CN103328655A - 信号放大 - Google Patents

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CN103328655A CN2011800640572A CN201180064057A CN103328655A CN 103328655 A CN103328655 A CN 103328655A CN 2011800640572 A CN2011800640572 A CN 2011800640572A CN 201180064057 A CN201180064057 A CN 201180064057A CN 103328655 A CN103328655 A CN 103328655A
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Abstract

本发明涉及组合物以及用于使用由核酸和/或蛋白酶组成的酶来产生并放大指示一种靶标存在的信号的方法。更确切地，本发明涉及包括核酸结构的组合物，这些核酸结构充当部分的或全部的酶底物，并涉及用于使用这些结构协助靶标的检测的方法。

Description

信号放大
通过交叉引用进行结合
本申请要求于在2010年11月19日提交的澳大利亚临时专利申请号2010905152的优先权，其全部内容通过交叉引用结合在此。
技术领域
本发明涉及组合物以及用于使用由核酸和/或蛋白酶组成的酶来产生并放大指示一种靶标存在的信号的方法。更确切地，本发明涉及包含核酸结构的组合物，这些核酸结构充当部分的或全部的酶底物，并涉及用于使用这些结构协助靶标的检测的方法。
背景
核酸酶
核酸酶是切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。脱氧核糖核酸酶作用于DNA，而核糖核酸酶作用于RNA，然而一些核酸酶利用DNA和RNA这二者作为底物。
虽然一些酶可以具有多个功能并且展现出核酸内切酶和核酸外切酶活性两者，但是仍可以将核酸酶进一步分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶切割多核苷酸链内的磷酸二酯键。相反，核酸外切酶切割在多核苷酸链末端的磷酸二酯键。核酸外切酶可以从DNA或RNA链的5’端或3’端亦或从两端去除核苷酸。瓣状核酸内切酶是结构特异性5’核酸内切酶，该酶识别双链寡聚核苷酸的分叉端，并且去除第一重叠碱基后面的单链5’臂，留下两个寡聚核苷酸之间的3’羟基切口。
核酸酶广泛用作分子生物学的工具。蛋白核酸内切酶的实例包括限制性核酸内切酶、绿豆核酸酶、核酸内切酶IV（大肠杆菌）、RNase A、RNase I（大肠杆菌）、RNase III（大肠杆菌）或RNase H（大肠杆菌）。蛋白核酸外切酶的实例包括核酸外切酶I（大肠杆菌）、核酸外切酶III（大肠杆菌）、核酸外切酶VII以及T7核酸外切酶。包括DNA酶、核酶以及MNA酶的催化性核酸还可以作为核酸内切酶发挥功能并且切割多核苷酸链内的磷酸二酯键。
限制性内切酶
限制性内切酶（RE）或限制性核酸内切酶是一种识别特异限制性内切酶识别（RER）位点或序列（RERS）、并且在RERS处亦或远离RERS处切割核酸的催化性蛋白。限制性内切酶是在分子生物学中最广泛使用的工具之一，并且它们典型地是从细菌或古生菌纯化。例如，EcoRI是从大肠杆菌纯化，并且Hind III是从流感嗜血杆菌纯化。已经纯化并且特征化了上千种限制性内切酶，并且已经鉴定了大于250种不同的限制性内切酶识别序列。
由限制性内切酶切割产生的末端的类型包括存在5’突出或3’突出的末端，或者该切口可以是平头（没有突出端）末端。多数限制性内切酶切割双链的双链体的两条链。切口酶需要双链DNA底物但仅有一条链被切割。此类型的酶的实例是Nt.AlwI，该酶识别序列GGATCNNNN/N并且在由斜线（/）指示的位置处切割此链。虽然多数需要双链DNA作为底物，但是少数限制性内切酶已经被报道识别并切割单链DNA。
催化性核酸酶
催化性核酸酶是可以修饰核酸底物的由核酸组成的酶（非蛋白酶）。例如，催化性核酸酶可以是一种DNA分子（在本领域中也称为DNA酶（DNAzyme）或脱氧核酶或DNA酶（DNA enzyme））或一种RNA分子（本领域中称为核酶）或由多个DNA或RNA分子组成的多组分核酸酶（在本领域中称为MNA酶）。催化性核酸内切酶（catalytic nucleic acidendonuclease）确切地识别并切割相异的核酸底物序列。已经示出DNA酶和核酶能够切割RNA底物、DNA底物和/或嵌合DNA/RNA底物。催化性核酸酶可以仅切割核酸底物（靶标），其条件是该底物序列满足最小序列要求。靶标底物必须与催化性核酸的底物识别结构域（结合臂）互补，并且该底物必须在切割位点处包含特异序列。在切割位点处的这样的序列要求的实例包括对DNA酶切割的嘌呤:嘧啶序列的要求（10-23模式）以及对锤头核酶的序列尿苷:X的要求（其中X可以等同于A、C或U但不是G）。10-23DNA酶是一种DNA酶，它能够在特定的RNA磷酸二酯键处切割核酸底物。此DNA酶具有15个脱氧核苷酸的催化性结构域，该催化性结构域侧翼为两个底物识别结构域（结合臂）。在DNA酶和核酶的情况下，被识别的靶标底物序列与被切割的分子相同。
MNA酶是多组分核酸酶，该酶被装配并且仅在装配促进物的存在下是具有催化活性的。这些酶是由多个部分酶（part-enzyme）或部分酶（partzyme）组成，这些部分酶在一个或多个装配促进物的存在下自我装配并且形成催化修饰底物的活性MNA酶。该底物和装配促进物（靶标）是单独的核酸分子。这些部分酶具有多个结构域，这些多个结构域包括(i)传感臂，该传感臂结合至装配促进物（例如靶标核酸）；(ii)底物臂，该底物臂结合底物，以及(iii)部分的催化核心序列，这些序列在装配时组合以提供一个完整的催化核心。MNA酶可以被设计为识别宽范围的装配促进物，包括例如不同的靶标核酸序列。响应装配促进物的存在，MNA酶修饰它们的底物。这种底物修饰可以连接至信号产生并且因此MNA酶可以产生酶放大输出信号。装配促进物可以是一种存在于生物或环境样品中的靶标核酸。在此类情况下，由MNA酶活性进行底物的修饰的检测指示靶标的存在。已经报道能够切割核酸底物的若干MNA酶，并且可以连接核酸底物的额外的MNA酶在本领域中也是已知的。
用于靶标检测或信号放大的使用限制性内切酶的方法
用于靶标核酸检测的使用限制性内切酶（RE）的方法在本领域中是已知的。它们可以通过特异性识别DNA中的单核苷酸多态性（SNP）而在基因等位基因之间进行区别。然而，这仅在如果SNP改变在一个等位基因中存在的天然发生的RERS时才可以完成。在此方法中，限制性内切酶可以用于确定DNA样品的基因型而无需测序。在用RE酶解基因组DNA后，可以将生成的DNA片段通过凝胶电泳进行分离和分析。在稀有实例中，如果获得的突变刚好位于天然发生的RERS内，则可以检测获得的突变。
已经公开了多种使用不同策略利用RE用于靶标检测的其他方法。一种方法，称为限制性放大分析，使用与有待检测的靶标互补的、并且跨越包含特异性RER位点的靶标区域的标记寡聚核苷酸探针，（美国专利5,102,784）。在标记探针与靶标杂交后，将生成的双链体用RE切割，并且被切割的探针的检测指示靶标的存在。随后，另一个完整的探针可以结合至一个第二互补寡聚核苷酸上并且结合至被切割的靶标片段上。第二寡聚核苷酸刚好在毗邻于经切割的靶标片段处结合，并且导致RE位点的重建，允许另一个探针的切割。这个方法的缺点包括(i)需要具有在感兴趣区域中包含特异性RERS的靶标，以及(ii)受限制的灵敏度，由于在任何时间可切割双链体的最大数目等于存在的靶标分子的原始数目。对于靶标在感兴趣区域中包含特异性RERS的要求显著地限制了该分析的灵活度。以上指出的第二个缺点也是特别重要的，因为在任何一个时间存在于分析中的产生信号的复合体的量被限制为存在的靶标分子的数目，这不利地影响信号强度以及需要达到令人满意的信号强度的运行时间。采用RE的靶标检测分析的另一个实例称为切口核酸内切酶信号放大（Nicking Endonuclease Signal Amplification）（NESA）。类似于限制性放大分析，此方法采用与有待检测的靶标互补的、并且跨越包含特异性RER位点（在此情况中用于切口RE）的靶标区域的标记寡聚核苷酸探针（Kiesling（基斯宁）等人,NAR（《核酸研究》）;35;18;e117,2007）。在标记探针与靶标杂交后，将所得双链体的一条链用切口RE切割，并且这个切割导致探针的解离而靶标保持原样。探针的切割产生指示特异性靶标存在的信号。然后该靶标可以与额外的探针杂交，导致信号增大。再次，这个方法的缺点是(i)需要具有靶标，该靶标在感兴趣区域中包含特异性天然发生的RERS（在此情况下，确切地为毗邻于靶标的很少切口RERS之一的RERS），以及(ii)该方法的灵敏度受限制，由于在任何时间可切割双链体的最大数目等于靶标分子的原始数目。
另一方案，称为级联酶信号放大（Zou（邹）等人,Angew.Chem.Int Ed（《应用化学国际版本》）;49p1-5;2010），需要多个步骤，即(i)两个探针结合至靶标上，创造一种重叠，该重叠被瓣状核酸内切酶切割；(ii)切割的侧翼片段结合至分子信标的环上，该分子信标在毗邻于另一个也结合至该环的寡聚核苷酸的位置处，然后T4连接酶连接（join）（连接）（ligate）这两个寡聚核苷酸，并且这打开了信标并且为切口RE创造了RERS；然后最终(iii)切口RE切割信标并且释放连接的片段以结合至另一信标。尽管该方法克服了对切口RERS天然发生在靶标中的特定需要，但是该方法仍传授了两个片段必须被连接以创造一个新的RER位点。另外，该方法是麻烦的，需要三种相继的缓冲液，每一种特异性针对核酸内切酶、连接以及切割活性的每一个。
这些方法没有提供用于信号放大的简单方案，该信号放大是由以一种方式对靶标进行的检测产生的，该方式在初始的靶标识别事件之后放大了独立于该靶标的信号，无论特异性靶标是否具有方便的、天然发生的RERS。
其他靶标和信号放大技术
为了增加靶标检测的灵敏度，已经采用了用于靶标扩增或信号放大的策略。采用靶标放大的方法的实例包括聚合酶链式反应（PCR）、链置换扩增（SDA）、环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、转录介导的扩增（TMA）；自主维持序列复制（3SR）、或基于核酸序列的扩增（NASBA）。
使用催化性核酸的信号放大级联反应的若干实例在本领域中是已知的。连接级联反应使用一个第一核酶(A)，该第一核酶连接两个包含RNA的寡聚核苷酸，从而形成一个第二核酶(B)。然后核酶(B)连接两种其他的包含RNA的寡聚核苷酸以形成一种新的第一核酶(A)，因此触发级联反应。其他信号放大级联反应使用环状的DNA酶/底物分子。DNA酶(A)在环状时是无活性的，但通过切割该环状DNA酶(A)的第二DNA酶(B)进行的线性化变得活化。然后活性线性DNA酶(A)切割环状DNA酶(B)分子，因此使它们线性化并活化。能够切割/线性化彼此的这两种DNA酶导致催化性核酸活性的级联反应。
其他方法是可用的，包括例如将DNA酶的使用与适体的多功能性和/或与传统蛋白酶的催化力量结合。该方法导致蛋白酶的释放，该蛋白酶可以进而催化可检测分子的形成，由此产生并且放大信号。此方法允许敏感检测，但那是昂贵的，因为对每个分析它需要高度定制的分子。可替代的方法包括，例如，分支DNA分析（bDNA），该分析通过采用附接至介导反应的标记探针上的次级报道分子（例如，碱性磷酸酯酶）来放大信号。酪胺信号放大（TSA）方法使用辣根过氧化物酶以将酪胺转化为它的活化形式，该活化形式结合至蛋白中的酪氨酸残基。侵入分析允许核酸酶切割，导致随着时间的推移每个靶标分子大于1000个的切割事件。然而，在已知的信号放大方法中存在一些限制和缺陷。例如，bDNA分析不像靶标扩增方法那么灵敏。除了灵敏度外，已知的信号放大分析已经与其他缺点关联，这些缺点包括拖延的运行时间、过度复杂的方案和/或增加的成本。
因此，对用于检测并且量化合并信号放大的核酸序列和其他靶标的、新的和改进的方法存在持续需求。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一全酶信号放大器（CESA）复合体，该复合体只有与第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于第一核酸酶的识别和切割序列，并且其中一部分第一DF与一部分EAS1互补。
