を含む。核酸分子の修飾はまた、限定されないが、塩基又は核酸分子全体に対して、追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用及び流動性を組み込む他の化学基を提供する修飾を含む。ヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌクレオチド集団を生成する修飾はまた、１つ以上の置換ヌクレオチド間連結、変化した糖、変化した塩基又はそれらの組み合わせを含むことができる。そのような修飾は、限定されないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオアート又はアルキルホスファート修飾、メチル化及び非天然塩基対合の組み合わせ（イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなど）を含む。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾を含むことができる。いくつかの実施態様において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ若しくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）又は３’−アミン（−−ＮＨ−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−）（式中、各Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ又は置換若しくは非置換アルキルである）に置き換わっている、核酸分子（ＮＡ１及び／又はＮＡ２）が提供される。連結基は、−−Ｏ−−、−−Ｎ−−又は−−Ｓ−−連結を介して隣接ヌクレオチドに接続され得る。オリゴヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。本明細書において使用される場合、ホスホロチオアートという用語は、ホスホジエステル結合中の１つ以上の非架橋酸素原子が１つ以上の硫黄原子に置き換わっていることを包含する。いくつかの実施態様において、核酸分子は、修飾糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上が、ハロゲン、脂肪族基で置き換わっているか、又はエーテル若しくはアミンとして官能化されている。１つの実施態様において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル又はハロ基のいずれかによって置換されている。２’修飾糖の合成の方法は、例えば、Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); 及び Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145 (1973) に記載されている。他の修飾は、当業者に公知である。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾を含むことができる。高耐性アプタマーを得るための別の方法は、天然ヌクレオチドの鏡像でありかつヌクレアーゼに耐性を示すＬヌクレオチドから構築された、人工のＬアプタマーの使用である。この戦略は、ターゲットのアデノシン及びアルギニンに対して１９９６年にKlussmann及びNolteによって開発された。本発明の核酸分子は、当業者にとって日常的な方法によって組換えにより又は合成により生成され得る。例えば、合成ＲＮＡ分子は、米国特許出願公報第20020161219号、又は米国特許第6,469,158号、第5,466,586号、第5,281,781号若しくは第6,787,305号に記載されているように製造され得る。

いくつかの実施態様において、ライブラリーは、一般式５’−Ｐ１−Ｖ−ＮＳＫｎ−Ｐ２−３’又は５’−Ｐ１−ＮＳＫｎ−Ｖ−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖは、少なくとも２つのヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子からなる。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖの各々は、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、ライブラリーは、一般式５’−Ｐ１−Ｖ１−ＮＳＫｎ−Ｖ２−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも５個のヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子からなる。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２の各々は、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、ライブラリーは、一般式５’Ｐ１−Ｘｎ−Ｖ１−ＮＳＫｎ−Ｖ２−Ｙｎ−Ｐ２（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも５個のヌクレオチドの可変領域を表し、Ｘｎ及びＹｎは、１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表し、かつＸｎ及びＹｎは、ハイブリダイズすることができ、そしてＮＳＫｎは、上述したような核酸分子ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）を有する複数の核酸分子からなる。

いくつかの実施態様において、可変領域Ｖ１及びＶ２の各々は、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、Ｘｎは、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す。

いくつかの実施態様において、Ｙｎは、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す。

いくつかの実施態様において、そのため、本発明は、相当数のライブラリーメンバー、とりわけ遅い解離反応速度を有するものについての平衡の確立に依存する。好ましくは、ライブラリー及びターゲット分子を、一緒に、ターゲット分子とライブラリーのメンバーとの相互作用を可能にするのに十分な時間、とりわけライブラリーのメンバーのターゲット分子との立体構造再配列を可能にするであろう十分な時間インキュベートする。必要な期間は、ターゲット及びライブラリーに、また選択のラウンドにもに左右されるだろう；好ましくは、例えば、選択の第一ラウンドは、約５分（又はそれ未満）〜約４８時間のインキュベーションを包含し得る。有利には、選択の第一ラウンドは、少なくとも約３０分〜約４時間、好ましくは１時間である。残りのラウンドは、完全な平衡の確立を可能にするために、少なくとも３０分〜約４時間、好ましくは１時間のインキュベーションを包含する。

いくつかの実施態様において、対応する核酸分子は、上述したような固体支持体上に固定化される。

いくつかの実施態様において、対応する核酸分子は、溶液中に遊離する。

いくつかの実施態様において、本方法は、非特異的候補及びターゲット分子ではなく固定化されたヘアピンとキッシング複合体を形成し得る候補を取り除くための、ターゲット分子の非存在下での、固定化されたヘアピン（そうでなければ、本出願において「aptakiss」とも称される）及び支持体に対するライブラリーの対抗選択からなる工程をさらに含む。

いくつかの実施態様において、本方法は、陽性候補を収集する工程をさらに含む。典型的には、キッシング複合体はマグネシウム感受性であるので、陽性候補の溶離は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて実施されるだろう。陽性候補の溶離のための古典的ＳＥＬＥＸ法において使用される任意の他の方法も実施することができる。陽性候補の特異的溶離に対して新たな方法を考慮することもできる：ｉ）固定化されたヘアピンは、ステムの底部にＤＮＡ酵素制限部位を示すＤＮＡ−ＲＮＡキメラ分子であろう。酵素的消化は、複合体（アプタマー−ターゲット−固定化されたヘアピン）の溶離を可能にし、非特異的候補の溶離を回避するであろう。ｉｉ）同様に、固定化されたヘアピンは、ステム中のＤＮＡ鎖（ＮＳ１）及びＲＮＡ相補鎖（ＮＳ２）からなるＤＮＡ−ＲＮＡキメラ分子であろう。溶離工程は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を認識するＲＮａｓｅ Ｈを用いた酵素的消化によって行われ得る。

核酸分子ＮＡ１とＮＡ２の間で形成された複合体の検出のために上述したような任意の方法（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、ＦＲＥＴ、表面プラズモン共鳴、ルミネッセンス…）が使用され得る。

典型的には、ターゲット分子は、制限されないが、上に定義したような有機又は無機小分子、炭水化物、核酸分子及び誘導体、脂質、微生物、ウイルス、アミノ酸、抗生物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、巨大分子、複合ターゲットなどであり得る。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

本研究において使用されるaptakiss及びaptaswitchの二次構造。使用される異なるオリゴヌクレオチド誘導体の配列は、表Ｓ１に提供される。赤色で示されるループ−ループ相互作用に関与するものを除いて、デオキシリボヌクレオチドは青色で、リボヌクレオチドは黒色で示される。aptakiss／adenoswitchループ中の点突然変異は、黒色に見える。 GTPswitch／aptakiss複合体のＳＰＲ解析。GTPswitch（２００mM ＫＣｌ及び１０mM ＭｇＣｌ_２を含有する１０mM Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ６．２）中２０μM）を、増加濃度（０〜１mM）のＧＴＰ（左上）又はＡＴＰ（左下）のいずれかの存在下、ビオチニル化aptakissが固定化されたチップ上に注入した。得られた最大ＳＰＲシグナルをヌクレオチド三リン酸の濃度の関数としてプロットした（右上）；結果を２つの個々の実験の平均誤差（mean±sem）として表す。対照として、ＧＴＰ（０〜１mM）の存在下のGTPswitchを、ビオチニル化aptakissmutで官能化されたチップ上に注入した（右下）。 固定化されたビオチニル化aptakissに対するadenoswitch／aptakiss複合体のＳＰＲセンサーグラム。上段：adenoswitch（１００mM ＮａＣｌ及び１０mM ＭｇＣｌ_２を含有する１０mM Tris（ｐＨ７．４）中５μM）を、増加量（０、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、４、８mM）のアデノシンの存在下で注入した。下段：増加濃度のadenoswitch（０、０．０８、０．１６、０．３１、０．６３、１．２５、２．５又は５μM）を用いた８mMアデノシンでの同じ条件下の類似の実験。 ３つのadenoswitch変異体（０．６２５μM）を８mMアデノシンの存在下で注入した（１０mM Tris、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ_２中）、固定化されたビオチニル化apatkissに対するＳＰＲセンサーグラム（上のパネル）。増加量のアデノシン（０、０．１３、０．２５、０．５、１、２、４又は８mM）の存在下のadenoswitchATGCについてのＳＰＲセンサーグラム（下のパネル）。 aptakiss-adenoswitch複合体のホモジニアス蛍光異方性アッセイ（結合緩衝液：１０mM Tris、ｐＨ７．５、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ２；反応温度：４℃）。１０nM aptakiss-TR及び１０nM adenoswitch（黒色三角、アデノシン）を使用して用量反応曲線を得た。１０nM adenoswitchTAGC（黒色菱形、アデノシン；白色四角、イノシン）又は１０nM adenoswitchTAGCmut2（白色菱形、アデノシン）。Δｒ＝ｒ−ｒ０（式中、ｒ０は、リガンドの非存在下での蛍光異方性である）。３連実験。 Ｋｘ１ヘアピン〜Ｋｘ４ヘアピンのＳＰＲ解析。 異なる複合体の融解転移。 抗アデノシン、ＡＤＯｓｗ１’、抗ＧＴＰ、ＧＴＰｓｗ２’、抗テオフィリン、ＴＨＥｓｗ４’アプタマーの配列及び構造。 固定化されたＫｘ２又はＫｘ４によるＧＴＰｓｗ２’−ＧＴＰ及びＴＨＥｓｗ４’−テオフィリン複合体のＳＰＲ解析。 ４チャネルＳＰＲチップにおけるaptaswitch−リガンド混合物のＳＰＲ解析。 ａ）ＨＩＶ−１のＲＮＡヘアピンＴＡＲに対する選択されたＤＮＡアプタマーＤＩＩ２１の頂点ループの略図。ｂ）アプタマーＤＩＩ２１のＤＮＡループを有するadenoswitch ＤＩＩ２１モデルＡ、Ｂ及びＣ、ＤＮＡＤＩＩ２１ループとアデノシンに結合するＤＮＡアプタマーの一部とを結合する種々のサイズ（３、２及び１塩基対）の３つのコネクター。 これらの３つのＤＩＩ２１Ａ、ＤＩＩ２１Ｂ及びＤＩＩ２１ＣモデルのＴＡＲに結合する能力の蛍光異方性を使用することによる比較。 「ＤＮＡ ＳＥＬＫＩＳＳ」について使用されるライブラリーの略図。ａ）変性配列は、ＤＩＩ２１ループとアデノシンアプタマー結合領域の間に位置するコネクター中にある。ｂ）変性配列は、アデノシンへの結合に関与するアプタマーの領域中に位置する。

