CN101809164B

CN101809164B - 利用核酸酶-适配体复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法

Info

Publication number: CN101809164B
Application number: CN200880018421.XA
Authority: CN
Inventors: A·S·米利根; S·J·弗莱彻
Original assignee: Australian Centre for Plant Functional Genomics Pty Ltd
Current assignee: Australian Centre for Plant Functional Genomics Pty Ltd
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: WO2008122088A1; WO2008122088A8; AU2008235260A1; EP2137321A4; AU2008235260B2; US9181554B2; US20100291561A1; EP2137321A1; CN101809164A; EP2137321B1

Abstract

本发明涉及检测样品中靶核苷酸序列的方法。更具体地说，本发明涉及利用核酸酶-适配体(aptamer)复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法。本发明还提供可用于本明方法的核酸酶结合适配体、核酸酶-适配体复合物和接头分子。

Description

利用核酸酶-适配体复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法

优先权要求声明

本国际专利申请声明要求2007年4月5日提交的澳大利亚临时专利申请2007901826的优先权，该专利申请的内容通过引用纳入本文。

发明领域

本发明涉及检测样品中靶核苷酸序列的方法。更具体地说，本发明涉及利用核酸酶-适配体(aptamer)复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法。

发明背景

业已开发了许多检测感兴趣核苷酸序列(本文也称为“靶核苷酸序列”)的分子技术。在许多其它应用中这些方法已用于，例如，公众健康、食物和水的病原体(GMO)检测、流行病学研究、转基因生物体(genetically modifiedorganism)的检测、医药、临床诊断、疾病可疑性诊断、组织分型、血液筛选、法医学、生物武器检测、分子毒理学、基因治疗和DNA靶向(治疗)，等等。

现有的检测靶DNA序列的方法一般涉及一种分子技术或数种分子技术的组合。这些技术通常分为三类，不严格地定义为：序列特异性检测，序列特异性富集和信号扩增。

大多数检测技术通过利用互补性探针或寡核苷酸与靶DNA样品中感兴趣序列的碱基配对而获知其序列特异性。

聚合酶链式反应(PCR)和Southern印迹法(Southern blot)这两种最常用的DNA检测方法差别是它们如何从此点开始而进行下去。PCR方法通过一系列扩增循环富集靶DNA，通过利用例如颜色、荧光或放射标记的来检测信号。而Southern印迹法虽不包括DNA富集步骤，但利用了高能³²P作信号扩增。这些已广泛使用的技术虽已高度发展，但仍有显著缺点。PCR需要昂贵的设备，费时和对专业技能的需求高。Southern印迹法常常要采用有害的放射标记物，要花费多达一周时间才能完成，并且需要大量的底物DNA。

检测样品中特异性DNA序列的有效生物传感器也有目前所用技术的一种或多种缺陷，但基本上不丧失靶特异性或敏感性是合乎要求的。另外，理想地也要求这类技术的资金输入低(特别是有设备需求的情况下)，专业技能或特定技术培训最少，以及能提供快速精确的结果。

本说明书中提及的任何现有技术，不是和不应被认为或任何形式地提议是承认此种现有技术构成任何国家中常用一般知识的一部分。

发明概述

本发明部分基于检测样品中靶核苷酸序列的方法，其中该方法采用了核酸酶-适配体复合物。

因此，本发明第一方面，提供了一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了此核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时即直接或间接地减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列。

在适配体复合物中核酸酶具体用作指示剂，因为许多核酸酶比其它酶活性高，可实现较高程度的信号扩增。而且现已有广泛阵列的核酸酶可购得，其中许多酶作用于不同的核酸底物或特异性核酸序列。这种靶特异性也使本发明得以提供“多重”检测方法同时检测样品中的多种靶序列。

在本发明的某些实施方式中，所述核酸酶是限制性内切核酸酶。

在一实施方式中，本发明方法利用适配体与靶核苷酸序列之间的杂交来修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合。因此，在一实施方式中，本发明方法包括以下步骤：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时该适配体能与靶核苷酸序列杂交从而修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

如果样品中存在靶核苷酸序列，该序列即与适配体杂交；和

检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。

在本发明上述实施方式中，设计和选择适配体使之包含能结合核酸酶的区域和能与靶核苷酸序列杂交的区域。然而，在本发明另一实施方式中，对设计和选择同时包含核酸酶结合区和靶核苷酸序列结合区的适配体的必要性可通过使用接头核酸而消除。

因此，在另一实施方式中，本发明方法包括以下步骤：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性；

提供一种接头核酸，其包含能与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交的第一部分，并包含该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与适配体杂交的第二部分，其中适配体与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了适配体与核酸酶之间的结合；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

将接头核酸加入到样品中；

使接头核酸第一部分与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交；

当该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时，使接头核酸第二部分与适配体杂交；和

核酸酶-适配体复合物在本发明方法中的使用也使本发明方法能够进行多重检测，即本发明也提供同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法。

第二方面，本发明提供一种筛检某生物体中是否存在靶核苷酸序列的方法，该方法包括：获得该生物体的含核酸样品，及按本发明第一方面的方法检测该样品中是否存在靶核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种核酸酶结合性适配体，该适配体与核酸酶结合可抑制核酸酶的活性。

第四方面，本发明提供一种核酸酶-适配体复合物，其包含与适配体结合的核酸酶。

第五方面，本发明包括一种接头核酸，其包含能与靶核苷酸序列杂交的第一部分，并包含该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与核酸酶-适配体复合物中的适配体杂交的第二部分，其中适配体与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了核酸酶-适配体复合物中适配体与核酸酶之间的结合。

第六方面，本发明提供一种用于实施本发明任何一种方法的试剂盒，该试剂盒包含本发明第三方面的一种或多种适配体；本发明第四方面的核酸酶-适配体复合物；和/或本发明第五方面的接头核酸。

在本说明书全篇中，除了另作指明的内容外，词语“包含”或其变化词，如“包括”或“含有”，应理解为包括所述的基本组分、基本组分的整体或组别，但不排除任何其它基本组分、基本组分的整体或组别。

本文中，用序列标识符(SEQ ID NO：)称呼核苷酸和氨基酸序列。SEQ IDNO：数字与序列表中该序列标识符相对应，如<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ ID NO：2)等等。表1提供了序列标识符概要，说明书末尾处提供了序列表。

表1.序列标识符概要

序列标识符	序列
		SEQ ID NO：1	EcoRI-结合性适配体核苷酸序列基序1
SEQ ID NO：2	EcoRI-结合性适配体核苷酸序列基序2
		SEQ ID NO：3	适配体3_ADJ_L核苷酸序列
SEQ ID NO：4	适配体3_ADJ_L结合性核苷酸序列
		SEQ ID NO：5	CaMV35S启动子靶向核苷酸序列
SEQ ID NO：6	结核分枝杆菌靶向核苷酸序列

示范性实施方式的描述

应理解，以下描述目的只是说明具体实施方式，不是将本发明限制于所描述的方面。

第一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，其中当样品中存在靶核苷酸序列时适配体对核酸酶活性的抑制被直接或间接地减少或消除；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

检测该核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。

要检测靶核苷酸序列的“样品”可以是推测含有靶核苷酸序列的任何样品。例如，此样品可以是生物学样品，包括得自生物体的样品，含一种细胞或多种细胞的样品，血液样品，血浆样品，及脑脊液(CSF)样品，羊水样品等等；环境样品，如水、空气或土壤样品；食物或饮料样品等等。此处考虑的样品可以粗制形式使用，或可按本发明方法加工后使用。例如，可对所述样品进行一个或几个核酸提取或纯化步骤以使样品中存在的任何核酸纯化或半纯化。本领域技术人员不难确定提取和纯化一系列样品中核酸的方法。关于这点，可参见“核酸方案手册(The Nucleic Acid Protocols Handbook)”(Rapley主编，Humana出版社，2000)。