在第二方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括EAS1、EAS2、以及第一核酸酶，其中一部分EAS1的与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包括用于所述第一核酸酶的识别序列和切割序列，其中一部分第一DF与一部分EAS1互补。
在第三方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多组分核酸酶（MNA酶）、MNA酶底物、EAS1、EAS2、以及第一核酸酶，其中：
MNA酶包括至少一种第一部分酶以及一种第二部分酶，这些部分酶在MNA酶装配促进物的存在下自我装配以形成MNA酶，其中所述至少第一和所述第二部分酶各自包括底物臂部分、催化核心部分、以及传感臂部分，并且其中这些传感臂与所述MNA酶装配促进物相互作用从而维持该第一和第二部分酶相互靠近以用于它们对应的催化核心部分的关联，从而形成MNA酶的催化核心，并且所述催化核心能够修饰所述MNA酶底物从而形成第一DF；
并且其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中第一DF能够与EAS1和EAS2装配以形成第一CESA复合体，该复合体包含用于所述至少第一核酸酶的识别位点和切割位点。
在第三方面的一个实施例中，MNA酶底物是包括第一和第二链的寡聚核苷酸复合体的第一链，其中所述第一链包括内部环部分，并且在内部环部分内的碱基与第二链的碱基不杂交，并且其中该MNA酶能够切割内部环部分。
在第三方面的一个实施例中，第二链包括第一DF。
在第三方面的一个实施例中，第一和第二链在一端由发夹环部分连接。
在第三方面的一个实施例中，MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的发夹环部分，所述MNA酶能够切割发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的双链茎部分的一条链中。
在第三方面的一个实施例中，装配促进物是有待鉴定的靶标。
在第四方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
该SIO能够与靶标杂交从而形成双链体底物，其中所述第一核酸酶能够切割双链体底物从而产生第一DF；并且其中；
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别序列和切割序列。
在第五方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
该SIO能够与一靶标杂交从而形成双链体结构，其中只有在所述SIO与靶标杂交时所述第一核酸酶才能够切割所述SIO从而产生第一DF；并且其中；
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别和切割序列。
在第六方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
该SIO能够与一靶标杂交从而形成双链体结构，其中只有在所述靶标与SIO杂交时所述第一核酸酶才能够切割所述靶标从而产生第一DF；
其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别和切割序列；
并且其中第一核酸酶不是限制性核酸内切酶。
在第四至第六方面的一个实施例中，只有当SIO与靶标杂交时，第一核酸酶才能够切割SIO以产生所述第一DF。
在第四至第六方面的一个实施例中，只有当靶标与SIO杂交时，第一核酸酶才能够切割靶标以产生所述第一DF。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一核酸酶不是限制性内切酶。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一核酸酶是核酸外切酶。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一和第二核酸酶是相同的核酸酶。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一和第二核酸酶是不同的核酸酶。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第四至第六方面的一个实施例中，第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第四至第六方面的一个实施例中，切口位于核酸酶识别位点内、核酸酶切割位点处、或核酸酶识别和切割位点之间。
在第四至第六方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第四至第六方面的一个实施例中，第一DF结合到所述EAS1完成了部分核酸酶识别序列。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF结合到所述EAS1完成了部分核酸酶切割序列。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF向所述序列贡献至少一个碱基。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF向所述序列贡献至少两个碱基。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF向所述序列贡献至少三个碱基。
在第一至第六方面的一个实施例中，这些碱基刚好是由所述EAS1和EAS2的结合形成的部分核酸酶识别位点的3’。
在第一至第六方面的一个实施例中，这些碱基刚好是由所述EAS1和EAS2的结合形成的部分核酸酶识别位点的5’。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF不向所述核酸酶识别序列或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
在第一至第六方面的一个实施例中，EAS1和EAS2是发夹寡聚核苷酸的组分，发夹寡聚核苷酸包括由所述EAS1和EAS2的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的发夹环部分。
在第一至第六方面的一个实施例中，发夹环部分是寡聚核苷酸接头或非寡聚核苷酸接头。
在第一至第六方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS1或EAS2的任一个延伸的单链5’或3’突出部分。
在第一至第六方面的一个实施例中，一部分所述EAS1或EAS2包括第二DF，并且其中所述第二DF可以在由核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
在第一至第六方面的一个实施例中，一部分所述发夹环部分包括第二DF，并且其中所述第二DF可以在由该核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF和所述第二DF不是相同的。
在第一至第六方面的一个实施例中，第一DF和所述第二DF是相同的。
在第一至第六方面的一个实施例中，第二DF是所述第一DF的一个片段，或者所述第一DF是所述第二DF的片段。
在第一至第六方面的一个实施例中，第二DF、EAS1、和EAS2能够装配以形成所述第一CESA复合体。
在第一至第六方面的一个实施例中，该组合物进一步包括第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4），其中一部分EAS3与一部分EAS4互补，并且一部分EAS3与一部分第二DF互补，并且其中EAS3和EAS4形成第二CESA复合体，该复合体只有在与该第二DF装配在一起时才包含用于额外的核酸酶的识别序列和切割序列。
在第一至第六方面的一个实施例中，EAS3或EAS4包括第三DF。
在第一至第六方面的一个实施例中，第三DF和所述第一DF是相同的。
在第一至第六方面的一个实施例中，第三DF和所述第一DF不是相同的。
在第一至第六方面的一个实施例中，该额外的核酸酶与所述组合物中的另一核酸酶是相同的。
在第一至第六方面的一个实施例中，该额外的核酸酶与所述组合物中的另一核酸酶不是相同的，并且其中所述组合物包括所述额外的核酸酶。
在第一至第六方面的一个实施例中，该额外的核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第一至第六方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第一至第六方面的一个实施例中，第二DF结合到所述EAS3完成了部分核酸酶识别序列和/或核酸酶切割序列。
在第一至第六方面的一个实施例中，第二DF不向所述核酸酶识别序列或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
在第一至第六方面的一个实施例中，EAS3和EAS4是发夹寡聚核苷酸的组分，发夹寡聚核苷酸包括由EAS3和EAS4的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的发夹环部分。
在第一至第六方面的一个实施例中，发夹环部分是寡聚核苷酸接头或非寡聚核苷酸接头。
在第一至第六方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS3或EAS4的任一个延伸的单链5’或3’突出部分。
在第七方面，本发明提供了包括第一复合体的组合物，所述第一复合体包括主链寡聚核苷酸、EAS1、EAS2、EAS3、以及EAS4，其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS1的第一部分，其中一部分所述EAS1与一部分EAS2互补，一部分EAS2与一部分第一DF互补，并且一部分EAS1或EAS2包括第二DF，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有与该所述第一DF装配在一起时才包含用于第一核酸酶的识别序列和切割序列；
(ii)包括所述EAS3的第二部分，其中一部分所述EAS3与一部分所述EAS4互补，一部分所述EAS3与一部分第二DF互补，并且一部分所述EAS3或EAS4包括所述第一DF，并且其中EAS3和EAS4形成一个第二CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于第二核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分。
在第七方面的一个实施例中，该组合物进一步包括第二复合体，所述第二复合体包括主链寡聚核苷酸、第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）、第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）、第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）、以及第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8），其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS5的第一部分，其中一部分所述EAS5与一部分所述EAS6互补，一部分所述EAS5与一部分所述第二DF互补，并且一部分所述EAS5或EAS6包括所述第一DF，并且其中EAS5和EAS6形成第三CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于第三核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(ii)包括所述EAS7的第二部分，其中一部分所述EAS7与一部分所述EAS8互补，一部分所述EAS8与一部分所述第一DF互补，并且一部分所述EAS7或EAS8包括所述第二DF，并且其中EAS7与EAS8形成第四CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包含用于第四核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补。