実施例１：
概要：
キッシング複合体は、ループを介して互いに相互作用するＲＮＡステムループによって形成される。これらの複合体は、プラスミドのＤＮＡ複製の制御又はウイルスのゲノムＲＮＡの二量化などの多くの生物プロセスに関与する。さらに、ＲＮＡヘアピンは、≪インビトロ≫選択によってターゲット化されており、ＲＮＡヘアピンアプタマーは同定されている。相互作用するループがキッシング複合体を生成したことが示された。これらのループ−ループ相互作用の研究は十分に実証されてはいるが、それらの形成、特異性及び安定性を導き得るいくつかの規則があるかを調査するために、本発明者等は、キッシングする能力についてＲＮＡヘアピンの≪インビトロ≫選択を実施した。高い親和性のいくつかのループ−ループ複合体が同定されている。≪インビトロ≫選択結果の配列解析によって、本発明者等は、ループの相互作用によって形成された二重螺旋中の新しいＲＮＡモチーフを特徴付けた。これらの仕事は、ループを介して高い親和性で相互作用してキッシング複合体を形成することができるＲＮＡヘアピンの一覧を得ることを可能にした。本発明者等は、これらの核酸分子をAptakissと命名した。

材料及び方法：
オリゴヌクレオチド
不変プライマーアニーリング部位によってフランキングされた１０又は１１個のランダムヌクレオチド又はコンセンサスモチーフを含有する、選択Ｉ及びＩＩに使用されるＲＮＡランダムライブラリー：

及び種々のＲＮＡアプタマーを、Expedite 8909 シンセサイザー（Applied Biosystems）で化学合成した。ステム配列に下線を引く。２つの異なるプライマー（Proligo）：ライブラリーＡ及びＣの３’末端に相補的なＰ２０（５’ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣ）と、３’ＳＬ（ＲＮＡプールと同じ極性でかつＴ７転写プロモーター（下線を引いた）を含む）５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＣを含有する）をＰＣＲ増幅に使用した。プライマーＰ１Ａ ５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧ及びＰ２Ａ ５’ＴＣＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＴＣＴＧをハンドルライブラリー（handle library）Ｄに使用した。全てのオリゴヌクレオチド及び転写産物を、２０％変性ポリアクリルアミド（７Ｍ尿素）ゲルでの電気泳動によって精製した。

インビトロ選択Ｉ：
ICN Pharmaceutical社の［γ３２−Ｐ］ＡＴＰ（１０mCi/mL）（４５００Ci/mmol）で標識したＲＮＡライブラリーＡ（５０ピコモル）を、室温で、Ｒ緩衝液（２０mM ＨＥＰＥＳ、２０mM 酢酸ナトリウム、１４０mM 酢酸カリウム及び３mM 酢酸マグネシウム、ｐＨ７．４）１０μLの最終容量で室温で２４時間混合した。選択の第一ラウンドでは、ストリンジェンシーは、選択されたプール中にキッシングすることができる配列を保持するのに十分に低かった。選択のその後のラウンドでは、高い安定性の複合体のみを維持するために、ＲＮＡヘアピン濃度を各ラウンドで１０倍減少させた。さらに、インキュベーションの時間を減少させた（ラウンド１では２４時間、ラウンド２では６時間、ラウンド３では１時間、そして最終ラウンドでは１０分間）。ＲＮＡ集団を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって分離した。サンプルを、５０mM Tris−アセタート（ｐＨ７．３、２０℃）及び３mM 酢酸マグネシウム（ＴＡＣ緩衝液）中の天然ゲル（１５％［w/v］、７５：１ アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）上に１００Ｖ及び４℃で１５時間流した。Instant Imager（Packard Instrument）によってバンドを可視化及び定量化した。ＲＮＡがシフトした複合体に相当するバンドをゲルから抽出し、溶離緩衝液（１０mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１mM エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び２５mM ＮａＣｌ）６００μl中、４℃で１６時間溶離し、次いで、エタノール沈殿した。

ＲＮＡ増幅、クローニング及び配列決定：
抽出したＲＮＡヘアピンを９５℃で４０秒間変性し、氷上に２分間置いた。次いで、５ユニットのＥＺｒＴｔｈ（Perkin elmer）ポリメラーゼを使用し、製造業者のプロトコールに従って６３℃で３０分間かけてＲＮＡプールをｃＤＮＡにコピーした。３００μMのｄＮＴＰ、２５mMのＭｎＯＡｃ及び２μMの各プライマーの他にＥＺｒＴｔｈ緩衝液を含有する同じチューブで候補を増幅した。次いで、反応混合物を９４℃に２分間変性させ、繰り返しサイクルに供した：９４℃で１分間、６３℃で１分間を４０サイクル及び６３℃で７分間を最終１サイクル。ＰＣＲ産物の沈殿後、ICN Pharmaceutical社の［γ３２−Ｐ］ＵＴＰ（１０mCi/mL）（４５００Ci/mmol）を含むTEBU社のAmpliscribe T7高収率転写キットを用いたインビトロ転写によって、ＲＮＡヘアピンを得た。転写産物を２０％変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって精製し、次いで、次の選択サイクルに使用した。４サイクルの後、Invitrogen社のTOPO TAクローニングキットを使用して、選択した配列をクローニングし、Perkin-Elmer社のdRhodamine Terminator Cycle配列決定キットを使用することによって製造業者の説明に従って配列決定した。

インビトロ選択ＩＩａ：
ビオチニル化ＲＮＡライブラリーＢを、Ｒ緩衝液中、５０nMのライブラリーＡ（ＣＣＮＹ）と室温で１時間混合した（図１４）。使用前に、ライブラリーＡを対抗選択に供した。ライブラリーＡを、Ｒ緩衝液中で事前に平衡化したストレプトアビジンビーズ（Promega社のStreptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles ２０μg）と混合し、ビーズに保持されないＲＮＡ候補を選択ＩＩに使用した。ビオチンを含有するライブラリーＢとライブラリーＡとで形成されたＲＮＡ複合体をストレプトアビジンビーズで１０分間捕捉した。未結合ＲＮＡを除去し、ビーズをＲ緩衝液１００μlで洗浄した。水５０μl中８５℃で４５秒間加熱することによって、ライブラリーＡの結合した候補をライブラリーＢから溶離した。ＲＮＡ候補を、選択Ｉで記載したようなＲＴ−ＰＣＲ及び転写に供した。５nMのライブラリーＡ及びＢを用いた選択の第二のラウンドを加えた。選択の２回のラウンドからの配列を上述したようにクローニングした。これらの配列を、ステム−ループ接合部におけるコンセンサスヌクレオチド配列に従って５つの異なるファミリーに分類した。ファミリー１のメンバーは、ＧＧクローニング塩基対、ファミリー２はＡＧ、ファミリー３はＧＵ又はＵＧ、ファミリー４及びファミリー５は、それぞれ選択の第一又は第二のラウンドの全ての他の配列を得た。

インビトロ選択ＩＩｂ
これらの候補の増幅を、５’末端にポリ−Ｔテールを含有する新たなプライマーＰ２０を用いて実施した。それで、ＰＣＲ産物をポリ−ＡテールドＲＮＡ候補にインビトロ転写した。ビオチニル化相補的ポリ−Ｔオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、ポリ−Ａ候補をストレプトアビジンビーズ上に固定化した。これらの候補に対して、Ｄライブラリーを用いて、ファミリー１、２、３、４については５０nMでの、ファミリー５については５nMでの選択の新たなラウンドを実施して、ＮＣＣＮＹＮ候補のＮＲＮＧＧＮパートナーを同定した。Ｄライブラリーのプライマーは、ライブラリーＡと比較して変化していた。この変化は、公知の候補Ｃではなく候補Ｄだけを増幅することが可能であるので重要であった。選択プロトコールは、ポリ−Ｔ−ビオチニル化プライマー単独とストレプトアビジンビーズ上のＲＮＡポリ−Ａオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたポリ−Ｔ−ビオチニル化プライマーの混合物に対して対抗選択を行った以外は、Ａライブラリーを用いた選択ＩＩａの第一ラウンドと同じであった。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
電気泳動移動度シフトアッセイを使用してループ−ループＲＮＡ複合体の解離定数（Ｋｄ）を決定した。一般に、０．１又は１nMの３２Ｐで５’末端標識したヘアピンを、Ｒ緩衝液１０μl中、増加濃度のパートナーと２３℃で２０分間インキュベートした。結合反応物を、４℃で平衡化した非変性天然ゲル［５０mM Tris−アセタート（ｐＨ７．３、２０℃）及び３mM 酢酸マグネシウム中の１２％（wt/v）１９：１ アクリルアミド／ビス（アクリルアミド）］上にロードし、１２０Ｖ（６V/cm）で一晩電気泳動した。Instant Imager analysis（Hewlett-Packard）によって複合体を定量化した。式：Ｂ＝（Ｂmax）（［Ｌ］０）／（［Ｌ］０＋Ｋｄ）（式中、Ｂは、複合体の割合であり、Ｂmaxは、形成された複合体の最大値であり、そして［Ｌ］０は、未標識リガンドの合計である）に従って、Kaleidagraph 3.0（Abelbeck software）を用いたデータポイント適合からＫｄ値を推定した。