参见本文，“核酸酶”应理解为能切割核酸的糖-磷酸骨架的任何酶。这样，“核酸酶”应理解为包括内切核酸酶和外切核酸酶。此外，考虑可用于本发明的核酸酶可以是脱氧核糖核酸酶(切割DNA)或核糖核酸酶(切割RNA)。通常本发明用的核酸酶，是一旦受到适配体抑制其活性降低或消失而不能切割或消化靶核苷酸序列，但仍能切割或消化其它核苷酸序列(如报告核酸，见下文)的核酸酶，故可检测此核酸酶的活性。可用于本发明的核酸酶包括，例如，限制性内切核酸酶、能切割序列错配的核酸酶、S1核酸酶、T7内切核酸酶I、T4内切核酸酶VII、CEL I(属于S1核酸酶家族的一种植物特异性胞外糖蛋白)和核糖核酸酶，如RNA酶A和H)。

然而，在本发明某些具体实施方式中(见下文)，核酸酶可以是限制性内切核酸酶。

术语“适配体”本文中应理解为一种核酸分子，此分子的至少一部分能结合另一分子。

核酸适配体通常是单链核酸分子，具有复杂的二级或三级结构(如下文讨论的可包含双链部分或区域)，能以高亲和力特异性结合靶分子。当与酶结合时，某些适配体能降低或抑制酶的活性。本发明考虑的核酸酶结合适配体至少能结合一种核酸酶而改变此酶的活性。而且，本发明考虑的核酸酶结合性适配体当与核酸酶结合时，通常降低或消除了此酶的活性。本发明的适配体也可包含不结合核酸酶的区域，此区域或核酸酶结合区域本身也可显示对其它分子如靶核苷酸序列或接头核酸具有结合亲和力(见下文)。

考虑可用于本发明的适配体可以是任何合适的核酸或其等价物。就此点而言，所述适配体包括，例如DNA、RNA、核酸拟似物如肽核酸(PNA)或封闭的核酸(LNA)、含有一个或多个修饰核苷酸的DNA或RNA等等。“修饰的”核苷酸包括，例如，其磷酸骨架、糖部分或碱基部分含有化学修饰的、含三苯甲基化碱基的和含稀有碱基如肌苷的核苷酸。采用修饰的核苷酸还可影响适配体与核酸酶的结合特性，例如参见Latham等(Nucl Acids Res 22(14)：2817-2822，1994)所述。

在某些具体实施方式中可采用RNA适配体，因为RNA能形成DNA通常不能形成的二级结构，如假结和碱基三连体。

核酸适配体也可用许多方法修饰，例如用以提高其稳定性，包括例如：

(i)用L-核苷酸(天然核苷酸的镜像物)合成适配体，这样它们不会被天然核酸酶降解；

(ii)在适配体中掺入封闭的核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)残基，LNA和PNA也能增强核酸双链体的稳定性；

(iii)其它化学修饰的核糖核酸，如2’-氨基-和2’-氟-嘧啶核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；和/或

(iv)用脱氧胸苷加帽3’末端以增强其对外切核酸酶的抗性。

可用本领域已知的方法产生能结合和抑制特定蛋白质(如核酸酶)活性的核酸适配体。例如，可采用体外选择法(如参见Ellingon和Szostak，Nature 346(6287)：818-22，1990)和SELEX法(如参见Tuerk和Gold，Science 249(4968)：505-510，1990)。也可在Osborne和Ellington(Chem Rev 97(2)：349-370，1997)的综述中找到关于产生和选择适配体的进一步细节。

鉴于以上所述，“核酸酶-适配体复合物”应理解为核酸酶已与适配体结合，或在实施本发明方法的条件下核酸酶与适配体可形成结合，因此适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，但当样品中存在靶核苷酸序列时，其直接或间接减少或消除了适配体对核酸酶活性的抑制。

在本发明的某些实施方式中，样品中存在的靶核苷酸序列能修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合，从而减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制。

本文提及的修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合，指适配体与核酸酶之间结合性质的任何质或量的变化，这种变化造成了适配体对核酸酶活性抑制的降低或消除。这种变化的出现是由于适配体与另一种分子(如靶核苷酸序列或接头核酸)之间发生结合，或核酸酶-适配体复合物与另一种分子(如靶核苷酸序列或接头核酸)之间发生结合的结果。

适配体与核酸酶之间结合性质的“质或量的变化”可包括，例如，核酸酶与适配体之间结合强度的变化；核酸酶和/或适配体相互作用或结合位点的变化；核酸酶-适配体复合物的解离，任选地适配体与另一分子的结合；适配体或核酸酶的构型、二级结构或三级结构的变化降低了适配体对核酸酶的抑制；适配体和/或核酸酶上结合位点相对位置的改变等等。

在一实施方式中，本发明方法利用适配体与靶核苷酸序列之间的杂交来修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合。

因此，在一实施方式中，本发明方法可包括以下步骤：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，其中当样品中存在靶核苷酸序列时，该适配体能与靶核苷酸序列杂交而修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

如果样品中存在靶核苷酸序列，该序列即与适配体杂交；和

在本发明此实施方式中，适配体能与靶核苷酸序列杂交而修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合。在样品的起始条件下，可发生靶核苷酸序列与适配体之间的杂交，与伴随的核酸酶与适配体之间结合的修饰、减少或消除，或者可改变条件以使适配体与靶核苷酸序列(如果存在的话)之间发生结合或促进其结合。

例如，可通过改变盐浓度和/或温度来改变适配体与靶核苷酸序列之间的结合，和/或适配体与核酸酶之间的结合。此外，也可利用去稳定剂如甲酰胺来改变适配体与任何核酸酶、靶核苷酸序列和/或接头核酸的结合。

在本发明此实施方式中，应设计或选择同时包含核酸酶结合区域和至少在某些杂交条件下能与靶核苷酸序列杂交的区域的适配体。这些区域可隔开一个或多个核苷酸残基，部分重叠，全部重叠，或一个区域可包含在另一个区域中，

然而，在本发明另一实施方式中，设计或选择同时包含核酸酶结合区和靶核苷酸序列结合区的适配体的必要性可通过利用接头核酸而消除。

因此，在另一实施方式中，本发明方法包括以下步骤：

提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，其中适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性；

提供一种接头核酸，其包含能与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交的第一部分，并包含当该接头核酸的第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与适配体杂交的第二部分，其中适配体与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了适配体与核酸酶之间的结合；

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

将接头核酸加入到样品中；

使接头核酸的第一部分与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交；

当该接头核酸的第一部分与靶核苷酸序列杂交时，使接头核酸的第二部分与适配体杂交；和

在一实施方式中，所述接头核酸包含一茎环结构，并且该接头的第一部分至少一部分包含在该茎环结构的环中，该接头的第二部分至少一部分包含在该茎环结构的茎干中。

在一实施方式中，当接头与靶核苷酸序列结合时，所述接头第二部分(即适配体结合部分)的长度通常足够允许其茎干部分变性或解离。如此，接头的第一部分(至少其一部分包含在茎环的环区内)杂交时通常会作用于接头的茎干部分使之变性或解离，从而暴露出接头核酸的适配体结合区。鉴于以上所述，茎环结构的茎干部分通常包含至少5个核苷酸，并且其长度可延伸约50个核苷酸。然而，不应认为这将本发明限制于任何特定长度的序列，而是本发明可采用能提供上述功能的其它长度序列。