在第七方面的一个实施例中，EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
在第七方面的一个实施例中，第一核酸酶与第三核酸酶相同，和/或第二核酸酶与第四核酸酶相同，和/或第一、第二、第三以及第四核酸酶是相同的。
在第七方面的一个实施例中，第一和第二复合体经由它们对应的互补的第三部分进行杂交，形成第一双重复合体。
在第七方面的一个实施例中，第一双重复合体连接至第二双重复合体。
在第七方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第七方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第七方面的一个实施例中，连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、共价键合以及肽接头中的任何一个或多个来达到的。
在第七方面的一个实施例中，连接是经由任何一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的多个生物素化的酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
在第七方面的一个实施例中，第一和/或所述第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第七方面的一个实施例中，第一和/或所述第二核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第七方面的一个实施例中，所述第一DF结合到所述EAS2或EAS8和/或所述第二DF结合到所述EAS3或EAS5完成了部分核酸酶识别序列和/或部分核酸酶切割序列。
在第七方面的一个实施例中，所述第一DF到所述EAS2或EAS8的结合和/或所述第二DF到所述EAS3或EAS5的结合不向所述核酸酶识别序列或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
在第七方面的一个实施例中，选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是发夹寡聚核苷酸的组件，该发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的发夹环部分。
在第七方面的一个实施例中，发夹环部分是寡聚核苷酸接头或非寡聚核苷酸接头。
在第七方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸包括单链5’或3’突出部分。
在第八方面，本发明提供了包括SIO的组合物，所述SIO包括：
(i)与靶标链互补的第一部分以及与所述靶标链不互补的第二部分，其中所述第一和第二部分是由硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括第一DF；以及，
(ii)EAS1以及EAS2，其中
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且EAS1与EAS2的杂交提供了在任一端具有3’突出端的双链体结构，
一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且
EAS1和EAS2能够形成第一CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包括能够由第一核酸酶所酶解的凹3’端。
在第八方面的一个实施例中，SIO是发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的双链茎、单链发夹环、以及3’突出端。
在第八方面的一个实施例中，该核酸酶是核酸外切酶。
在第八方面的一个实施例中，该核酸外切酶不能酶解单链寡聚核苷酸、包括具有5个或更多个碱基的3’突出端的双链寡聚核苷酸，或硫代磷酸酯核苷酸间连键。
在第一至第八方面的一个实施例中，任何所述第一DF是使用核酸内切酶或核酸外切酶产生的。
在第一至第八方面的一个实施例中，该核酸外切酶是选自下组，该组由以下各项组成：核酸酶BAL-31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I以及核酸外切酶T。
在第一至第八方面的一个实施例中，核酸外切酶是核酸外切酶III。
在第一至第八方面的一个实施例中，该核酸内切酶是T7核酸内切酶I、RNase H、侧翼核酸酶、或绿豆核酸酶。
在第一至第八方面的一个实施例中，任何所述EAS包括一个或多个可检测标记。
在第一至第八方面的一个实施例中，任何所述EAS包括荧光团部分和/或淬灭剂部分。
在第一至第八方面的一个实施例中，任何所述部分酶、装配促进物、MNA酶底物、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、或SIO包括至少一个选自下组的核苷酸替换物或增加物，该组由以下各项组成：硫代磷酸酯、4-乙酰胞苷、5-(羟甲基羧基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、βD-半乳糖辫苷、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、βD-甘露糖甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、βD-阿糖尿苷以及βD-阿糖胸苷。
在第三方面的一个实施例中，MNA酶部分酶、MNA酶底物或其组合中的至少一个进一步包括适体或其部分。
在第三方面的一个实施例中，该适体或其部分包括以下项中的至少一个：核酸、肽、多肽、蛋白，其衍生物，或它们的组合。
在第一至第八方面的一个实施例中，任何所述的MNA酶部分酶、MNA酶底物、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF或核酸酶附接至固体支持物上。
在第一、第二以及第七方面的一个实施例中，所述第一DF仅在靶标的存在下产生。
在第三方面、以及第四至第七方面的一个实施例中，所述第一DF与所述靶标是相异的。
在第一和第二方面的一个实施例中，该组合物是用于检测靶标，并且第一DF与所述靶标是相异的。
在该第三方面的一个实施例中，任何所述EAS可以与另一EAS杂交从而形成部分酶信号放大器（PESA）复合体，该复合体能够与多于一个DF杂交。
在第三方面的一个实施例中，该组合物包括特异性针对靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
在第三方面的一个实施例中，特异性针对所述靶标分子的不同部分的MNA酶在所述靶标存在下装配时识别并且切割相同底物。
在第三方面的一个实施例中，该组合物包括对相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
在第四至第六和第八方面的一个实施例中，该组合物包括对相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
在第四至第六和第八方面的一个实施例中，该组合物包括与不同的第一DF装配在一起的至少两种相异的CESA复合体。
在第九方面，本发明提供了用于检测靶标的方法，该方法包括：
(a)提供两种或更多种部分酶以及至少一种多组分核酸（MNA酶）底物，其中这些部分酶在靶标的存在下进行自我装配以形成至少一种MNA酶；
(b)在允许MNA酶的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含靶标的样品接触，并且其中所述MNA酶的催化活性从所述至少一种MNA酶底物产生第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）；
(c)提供第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）和第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且；
(d)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与第一DF接触；
(1)第一DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成第一全酶信号放大器（CESA）复合体，以及
(2)用于第一核酸酶的识别位点和切割位点的形成；
(e)提供第一核酸酶；并且
(f)在允许核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使第一核酸酶与第一CESA复合体接触，其中由所述第一核酸酶进行的切割产生指示该靶标的存在的可检测效应。
在第九方面的一个实施例中，第一核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一核酸酶的所述识别位点和/或所述切割位点的两条链的至少一条中的切口。
在第九方面的一个实施例中，第一DF是通过MNA酶底物的切割产生的。
在第九方面的一个实施例中，第一DF是通过两个或更多个MNA酶底物的连接产生的。
在第九方面的一个实施例中，MNA酶底物是包括第一和第二链的寡聚核苷酸复合体的第一链，其中所述第一链包括内部环部分，并且在内部环部分内的碱基与该第二链的碱基不杂交，并且其中MNA酶能够切割内部环部分。
在第九方面的一个实施例中，第二链包括第一DF。
在第九方面的一个实施例中，第一和第二链在一端由发夹环部分连接。
在第九方面的一个实施例中，该MNA酶底物是发夹寡聚核苷酸的发夹环部分，所述MNA酶能够切割发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的双链茎部分的一条链中。
在第十方面，本发明提供了检测靶标的方法，该方法包括;
(a)提供至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）；
(b)在允许SIO与靶标杂交的条件下，使该SIO与推定包含靶标的样品接触，因此为第一核酸酶创造双链体底物；
(c)提供能够切割由SIO与靶标的杂交形成的双链体底物的第一核酸酶，其中由第一核酸酶对双链体底物的切割产生第一DF；
(d)提供EAS1和EAS2，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且；
(e)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与第一DF接触：
(1)第一DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成第一CESA，以及
(2)用于用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的形成；
(f)提供第二核酸酶；并且
(g)在允许该第二核酸酶与该识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使第二核酸酶与第一CESA接触，其中由第二核酸酶进行的切割产生指示靶标的存在的可检测效应。
在第十一方面，本发明提供了检测靶标的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）；
(b)在允许SIO与靶标杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，因此为第一核酸酶创造双链体结构；
(c)使双链体结构与第一核酸酶接触，该第一核酸酶只有在SIO与靶标杂交时才能够切割SIO，其中所述第一核酸酶切割SIO以产生第一DF；
(d)提供EAS1和EAS2，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且；
(e)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与第一DF接触：
(1)第一DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成第一CESA，以及
(2)用于用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的形成；
(f)提供第二核酸酶；并且