ＲＮＡ複合体の熱変性
ＲＮＡヘアピン及び複合体を、１４０mM 塩化カリウム、２０mM 塩化ナトリウム及び０，３；３又は１０mM 塩化マグネシウムを含有する２０mM カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３、２０℃）中に調製した。ＲＮＡサンプルを１μMの最終濃度で調製した。サンプルを９０℃で１分間及び３０秒間変性し、氷上に１０分間置いた。室温で１０分間のインキュベーション後、ＲＮＡ配列を混合し、３０分間インキュベートした。０．４℃／分で４から９０℃に昇温させることによってサンプルの変性を達成し、２６０nmで追跡した。±０．１℃以内で温度を制御するペルティエ効果素子（Peltier effect device）と適合するCary 1分光光度計で熱変性をモニタリングした。

表面プラズモン共鳴反応速度測定
BIAcore 2.1ソフトウェアで実行するBIAcore 2000又は3000装置（Biacore AB,Sweden）でＳＰＲ実験を実施した。ビオチニル化ヘアピンＲＮＡ（１５０〜１０００ＲＵ）を、ＢＩＡアプリケーションハンドブックに記載されている手順に従って、Ｒ選択緩衝液中のＳＡセンサーチップ上に、５μl／分の流速で、５０nMで固定化した。１つのストレプトアビジンコートフローセルを使用して、ＲＮＡヘアピンの非特異的結合をチェックした。これらの制御チャネルからのシグナルはベースラインとして役立ち、複合体が形成されたときに観察されたＲＵ変化を減算した。３mM ＥＤＴＡの１回の２０μlパルス、続く、蒸留水の１回の２０μlパルス、最後にＲ緩衝液の１回の２０μlパルスでセンサーチップ（sensorship）表面の再生に成功した。２３℃で５種の濃度（少なくとも）の注入ＲＮＡによる単一のセンサーグラムの非線形回帰分析を使用して、複合体形成の動態パラメーターを決定した。BIA evaluation 2.2.4ソフトウェアで、それぞれ会合段階及び解離段階について方程式１−２に従ってデータを解析し、擬一次モデルを推測した。式中、Ｒは、シグナル応答であり、Ｒｍａｘは最大応答レベルであり、Ｃは注入したＲＮＡ分子のモル濃度であり、ｋｏｎは会合速度定数であり、そしてｋｏｆｆは解離速度定数である。

結果：
ＳＥＬＥＸ Ｉ
キッシング複合体は、ループを介して互いに相互作用するＲＮＡステムループによって形成される。これらの複合体は、プラスミドのＤＮＡ複製の制御又はウイルスのゲノムＲＮＡの二量化などの多くの生物プロセスに関与する。さらに、ＲＮＡヘアピンは、≪インビトロ≫選択によってターゲット化されており、ＲＮＡヘアピンアプタマーは同定されている。相互作用するループがキッシング複合体を生成したことが示された。これらのループ−ループ相互作用の研究は十分に実証されてはいるが、それらの形成、特異性及び安定性を導き得るいくつかの規則があるかを調査するために、本発明者等は、キッシングする能力についてＲＮＡヘアピンの≪インビトロ≫選択を実施した。

選択Ｉに使用されるＲＮＡランダムライブラリーは、不変プライマーアニーリング部位によってフランキングされた１０又は１１個のランダムヌクレオチドを含有した。

高い親和性のいくつかのループ−ループ複合体が同定されている。≪インビトロ≫選択結果の配列解析によって、本発明者等は、ループの相互作用によって形成された二重螺旋中の新しいＲＮＡモチーフを特徴付けた。これらの仕事は、ループを介して高い親和性で相互作用してキッシング複合体を形成することができるＲＮＡヘアピンの一覧を得ることを可能にした。

ＲＮＡ集団を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって分離した。サンプルを、５０mM Tris−アセタート（ｐＨ７．３、２０℃）及び３mM 酢酸マグネシウム（ＴＡＣ緩衝液）中の天然ゲル（１５％［w/v］、７５：１ アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）上に１００Ｖ及び４℃で１５時間流した。Instant Imager（Packard Instrument）によってバンドを可視化及び定量化した。ＲＮＡがシフトした複合体に相当するバンドをゲルから抽出し、溶離緩衝液（１０mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１mM エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び２５mM ＮａＣｌ）６００μl中、４℃で１６時間溶離し、次いで、エタノール沈殿した。

抽出したＲＮＡヘアピンを９５℃で４０秒間変性し、氷上に２分間置いた。次いで、５ユニットのＥＺｒＴｔｈ（Perkin elmer）ポリメラーゼを使用し、製造業者のプロトコールに従って６３℃で３０分間かけてＲＮＡプールをｃＤＮＡにコピーした。３００μMのｄＮＴＰ、２５mMのＭｎＯＡｃ及び２μMの各プライマーの他にＥＺｒＴｔｈ緩衝液を含有する同じチューブで候補を増幅した。次いで、反応混合物を９４℃に２分間変性させ、繰り返しサイクルに供した：９４℃で１分間、６３℃で１分間を４０サイクル及び６３℃で７分間を最終１サイクル。ＰＣＲ産物の沈殿後、ICN Pharmaceutical社の［γ３２−Ｐ］ＵＴＰ（１０mCi/mL）（４５００Ci/mmol）を含むTEBU社のAmpliscribe T7高収率転写キットを用いたインビトロ転写によって、ＲＮＡヘアピンを得た。転写産物を２０％変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって精製し、次いで、次の選択サイクルに使用した。４サイクルの後、Invitrogen社のTOPO TAクローニングキットを使用して、選択した配列をクローニングし、Perkin-Elmer社のdRhodamine Terminator Cycle配列決定キットを使用することによって製造業者の説明に従って配列決定した。

１１０個のＲＮＡ候補を解析した。コンセンサス配列及び相補的配列を調査した。例えば：配列を７１個のファミリーに分類し、各ファミリーは、４つの隣接塩基対合を介して１つの推定相補的配列にマッチすることができる少なくとも３つの配列を含有する：

ループの配列と少なくとも３つのパートナー及びアラインメント：

相補性について最良のスコアを示すループ配列を本明細書以下に提示する：

各配列についての最良のスコア

本発明者等はまた、各ファミリーのＲＮＡ配列についての相互作用する能力をＥＭＳＡによって１０nM及び２００nMでチェックした。５０個の推定複合体をスクリーニングした。親和性は、７つの複合体及び３つのパリンドローム配列（単独で試験した）について１０nMより小さく、２１個の複合体は１０〜２００nMの間の親和性を示した。

１０nMのヘアピン濃度で複合体の５０％超が形成された最良の結果を表１に示す：

表１：選択したループ配列の相補性の例。名称を左に示す。配列をそれらの相同性及び相補性に従ってファミリーにまとめる。各ファミリーは、５つの隣接塩基対合を介して１つの推定相補的配列（右から左へ５’〜３’）とマッチすることができる、少なくとも３つの配列（左から右へ５’〜３’）を含有する。推定相補的塩基を灰色で表す。第一のファミリーは、共通の繰り返しプリン／ピリミジンモチーフを共有するオクタ又はヘキサヌクレオチド自己相補的配列を示す。推測のＫＤ（nM）を右に示す。

短いコンセンサスモチーフは、２つの分子間Ｇ−Ｃ塩基対（Ｇが同じループ中で隣接しており、Ｃが相補的ループ上にあった）からなる。プリン塩基（Ｒ）、優先的にＧは、先のＧＧモチーフのｎ−２塩基に見いだされ、その結果としてピリミジン（Ｙ）は、ＣＣモチーフのｎ＋２に存在した。ＣＣ塩基は、Ａ、Ｕ又はＧによってピリミジンから分離されていた。このＣＣ（Ａ／Ｕ／Ｇ）Ｙ又はＣＣＤＹ／ＲＨＧＧモチーフは、Ｃが欠けていた場合であっても試験されていなかったためにＣＣＮＹ配列まで拡大されており、本発明者等は、全ての選択されたヘアピン集団（１１０個の配列）において、これらのモチーフＲＮＧＧ及びＣＣＮＹを調査した。本発明者等は、配列の５２％がいずれかのモチーフを持っていたことを観察し、このことはその集団がこの変性配列へと進化したことを示している（表２）。

表２：５０個の推定複合体の電気泳動移動度シフトアッセイによるスクリーン及び１０nMのヘアピン濃度で複合体の５０％超が形成されたＲＮＡ配列のアラインメントの最良の結果。親和性の推測を右に示す。相補的塩基には下線を引き、共通配列を四角で囲む。