在另一实施方式中，设计的接头当与靶序列杂交时，该接头第一部分的解链温度高于接头茎干的解链温度。在某些实施方式中，当与靶序列杂交时，该接头第一部分的解链温度高于接头茎干的解链温度约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃或约20℃。在一具体实施方式中，当与靶序列杂交时，该接头第一部分的解链温度高于接头茎干的解链温度约10℃。

在此实施方式中，当样品中存在靶核苷酸序列时，热变性或化学变性的接头与靶序列的结合优先于热变性或化学变性后引入复性条件而恢复其天然的茎/环结构。

该茎环结构的茎干部分可以是完全同源的，即杂交序列中无错配。或者，此茎干部分可包含一个或多个错配碱基对。例如，在本发明方法中，可利用此种错配来促进茎环结构的茎干部分变性，和/或使适配体与茎干部分之间杂交。也可将例如错配和/或突出端掺入到该茎干中以获得合适的解链温度差异，从而避免需要过分长的靶-互补序列。

在其它实施方式中，所述的第一部分可不全部包含在环中，也可以是茎干的一部分。类似地，所述第二部分可以不需要全部包含在茎干部分中，可以伸入环部分。

在其它实施方式中，接头的第一和第二部分可以隔开一个或多个核苷酸残基、部分重叠、全部重叠，或一个区域可包含在另一个区域中。

采用本发明此实施方式的接头核酸也提供了一个显著的优点，即不需要设计和选择具有靶核苷酸序列结合区域的适配体。而是，可将该靶核苷酸序列结合区域掺入到所述接头的第一部分中，和设计与适配体结合的接头第二部分。这样提供的好处是，掺入接头核酸中的适配体结合性核苷酸序列比设计或选择同时包含核酸酶结合区域和靶序列结合区域的适配体更简单和/或费时更少。即，可以设计出能结合某适配体(其能结合核酸酶)的接头核酸，而不是根据能否结合核酸酶和靶核苷酸序列二者来选择适配体。另一显著优点是，可采用单一的一种核酸酶-适配体复合物，简单地通过修饰接头的第一部分来检测许多不同的靶序列。

如以上所述，本发明方法涉及检测核酸酶的活性，其中核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列。

检测核酸酶活性所用的方法可以是适合检测目标核酸酶的任何方法。例如，分别通过观察DNA、RNA或DNA/RNA杂交报告核酸的降解或切割来确定DNA酶或RNA酶的活性。此种报告核酸可以是单链或双链核酸，只要适合于核酸活性的检测即可。可用任何已知方法检测报告核酸的切割。例如，可用电泳方法、染色方法、标记核苷酸的释放、荧光/猝灭剂标记核酸被切断而释放荧光团，来检测报告核酸被切断成较低分子量的产物等等。

如以上所述，在某些具体实施方式中，本发明所用的核酸酶是限制性内切核酸酶。如本文所述，“限制性内切核酸酶”指能结合双链DNA的特定核苷酸序列的任何内切核酸酶，如果DNA双链的所述序列缺乏相应的修饰，就在该DNA分子的识别序列或另一位点切割该DNA。本领域技术人员不难查明，有许多具有不同识别位点和不同切割位点的限制性内切酶。例如，可从NewEngland Biolabs(Ipswich，MA，USA)处获得许多限制性内核酸酶。

在本发明采用限制性内切核酸酶的实施方式中，通过其对包含双链DNA至少一个区域的报告核酸的切割速率或程度来测定限制性内核酸酶的活性。

在一具体实施方式中，使荧光团结合于该报告核酸，能猝灭荧光团荧光的猝灭剂也结合于该报告核酸，当该报告核酸被核酸酶切断时即减少或消除了猝灭剂对荧光团的猝灭作用。

本领域技术人员不难获得示范性荧光团和猝灭剂的信息，关于这点可参考Marras的综述(Methods Mol Biol 335，3-16，2006)。

在一具体实施方式中，如Biggins等(Proc Natl Acad Sci USA，97(25)：13537-13542，2000)所述，包含荧光团和猝灭剂的报告核酸可包含分子断裂光(molecular break light，MBL)。

在另一示范性实施方式中，一条多肽结合于该报告核酸并且固定物也结合于该报告核酸，当报告核酸被切断时使多肽从固定物释放，因此当报告核酸与固定物的固定处被切断后，未固定多肽的量可表明核酸酶的活性。

本领域技术人员不难弄明白各种“固定物”的信息，可包括，例如：

(i)某种抗原，可通过使之接触能结合该抗原的固定抗体而将其固定；

(ii)某种抗体，可通过使之接触能结合该抗体的固定抗原或抗独特性抗体而将其固定；

(iii)含有组氨酸尾的多肽，可通过使之接触包含镍或钴离子的亲和介质将其固定；

(iv)生物素，可通过使之接触固定的亲和素或链霉亲和素而将其固定；

(v)亲和素或链霉亲和素，可通过使之接触固定的生物素而将其固定；和/或

(vi)磁性或顺磁性颗粒，可通过磁场将其固定。

如上所述，某些固定物可通过使之接触本身已被固定的结合伴侣而固定。采用该领域已知的方法可达到结合伴侣的固定。例如，可将固定物的结合伴侣固定在培养瓶、培养管或平板(已预先用试剂如硅烷处理过)表面上，固定在珠子或其它颗粒表面上，固定在层析柱或其它层析介质上，或固定在膜上。

本领域技术人员也不难获得许多其它固定物的信息，不应认为本发明以任何方式受限于以上例举的固定物。

在一具体实施方式中，所述固定物是磁珠，通过向样品施加磁场来影响固定物的固定。

被固定物固定后，可用蛋白检测的标准方法检测样品中仍然“游离”的多肽，如本领域所知，例如，电泳、免疫色谱试验：包括横向流纸条、免疫印染、质谱、用生物传感器检测(基于生物传感器的溶液蛋白质检测综述参见Leca-Bouvier和Blum，Analytical Letters，38(10)：1491-1517，2005)。可在“蛋白和蛋白质组学：实验室手册(Protein and Proteomics：A LaboratoryManual)”(Simpson，CSHL出版社，2003)中找到许多示范性蛋白质检测方法。

在本发明方法中采用核酸酶-适配体复合物也使本发明方法可进行多重检测，即本发明提供了可同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法。

例如，在适配体结合靶核苷酸序列的本发明实施方式中，同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法可包括：提供多种核酸酶-适配体复合物，其中至少两种核酸酶-适配体复合物包含(i)能与不同靶核苷酸序列发杂交的适配体，

(ii)其活性可分别检测的不同核酸酶。

在适配体结合于接头核酸的本发明实施方式中，同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法包括：

提供多种接头核酸，其中至少两种接头核酸包含能与不同靶核苷酸序列杂交的不同的第一部分，并且还包含能与不同适配体杂交的不同的第二部分；和

提供多种核酸酶-适配体复合物，其中至少两种核酸酶-适配体复合物包含能与不同的接头核酸第二部分优先杂交的适配体，并且包含其活性能分别检测的不同核酸酶。

在另一实施方式中，采用单一的一种核酸酶-适配体复合物来检测样品中的一种或多种不同靶序列。即在适配体结合接头核酸的本发明实施方式中，同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法，包括：