(g)在允许第二核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使第二核酸酶与第一CESA接触，其中由第二核酸酶进行的切割产生指示靶标的存在的可检测效应。
在第十二方面，本发明提供了检测靶标的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）；
(b)在允许SIO与靶标的杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，因此为第一核酸酶创造双链体结构；
(c)使双链体结构与第一核酸酶接触，第一核酸酶只有在靶标与SIO杂交时才能够切割靶标，其中所述第一核酸酶切割靶标以产生第一DF；
(d)提供EAS1和EAS2，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且；
(e)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与第一DF接触：
(1)第一DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成第一CESA，以及
(2)用于用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的形成；
(f)提供第二核酸酶；并且
(g)在允许第二核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使第二核酸酶与第一CESA接触，其中由第二核酸酶进行的切割产生指示靶标的存在的可检测效应。
在第十至第十二方面的一个实施例中，只有在所述SIO与靶标杂交时，该第一核酸酶切割所述SIO以产生所述第一DF。
在第十至第十二方面的一个实施例中，只有在所述靶标与SIO杂交时，该第一核酸酶切割所述靶标以产生所述第一DF。
在第十至第十二方面的一个实施例中，第一核酸酶不是限制性内切酶。
在第十至第十二方面的一个实施例中，第一核酸酶是核酸外切酶。
在第十至第十二方面的一个实施例中，第一CESA复合体的切割允许另外的DF的释放，并且另外的DF与另外的酶放大器底物寡聚核苷酸装配以形成另外的CESA复合体，并且至少一种核酸酶用来切割另外的CESA复合体，从而产生另外的可检测效应并且释放另外的DF，由此协助可检测效应的进一步增大。
在第十三方面，本发明提供了使用级联反应来检测靶标的方法，该方法包括：
(a)产生第一DF，其中所述第一DF仅在所述靶标的存在下产生，
(b)提供：
(i)EAS1和EAS2，其中：
一部分EAS1与一部分EAS2互补：
一部分EAS1与一部分第一DF互补；以及
一部分EAS1或EAS2包括第二DF；
以及，
(ii)第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4），其中:
一部分EAS3与一部分EAS4互补;
一部分EAS3与一部分第二DF互补;
(c)接触：
(i)在允许第一DF与EAS1和EAS2的装配的条件下，EAS1和EAS2与(a)的第一DF接触，以形成包括用于第一核酸酶的识别位点和切割位点的第一CESA复合体；
(ii)在允许第一核酸酶与第一CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第一CESA复合体与第一核酸酶接触，其中由第一核酸酶在切割位点处进行的切割释放第二DF；
(d)接触：
(i)在允许第二DF与EAS3和EAS4的装配的条件下，EAS3和EAS4与第二DF接触，以形成包括用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的第二CESA复合体；
(ii)在允许第二核酸酶与第二CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第二CESA复合体与第二核酸酶接触，其中第二核酸酶在所述切割位点处切割所述第二CESA复合体；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生可检测效应。
在第十三方面的一个实施例中，所述第一CESA复合体以及所述第二CESA复合体的切割各自产生可检测效应。
在第十三方面的一个实施例中，该第一核酸酶和第二核酸酶是相同的核酸酶。
在第十三方面的一个实施例中，第一核酸酶和第二核酸酶是不同的核酸酶。
在第十三方面的一个实施例中，一部分所述EAS3或所述EAS4包括额外的DF，并且由第二核酸酶在第二CESA复合体的所述切割位点处进行的切割释放所述额外的DF。
在第十三方面的一个实施例中，一部分所述额外的DF的与第一部分的第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）互补，其中第二部分的所述EAS5与一部分第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）互补，并且其中所述EAS5和EAS6与所述额外的DF装配以形成第三CESA复合体。
在第十三方面的一个实施例中：
(i)一部分额外的DF与所述第一DF相同；
(ii)额外的DF与所述第一DF相同；或
(iii)额外的DF是所述第一DF的片段；
并且所述额外的DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA复合体。
在第十四方面，本发明提供了使用级联反应来检测多个相异的靶标的方法，该方法包括：
(a)产生至少一种第一DF和一种第二DF，其中所述第一DF仅在第一靶标的存在下产生，并且所述第二DF仅在第二靶标的存在下产生；
(b)提供：
(i)EAS1和EAS2，其中：
一部分EAS1与一部分EAS2互补：
一部分EAS1与一部分第一DF互补；以及
(ii)EAS3和EAS4，其中：
一部分EAS3与一部分EAS4互补：
一部分EAS3与一部分第二DF互补;
(c)接触：
(i)在允许第一DF与EAS1和EAS2的装配的条件下，EAS1和EAS2与(a)的第一DF接触，以形成包括用于第一核酸酶的识别位点和切割位点的第一CESA复合体；
(ii)在允许第一核酸酶与第一CESA复合体的所述识别位点和切割位点相互作用的条件下，第一CESA复合体与第一核酸酶接触，其中所述第一核酸酶在所述切割位点处切割所述第一CESA复合体，产生第一可检测效应；
(d)接触：
(i)在允许第二DF与EAS3和EAS4的装配的条件下，EAS3和EAS4与第二DF接触，以形成包括用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的第二CESA复合体；
(ii)在允许第二核酸酶与第二CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第二CESA复合体与第二核酸酶接触，其中所述第二核酸酶在所述切割位点处切割所述第二CESA复合体，产生第二可检测效应；
并且其中所述第一可检测效应与所述第二可检测效应相异。
在第十四方面的一个实施例中，第一核酸酶和所述第二核酸酶是相同的核酸酶。
在第十四方面的一个实施例中，第一核酸酶和所述第二核酸酶是不同的核酸酶。
在第十四方面的一个实施例中：
(i)所述EAS1或所述一部分EAS2包括额外的DF，并且由第一核酸酶在第一CESA复合体的所述切割位点处进行的切割释放所述额外的DF；并且
(ii)所述额外的DF与至少两种额外的EAS寡聚核苷酸装配以形成额外的CESA复合体，并且由核酸酶对所述额外的CESA复合体的切割增大所述第一可检测效应。
在第十四方面的一个实施例中：
(i)一部分所述EAS3或所述EAS4包括额外的DF，并且由第二核酸酶在第二CESA复合体的所述切割位点处进行的切割释放所述额外的DF；并且
(ii)所述额外的DF与至少两种额外的EAS寡聚核苷酸装配以形成额外的CESA复合体，并且由核酸酶对所述额外的CESA复合体的切割增大所述第二可检测效应。
在第十五方面，本发明提供了使用级联反应来检测靶标的方法，该方法包括：
(a)产生第一驱动片段，其中仅在所述靶标的存在下提供所述第一驱动片段；
(b)提供：
(i)EAS1和EAS2，其中：
一部分EAS1与一部分EAS2互补；
一部分EAS1与一部分第一DF互补；
一部分EAS1或EAS2包括第二DF；并且
EAS1或EAS2被拴系至支持物上；
(ii)EAS3和EAS4，其中：
一部分EAS3与一部分EAS4互补：
一部分EAS3与一部分第二DF互补;
一部分EAS3或EAS4包括第三DF；并且
EAS3或EAS4被拴系至支持物上；
(c)接触：
(i)在允许第一DF与EAS1和EAS2的装配的条件下，EAS1和EAS2与(a)的所述第一DF接触，以形成包括用于第一核酸酶的识别位点和切割位点的第一CESA；
(ii)在允许第一核酸酶与第一CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第一CESA与第一核酸酶接触，其中由第一在所述切割位点处进行的切割释放第二DF；
(d)接触：
(i)在允许第二DF与EAS3和EAS4的装配的条件下，EAS3和EAS4与第二DF接触，以形成包括用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的第二CESA；
(ii)在允许第二核酸酶与第二CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第二CESA与第二核酸酶接触，其中由第二核酸酶在所述切割位点进行的切割释放第三DF，第三DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生可检测效应。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，(a)的第一DF是通过以下方法产生：
在允许SIO与靶标的杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，从而形成易于由起始物核酸酶修饰的双链体结构，并且
使双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由起始物核酸酶对在双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第一DF。
在第十四方面的一个实施例中，(a)的第二DF是通过以下方法产生：
在允许SIO与靶标的杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，从而形成易于由起始物核酸酶修饰的双链体结构，并且
使双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由起始物核酸酶对在双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第二DF。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，只有在SIO与靶标杂交时，起始物核酸酶切割SIO以产生所述DF。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，只有在靶标与SIO杂交时，起始物核酸酶切割靶标以产生所述DF。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，起始物核酸酶不是限制性内切酶。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，起始物核酸酶是核酸外切酶。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，SIO附接至支持物上。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，(a)的第一DF是通过以下方法产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含靶标的样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第一DF。