Ｋ１８、Ｋ１４及びＫ９８ループは、自己相補的オクタ又はヘキサヌクレオチド配列を含有した（表３）。これらの自己相補的配列は、ＤＩＳに記載したような二量体を生成することができた（ＨＩＶ−１の二量体開始部位、ＡＭＶ）。これらのループの相互作用領域は、共通の４つのＧＣ隣接塩基対モチーフを再び共有していた。推定ループ間配列は、プリン／ピリミジンの連結であった。このプリン／ピリミジンは３回繰り返された。Ｋ１４、Ｋ１８及びＫ９８についてのＥＭＳＡによる解離定数の測定は、ＲＮＡの５０％が複合体にシフトした値が１nM未満であったために解釈不可能であった。高い親和性及び安定性を有する複合体の形成を確認するために、本発明者等は、ＲＮＡ Ｋ１８複合体（５’ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＧＣＡ）の熱変性を実施した。Ｋ１８複合体の融解温度を異なる濃度で研究し、結果は二量体が形成されたことを示した。１、５及び１０μM（３mMのマグネシウムで）におけるＴｍは、それぞれ６０．６、６１．５及び６２．３℃であった。観察されたＴｍがＫ１８濃度に依存していたので、Ｔｍが、Ｋ１８ヘアピンの融合にだけではなくＫ１８−Ｋ１８複合体の融合に対応していたことを意味する。１、５又は１０μMにおける値は、１０mM マグネシウムでそれぞれ６２．６、６５．４及び６６．５℃に増加した；このことは、Ｋ１８二本鎖の安定性がマグネシウムに依存することを示している。

１１０個の配列内の４つの塩基変性モチーフの頻度解析は、以下の結果を与える（最も多く表されるものを左から右へ示す）：ＹＲＹＲ、ＲＹＲＹ、ＹＹＲＹ、ＲＹＲＲ、ＹＹＹＲ、ＹＲＹＹ、ＲＹＹＲ、ＹＲＲＹ、ＹＲＲＲ、ＲＹＹＹ、ＲＲＹＲ、ＲＲＹＹ、ＲＲＲＲ、ＲＲＲＹ、ＹＹＹＹ及びＹＹＲＲ。

使用に適したキッシング複合体の数を増加させるためにかつＲＮＡループ−ループ複合体の形成への他の重要な決定因子（ステム−ループ接合部に位置する優先的な塩基として）を決定するために、先に記載したモチーフの周囲で第二のインビトロ選択を実施した。

ＳＥＬＥＸ ＩＩ
ＲＮＧＧモチーフを有するビオチニル化ライブラリーＢに対するコンセンサス配列ＣＣＮＹを含有するライブラリーＡを用いて、第二のＳＥＬＥＸを実施した。２回のラウンドを行った。本発明者等は、最初にライブラリーＡの候補を解析した。選択の第一ラウンドからの４５個の配列及び第二のラウンドからの４３個の配列をそれぞれ研究した。これらのヘアピンは全て、モチーフＣＣＮＹを含有していた。これらのＣＣＮＹ候補の増幅を、５’末端にポリ−Ｔテールを含有する新たなプライマーＰ２０を用いて実施した。それで、ＰＣＲ産物をポリ−ＡテールドＲＮＡ候補にインビトロ転写した。ビオチニル化相補的ポリ−Ｔオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、ポリ−Ａ候補をストレプトアビジンビーズ上に固定化した。これらの候補に対して、Ｄライブラリーを用いて、新たな選択のラウンドを実施し、ＮＣＣＮＹＮ候補のＮＲＮＧＧＮパートナーを同定した。Ｄライブラリーのプライマーは、ライブラリーＡと比較して変化していた。

結果を表６に記述する。Ｎ１とＮ６の位置（Ｎ１ＣＣＮＹＮ６）の解析は、３つのクラスの配列の出現を導いた。クラスＡは、ステムループ接合部にＧ−Ｇ塩基を含有する２４個の配列から構成されていた。クラスＢは、これらの位置にコンセンサス配列Ａ−Ｇ塩基を提示する１６個の配列から構成されていた。これらの位置にＧ−Ｕ又はＵ−Ｇ塩基を有する１５個の他の配列はクラスＣを構成した。これらのファミリーは、Ｎ１ＲＮＧＧＮ６のＮ１−Ｎ６組成に対して出現した。さらに、クラスＡ’は、Ｇ−Ｇ塩基に富んでいた（２１の配列）。クラスＢ’及びクラスＣ’は、それぞれ、Ｕ−Ｃを含有する１６個の配列及びＧ−Ｕ又はＵ−Ｇを含有する１５個の配列から構成されていた。

配列ＫＣ２４：ＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ及びＫＣ２３：ＵＧＣＵＣＧＧＣＣＧＵＧＣＧＡＧＣＡが最も多く表された（それぞれ、８回及び７回）。２つの他の配列ＵＧＣＵＣＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＡ及びＵＧＣＵＣＧＡＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡは、ＮＣＣＮＹＮヘアピン中それぞれ５回及び４回見いだされ、ＮＲＮＧＧＮパートナーについては、２つの配列：ＫＧ５１：ＧＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＣＧＣＵＣＧＵＣ及びＫＧ１１４：ＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＵＣＧＵＣが１０回見いだされた。配列ＫＧ７１：ＧＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＵＧＣＵＣＧＵＣは、５回表された。

熱変性を使用して、異なる複合体の融解点を異なる濃度のマグネシウムで定義したが、このことは、複合体がマグネシウムに感受性であったことを示している。

これらの複合体の高い親和性をＳＰＲ実験によって示し、例えば：ビオチニル化ＫＣ２４（ＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ）をストレプトアビジンセンサーチップ上に固定化した。ＫＧ５１（ＧＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＣＧＣＵＣＧＵＣ）を、３mM マグネシウムで８nMのＫｄを決定することが可能であった異なる濃度で注入した。

結論として、ループ−ループ複合体を選択するために使用したインビトロ選択は、マグネシウム感受性でかつ高い親和性を示すＲＮＡキッシング複合体の同定を可能にした。

実施例２：小さいリガンドの検出のためのキッシング複合体ベースriboswitch
アプタマーは、ＳＥＬＥＸと呼ばれるコンビナトリアルプロセスを介して得られた単鎖核酸である｛C. Tuerk, L. Gold, Science 1990, 249, 505-510; A. D. Ellington, J. W. Szostak, Nature 1990, 346, 818-822｝。これらは、アプタマー分子内フォールディング（これは、その後ターゲット分子との最適化された分子間相互作用を導く）から生じるそれらの３Ｄ形状のおかげで既定のターゲットに対して強い親和性及び高い特異性を提示する。ＲＮＡヘアピンに対するＲＮＡ候補の選択は、そのループがターゲットヘアピンのループと相補的である（したがって、ループ−ループ相互作用を生じる）ヘアピンアプタマーを導く｛a) F. Duconge, J. J. Toulme, RNA 1999, 5, 1605-1614; b) K. Kikuchi, T. Umehara, K. Fukuda, J. Hwang, A. Kuno, T. Hasegawa, S. Nishikawa, J. Biochem. (Tokyo) 2003, 133, 263-270; c) S. Da Rocha Gomes, E. Dausse, J. J. Toulme, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 322, 820-826｝。そのようないわゆるキッシング複合体の安定性は、ループ−ループへリックスのワトソンクリック塩基対に由来するが、ループ−ループモジュールと各ヘアピンパートナーの二本鎖ステムの間の接合部におけるスタッキング相互作用にも由来する｛a) F. Beaurain, C. Di Primo, J. J. Toulme, M. Laguerre, Nucleic Acids Res. 2003, 31, 4275-4284; b) I. Lebars, P. Legrand, A. Aime, N. Pinaud, S. Fribourg, C. Di Primo, Nucleic Acids Res. 2008, 36, 7146-7156; c) H. Van Melckebeke, M. Devany, C. Di Primo, F. Beaurain, J. J. Toulme, D. L. Bryce, J. Boisbouvier, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2008, 105, 9210-9215｝。実際に、６塩基対ループ−ループへリックスを生じる、ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡ不完全ステムループエレメントのヘアピンアプタマーへの結合は、同じ６塩基対二本鎖を生じる、ＴＡＲとアンチセンスオリゴマー間の複合体の融解温度よりも２０℃高い融解温度によって特徴付けられた｛F. Duconge, C. Di Primo, J. J. Toulme, J. Biol. Chem. 2000, 275, 21287-21294｝。本発明者等は、アプタマーベースセンサーを設計するために、折畳み構造と直線構造とを区別するＲＮＡヘアピンの可能性を活用した。

riboswitchは、小さいリガンドに対する結合部位を含むセンサーから構成される、原核生物において同定されたＲＮＡモジュールであり、このセンサーは、立体構造変化によってリガンドとの会合に応答する｛a) A. Serganov, E. Nudler, Cell 2013, 152, 17-24; b) B. J. Tucker, R. R. Breaker, Curr. Opin. Struct. Biol. 2005, 15, 342-348｝。センサーは、アプタマーの機能的等価物であり、特に特異性に関して類似の特性を提示する。アプタマーは、それぞれその同族ターゲットの存在下及び非存在下で、折り畳まれた構造と開構造との間で分子スイッチングし得る。そのようなアプタマーのいくつかの例が文献に記載されている。しかしながら、ターゲット分子に結合したときにキッシング複合体を形成することができるループを含む立体構造にスイッチングすることができるアプタマーを記載している研究はない。

本発明者等は、ヘアピンアプタマーによって特異的に認識されるリガンドの存在を計測するためにキッシング複合体の形成を活用した。アプタマーは、小分子の結合がその立体構造を折り畳まれていない形状から折り畳まれた（ヘアピン）形状にシフトさせるように改変される（それゆえ、その名称は、aptaswitch）。折り畳まれた構造の認識は、aptaswitchとキッシング複合体を形成することができる第二のヘアピンによって確実となる。この第二の分子は、aptakissと呼ばれる。そのため、aptaswitch−aptakiss複合体の形成は、小分子の存在を示す。