提供多种接头核酸，其中至少两种接头核酸包含能与不同靶核苷酸序列杂交的不同的第一部分，但该接头核酸包含能与同一适配体杂交的第二部分；和

提供含有能与该接头核酸第二部分杂交的适配体的核酸酶-适配体复合物。

在上述实施方式中，核酸酶活性升高表明样品中存在一种或多种靶核苷酸序列。

如上所述，可断言，本发明方法同时检测样品中多种靶核苷酸序列的某些实施方式部分是基于采用了多种核酸酶-适配体复合物，其中至少两种核酸酶-适配体复合物包含其活性能分别检测的不同核酸酶。

如上文所述“其活性能分别检测的不同核酸酶”指，例如，其作用是切割或消化可鉴别性报告核酸的核酸酶。例如，一种可切割或消化RNA的核酸酶，而另一种可切割或消化DNA。

在另一实施方式中，提供多种报告核酸，其中至少两种包含提供不同限制性内切核酸酶识别位点和/或切割位点的不同核苷酸序列。

例如，可用电泳方法、标记核苷酸的释放、荧光团/猝灭剂标记的核酸被切断释放出荧光团等等，来检测对不同报告核酸的切割，只要能够鉴别一种报告核酸与另一种报告核酸的切断即可。

例如，在一实施方式中，用于不同核酸酶的这种报告核酸包含的荧光团从猝灭剂释放后能被分别检测。

在另一实施方式中，用于不同核酸酶的这种报告核酸包含的多肽从固定物释放后能被分别检测。

“从固定物释放后能被分别检测”的多肽包括，例如，可用电泳或质谱分辨的分子量不同的多肽，可用等电聚焦分辨的带有不同电荷的多肽，可利用抗体结合活性差异分辨的具有不同抗原性的多肽，具有不同酶活性可用一种或多种酶活性试验分辨的多肽，具有一种或多种独特物理特征(如特定波长荧光)可依据不同物理特征分辨的多肽，掺入了一种或多种独特的可检测标记(如放射标记、化学标记或荧光标记)的多肽，等等。

第二方面，本发明提供筛检某生物体是否存在靶核苷酸序列的方法，该方法包括：获得该生物的核酸样品，及按照本发明第一方面方法检测样品中存在的靶核苷酸序列。

本发明第二方面的方法可用于检测生物体核酸样品中的任何靶核苷酸序列。例如，此靶核苷酸序列可以是该生物体的内源性或天然的核苷酸序列，或者，此靶核苷酸序列可以是引入的或外源的核苷酸序列。因此，可用本发明第二方面方法检测的靶核苷酸序列包括，例如，基因组核苷酸序列、转基因、等位基因核苷酸序列、单个核苷酸多样性、突变的核苷酸序列、转座子核苷酸序列或病毒核苷酸序列。

本发明第二方面的方法可用于检测任何生物体中的靶核苷酸序列。然而，在一具体实施方式中，本发明第二方面的方法可用于检测植物核酸样品中的靶核苷酸序列。在本发明此实施方式的内容中，应将植物的核酸样品理解为包括活植物的样品(或其一部分，如器官、组织或细胞)或得自植物的样品或其经过加工的部分，如用作食物的经过加工的植物部分(如面粉等等)。

检测植物中特定的核苷酸序列特别有用，例如，诊断植物的疾病，检测食物污染，植物和植物各部分的分类学鉴定，及检测基因修饰的植物(受环境影响或加工用作食物的植物)。

在一具体实施方式中，本发明应用于检测粮食中的基因修饰植物。就此点而言，已知晓在95％以上现有的基因修饰的农作物植物中发现了花椰菜镶嵌病毒35S启动子、根癌土壤杆菌胭脂碱合酶终末子和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)编码核苷酸序列的至少一种。因此，这些序列代表了检测基因修饰植物材料特别有价值的目标靶子。

因此，在本发明第二方面的一个具体实施方式中，所述靶核苷酸序列包括：花椰菜镶嵌病毒35S(CaMV 35S)启动子序列、根癌土壤杆菌胭脂碱合酶(nos)终末子序列、或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)编码核苷酸序列之一种或多种。

第三方面，本发明还提供一种核酸酶-结合性适配体。本发明第三方面的核酸酶-结合性适配体的作用通常是与某核酸酶结合时可抑制该核酸酶的活性。

可用已报导的已知的适配体产生或选择方法制备本发明的适配体。

在某些实施方式中，本发明的适配体能结合和/或抑制限制性内切核酸酶的活性，包括修饰的限制性内切核酸酶识别序列。术语“修饰的限制性内切核酸酶识别序列”应理解为适配体中能结合某限制性内切核酸酶的一种核苷酸序列，但此种序列又足以与该限制性内切核酸酶的天然识别序列相区别，因此该适配体本身不是此制性内切核酸酶切割的底物。

在某些实施方式中，修饰的限制性内切核酸酶识别序列包含适配体的双链区域，该区域含有该限制性内切核酸酶的携带有一个或多个以下修饰的天然识别序列：

(i)相对于天然识别序列的核苷酸序列，其一条或二条链中含有一处或多处核苷酸取代；

(ii)该修饰的识别序列中含有一对或多对核苷酸错配；

(iii)相对于其天然识别序列，含有一处或多处双链插入或缺失；和/或

(iv)该修饰的识别序列一条或二条链中含有一处或多处插入或缺失从而形成环状结构，此环状结构在双链区的一条或二条链中含有一个或多个不成对的核苷酸。

修饰的限制性内切核酸酶识别序列相对于天然序列可包含一个或多个修饰。例如，根据所要修饰的天然识别序列的性质和长度制作1、2、3、4、5、6、7、8、9、10处或更多处修饰。然而，实施时，修饰的数目将受到使适配体保留其结合限制性内切酶能力的同时所能耐受的修饰数目的限制。

在一具体实施方式中，限制性内切核酸酶识别序列相对于其天然识别序列含有单一的一个核苷酸取代。在另一具体实施方式中，限制性内切核酸酶识别序列相对于其天然识别序列含有单一的一条链缺失从而形成环状结构，此环状结构在该修饰的限制性内切核酸酶识别序列的相反链中含有单个不成对的核苷酸残基。在还有一实施方式中，相对于其天然序列，此环状结构中的单个不成对核苷酸残基被取代。

在一实施方式中，核酸酶-结合性适配体能结合EcoRI(酶)并在结合时抑制EcoRI的活性。

在一实施方式中，本发明的EcoRI结合性适配体包含以下核苷酸序列基序：

5’-GAGTTC-3’(SEQ ID NO：1)

在另一实施方式中，本发明的EcoRI结合性适配体还可包含以下核苷酸序列基序：

5’-HSGAGTTCWR-3’(SEQ ID NO：2)

此基序中，H可以是A、T或C之一；S可以是C或G；W可以是A或T；和R可以是A或C。

在还有一实施方式中，本发明的EcoRI结合性适配体包含以下所示修饰的EcoRI识别序列：

5’-GAGTTC-3’

3’-CT-AAG-5’

其中，粗体表示的G残基是形成环状结构的不成对核苷酸残基。

在还有一实施方式中，本发明的EcoRI结合适配体可包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其保留了结合和抑制EcoRI活性能力的变体。通常，所考虑的这种变体包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列基序，和/或包含以上所示修饰的EcoRI识别序列。

第四方面，本发明还提供包含结合于适配体的核酸酶的核酸酶-适配体复合物。通常，在核酸酶-适配体复合物中适配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性。