在第十四方面的一个实施例中，(a)的第二DF是通过以下方法产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含靶标的样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第二DF。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，MNA酶底物是包括第一和第二链的寡聚核苷酸复合体的第一链，其中所述第一链包括内部环部分，并且在内部环部分内的碱基与第二链的碱基不杂交，并且其中MNA酶能够切割内部环部分。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，第二链包括所述DF。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，第一和第二链在一端由发夹环部分连接。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，发夹环部分是寡聚核苷酸接头或非寡聚核苷酸接头。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，MNA酶底物是发夹寡聚核苷酸的发夹环部分，所述MNA酶能够切割发夹环部分，并且所述驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的双链茎部分的一条链中。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，EAS3和EAS4是发夹寡聚核苷酸复合体的组分，发夹寡聚核苷酸复合体包括在所述EAS3和EAS4的互补部分之间形成的双链部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的发夹环部分。
在第九至第十五方面的一个实施例中，EAS1和EAS2是发夹寡聚核苷酸复合体的组分，该发夹寡聚核苷酸复合体包括在所述EAS1和EAS2的互补部分之间形成的双链部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的发夹环部分。
在第九至第十五方面的一个实施例中，发夹环部分是寡聚核苷酸接头或非寡聚核苷酸接头。
在第九至第十五方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸复合体进一步包括从一个EAS寡聚核苷酸延伸的5’或一个3’突出单链部分。
在第九至第十五方面的一个实施例中，发夹环部分包括可检测部分和/或淬灭剂部分。
在第九至第十五方面的一个实施例中，EAS3和/或EAS4包括可检测部分和/或淬灭剂部分，并且在由第二核酸酶对第二CESA进行切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供了可检测效应。
在第九至第十五方面的一个实施例中，EAS3包括可检测部分和淬灭剂部分，EAS4包括另外的淬灭剂部分，并且在由第二核酸酶对第二CESA进行切割时所述可检测部分和另外的淬灭剂部分分离，提供了可检测效应。
在第九至第十五方面的一个实施例中，EAS1和/或EAS2包括可检测部分和/或淬灭剂部分，并且在由第一核酸酶对第一CESA进行切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供了可检测效应。
在第九至第十五方面的一个实施例中，EAS1包括可检测部分和淬灭剂部分，EAS2包括另外的淬灭剂部分，并且在由该第一核酸酶对该第一CESA进行切割时所述可检测部分和另外的淬灭剂部分分离，提供了可检测效应。
在第九至第十五方面的一个实施例中，可检测部分是荧光团。
在第九方面的一个实施例中，第一核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第十至第十二方面的一个实施例中，第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，第一核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链的至少一条中的切口，和/或所述第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的切口。
在第九至第十五方面的一个实施例中，切口位于核酸酶识别位点内、核酸酶切割位点处、或核酸酶识别和切割位点之间。
在第九至第十五方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第九至第十五方面的一个实施例中，第一DF结合到所述EAS1完成了部分核酸酶识别位点和/或部分核酸酶切割位点。
在第九至第十五方面的一个实施例中，该第二DF结合到所述EAS2完成了部分核酸酶识别位点和/或部分核酸酶切割位点。
在第九至第十五方面的一个实施例中，该DF向所述部分的核酸酶识别序列和/或部分核酸酶切割位点贡献至少一个碱基。
在第九至第十五方面的一个实施例中，该DF向所述部分的核酸酶识别位点和/或部分核酸酶切割位点贡献至少两个碱基。
150.如权利要求146至149中任一项所述的方法，其中该DF向所述部分的核酸酶识别位点和/或部分核酸酶切割位点贡献至少三个碱基。
在第九至第十五方面的一个实施例中，这些碱基刚好是由所述酶放大器底物寡聚核苷酸的结合形成的部分核酸酶识别位点的3’。
在第九至第十五方面的一个实施例中，这些碱基刚好是由所述酶放大器底物寡聚核苷酸的结合形成的部分核酸酶识别位点的5’。
在第九至第十五方面的一个实施例中，第一DF不向所述核酸酶识别位点或所述核酸酶切割位点贡献任何碱基。
在第十三至第十五方面的一个实施例中，该第二DF不向所述核酸酶识别位点或所述核酸酶切割位点贡献任何碱基。
在第十六方面，本发明提供了使用级联反应来检测靶标的方法，该方法包括：
(a)产生第一驱动片段，其中所述第一驱动片段仅在所述靶标的存在下产生；
(b)提供包括一个主链寡聚核苷酸的第一复合体，所述第一主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括EAS1的第一部分，其中
一部分所述EAS1与一部分EAS2互补；
一部分EAS2与一部分第一驱动片段互补；以及
一部分EAS1或EAS2包括第二驱动片段；
(ii)包括EAS3的第二部分，其中
一部分所述EAS3与EAS4互补；
一部分所述EAS3与一部分第二驱动片段互补；并且
一部分EAS3或EAS4包括所述第一驱动片段；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分；
并且，
(c)接触：
(i)在允许第一DF与EAS1和EAS2的装配的条件下，EAS1和EAS2与(a)的所述第一DF接触，以形成包括用于第一核酸酶的识别位点和切割位点的第一CESA；
(ii)在允许第一核酸酶与第一CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第一CESA与第一核酸酶接触，其中由第一核酸酶在所述切割位点处进行的切割释放第二DF；
(d)接触：
(i)在允许第二DF与EAS3和EAS4的装配的条件下，EAS3和EAS4与第二DF接触，以形成包括用于第二核酸酶的识别位点和切割位点的第二CESA；
(ii)在允许第二核酸酶与第二CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第二CESA与第二核酸酶接触，其中由第二核酸酶在所述切割位点进行的切割释放第一DF，第一DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中，所述第一CESA复合体的切割以及所述第二CESA复合体的切割各自产生可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中，该方法进一步包括：
(a)提供第二复合体，所述第二复合体包括主链寡聚核苷酸，该主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）的第一部分，其中
一部分所述EAS5与一部分第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）互补；并且
一部分EAS5与一部分第二驱动片段互补；并且
一部分EAS5或EAS6包括第一驱动片段；以及
(ii)包括第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）的第二部分，其中
一部分所述EAS7与一部分第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8）互补；
一部分所述EAS8与一部分第一驱动片段互补；
一部分EAS7或EAS8包括所述第二驱动片段；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补；并且，
(b)在允许所述第一复合体的第三部分与所述第二复合体的第三部分杂交的条件下使所述第一和第二复合体接触，由此形成第一双重复合体；
(c)接触：
(i)在允许第二DF与EAS5和EAS6的装配的条件下，EAS5和EAS6与(a)的所述第二DF接触，以形成包括用于第三核酸酶的识别位点和切割位点的第三CESA；
(ii)在允许第三核酸酶与第三CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第三CESA与第三核酸酶接触，其中由第三核酸酶在所述切割位点进行的切割释放第一DF，第一DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA，并且与所述EAS7和EAS8装配以形成所述第四CESA；并且，
(d)接触：
(i)在允许第一DF与EAS7和EAS8的装配的条件下，EAS7和EAS8与第一DF接触，以形成包括用于第四核酸酶的识别位点和切割位点的第四CESA；
(ii)在允许第四核酸酶与第四CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，第四CESA与第四核酸酶接触，其中由第四核酸酶在所述切割位点进行的切割释放第二DF，第二DF可以与所述EAS3和EAS4装配以形成所述第二CESA，并且与所述EAS5和EAS6装配以形成所述第三CESA；
并且其中所述第三CESA复合体和/或所述第四CESA复合体的切割产生可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中，所述第三CESA复合体的切割以及所述第四CESA复合体的切割各自产生可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中，EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
在第十六方面的一个实施例中，第一双重复合体连接至第二双重复合体。
在第十六方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第十六方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第十六方面的一个实施例中，连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、以及肽接头中的任何一个或多个来达到的。
在第十六方面的一个实施例中，连接是经由任何一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的经生物素化的多个酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
在第十六方面的一个实施例中，(a)的第一DF是通过以下方法产生：
在允许SIO与靶标的杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，从而形成易于由起始物核酸酶修饰的双链体结构，并且
使双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由起始物核酸酶对在双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第二DF。
在第十六方面的一个实施例中，只有在SIO与靶标杂交时，起始物核酸酶切割SIO以产生所述DF。
在第十六方面的一个实施例中，只有在靶标与SIO杂交时，起始物核酸酶切割靶标以产生所述DF。
在第十六方面的一个实施例中，起始物核酸酶不是限制性内切酶。