本発明者等は、核酸塩基誘導体、すなわちＧＴＰ及びアデノシンに対して先に作製されたアプタマーを用いてこの概念を立証した。それらの両方は、リガンドの結合部位を構成するプリンリッチの中心ループを示す（図１）。本発明者等は、本発明者等の戦略をＲＮＡアプタマー又はＤＮＡアプタマーのいずれかに適合させることができることを実証した。以下に記載されるように、aptaswitch−aptakissの組み合わせは、固定化された又は蛍光標識されたaptakissをそれぞれ使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は蛍光異方性のいずれかによる、ターゲットリガンドの特異的かつ定量的な検出を可能にした。

本発明者等は、実施例１において先に同定され、かつＳＰＲによって評価したところ低いＫｄ（室温、１４０mM Ｋ^＋、２０mM Ｎａ^＋及び１０mM Ｍｇ^＋＋を含有する２０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中５nM）によって特徴付けられたＲＮＡ−ＲＮＡキッシング複合体であるＫＣ２４−ＫＧ５１に基づいて、本発明者等のセンサーを変更した。これらのヘアピンは、５つのＧＣ対及び１つのＧＵ対を含む６bpのループ−ループへリックスを潜在的に形成する。ＫＣ２４を１８ntに短縮することで、６bpのステム及び６ntのループを有する本研究において使用されるaptakissを生成した（図１）。ＫＣ２４（aptakiss）ループと相互作用しやすいＫＧ５１ループ配列５’ＣＵＧＧＧＧＣＧを、ＧＴＰ又はアデノシンのいずれかに対して作製された先に記載した不完全ヘアピンアプタマーの頂点ループ中に挿入することによってaptaswitchを改変することで、それぞれGTPswitch及びadenoswitchを生成した（図１及び図７）。

５’ＣＵＧＧＧＧＣＧ配列を、ＧＴＰと相互作用しないことが実証されたアプタマーのオリジナルの頂点部分に置換することによって、先に記載した抗ＧＴＰ ＲＮＡアプタマーをGTPswitchに変換した。加えて、アプタマーステムが４塩基対に減少したら、得られたオリゴヌクレオチドの中心２７ntが大きな非構造化一本鎖内部ループとして残留する可能性が高い。このGTPswitchは、aptakissが固定化されたチップ上に流した場合に、検出可能なＳＰＲシグナルを生じなかった。対照的に、プレインキュベートしたGTPswitch/GTP混合物の注入は、ＧＴＰ濃度を最大０．２５mMに増加させた振幅のシグナルを導いた（図２）：８μMでは、１０ＲＵのシグナルが本発明者等の実験条件下で検出された。これは、GTPswitchへのＧＴＰ結合によって誘導された構造のaptakissによる認識が原因の可能性が高い。ＳＰＲシグナルは、アプタマーによって認識されないＡＴＰがＧＴＰに置換された場合には観察されない（図２）。それは、ループ−ループへリックス中にＧ−Ｇミスマッチを導入する点突然変異apatkiss（図１）がセンサーチップ上に固定化されたいずれの場合にも検出されない（図２）。これらの実験は、センサーの高い特異性を実証し、そして、一方でリガンド−aptaswitch相互作用によって、一方でキッシング複合体形成によって果たされる役割を明確に示しており、それゆえ本発明者等の設計を立証している。

第二の場合では、スタートポイントをアデノシンに対するＤＮＡアプタマーとしたキメラaptaswitchが生じた以外は、同じアプローチを使用した。５’ＣＵＧＧＧＧＣＧ配列を親ヘアピンのオリジナルの頂点部分に置換した（図１）。次いで、親アプタマーのステムを大幅に短縮して、構造の一番下に単一の潜在的なＡＴ対だけを残し、２１nt長のadenoswitchを導いた。次いで、チップ上に固定化されたビオチニル化aptakissに対するＳＰＲによってその特性を調査した。GTPswitchについて上で述べたように、シグナルの振幅は、加えたアデノシンの濃度に相関しており、adenoswitchを単独で注入した場合に共鳴は検出されなかった（図３）。

一定のアデノシン濃度では、ＳＰＲシグナルもadenoswitch濃度と共に増加し、このことは、アデノシンadenoswitch複合体が固定化されたaptakissによって認識される種であり、遊離adenoswitchではなかったことを示している。aptakiss-adenoswitchタンデムによって構成されたセンサーは、特異的であることが証明された：アデノシンを親アプタマーによって認識されないイノシンに置換した場合にシグナルは検出されなかった。また、aptakiss又はadenoswitchループのいずれにおける点突然変異の導入もシグナルを生じることなかったが、このことは、機能的センサーのためのキッシング相互作用の絶対的必要性を実証している。興味深いことに、２つのループの相補性が確保されてもaptakissmut-adenoswitchmut組み合わせによる検出が観察されなかった。実際に、キッシング複合体の安定性はループ配列に高度に依存し、この特定のループ−ループ二本鎖は親のものよりも安定性が有意に低い。

先のＮＭＲ研究は、アプタマーの中心ループのプリン対とのアデノシン環のスタッキングを実証した。これは、キッシング認識しやすいループとしてadenoswitchの頂点部分を形成することに寄与する。センサーの感度は、aptaswitchの折り畳まれていない状態と折り畳まれた状態との間の平衡、すなわち、aptaswitchのそのリガンドに対する結合定数に依存するだろう。言い換えると、aptakissによって認識されるadenoswitchのヘアピン構造の形成へのアデノシンによってもたらされるスタッキング寄与度は、検出に影響を与えるだろう。リガンドの非存在下でヘアピンが形成される極端な場合では、aptakissは遊離adenoswitchに結合するだろう。

そのため、アプタマーベースの分子ビーコンについて先に報告されたように、センサー応答は、リガンドの非存在下で、adenoswitchヘアピンの安定性に関連するであろうと予想される。この仮説を試験するために、本発明者等は、ステムの底に１つ又は２つの塩基対を加えたadenoswitch変異体の特性を評価した（図１）。図４に示すように、一定のアデノシン濃度に対するＳＰＲ応答は、adenoswitch＜adenoswitchTA＜adenoswitchTAGCの順に（すなわち、ヘアピンステム中の塩基対の数と共に）増加した。実際に、後者の変異体は、アデノシンの検出を、親adenoswitchの２mM（図３）に対して、０．１２５mM（図４）の濃度で可能にした。増加した感度は、特異性を犠牲にしては達成されなかった：adenoswitchATGC（そうでなければ、以下でＡＤＯｓｗ１’とも称される）はイノシンを認識せず、aptakissmutで官能化されたチップ上でシグナルは観察されなかった。

本発明者等は、蛍光異方性（ＦＡ）を使用して溶液中でaptakiss-aptaswitch複合体を検出する可能性をさらに考慮した。このために、蛍光プローブとしてテキサスレッド（ＴＲ）３’末端コンジュゲートaptakiss（aptakiss-TR）を使用して、上述したキメラadenoswitchを用いた。adenoswitchへのaptakissの結合は、全体のサイズを増加させ、その結果として増加したＦＡを生じるであろう。１０nM adenoswitchの存在下では、反応混合物にアデノシンを加えた場合に、aptakiss-TR（１０nM）のＦＡシグナル（ｒ）が増大した。ＦＡ変化、すなわち、Δｒ＝ｒ−ｒ_０（式中、ｒ_０は、リガンドの非存在下の異方性である）は、２mM アデノシン濃度で約０．０１５に達した（図５）。

次いで、最適化されたadenoswitchTAGCで用量反応曲線を確立した。図５に示すように、感度は親adenoswitchと比べて大きく改善した。adenoswitchTAGCと形成された三成分複合体について、オリジナルのアプタマーについて報告された５〜１０μM値に近い３５μMの見掛けの解離定数を得た。アデノシン結合部位の一部である内部プリンループの５’側の２つのＡを２つＧに交換した場合に（ａdenoswitchTAGCmut2）、アデノシン添加時のＦＡ応答は不変であった。予想通り、アデノシンアプタマーに結合しないイノシンの添加時にＦＡの変動は観察されなかった。これは、シグナル変換がadenoswitchのアプタマードメインへのアデノシンの結合に依存することを確認する。

結論として、本発明者等は、スイッチングセンサーを生成するためにプリン誘導体に対するアプタマーを改変した。ヘアピン形状が同族リガンド（すなわち、ＧＴＰ又はアデノシン）の存在下で独占的に採用されるようにアプタマーの構造を最適化した。加えて、本発明者等は、親アプタマーの頂点ループの部分を、aptaswitchの結合特性を著しく変化させることなく、ヘアピンaptakissとループ−ループ相互作用しやすい短いＲＮＡ配列に置換させることに成功した。リガンドの存在を示すaptaswitch-aptakiss複合体の形成を、自動化され得る種々の技術（蛍光、ＳＰＲ）によってモニタリングすることができる。ＧＴＰ及びアデノシンについてここで実証したように、同じaptakissを、そのループが相補的配列で適切に修飾された任意のaptaswitchを検出するために使用することができる。

アデノシンの検出について他のアプタマーベースのセンサーを記載した。aptaswitchベースの蛍光異方性アッセイについて、アデノシンの検出限界は約１０μMであると推測され、これは、蛍光aptasensing法（精巧な増幅系バイオセンサーを除く）で一般的に報告されたものと同じ範囲である。