在某些实施方式中，核酸酶-适配体复合物可包含已结合于适配体的限制性内切核酸酶。在这些实施方式中，该核酸酶-适配体复合物中的适配体可包含上文所述的修饰的限制性内切核酸酶识别序列。

在一具体实施方式中，所述核酸酶-适配体复合物包括EcoRI-适配体复合物。在此实施方式中，该EcoRI-适配体复合物中的适配体可以是上述EcoRI-结合性适配体。

可明白，也可将本发明扩展到之前描述的核苷酸序列的检测方法，其中核酸酶-适配体复合物是本发明第四方面所述的核酸酶-适配体复合物。

第五方面，本发明还包括接头核酸，其包含能与靶核苷酸序列杂交的第一部分，和当该接头核酸第一部分与靶核苷酸杂交时能与核酸酶-适配体复合物中的适配体杂交的第二部分，其中，适配体与接头核酸基序第二部分之间的杂交减少或消除了该核酸酶-适配体复合物中适配体与核酸酶之间的结合。

在一实施方式中，接头核酸包含一种茎环结构，该接头第一部分中的至少一部分包含在此茎环结构的环中，而该接头第二部分中的至少一部分包含在此茎环结构的茎干中。

在另一实施方式中，设计接头，其第一部分与靶序列杂交后的解链温度高于上述该接头茎干的解链温度。

在一具体实施方式中，所述接头包含的第二部分能与前述EcoRI-结合性适配体杂交。在另一具体实施方式中，能与EcoRI-结合性适配体杂交的该接头的第二部分包含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

该接头的第一部分可适合与任何感兴趣靶核苷酸序列结合。在一示范性实施方式中，可使该接头分子第一部分适合与花椰菜镶嵌病毒35S启动子核苷酸序列的某一区域杂交。在一更具体的实施方式中，可使该接头分子第一部分适合与含有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的花椰菜镶嵌病毒35S启动子核苷酸序列的区域杂交。

在另一示范性实施方式中，可使该接头分子第一部分适合与结核分枝杆菌的核苷酸序列杂交。在一更具体的实施方式中，可使该接头分子第一部分适合与含有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的结核分枝杆菌核苷酸序列杂交。

可明白，本发明也可扩展到之前描述的核苷酸序列的检测方法，其中接头核酸是本发明第五方面所述的接头核酸。

第六方面，本发明提供一种实行本发明任何方法的试剂盒，该试剂盒装有：本发明第三方面的一种或多种适配体；本发明第四方面的核酸酶-适配体复合物；和/或本发明第五方面的接头核酸。

最后，可参见执行本发明所包括的基本技术方法的分子生物学标准教课书，书中包括了本文所述的产生各种基因构建物的DNA限制性内切和连接内容。参见，例如，Maniatis等人的“分子克隆：实验室手册”(Cold Spring haborlaboratory出版社，纽约，1982)和Sambrook等(2000，同上)。

现通过以下非限制性实施例对本发明作进一步阐述。

附图的简要说明

图1显示按照本发明一实施方式检测样品中靶核苷酸序列的方法。

图2显示按照本发明另一实施方式检同时测样品中多种靶核苷酸序列的方法。

图3显示示范性的接头分子和它们的靶序列。A：任意的靶-接头和靶序列。互补的靶序列为兰色阴影。B：35S-接头和靶序列。互补的靶序列为绿色阴影。C：结核分枝杆菌-接头和靶序列。互补的靶序列为黄色阴影。所有检测器中适配体结合序列(触发部分)为红色阴影。用MFOLD程序(Zucker，2003http://fronten.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-forml.cgi)获得了预计的二级结构。

图4显示，A：适配体3_ADJ_L。除了5’和3’引物-结合区的一部分外，适配体3_ADJ_L的核苷酸序列与SELEX方法中鉴定到的适配体3相比没有变化。EcoRI强抑制剂中的普遍保守区为红色阴影。对该接头分子触发部分的结合位点毗邻绿色点线。B：能强抑制EcoRI的适配体的保守区。假设适配体核苷酸序列的此部分是介导抑制EcoRI活性的主要位点的一个元件。

图5显示，存在靶核酸时接头从无活性转化成活性状态的一个实例。在接头处于灭活状态时，其触发部分结合于互补的茎干伴侣，因而不能结合适配体3_ADJ_L。在其活化状态时，该靶-互补序列结合于靶核酸，触发序列游离以结合适配体3_ADJ_L。

图6显示适配体3的凝胶-迁移试验，采用适配体3产生的不对称PCR产物。电泳迁移减慢伴随着高分子量条带，表明适配体3/EcoRI复合体的存在。表明适配体3结合于限制性内切酶EcoRV或牛血清白蛋白(BSA)的同样条带没有出现。

图7显示EcoRI的分子断裂光(molecular break light，MBL)。此处显示了预计的茎/环发夹二级结构。该寡核苷酸包含5’荧光团和3’淬灭剂。该分子的茎干(红色阴影)中存在限制性内切酶EcoRI的识别序列。被EcoRI切断后，荧光团与猝灭剂解链分离，而产生可检测的荧光信号。

图8显示对结核分枝杆菌靶序列的生物传感器试验结果。每种处理的标准化荧光输出是至少三次重复反应的平均值。5分钟时间后300nM靶序列的存在有迹可寻，与0nM靶DNA序列和300nM非靶DNA序列阴性对照有明显区别。

图9显示对CaMV 35S启动子靶序列的生物传感器试验结果。每种处理的标准化荧光输出是四次重复反应的平均值。15分钟时间后300nM靶序列的存在有迹可寻，与0nM靶DNA序列和300nM非靶DNA序列阴性对照有明显区别。

图10是一种任意靶序列的生物传感器试验结果。每种处理的标准化荧光输出是四次重复反应的平均值。10分钟时间后该任意靶序列(300nM)的存在有迹可寻，与0nM任意的靶序列和300nM非靶DNA序列阴性对照有明显区别。

图11显示半定量生物传感器试验的结果。靶(结核分枝杆菌产生的寡核苷酸)序列浓度从0nM递增至500nM导致在给定时间期间信号强度(荧光单位)升高。数据是至少二次重复反应的标准化平均值。

图12显示多重生物传感器试验的结果。在一次试验中，同时检测了两种之一或两种靶序列(35S和结核分枝杆菌)。

实施例1.检测靶核苷酸序列的方法

下面对应于图1描述本发明一实施方式的方法。

图1的分图1显示了靶核苷酸序列100和含有茎环结构的接头核酸110。该茎环结构的环部分112包含能与靶核苷酸序列100杂交的第一核苷酸序列113；该茎环结构的茎干部分114包含当第一核苷酸序列113与靶核苷酸序列100杂交时某适配体能与之结合的第二核苷酸序列115。

分图2显示了接头核酸110中第一核苷酸序列113与靶核苷酸序列100之间的杂交。此杂交引起该茎环结构的茎干部分114解离从而暴露出第二核苷酸序列115，使其可用于结合核酸酶-适配体复合物120中的适配体。

分图3显示了适配体124与第二核苷酸序列115之间的杂交。此杂交减少或消除了适配体124对核酸酶122的抑制。图中，此种抑制的减少和消除表现为适配体124与核酸酶122的分离，部分作为一种概念帮助。然而，如上文所述，适配体124对核酸酶122抑制的减少或消除可能或可能并不涉及核酸酶122与适配体124之间真正的分离。

分图4中，核酸酶122脱离了适配体124的抑制而活化，可通过核酸酶122是否切断了报告核酸130来检测。报告核酸130含有可被核酸酶122切割的核苷酸序列132。报告核酸130也含有结合的荧光团134和结合的猝灭剂136，后者的作用是猝灭荧光团134的荧光。