在第十六方面的一个实施例中，(a)的第一DF是通过以下方法产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含靶标的样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第一DF。
在第十六方面的一个实施例中，所述EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7和EAS8中的任何一个或多个包括可检测部分和淬灭子部分，并且在该第一、第二、第三、和/或第四CESA的切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中：
(i)EAS1包括可检测部分并且所述EAS2包括淬灭剂部分或反之亦然；和/或
(ii)EAS3包括可检测部分并且所述EAS4包括淬灭剂部分或反之亦然；和/或
(iii)EAS5包括可检测部分并且所述EAS6包括淬灭剂部分或反之亦然；
(iv)EAS7包括可检测部分并且所述EAS8包括淬灭剂部分或反之亦然；并且，
其中在第一、第二、第三、和/或第四CESA的切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供可检测效应。
在第十六方面的一个实施例中，核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一、第二或第三核酸酶的所述识别序列的两条链的至少一条中的切口。
在第十六方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第十六方面的一个实施例中，任何所述DF结合到酶放大器底物寡聚核苷酸上完成了部分核酸酶识别位点和/或部分核酸酶切割位点。
在第九至第十六方面的一个实施例中，选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是发夹寡聚核苷酸的组件，发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的发夹环部分。
在第九至第十六方面的一个实施例中，任何所述第一DF是使用选自核酸内切酶和核酸外切酶的核酸酶产生的。
在第九至第十六方面的一个实施例中，该核酸外切酶是选自下组，该组由以下各项组成：核酸酶BAL-31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I以及核酸外切酶T。
在第九至第十六方面的一个实施例中，该核酸内切酶是T7核酸内切酶I、RNase H、侧翼核酸酶、或绿豆核酸酶。
在第十七方面，本发明提供了使用级联反应来检测靶标的方法，该方法包括：
(a)提供：
(i)与靶标链互补的第一部分以及与所述靶标链不互补的第二部分，其中所述第一和第二部分是由硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括第一DF；以及
(ii)EAS1和EAS2，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且EAS1与EAS2的杂交提供了在任一端具有3’突出端的双链体结构，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补；
(iii)第一核酸外切酶；并且
(b)接触：
(i)在允许SIO与靶标杂交的条件下，所述SIO与推定包含靶标的样品接触，因此创造用于第一核酸外切酶的双链体结构，其中由第一核酸外切酶对双链体结构修饰从所述双链体底物释放所述第一DF；
(ii)在允许第一DF与所述EAS1和EAS2的装配的条件下，EAS1和EAS2与(b)的第一DF接触，以形成包括用于第二核酸外切酶的底物的第一CESA复合体；
(iii)在允许第二核酸外切酶与第一CESA复合体相互作用的条件下，第一CESA与第二核酸外切酶接触，其中由第二核酸外切酶对第一CESA复合体修饰从所述第一CESA复合体释放所述第一DF，所述第一CESA复合体可以与额外的EAS1和EAS2装配以形成额外的第一CESA复合体；
并且其中双链体结构的所述修饰和/或第一CESA复合体的所述修饰提供可检测效应。
在第十七方面的一个实施例中，双链体结构的修饰以及第一CESA复合体的所述修饰提供可检测效应。
在第十七方面的一个实施例中，SIO是发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的双链茎、单链发夹环、以及3’突出端。
在第十七方面的一个实施例中，该第一和/或第二核酸外切酶是核酸外切酶III。
在第十七方面的一个实施例中，SIO和/或所述EAS1包括可检测部分以及淬灭剂部分，并且其中所述可检测部分和淬灭剂部分在由所述核酸外切酶进行修饰时可以分离以提供可检测效应。
在第十七方面的一个实施例中，可检测部分是荧光团。
在第九至第十七方面的一个实施例中，该可检测效应是由荧光光谱、表面等离子体共振、质谱、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、圆二色性谱、免疫测定、色谱法、放射分析法、亮度测定法、闪烁照相术、电子法、UV、可见光或红外光谱、酶法或它们的任何组合来检测。
在第九至第十七方面的一个实施例中，测量可检测效应，并且其中可检测效应的所述测量的幅度和/或积累率指示靶标的量。
在第九至第十七方面的一个实施例中，靶标选自下组，该组由以下各项组成：核酸、蛋白、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古生菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或它们的任何衍生物、部分或组合。
在第九至第十七方面的一个实施例中，核酸选自下组，该组由以下各项组成：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前-以及初级-小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、它们的衍生物、它们的扩增子以及它们的任何组合。
在第九至第十七方面的一个实施例中，核酸的来源选自下组，该组由以下各项组成：合成的、哺乳动物的、人的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的、古生菌的、以及它们的任何组合。
在第九至第十七方面的一个实施例中，扩增核酸。
在第十至第十六方面的一个实施例中，第一DF与所述靶标是相异的。
在第九至第十七方面的一个实施例中，任何所述EAS可以与另一EAS杂交从而形成部分酶信号放大器（PESA）复合体，该复合体能够与多于一种DF杂交。
在第九和第十三至第十六方面的一个实施例中，该方法包括使用特异性针对靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
在第九和第十三至第十六方面的一个实施例中，特异性针对所述靶标分子的不同部分的MNA酶在所述靶标的存在下装配时识别并且切割相同底物。
在第九和第十三至第十六方面的一个实施例中，该方法包括使用对于相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
在第十至第十六方面的一个实施例中，该方法包括使用对于相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
在第九至第十六方面的一个实施例中，该方法包括使用与一种不同的第一DF装配在一起的至少两种相异的CESA复合体。
在第十八方面，本发明提供了用于放大信号的试剂盒，该试剂盒包括；
核酸酶；以及
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成复合体，该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列以及切割序列。
在第十九方面，本发明提供了用于检测靶标的试剂盒，该试剂盒包括；
核酸酶；
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补
多种部分酶，该多种部分酶被设计为装配对应于靶标的MNA酶，以及
MNA酶底物，其中一部分所述底物与一部分EAS1互补；并且
其中EAS1和EAS2形成复合体，该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列和切割序列。
在第二十方面，本发明提供了用于检测靶标的试剂盒，该试剂盒包括
核酸酶；
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补；
多种SIO，被设计为与该靶标杂交以形成核酸酶底物；
其中一部分所述核酸酶底物与一部分EAS1互补
其中EAS1和EAS2形成复合体，该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列和切割序列。
在第二十一方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一全酶信号放大器（CESA）复合体，该复合体只有与一种第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于第一核酸酶的识别和切割序列，并且其中一部分第一DF与一部分EAS1互补。
在第二十二方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括EAS1、EAS2、以及第一核酸酶，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与一种第一DF装配在一起时才包括用于所述第一核酸酶的识别序列和切割序列，其中一部分第一DF与一部分EAS1互补。
在第二十三方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括一种多组分核酸酶（MNA酶）、MNA酶底物、EAS1、EAS2、以及第一核酸酶，其中：
MNA酶包括至少一种第一部分酶以及一种第二部分酶，这些部分酶在MNA酶装配促进物的存在下自我装配以形成MNA酶，其中所述至少第一和所述第二部分酶各自包括底物臂部分、催化核心部分、以及传感臂部分，并且其中这些传感臂与所述MNA酶装配促进物相互作用从而维持该第一和第二部分酶相互靠近以用于它们对应的催化核心部分的关联，从而形成MNA酶的催化核心，并且所述催化核心能够修饰所述MNA酶底物从而形成第一DF；
并且其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中第一DF能够与EAS1和EAS2装配以形成第一CESA复合体，该复合体包含用于所述至少第一核酸酶的识别位点和切割位点。
在第二十三方面的一个实施例中，MNA酶底物是包括第一和第二链的寡聚核苷酸复合体的第一链，其中所述第一链包括内部环部分，并且在内部环部分内的碱基与第二链的碱基不杂交，并且其中MNA酶能够切割内部环部分。
在第二十三方面的一个实施例中，该第二链包含第一DF。
在第二十三方面的一个实施例中，第一和第二链在一端由发夹环部分连接。
在第二十三方面的一个实施例中，MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的一种发夹环部分，所述MNA酶能够切割发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸内的双链茎部分的一条链中。
在第二十三方面的一个实施例中，装配促进物是有待鉴定的靶标。
在第二十四方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
SIO能够与靶标杂交从而形成双链体底物，其中所述第一核酸酶能够切割双链体底物从而产生第一DF；并且其中；
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别序列和切割序列。
在第二十五方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、以及第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
SIO能够与靶标杂交从而形成双链体结构，其中只有在所述SIO与靶标杂交时所述第一核酸酶才能够切割所述SIO从而产生第一DF；并且其中；
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别和切割序列。