実施例３：Ｋｘ１、Ｋｘ２、Ｋｘ３及びＫｘ４複合体の特性決定
次いで、本発明者等は、いくつかのリガンドの同時検出を可能にし得るaptaswitchを設計するために二次的に使用されるであろう、数種のキッシングカップルの特性決定に着手した。このために、本発明者等は、便宜上、Ｋｘ１〜Ｋｘ４と呼ぶ４つの配列及びそれらのキッシング相補体Ｋｘ１’〜Ｋｘ４’を選択した。Ｋｘ１、Ｋｘ１’、Ｋｘ２及びＫｘ２’は、それぞれ、上のＫＣ２４、ＫＧ５１、ＫＣ２８及びＫＧ４９配列に対応する。Ｋｘ３、Ｋｘ４、Ｋｘ３’及びＫｘ４’は、それぞれ、以下の配列を有する：ＧＧＵＣＧＧＵＣＣＣＡＧＡＣＧＡＣＣ（ループ配列ＧＵＣＣＣＡＧＡ）、ＧＧＵＵＵＣＡＧＧＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＧＣＣＣＣＵＣＧＧＡＡＧＡＵＡＡＣＣ（ループ配列ＧＵＧＡＵＧＵ）、ＣＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＧ（ループ配列ＣＵＧＧＧＡ）及びＣＣＵＧＡＣＡＵＣＡＣＣＡＧＧ（ループ配列ＡＣＡＵＣＡＣ）。ヘアピンＫｘ１〜Ｋｘ４は、ストレプトアビジンセンサーチップ上での固定化を可能にする３’ビオチニル残基を用いて化学合成した。キッシングモチーフは、ヘアピンとの関連で６ntステム及び６ntループで表示される。加えて、候補ヘアピンごとの同一のステムの存在に起因してオリジナルのプール中に生じ得る伸長した二本鎖の形成を抑制するために、本発明者等は異なるステムを有するパートナーを設計した。本発明者等は、最初に、これらの複合体の１つ：ループ配列５’ＧＣＣＣＣＧ及び５’ＵＧＧＧＧＣをそれぞれ提示するＫｘ１−Ｋｘ１’（Ｋｘ１’についてこの実験で使用されるステムは、２つの相補的配列：５’−ＡＣＧＡＧＣ．．．ＧＣＵＣＧＵ−３’で形成され；Ｋｘ１についてのステムは、２つの相補的配列：５’−ＵＧＣＵＣＧ．．．ＣＧＡＧＣＡ−３’で形成される）を詳しく調査した。本発明者等は、ＵＶ吸光度モニタリング熱変性及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって複合体安定性に及ぼす点突然変異の効果をチェックした。３mM Ｍｇ^２＋を含有する緩衝液中では、Ｋｘ１−Ｋｘ１’親複合体の転移のＴｍは、４４．２＋０．７℃であった（図７）。固定化されたＫｘ１を用いたＳＰＲ解析は、６．９＋１．１nMのＫｄを導いた（図７）。ループ−ループ二本鎖中に追加のＧＣ対を生成するためにＫｘ１’ループ中の５’ＵをＣに置換すると、実際にＫｄの増加を生じた（１８＋１．１nM）。Ｋｘ１’中の相補的突然変異と組み合わせたＫｘ１中の他の点改変は、さらにより劇的な効果を導いた：例えば、ループ−ループ二本鎖の第二のＧＣ対の反転は、弱い複合体（Ｋｘ１ｍ３／Ｋｘ１’ｍ４複合体：野生型と比べて、Ｔｍ＝３１．５＋０．７℃）を生じ、これはＣＣＮＹ／ＲＮＧＧモチーフの重要性と本発明者等の選択アプローチの関心の両方を指摘している。加えて、配列Ｋｘ５（ＡＣＣＣＣＧ）及びＫｘ５’（ＵＧＧＧＧＵ）を有する異なる複合体も評価し（図７）、安定な複合体を形成した。

本発明者等は、ＳＰＲによって、ビオチニル化ヘアピンＫｘ１〜Ｋｘ４をバイオチップの異なるチャネル上に固定化することによって４つの先に選択したキッシング複合体の適合性を調査した。Ｋｘ１’、Ｋｘ２’、Ｋｘ３’又はＫｘ４’ の個々の溶液をチップ上に流した。各同族の組み合わせＫｘ１−Ｋｘ１’、Ｋｘ２−Ｋｘ２’及びＫｘ４−Ｋｘ４’について予想した通り良好な共鳴シグナルを得た（図７）。対照的に、Ｋｘ３’−Ｋｘ１（示さず）以外の任意の他の組み合わせでは、シグナルは観察されなかった；結果として、本発明者等は、もはやＫｘ３−Ｋｘ３’複合体を使用せず、キッシング複合体ベースのaptasensorの設計に関して３つの他の組み合わせに制限した。

実施例４：テオフィリンの検出のためのキッシング複合体ベースのriboswitch
上述したように、頂点ループがそれらの同族リガンドの結合に関与しない不完全ヘアピンとして組織化されたアプタマーを、aptaswitchへと潜在的に改変することができる。このために、本発明者等は、まず、キッシング相互作用しやすい短い配列をオリジナルのアプタマーループに置換する必要がある。本発明者等は、アデノシン、ＧＴＰ又はテオフィリンに対して先に選択されたアプタマー中にＫｘ１’、Ｋｘ２’又はＫｘ４’のループを導入することで、それぞれＡＤＯｓｗ１’、ＧＴＰｓｗ２’及びＴＨＥｓｗ４’を生成した（図８）。これらのアプタマーは、それらのそれぞれのリガンドの結合部位を構成するプリンリッチ内部ループによって特徴付けられる。本発明者等は、同族アプタマーターゲットの添加時にaptaswitchが条件付きでヘアピン中に折り畳まれるように、中心ループの上下に短い二本鎖領域を作った。次いで、aptaswitch−リガンド複合体は、aptakissＫｘ１、Ｋｘ２又はＫｘ３によって認識されるが、折り畳まれていないアプタマーは認識されない。ＡＤＯｓｗ１’は、先に上で特徴付けられた（Adeno-switchＴＡＧＣ）：アデノシン及びＫｘ１の同時添加時に特異的なＳＰＲ又は蛍光シグナルが観察されたが、イノシンの存在下ではシグナルは検出されなかった。ＧＴＰｓｗ２’は、Ｋｘ２’ループを以前に使用したＫｘ１’に置換することによって上述したaptaswitchから誘導される。ＧＴＰ及びaptakissに関連するその特異的な応答性は保持される：ＧＴＰの添加時に用量依存ＳＰＲシグナルが観察されたが、ＡＴＰでは共鳴は認められなかった（図９）。ＴＨＥｓｗ４’の設計は、トライアル及びエラーを必要とした：最良のaptaswitch（図８）は、内部ループの下と上にｘ及びｙ推定塩基対を含有する。ＴＨＥｓｗ４’の及びテオフィリンの混合物は、Ｋｘ４が固定化されたチップ上に流された場合にＳＰＲシグナルを誘発する（図９）。カフェインの存在下ではシグナルは検出されず、このことは、結合の特異性が保持されることを示している。しかしながら、テオフィリンに対するＴＨＥｓｗ４’の親和性は、親アプタマーに比べて低下する。全ての複合体に最良の媒体に相当していなくても、３つのaptaswitch-aptakiss複合体が多重分析の必要条件である同じイオン条件下で評価されたことに注目すべきである。

実施例５：ＳＰＲ及び蛍光異方性によるリガンドの同時検出
このために、本発明者等は、４つのチャネルを有するＳＰＲストレプトアビジンバイオチップを使用した。ビオチニル化Ｋｘ１、Ｋｘ２及びＫｘ４をそれぞれチャネル１、２及び３上に固定化し、そして、４つ目のチャネルをビオチニル化リンカーで飽和し、これを対照として使用した。示すように（図１０）、ＡＤＯｓｗ１’、ＧＴＰｓｗ２’又はＴＨＥｓｗ４’と、それぞれ飽和条件の同族リガンド、アデノシン、ＧＴＰ又はテオフィリンを飽和条件下で流すと、独占的に、対応する官能化チャネルすなわちそれぞれ１、２又は４上にシグナルを生じた。次いで、より複雑な混合物を試験した：３つのaptaswitchの同時存在は、１つのリガンドの同時検出を可能にした：例えば、５μM ＡＤＯｓｗ１’＋５μM ＧＴＰｓｗ２’＋１μM ＴＨＥｓｗ４’への１mM テオフィリンの添加は、チャネル３上でのみシグナルを生成した（図１０）。２mM ＧＴＰで類似の結果が得られた（示さない）。１つのaptaswitch及び３つのリガンドとの混合物もまた特異的な応答を生成した：例えば、２mM アデノシン＋１mM ＧＴＰ＋１mM テオフィリンとの５μM ＧＴＰｓｗ２’は、チャネル２上でのみシグナルを与えた（図１０）。３つのリガンドとのＡＤＯｓｗ１’又はＴＨＥｓｗ４’のいずれかの使用もまた、同族リガンドの検出を可能にした（示さない）。最後に、本発明者等は、４つのチャネルチップ上に３つのaptaswitchと３つのリガンドの混合物を注入し、３つの異なるaptakissを有する３つのチャネル上でシグナルを観察した（図１０）。

実施例６：ＤＮＡaptaswitch−ＲＮＡaptakissカップルの使用
上記において、本発明者等は、アデノシンに対して以前に同定されたＤＮＡアプタマーから誘導されたaptaswitchの領域に小分子（アデノシン）が結合することを意味する、キメラＤＮＡ−ＲＮＡを記載する。このＤＮＡアプタマーには、aptakiss ＲＮＡとキッシング複合体を形成することができるＲＮＡループが加えられている。この制約は、２つのＤＮＡループが関与するキッシング複合体がまだ記載されていないという事実に関連する。対照的に、ＲＮＡ及びＤＮＡループループ相互作用が関与するキッシング複合体は選択されている（Darfeuille, F., Sekkai, D., Dausse, E., Kolb, G., Yurchenko, L., Boiziau, C., and Toulme, J. J. (2002) Comb Chem High Throughput Screen 5, 313-25）。ランダムＤＮＡライブラリーからのこのＳＥＬＥＸをＨＩＶ−１のＴＡＲ ＲＮＡヘアピン構造に指向した。選択した候補を、ＴＡＲに対するそれらの親和性についてＥＭＳＡ（電気泳動移動度シフトアッセイ）によって試験し、それらの中でＤＩＩ２１と呼ばれるものが、３mM マグネシウムの存在下、室温で２０nMの親和性を示した。