然而，如分图5所示，报告核酸130被切断成含荧光团的片段138和含片段140的猝灭剂，减少或消除了猝灭剂136对荧光团134的猝灭。因此，核酸酶122切断报告核酸130导致了可检测到荧光团134发出的荧光信号。

实施例2.同时检测多种靶核苷酸序列的方法

下面对应于图2描述本发明另一实施方式的方法。

图2的分图1显示了三种不同的靶核苷酸序列200/300/400，和各自含有茎环结构的三种接头核酸210/310/410。该茎环结构的环部分各包含能与特定靶核苷酸序列200/300/400杂交的第一核苷酸序列213/313/413。具体说，第一核苷酸序列213能与靶核苷酸序列200特异性杂交；第一核苷酸序列313能与靶核苷酸序列300特异性杂交；第一核苷酸序列413能与靶核苷酸序列400特异性杂交。接头核酸的茎干部分各自包含第二核苷酸序列215/315/415，当第一核苷酸序列213/313/413与靶核苷酸序列200/300/400杂交时，特异性适配体即与第二核苷酸序列215/315/415特异性结合。

分图2显示了第一核苷酸序列213/313/413与靶核苷酸序列200/300/400之间的杂交。此杂交引起茎环结构的茎干部分解离从而暴露出第二核苷酸序列215/315/415，使之能分别用于结合核酸酶-适配体复合物220/320/420中的适配体224/324/424。每种适配体均能优先与不同的第二核苷酸序列特异性杂交，具体来说，适配体224/324/424分别优先与各自的第二核苷酸序列215/315/415杂交。此外，核酸酶-适配体复合物220/320/420各自含有不同的核酸酶222/322/422，其活性可分别检测。具体来说，在此实施方式中，核酸酶222/322/422是各自能识别不同切割位点的限制性内切核酸酶。

分图3显示了适配体224/324/424与第二核苷酸序列215/315/415之间的杂交。此杂交减少或消除了适配体224/324/424对核酸酶222/322/422的抑制。见图1，抑制的此种减少或消除表现为适配体224/324/424与核酸酶222/322/422的分离，部分作为一种概念帮助。然而，如前文所述，适配体224/324/424对核酸酶222/322/422抑制的减少或消除可能或可能并不涉及核酸酶222/322/422与适配体224/324/424之间的真正解离。

分图4，可通过切断不同的报告核酸来检测核酸酶222/322/422各自的活性。此种报告核酸各自包含有不同的核苷酸序列，每种序列分别可被核酸酶222/322/422之一特异性切割。

这些报告核酸各自也包含不同的结合荧光团234/334/434，及能猝灭各荧光团234/334/434荧光的结合猝灭剂236/336/436。然而，当各报告核酸被切断成含片段238/338/438的荧光团和含片段240/340/440的猝灭剂时，即减少或消除了猝灭剂236/336/436对荧光团234/334/434的猝灭。不同荧光团234/334/434各自有不同的发射光谱，因此一旦脱离了猝灭剂236/336/436的作用而释放，即可分别检测到各荧光团234/334/434的信号。

因此，核酸酶222/322/422分别切断一种或多种报告核酸，导致可检测到从荧光团234/334/434发出的一种或多种各自可检测的荧光信号。

实施例3.利用EcoRI-适配体3_ADJ_L复合物的生物传感

在一实施方式中，本发明方法所用的靶序列特异性检测机制包含一种接头分子，当其与靶核酸杂交时能从“无活性”构型转变成“活性”构型。此“活性”构型中，接头能结合含限制性内切酶(此例为EcoRI)复合物中的适配体，使该内切酶从适配体-介导的抑制中释放。在“无活性”构型时，该接头不能与内切酶/适配体复合物相互作用或作用能力显著降低，当从抑制中释放时，该核酸酶分子即能切断信号分子产生可检测信号。此系统是半定量系统，在一个分散范围内产生的信号强度与溶液中的靶核酸分子含量成比例。

为了证明此系统可应用于真实世界的核酸检测情况，采用了合成的靶序列，它们代表通常表明植物发生了基因改变的花椰菜镶嵌病毒35S启动子和引起严重的世界性传染病的结核分枝杆菌基因组中所含的核苷酸序列。

生物传感系统的此实施方式是模块化的，有三种主要成分：靶-检测接头、限制性内切核酸酶/适配体复合物和分子断裂光信号分子。

此靶-检测模块包含：折叠成稳定的茎/环发夹二级结构的寡核苷酸接头(其环部分与靶序列互补)和称为“触发”部分的双链茎干部分的一条链(与适配体3_ADJ_L假设的EcoRI结合区互补)(图3和4)。

设计的此接头当与靶序列杂交时，该分子的靶-互补部分的解链温度比含触发部分茎干结构的解链温度高约10℃。这样确保了溶液中存在靶核酸时，该接头与靶序列结合经加热变性和冷却后优先逆转恢复其天然茎/环结构。因此，含错配和触发部分的茎干伸出得以获得合适的解链温度差异而不需要过分长的靶-互补序列(图5)。

采用SELEX方案已鉴定到许多能强烈特异性结合EcoRI的独特适配体(如图6)。所分析的大多数适配体能显著抑制EcoRI的活性。用于生物传感器适配体/EcoRI复合物中的理想适配体应当不仅能强烈特异性抑制EcoRI，而且具有易于通过该接头分子的短触发部分杂交而受破坏的二级和三级结构。

经SELEX鉴定的许多EcoRI-抑制性适配体包含有假设能结合EcoRI酶活性位点的高度保守核苷酸序列，可能是由于该保守区的序列类似于EcoRI的识别区(图4b)。因为保守区中预计的适配体二级结构含有错配，该位点特别易于通过结合足够长度的偏爱互补寡核苷酸发生链置换而变性。适配体3被选为这类适配体的一个例子。根据适配体3的核苷酸序列，商业上合成了其去除了SELEX引物结合位点部分的修饰版本(适配体3_ADJ_L)，构成了生物传感器的适配体/EcoRI模块的基础。

当接头分子与靶核酸结合构转变成其活性状态时，暴露出的触发部分能结合适配体3_ADJ_L，继而适配体3_ADJ_L构型改变为不再能抑制EcoRI的活性。

为检测活化EcoRI的活性及靶核酸的存在，修饰版本的分子断裂光(MBL)分子(如Biggins等，2000所描述的，同上)起了信号传递模块的作用(图7)。MBL是一种寡核苷酸，其5’-标记了荧光团(如FAM)而3’-标记了猝灭剂(如荧光素)。在EcoRI活化的温度时，它形成发夹茎/环二级结构。由于荧光团与猝灭剂紧密靠近，福斯特共振能量转移(FRET)确保激发荧光团发射光遭受强烈猝灭。EcoRI识别序列在茎干结构中，当被EcoRI切断时，荧光团立即与猝灭剂解链分离，其荧光信号不再受到猝灭因而易于检测到。荧光信号的强度与溶液中消化产生的断裂光分子含量成比例，因而与活化的EcoRI量成比例。

进行全部传感器试验有二种顺次反应。将DNA样品加入到含接头的溶液中后，加热变性反应物并冷却到至少37℃。将该制备好的靶/接头样品加入到含适当浓度适配体/EcoRI复合物和MBL的缓冲液中立即进行分析。荧光检测在RotorGene RG-3000实时PCR仪上30℃或37℃恒温下进行。