在第二十六方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、EAS1、EAS2、第一核酸酶、以及第二核酸酶，其中：
SIO能够与靶标杂交从而形成双链体结构，其中只有在所述靶标与SIO杂交时所述第一核酸酶才能够切割所述靶标从而产生第一DF；
其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有在与第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的识别和切割序列；
并且其中第一核酸酶不是限制性核酸内切酶。
在第二十四至二十六方面的一个实施例中，只有当SIO与靶标杂交时，核酸酶才能够切割SIO以产生所述第一DF。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，只有当靶标与SIO杂交时，第一核酸酶才能够切割靶标以产生所述第一DF。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，第一核酸酶不是限制性内切酶。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，第一核酸酶是核酸外切酶。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，第一和第二核酸酶是相同的核酸酶。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，第一和第二核酸酶是不同的核酸酶。
在第二十一至第二十六方面的一个实施例中，第一核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第二十四至第二十六方面的一个实施例中，第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第二十一至第二十六方面的一个实施例中，切口位于核酸酶识别位点内、核酸酶切割位点处、或核酸酶识别和切割位点之间。
在第二十一至第二十六方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，EAS1和EAS2是发夹寡聚核苷酸的组分，发夹寡聚核苷酸包括由所述EAS1和EAS2的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的发夹环部分。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS1或EAS2的任一个延伸的单链的5’或3’突出部分。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，所述一部分EAS1或EAS2包括第二DF，并且其中所述第二DF可以在由核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，一部分所述发夹环部分包括第二DF，并且其中所述第二DF可以在由核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第一DF和第二DF不是相同的。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第一DF和第二DF是相同的。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第二DF是所述第一DF的片段，或者所述第一DF是所述第二DF的片段。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第二DF、EAS1、和EAS2能够装配以形成所述第一CESA复合体。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，试剂盒进一步包括第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4），其中一部分EAS3与一部分EAS4互补，并且一部分EAS3与一部分第二DF互补，并且其中EAS3和EAS4形成第二CESA复合体，该复合体只有在与第二DF装配在一起时才包含用于额外的核酸酶的识别序列和切割序列。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，EAS3或EAS4包括第三DF。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第三DF和所述第一DF是相同的。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，第三DF和所述第一DF不是相同的。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，额外的核酸酶与所述试剂盒中的另一核酸酶是相同的。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，额外的核酸酶与所述试剂盒中的另一核酸酶不是相同的，并且其中所述试剂盒包括所述额外的核酸酶。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，额外的核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，EAS3和EAS4是发夹寡聚核苷酸的组分，发夹寡聚核苷酸包括由EAS3和EAS4的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的发夹环部分。
在第十八至第二十六方面的一个实施例中，发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS3或EAS4的任一个延伸的单链的5’或3’突出部分。
在第二十七方面，本发明提供了包括第一复合体的试剂盒，所述第一复合体包括主链寡聚核苷酸、EAS1、EAS2、EAS3、以及EAS4，其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS1的第一部分，其中一部分所述EAS1与一部分EAS2互补，一部分EAS2与一部分第一DF互补，并且一部分EAS1或EAS2包括第二DF，并且其中EAS1和EAS2形成第一CESA复合体，该复合体只有与该所述第一DF装配在一起时才包含用于第一核酸酶的识别序列和切割序列；
(ii)包括所述EAS3的第二部分，其中一部分所述EAS3与一部分所述EAS4互补，一部分所述EAS3与一部分第二DF互补，并且一部分所述EAS3或EAS4包括所述第一DF，并且其中EAS3和EAS4形成第二CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于第二核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分。
在第二十七方面的一个实施例中，试剂盒进一步包括第二复合体，所述第二复合体包括主链寡聚核苷酸、第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）、第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）、第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）、以及第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8），其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS5的第一部分，其中一部分所述EAS5与一部分所述EAS6互补，一部分所述EAS5与一部分所述第二DF互补，并且一部分所述EAS5或EAS6包括所述第一DF，并且其中EAS5和EAS6形成第三CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于第三核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(ii)包括所述EAS7的第二部分，其中一部分所述EAS7与一部分所述EAS8互补，一部分所述EAS8与一部分所述第一DF互补，并且一部分所述EAS7或EAS8包括所述第二DF，并且其中EAS7和EAS8形成第四CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包含用于第四核酸酶的识别序列和切割序列；以及
(iii)连接第一和第二部分的第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补。
在第二十七方面的一个实施例中，EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
在第二十七方面的一个实施例中，第一核酸酶与第三核酸酶相同，和/或第二核酸酶与第四核酸酶相同，和/或第一、第二、第三以及第四核酸酶是相同的。
在第二十七方面的一个实施例中，第一和第二复合体经由它们对应的互补的第三部分进行杂交，形成第一双重复合体。
在第二十七方面的一个实施例中，第一双重复合体连接至第二双重复合体。
在第二十七方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第二十七方面的一个实施例中，通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
在第二十七方面的一个实施例中，连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、以及肽接头中的任何一种或多种来达到的。
在第二十七方面的一个实施例中，连接是经由任何一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的经生物素化的多个酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
在第二十七方面的一个实施例中，第一和/或所述第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链中的至少一条中的切口。
在第二十七方面的一个实施例中，该第一和/或所述第二核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
在第二十七方面的一个实施例中，选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是发夹寡聚核苷酸的组件，发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的发夹环部分。
在第二十八方面，本发明提供了包括SIO的试剂盒，所述SIO包括：
(i)与靶标链互补的第一部分以及与所述靶标链不互补的第二部分，其中所述第一和第二部分是由硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括第一DF；以及
(ii)一个EAS1以及一个EAS2，其中
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且EAS1与EAS2的杂交提供了在任一端具有3’突出端的双链体结构，
一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且
EAS1和EAS2能够形成第一CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包括能够由第一核酸酶所酶解的凹3’端
在第二十八方面的一个实施例中，SIO是发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的双链茎、单链发夹环、以及3’突出端。
在第二十八方面的一个实施例中，核酸酶是核酸外切酶。
在第十八至第二十八方面的一个实施例中，任何所述EAS包括一个或多个可检测标记。
在第十八至第二十八方面的一个实施例中，任何所述EAS包括荧光团部分和淬灭剂部分。
在第十八至第二十八方面的一个实施例中，任何所述的MNA酶部分酶、MNA酶底物、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF或核酸酶附接至固体支持物上。