それで、本発明者等は、この複合体を利用して、アデノシンに指向するアプタマーのＤＮＡ頂点ループを、キッシング複合体を形成することができるＤＩＩ２１アプタマーのＤＮＡループと置き換えた。ループとアデノシンの結合の領域との間に導入された３つの異なるコネクターを有する３つのモデル（Ａ、Ｂ及びＣ）を合成した（図１１）。

これらの３つのモデルを、一方ではイノシン（アデノシンの特異性の対照）の存在下で、他方ではアデノシンの存在下で、蛍光基（テキサスレッド）で標識されたＴＡＲに結合するそれらの能力について蛍光異方性によって試験した（図１２）。その結果は、イノシンの存在下でのＤＩＩ２１ Ａの強い非特異的結合を示す。aptaswitch ＤＩＩ２１Ｂ及びＣは、ＴＡＲに対して高特異的結合を示す。

これらの結果は、完全にＤＮＡ aptaswitchが機能的であり得ることを実証する。そのため、本発明者等のaptakiss−aptaswitch戦略は、ＲＮＡ−ＲＮＡキッシング複合体に制限されることなく、ＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体まで拡張することができる。この可能性は、ＤＩＩ２１配列に制限さることなく、ＲＮＡ−ＤＮＡ安定キッシング複合体を生成することができる任意の配列まで拡張することができる。

実施例７：ＤＮＡコンビナトリアルライブラリー
ＤＩＩ２１Ｂモデルで得られた結果に基づいてＤＮＡライブラリーを合成し、ＤＮＡライブラリーを用いてＳＥＬＫＩＳＳ（すなわち、キッシング複合体形成を遂行するＳＥＬＥＸ）を実施した。ＲＮＡライブラリーと同じ設計を使用してＤＮＡライブラリーを生成した：１つの固定された領域は、２つのランダムウインドウ（それら自体は、２つのプライマーによってフランキングされている）によってフランキングされる。異なるランダムウインドウを有する５つのライブラリーを２つの別個の目的で設計した：ａ）３つのライブラリーは、アデノシンの存在下でＴＡＲに結合することができる最良の配列を見つけるためにコネクター上にランダム領域を含有する、ｂ）アデノシンへの結合に関与する領域中にランダムウインドウを有する２つのライブラリー（図１３）。

ＤＮＡ ＳＥＬＫＩＳＳによって生成した集団の蛍光異方性による初期解析は、アデノシンに特異的な候補の小さな集団の存在を示す。異なる選択圧（ＤＮＡ及びアデノシン濃度、解離時間…）で得られたサンプルのハイスループット配列決定は、ａptaswitchファミリーを得ること及びＴＡＲに特異的に結合するそれらの能力をチェックすることによって特異的配列を同定することを可能にする。

本明細書において使用されるaptakissは、常にＲＮＡヘアピンである。しかしながら、実験は、ＲＮＡ２’−フルオロピリミジンaptakissも使用することができることを確認する（データは示さず）。

さらに、ＤＮＡ aptaswitch及びＤＮＡ aptakissを得るために、ＤＮＡキッシング複合体のＳＥＬＥＸに着手し、現在、これを配列決定している。

ＤＮＡ ＳＥＬＫＩＳＳは、未修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼに高い耐性を示すＤＮＡ aptaswitchを提供する。加えて、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成コストは、ＲＮＡの場合の合成コストよりも非常に低い（ファクター５）。

本センシングフォーマットは、三成分複合体形成に関与する二重認識メカニズムから生じるユニークな結合特異性での小さいリガンド検出のための、オリジナルのサンドイッチ様アッセイとして考慮することができる。さらに、そのようなサンドイッチ様アッセイは、酵素結合aptakiss及び表面固定化aptaswitchの両方を使用することによって、ＥＬＩＳＡ型フォーマットに容易に適合してシグナル増幅を達成することができる。本発明者等の戦略はまた多重解析も可能にする：本発明者等は、実際に、交差相互作用しないいくつかのキッシング対のレパートリーを同定した。そのため、本発明者等は、異なるアプタマー中に異なるキッシングしやすい配列を導入することで、これらを独立してモニタリングすることができる限り同時に使用することができる一連のaptaswitchを生成することができる。このアプローチを、頂点ループがリガンドとの相互作用に重要でない不完全ヘアピンとして折り畳まれた任意のアプタマーに適合することができるので、aptakiss-aptaswitchの組み合わせは、解析応用に広い潜在的関心を有する。

参考文献：
本出願を通して、種々の参考文献が、本発明が属する最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に組み入れられる。

Claims (57)