图8、9和10分别显示靶序列是合成结核分枝杆菌靶序列、合成35S靶序列和产生无二级结构的任意靶序列的生物传感器反应数据。显示产生信号是靶核酸存在时的产物而非人为产物的对照包括：0-靶对照；非靶对照；用于证明特异性的另一种非靶寡核苷酸；证明靶序列与接头之间相互作用是使EcoRI从抑制中特异性释放的非-接头对照；和用于证明适配体3_ADJ_L抑制EcoRI活性基线的非-靶非接头对照。目前形式的生物传感器能特异性检测极少试验体积(20微升)中的低至皮摩尔浓度范围的靶核酸

决定生物传感系统灵敏度的主要因素是试验所用仪器的检测限度；进行试验的时间；和试验中存在的背景信号强度。与适配体介导的EcoRI不完全抑制和/或接头在其“灭活”状态时使EcoRI分子从抑制中释放所致的相关背景荧光，易于使靶序列产生的低水平信号不被检出。

接头分子二级结构的稳定介导了与接头不完全灭活相关的背景荧光。针对任意的靶序列设计的接头茎/环结构在生物传感器反应温度(30℃-37℃)下稳定性比35S和结核分枝杆菌接头差，致使甚至在缺乏靶核酸时接头茎干的一部分解链而暴露出触发部分与适配体3_ADJ_L杂交。然而在30℃温度下反应15-20分钟后，存在与缺乏靶核酸之间的荧光强度产生明显差异。由于结核分枝杆菌和35S接头分子的靶核酸结合序列的二级结构更稳定，这些接头在30℃仍然无活性，出现接头介导的背景信号不明显或显著减少。这样，经15分钟时间反应后可清晰辨别6皮摩尔靶序列的存在。

所有传感器实施例中存在的背景来源是由于适配体3_ADJ_L对EcoRI的不完全抑制。这主要是由于用于传感器反应之前系统简单地混合EcoRI与过量的适配体3_ADJ_L，在37℃结合45分钟，残留了显著量的未结合适配体3_ADJ_L(它降低了传感器的灵敏度)和未结合的EcoRI(它产生背景信号)。去除未结合的适配体/EcoRI和适配体与EcoRI潜在的共价结合预期将显著减少或消除这种背景信号的形成

由于在一定的离散范围内，荧光强度与溶液中的靶序列含量成比例，该系统是半定量系统(图11)。减少背景信号将进一步增大系统的半定量测定范围。

采用多种限制性内切核酸酶得以同时检测多种靶序列。在最适反应条件下，即使当同一消化反应中存在多种酶，限制性内切核酸酶仍为高度序列特异。类似地，预计在一次反应中采用多种独特的接头、适配体/酶复合物和信号分子将特异和精确地检测出存在的多种独特靶分子。

材料和方法

(i)EcoRI-结合性适配型的选择

用SELEX(指数富集性配体系统进化)方法从随机库中选择DNA适配体(参见Tuerk和Gold，1990，同上)。

为选择能结合并抑制限制性内切核酸酶EcoRI的适配体，采用包含侧接有20个碱基对引物结合位点的随机40-聚体的DNA寡核苷酸文库(5’-CAAGGCCTCTCCTGATCCGA-40N-GTCGGGAGCTGAAGCTGCTT-3’)。扩增文库的PCR寡核酸苷引物序列是5’-CAAGGCCTCTCCTGATCCGA-3’和5’-生物素-AAGCAGCTTCAGCTCCCGAC-3’。对于14轮SELEX，采用硝酸纤维滤膜为基础的结合方法(Pileur等，Nucleic Acids Research 31：5776-5788，2003)。硝酸纤维滤膜能结合EcoRI，任何DNA也能结合EcoRI。大多数未结合的DNA自由通过此膜伴有少量背景留存。洗脱滤膜上结合的DNA，扩增，用于后续SELEX轮次。

对每轮SELEX，采用500微升含50mM NaCl、10mM Tris-HCl和10mMMgCl₂的缓冲液(pH8)配制4微克寡核苷酸库。在这样的缓冲条件下EcoRI为高活性。为了让该寡核苷酸库中的各序列形成其天然二级结构，将此缓冲系统加热至94℃，二分钟后立即放置冰上10分钟。先将4微升浓缩的EcoRI(New England Biolabs，100,000U/ml)加入到此缓冲系统中，然后室温培育20分钟。在各SELEX后续步骤中加入递减量的EcoRI。SELEX第7和第9轮采用不加EcoRI的阴性对照溶液来相对定量测定回收的EcoRI-结合DNA与滤膜-结合的背景DNA。使这些混合液减压通过预先洗涤过的碱处理的25mm0.45μM硝酸纤维素HAWP滤膜(Millipore)。用3ml缓冲液洗涤后，在预热至80℃的7M尿素、50mM EDTA、400mM乙酸钠的400μl溶液中破碎滤膜洗脱结合成分，室温培育10分钟。用800μl 100％乙醇和2μl GlycoBlue(Ambion)沉淀上清液中的DNA。以1.5ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀，空气干燥后重新悬浮于150μl的10mM Tris-HCl(pH8)溶液中。

为下一轮SELEX获得足够的DNA，用PCR扩增回收的DNA。每100μl PCR包含1mM的各引物(Sigma-Proligo)、200μM dNTP(Bioline)、1.5mM MgCl₂(Bioline)、0.5U Immolase DNA聚合酶(Bioline)、1×Immolase DNA聚合酶缓冲液(Bioline)和10μl DNA溶液。前8轮的循环条件如下：95℃7分钟，然后，94℃10秒、60℃30秒和72℃20秒，30个循环。72℃延伸5分钟完成PCR。第9轮SELEX后调节PCR循环条件，采用95℃7分钟，然后94℃35秒，60℃30秒和72℃20秒，15个循环，以防止非特异性PCR人为产物的积累。每轮SELEX进行总共12次100μl的PCR。接着用QiagenMinElute柱纯化所有反应产物，重新悬浮于5μl的10mM Tris-HCl pH8溶液中，合并成60μl总体积。这些溶液的DNA浓度范围为500-800ng/μl。

为了从扩增的双链DNA产生单链DNA寡核苷酸，使30μg生物素化PCR产物在1M NaCl结合缓冲液中结合于M-270链霉亲和素包被的Dynabeads珠(Invitrogen)。用结合缓冲液洗涤后，在60μl体积的150mM NaOH液中培育Dynabeads珠-PCR产物复合物，以断裂使互补DNA双链结合在一起的氢键。取出含游离单链DNA的上清液，用40μl 200mM HCl和7.6μl 1MTris-HCl中和。用另外400μl 10mM Tris-HCl稀释该中和液用于下一轮SELEX。

总共进行了14轮SELEX，然后克隆PCR产物并测序。

(ii)克隆EcoRI结合性适配体

将经过14轮SELEX产生的PCR产物按厂商说明书克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)中。然后将该质粒转化入热激感受态大肠杆菌DH5α细胞中，在氨苄西林选择下37℃培养过夜。此pGEM-T Easy系统能对含有插入PCR产物的细菌菌落作白/兰选择。

(iii)菌落和非对称性PCR

为了快速测试各适配体的结合与抑制效力，采用了菌落PCR然后非对称PCR策略。用无菌移液头取得各菌落的一部分然后重悬于100μl双蒸水中制备菌落的PCR模板。将这些溶液95℃变性2分钟，冰上冷却10分钟。用1mM非生物素化SELEX正向和反向引物(Sigma-Proligo)、0.2m MdNTP(Bioline)、1×反应缓冲液(Bioline)、5％二甲基亚砜(Sigma)、0.5U ImmolaseDNA聚合酶(Bioline)和2μl已制备的PCR模板进行20μl PCR。PCR循环条件与SELEX方法后阶段所用的相同。

完成菌落PCR后，用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒按厂商说明书努力去除过量的引物和反应成分，纯化反应产物。将PCR产物重悬于11μl的洗脱缓冲液中。

用菌落PCR的纯化PCR产物进行非对称PCR。只加入有义SELEX的正向引物使之在PCR反应中延伸，产生序列与原始适配体相同的单链DNA产物。PCR反应的其它条件与菌落PCR相同，除了省略二甲基亚砜外。反应总体积为100μl，采用菌落PCR纯化的PCR产物10μl。完成此PCR后，95℃加热产物2分钟，冰上冷却10分钟，使单链适配体形成其正确的二级结构。由于PCR纯化反应中过量的引物去除不完全，可发生某种指数和线性扩增。因此，21轮PCR循环后约50％产物为单链，50％为双链。

(iv)凝胶迁移试验

用非对称PCR方法产生的各适配体进行凝胶迁移试验。取10μl各PCR产物加到用1xNEB缓冲液配的300单位EcoRI(New England Biolabs)中。对于选择性对照反应，加入限制性内切酶EcoRV(New England Biolabs)或牛血清白蛋白(New England Biolabs)代替EcoRI。室温进行适配体/配体结合20分钟。将样品加载到10％非变性聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳1小时，然后作溴乙锭染色，在UV透射仪(Syngene)上观察。

(v)适配体抑制试验

为测定各适配体的EcoRI抑制能力，将1μl非对称PCR产物加入到以1X缓冲液配的4单位EcoRI中。37℃进行适配体/EcoRI结合45分钟。各反应中加入4μl的EcoRI分子断裂光(330nM)(至最终浓度66nM)。各反应的总体积为20μl。然后立即在37℃恒温下操作，用Corbett RotorGeneRG-300仪分析反应，在FAM通道每间隔一分钟读取读数。

(vi)质粒测序

用M13引物和Big Dye终末子V3.1反应混合物(Applied Biosystems)按厂商说明书正向和反向测定显示EcoRI强抑制的含适配体序列的各个质粒中插入物的序列。

(vii)生物传感器试验

采用强抑制剂适配体3的合成版本(Sigma-Proligo)进行生物传感器试验。除了去除二引物结合位点的一部分之外，适配体3_ADJ_L的序列与适配体3的序列相同。适配体3_ADJ_L的总长度是49个核苷酸(5’-CCGACGAGCAAGTAGCTCCAAGACGAGTTCAACCCCAGAATCAGGTCGG-3’；SEQ ID NO：3)。

进行此试验前，在含1μg/μl BSA(New England Biolabs)的溶液中以约40ng适配体对4单位EcoRI(New England Biolabs)的比例使适配体3_ADJ_L结合于EcoRI。37℃结合45分钟。

95℃加热具体实验所需浓度的接头和靶序列或对照DNA 2分钟，然后以0.1℃/秒的速度缓慢冷却至4℃。将冷却的接头/靶序列样品与1.5x EcoRI NE缓冲液配的EcoRI(4U)/适配体3_ADJ_L复合物(40ng)和MBL(66ng)混合。在30℃恒温下操作，用Corbett RotorGene RG-300仪分析反应。以一分钟间隔检测FAM通道的荧光。

(viii)半定量生物传感器试验

除了试验中加入较高浓度的EcoRI(8U)/适配体3_ADJ_L(80ng)和MBL(122ng)外，按生物传感器试验进行半定量生物传感器试验。采用了结核分枝杆菌的接头和靶序列。最终反应液中的靶序列浓度是0nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM。

(ix)多重生物传感器试验

除了试验中加入较高浓度的EcoRI(7U)/适配体3_ADJ_L(53ng)和MBL(100ng)外，按生物传感器试验进行多重生物传感器试验。靶结合反应中存在结核分枝杆菌的接头和35S接头。各反应液中加入5皮摩尔的35S和/或结核分枝杆菌靶核酸，最终浓度为250nM。

本领域技术人员应明白，不难对本说明书所描述的本发明那些具体描述内容作各种变化和修饰。但应理解本发明包括所有这些变化和修饰。本发明还单独或综合地包括本说明书引用或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，及任何两个或多个步骤或特征的任何和所有组合。

Claims

1.一种非诊断疾病用的检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列，

其中所述适配体由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成，所述核酸酶为EcoRI。

2.一种检测植物样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，样品中存在的靶核苷酸序列可修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合，从而减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制。

4.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

如果样品中存在靶核苷酸序列，该序列即与适配体杂交；和

检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列，

5.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：

将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；

将接头核酸加入到样品中；

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述接头核酸包含一茎环结构，并且接头第一部分的至少一部分包含在该茎环结构的环中，接头第二部分的至少一部分包含在该茎环结构的茎干中。

7.如权利要求5所述的方法，其中，该方法包括同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法，该方法包括：

提供含有能与该接头核酸第二部分杂交的适配体的核酸酶-适配体复合物，

8.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过报告核酸被切割的速率或程度来检测所述核酸酶的活性。

9.如权利要求8所述的方法，其中，使一种荧光团结合于所述报告核酸，能猝灭该荧光团荧光的猝灭剂也结合于所述报告核酸，其中当所述报告核酸被核酸酶切断时即减少或消除了猝灭剂对荧光团的猝灭作用。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述报告核酸结合有一多肽并且该报告核酸还结合于一种固定物，当该报告核酸被切断时使该多肽从固定物释放，因而当固定物固定后，未固定的多肽量可表明核酸酶的活性。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述的固定物是磁珠，固定物的固定受施加磁场的影响。

12.一种非诊断疾病用的筛检生物体是否存在靶核苷酸序列的方法，该方法包括从生物体获得核酸样品，和按照权利要求1所述的方法检测该样品中存在的靶核苷酸序列。

13.一种筛检植物是否存在靶核苷酸序列的方法，该方法包括从植物获得核酸样品，和按照权利要求2所述的方法检测该样品中存在的靶核苷酸序列。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是生物体的非天然核苷酸序列。

15.如权利要求12或13所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是植物的非天然核苷酸序列。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是引入的核苷酸序列。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是引入的核苷酸序列。

18.如权利要求12或13所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是基因组核苷酸序列、等位基因核苷酸序列、突变的核苷酸序列、单个核苷酸多态性、转座子核苷酸序列或病毒核苷酸序列。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包括以下之一种或几种：花椰菜镶嵌病毒35S（CaMV35S）启动子序列、根癌土壤杆菌胭脂碱合酶(nos)终末子序列或5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶(EPSPS)编码核苷酸序列。

20.如权利要求5所述的方法，其中所述接头核酸的第二部分包含SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。

21.如权利要求5所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分适合于与花椰菜镶嵌病毒35S启动子的核苷酸序列的一个区域杂交。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分包含SEQID NO:5所示的核苷酸序列。

23.如权利要5所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分适合于与结核分枝杆菌衍生的核苷酸序列杂交。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分包含SEQID NO:6所示的核苷酸序列。

25.如权利要求20所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分适合于与花椰菜镶嵌病毒35S启动子的核苷酸序列的一个区域杂交。

26.如权利要求20所述的方法，其中所述接头核酸的第一部分适合于与结核分枝杆菌衍生的核苷酸序列杂交。