1. 少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１と少なくとも１つの核酸分子ＮＡ２を含むキットオブパーツであって：
   ａ）第一の核酸分子ＮＡ１が、ＮＳ１−ＮＳＫ１−ＮＳ２のヌクレオチド酸配列を含み、ここで
   −ＮＳ１及びＮＳ２が、少なくとも１ヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドからなり、そしてＮＳ１及びＮＳ２が相補的配列を有し；
   −ＮＳＫ１が、少なくとも２個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有し，
   ｂ）第二の核酸分子ＮＡ２が、ＮＳ３−ＮＳＫ２−ＮＳ４のヌクレオチド配列を含み、ここで：
   −ＮＳ３及びＮＳ４が、少なくとも１ヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドからなり、そしてＮＳ３及びＮＳ４が相補的配列を有し；
   −ＮＳＫ２が、少なくとも２個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有し
   ｃ）核酸分子ＮＡ１及びＮＡ２が共に、適切な条件で、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をぞれぞれ含む少なくとも１つのヘアピンループを形成することができ；そして
   ｄ）核酸分子ＮＡ１及びＮＡ２が、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含むヘアピンループ間のキッシング複合体の形成によって二本鎖を形成することができ；そして
   ｅ）少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２がターゲット分子に対して特異性及び親和性を示すアプタマーである、キットオブパーツ。
2. ヘアピン構造中に折り畳まれた第一の核酸分子ＮＡ１を含み、ここで、ＮＳＫ１が、ヘアピン構造中に折り畳まれた第二の酸核酸分子ＮＡ２のループ中に存在する第二の核酸配列ＮＳＫ２と相互作用することができる配列ループによって表される、請求項１に記載のキットオブパーツ。
3. ＮＫＳ１が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有する、請求項１に記載のキットオブパーツ。
4. ＮＫＳ２が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有する、請求項１に記載のキットオブパーツ。
5. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＹＲＹＲ、ＲＹＲＹ、ＹＹＲＹ、ＲＹＲＲ、ＹＹＹＲ、ＹＲＹＹ、ＲＹＹＲ、ＹＲＲＹ、ＹＲＲＲ、ＲＹＹＹ、ＲＲＹＲ、ＲＲＹＹ、ＲＲＲＲ、ＲＲＲＹ、ＹＹＹＹ、ＹＹＲＲからなる群より選択される配列を有する）、及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＫＳ１とキッシング複合体を形成することができる）を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
6. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、Ｋ_ｎによって表される）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、Ｋ_ｎ’によって表される）を含み、ここで、Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’が表Ｂに記述されるように選択され、そしてＫ_ｎ及びＫ_ｎ’が同一であるか又は異なる、請求項１に記載のキットオブパーツ。
7. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、Ｋ_ｎによって表される）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、Ｋ_ｎ’によって表される）を含み、ここで、Ｋ_ｎ及びＫ_ｎ’が表Ｃ１に記述されるように選択され、そしてＫ_ｎ及びＫ_ｎ’が同一であるか又は異なる、請求項１に記載のキットオブパーツ。
8. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＣＣＮＹからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＲＮＧＧからなる核酸配列を含む）を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
9. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含む）を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
10. 第一の核酸分子ＮＡ１（ここで、ＮＳＫ１は、ＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含む）及び第二の核酸分子ＮＡ２（ここで、ＮＫＳ２は、ＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含む）を含み、ここで配列ＮＣＣＮＹＮ及び配列ＮＲＮＧＧＮが、それぞれ、表Ｃ２に記述されるように選択される、請求項１に記載のキットオブパーツ。
11. ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３又はＮＳ４が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
12. ＮＳ１がＵＧＣＵＣＧによって表され、そしてＮＳ２がＣＧＡＧＣＡによって表される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
13. ＮＳ３がＡＣＧＡＧＣによって表され、そしてＮＳ４がＧＣＵＣＧＵによって表される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
14. ＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＣＧＣＵＣＧＵ（KG51）によって示される核酸配列を含む第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列を含む第二の核酸分子を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
15. ＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡによって示される核酸配列を含む第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列を含む第二の核酸分子を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
16. ＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡによって示される核酸配列からなる第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列からなる第二の核酸分子を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
17. ＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＣによって示される核酸配列からなる第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列からなる第二の核酸分子を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
18. ＵＣＣＧＡＡＧＵＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＧＧＧＣＧＵＧＵＧＡＡＡＡＣＧＧＡによって示される核酸配列からなる第一の核酸分子及びＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ（KC24-Aptakiss）によって示される核酸配列からなる第二の核酸分子を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
19. アプタマーが、有機小分子、特に少なくとも１つの芳香族環基を含有する有機小分子に特異的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
20. ターゲット分子に特異的なアプタマーである核酸分子が、それがターゲット分子に結合する場合にのみ、キットオブパーツの他の核酸分子との複合体を形成することができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
21. アプタマーが、ターゲット分子に対して産生された以前から公知のアプタマーから誘導される、請求項１８又は１９に記載のキットオブパーツ。
22. 少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２が標識され、ここで、標識が、視覚的、光学的、フォトニック、電子的、音響的、光音響的、質量により、電気化学的、電気光学的、分光法、酵素的、又はそうでなければ化学的、生化学的若しくは物理的に検出可能である標識からなる群より選択される、請求項１に記載のキットオブパーツ。
23. マイクロアレイを形成するために固体支持体中に固定化された少なくとも１つの核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２を含む、請求項１に記載のキットオブパーツ。
24. 少なくとも１つの可変領域によってフランキングされたキッシング複合体を形成することができる配列ＮＡ１又はＮＡ２を含む内部領域を有する核酸分子からなるコンビナトリアルランダムライブラリー。
25. 一般式：
    −５’−Ｐ１−Ｖ−ＮＳＫｎ−Ｐ２−３’又は５’−Ｐ１−ＮＳＫｎ−Ｖ−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖは、少なくとも２つのヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫｎは、核酸配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）、又は
    −５’−Ｐ１−Ｖ１−ＮＳＫｎ−Ｖ２−Ｐ２−３’（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも２つのヌクレオチドの可変領域を表し、ＮＳＫｎは、核酸配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）、又は
    −５’−Ｐ１−Ｘｎ−Ｖ１−ＮＳＫｎ−Ｖ２−Ｙｎ−Ｐ２（式中、Ｐ１及びＰ２は、プライマー領域を表し、Ｖ１及びＶ２は、少なくとも２つのヌクレオチドの可変領域を表し、Ｘｎ及びＹｎは、１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表し、かつＸｎ及びＹｎはハイブリダイズすることができ、そしてＮＳＫｎは、核酸配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２を表す）；
    を有する複数の核酸分子を含む、請求項２４に記載のコンビナトリアルランダムライブラリーであって、
    ＮＳＫｎが、少なくとも２個のヌクレオチドのヌクレオチド酸配列を有し、
    核酸分子が、適切な条件下で、ＮＳＫｎ配列を含む少なくとも１つのヘアピンループを形成することができ、かつキッシング複合体を形成することができ；そして
    ＮＳＫｎ配列が別のヘアピンループとキッシング複合体を形成することができる、コンビナトリアルランダムライブラリー。
26. 可変領域が、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む、請求項２４又は２５に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
27. 可変領域が同じ長さを有するか又は有さない、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
28. ＮＳＫｎが、ＹＲＹＲ、ＲＹＲＹ、ＹＹＲＹ、ＲＹＲＲ、ＹＹＹＲ、ＹＲＹＹ、ＲＹＹＲ、ＹＲＲＹ、ＹＲＲＲ、ＲＹＹＹ、ＲＲＹＲ、ＲＲＹＹ、ＲＲＲＲ、ＲＲＲＹ、ＹＹＹＹ、ＹＹＲＲからなる群より選択される配列を有する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
29. ＮＳＫ１又はＮＳＫ２が、表Ｂ又は表Ｃ１に記述されるように選択されるＫｎ又はＫｎ’によって表される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
30. ＮＳＫ１がＣＣＮＹからなる核酸配列を含むか、又はＮＫＳ２がＲＮＧＧからなる核酸配列を含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
31. ＮＳＫ１がＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含むか、又はＮＫＳ２がＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
32. ＮＳＫ１がＮＣＣＮＹＮからなる核酸配列を含むか、又はＮＫＳ２がＮＲＮＧＧＮからなる核酸配列を含み、ここで、配列ＮＣＣＮＹＮ及び配列ＮＲＮＧＧＮが、それぞれ、表Ｃ２に記述されるように選択される、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
33. 可変領域Ｖ１及びＶ２が、５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；又は３０個のヌクレオチドを含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
34. Ｘｎが、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；又は３０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
35. Ｙｎが、１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；又は３０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリー。
36. 以下の工程：
    ｉ）ターゲット分子を請求項２４〜３５のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリーと接触させる工程；
    ｉｉ）工程ｉ）の混合物を、対応する配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２配列を含む核酸と接触させる工程；
    ｉｉｉ）ターゲット分子に親和性を有する核酸をライブラリーの残りから分割する工程であって、配列ＮＳＫ１及びＮＳＫ２をそれぞれ含む２つの核酸間で形成された二本鎖の形成の検出がターゲット分子に親和性を有する核酸の存在を示す工程
    を含む、ターゲット分子に指向するアプタマーを同定するための方法。
37. ターゲット分子が固体支持体上に固定化されず、流体サンプル中に可溶化される、請求項３６に記載の方法。
38. ターゲット分子に親和性を有する核酸の候補濃縮混合物を生成するための親和性を有する核酸を増幅する工程、場合により、ターゲット分子に最も強い親和性を有するアプタマーを選択するための工程ｉ）〜ｉｉｉ）を何回も繰り返す工程並びに最も強い親和性を有するアプタマーを配列決定及び生成する工程をさらに含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 対応する核酸分子が固体支持体上に固定化される、請求項３６に記載の方法。
40. ターゲット分子ではなく固定化されたヘアピンとキッシング複合体を形成し得る非特異的候補を取り除くための、ターゲット分子の非存在下での、固定化されたヘアピン及び支持体に対するライブラリーの対抗選択からなる工程をさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 陽性候補を溶離する工程をさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. ライブラリー及びターゲット分子を、一緒に、ターゲット分子とライブラリーのメンバーとの相互作用を可能にするのに十分な時間、とりわけライブラリーのメンバーのターゲット分子との立体構造再配列を可能にするであろう十分な時間インキュベートする、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. ターゲット分子が有機小分子である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. ターゲット分子が少なくとも１つの芳香族環基を含有する有機小分子である、請求項４３に記載の方法。
45. サンプル中の少なくとも１つのターゲット分子を検出するための方法であって、ｉ）ターゲット分子に特異的であるアプタマーである核酸分子ＮＡ１又はＮＡ２を含む請求項１〜２３のいずれか一項に記載のキットオブパーツを提供する工程（ここで、前記アプタマーは、それがターゲット分子に結合する場合にのみ、キットオブパーツの他の核酸分子との複合体を形成することができる）；ｉｉ）サンプルをキットオブパーツの核酸分子と接触させる工程、及びｉｉｉ）２つの核酸ＮＡ１とＮＡ２との間に形成される二本鎖の形成を検出する工程からなる工程を含む方法。
46. 工程ｉ）が、ターゲット分子に特異的なアプタマーを各々含む複数のキットオブパーツを提供し、それによってサンプル中の複数のターゲット分子の存在又は非存在を検出する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
47. ターゲット分子が有機小分子である、請求項２８又は２９に記載の方法。
48. サンプルが、個体から単離された生物学的物質、例えば、生物学的組織及び流体（血液、皮膚、血漿、血清、リンパ液、尿、脳脊髄液、涙液、スミア、水のサンプル、特に飲料水、地下水、表流水又は廃水サンプル、環境由来物質から調製されたサンプル、臨床検体又は食品サンプルを含む）からなる群より選択される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
49. サンプルがかなりの量のマグネシウムを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
50. 検出が、液相中、多数の標準的な技術（限定されないが、クロマトグラフィー、電気泳動又は濾過を含む）のいずれかによって実行される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
51. ターゲット分子に特異的なアプタマーではない核酸分子が上述した固体支持体上に固定化され、そして、アプタマーではない核酸分子がターゲット分子に特異的なアプタマーである核酸分子に結合することができるバイオセンサー素子として使用される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
52. 以下の工程：
    ｉ）ターゲット分子を、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のコンビナトリアルランダムライブラリーと接触させる工程
    ｉｉ）工程ｉ）の混合物を、対応する配列ＮＳＫ１又はＮＳＫ２配列を含む核酸と接触させる工程
    ｉｉｉ）ターゲット分子に親和性を有する核酸をライブラリーの残りから分割する工程であって、配列ＮＳＫ１及びＮＫＳ２をぞれぞれ含む２つの核酸間で形成された二本鎖の形成の検出がターゲット分子に親和性を有する核酸の存在を示す工程
    を含む、ターゲット分子に指向するアプタマーを同定するための方法。
53. ターゲット分子に親和性を有する核酸の候補濃縮混合物を生成するための親和性を有する核酸を増幅する工程、場合により、ターゲット分子に最も強い親和性を有するアプタマーを選択するための工程ｉ）〜ｉｉｉ）を何回も繰り返す工程並びに最も強い親和性を有するアプタマーを配列決定及び生成する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
54. 対応する核酸分子が上述した固体支持体上に固定化される、請求項３５又は３６に記載の方法。
55. 非特異的候補及びターゲット分子ではなく固定化されたヘアピンとキッシング複合体を形成し得る候補を取り除くための、ターゲット分子の非存在下での、固定化されたヘアピン及び支持体に対するライブラリーの対抗選択からなる工程をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
56. 陽性候補を溶離する工程をさらに含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
57. ＡＣＧＡＧＣＵＧＧＧＧＣＧＣＵＣＧＵ、ＵＧＣＵＣＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ、ＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡ、ＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡ、ＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＣ、ＵＣＣＧＡＡＧＵＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＧＧＧＣＧＵＧＵＧＡＡＡＡＣＧＧＡ、ＵＧＣＵＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＡ及びＴＧＧＧＧＧＡＣＵＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡからなる群より選択される配列を含むか又は前記配列からなる、核酸分子。