在第十九、第二十、以及第二十三至第二十六方面的一个实施例中，任何第一DF与所述靶标是相异的。
在第十九和第二十三方面的一个实施例中，试剂盒包括特异性针对靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
在第十九和第二十三方面的一个实施例中，特异性针对所述靶标分子的不同部分的MNA酶在所述靶标的存在下装配时识别并且切割相同底物。
在第十九和第二十三方面的一个实施例中，试剂盒包括对于相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
在第二十、第二十四至第二十六、以及第二十八方面的一个实施例中，试剂盒包括对于相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
在第二十九方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括第一至第八方面中任一方面的组合物。
在第十九至第二十九方面的一个实施例中，试剂盒进一步包括用于使用所述试剂盒的说明书。
在另一方面，提供了一种组合物，该组合物包括至少一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及至少一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有与驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于核酸酶的识别序列和切割序列，其中一部分DF与一部分EAS1互补。
在另一方面，提供了一种组合物，该组合物包括至少一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及至少一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2）以及至少一种第一核酸酶，其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有与驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于所述第一核酸酶的识别序列和切割序列，其中一部分DF与一部分EAS1互补。核酸酶可以是限制性内切酶。
在另一方面，提供了一种组合物，该组合物包括至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、至少一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）、至少一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2）、至少一种第一核酸酶以及至少一种第二核酸酶，其中；
SIO能够与靶标杂交从而形成双链体底物，其中所述第一核酸酶能够切割该双链体底物从而产生驱动片段（DF）；并且其中；
一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分DF互补，并且其中EAS1和EAS2形成全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有在与该DF装配在一起时才包含用于第二核酸酶的识别和切割序列。
该第一和第二核酸酶可以是相同的核酸酶，可替代地第一和第二核酸酶可以是不同的核酸酶。
在另一方面，提供了一种组合物，该组合物包括至少一种MNA酶、至少一种MNA酶底物以及至少一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及至少一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2）以及至少一种第一核酸酶，其中：
MNA酶包括至少一种第一部分酶以及一种第二部分酶，这些部分酶在MNA酶装配促进物的存在下自我装配以形成MNA酶，并且其中所述至少第一和所述第二部分酶各自包括底物臂部分、催化核心部分、以及传感臂部分，并且其中这些传感臂与所述MNA酶装配促进物相互作用从而维持该第一和第二部分酶相互靠近以用于它们对应的催化核心部分的关联，从而形成MNA酶的催化核心，所述催化核心能够修饰所述MNA酶底物从而形成驱动片段（DF）；
并且其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且一部分EAS1与一部分第一DF互补，并且其中DF能够与EAS1和EAS2装配以形成全酶信号放大复合体（CESA），该复合体包含用于所述至少第一核酸酶的识别位点和切割位点。
装配促进物可以是有待鉴定的靶标。第一和/或第二核酸酶可以选自下组，该组包括：限制性内切酶、核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶可以是T7核酸内切酶I或绿豆核酸酶。核酸外切酶可以是核酸酶BAL-31、核酸外切酶1、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I或核酸外切酶T。在一个实施例中，核酸外切酶是核酸外切酶III。
在另一方面，提供了检测靶标的方法，该方法包括
(a)提供至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）；
(b)在允许SIO与靶标的杂交的条件下，使SIO与推定包含靶标的样品接触，因此为一种第一核酸酶创造一种双链体底物，
(c)提供能够切割由该SIO与该靶标的杂交形成的双链体底物的第一核酸酶，其中由第一核酸酶对该双链体底物的切割产生驱动片段（DF）；
(d)提供第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）和第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分DF互补，并且；
(e)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与驱动片段接触：
(1)DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成CESA，以及
(2)用于第二核酸酶的识别和切割位点的形成；
(f)提供第二核酸酶；并且
(g)在允许第二核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使第二核酸酶与CESA接触，其中由第二核酸酶进行的切割产生指示靶标的存在的可检测效应。
在另一方面，提供了用于检测靶标的方法，该方法包括
(a)提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，其中这些部分酶在靶标的存在下进行自我装配以形成至少一种MNA酶；
(b)在允许MNA酶的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含靶标的样品接触，并且其中所述MNA酶的催化活性从所述至少一种MNA酶底物产生驱动片段（DF）；
(c)提供第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）和第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分EAS1与一部分EAS2互补，并且其中一部分EAS1与一部分DF互补，并且；
(d)在允许以下项的条件下使EAS1和EAS2与驱动片段接触：
(1)DF与EAS1和EAS2的装配，从而形成CESA，以及
(2)核酸酶识别和切割位点的形成
(e)提供核酸酶；
(f)在允许核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使核酸酶与CESA接触，其中由所述核酸酶进行的切割产生指示靶标的存在的可检测效应。
在第五和第六方面的方法中的核酸酶可以选自下组：限制性内切酶、核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶可以是T7核酸内切酶I或绿豆核酸酶。核酸外切酶可以是核酸酶BAL-31、核酸外切酶1、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I或核酸外切酶T。在一个实施例中，核酸外切酶是核酸外切酶III。
驱动片段可以通过MNA酶底物的切割或两种或更多种MNA酶底物的连接来产生。
EAS1可以包括可检测部分和淬灭剂部分，其中在由核酸酶对EAS1进行切割时，由可检测部分提供的可检测效应增大或减小。在另一个实施例中，EAS1可以包括可检测部分并且EAS2可以包括淬灭剂部分。可替代地，EAS2可以包括可检测部分并且EAS1可以包括淬灭剂部分。在由核酸酶进行切割时，由可检测部分提供的可检测效应可以增大或减小。
CESA的切割允许另外的驱动片段的释放，并且该驱动片段可以与另外的EAS1和EAS2装配以形成另外的CESA，其中至少一种另外的核酸酶切割另外的CESA以产生另外的可检测效应以及另外的驱动片段的释放，由此协助可检测效应的进一步增大。
可检测效应可以通过荧光光谱、表面等离子体共振、质谱、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、圆二色性谱、免疫测定、色谱法、放射分析法、亮度测定法、闪烁照相术、电子法、UV、可见光或红外光谱、酶法或它们的任何组合来检测。
可以测量可检测效应，并且该测量的幅度可以指示靶标的量。
靶标可以选自下组：核酸、蛋白、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古生菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或它们的任何衍生物、部分或组合。
核酸可以选自下组：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前-以及初级-小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、它们的衍生物、它们的扩增子或它们的任何组合。
核酸的来源可以选自下组：合成的、哺乳动物的、人的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的、古生菌的、以及它们的任何组合。
可以扩增核酸。扩增可以包括以下项的一个或多个：聚合酶链式反应（PCR）、链置换扩增（SDA）、环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、转录介导的扩增（TMA）、自主维持序列复制（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
部分酶、装配促进物、MNA酶底物、驱动片段、EAS1、EAS2或SIO中的至少一个包括至少一个选自下组的核苷酸替换物或增加物，该组由以下各项组成：硫代磷酸酯、4-乙酰胞苷、5-(羟甲基羧基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、βD-半乳糖辫苷、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、βD-甘露糖甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、βD-阿糖尿苷以及βD-阿糖胸苷。
在一些实施例中，可以将核苷酸类似物包括进来以防止特异性核酸内切酶或核酸外切酶在一些位点处对寡聚核苷酸片段的酶解，这些位点会干扰由CESA的靶向切割引起的信号的产生。在优选实施例中，硫代磷酸酯连键可以用来抑制核酸酶（例如T7核酸外切酶、核酸外切酶III和/或核酸外切酶I）的切割。
MNA酶部分酶、MNA酶底物或其组合的至少一个可以进一步包括至少一种适体或其部分。适体或其部分可以包括以下项中的至少一个：核酸、肽、多肽或蛋白或它们的衍生物或组合。
适体、或其部分可以结合靶标，该靶标选自下组：核酸、蛋白、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古生菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或它们的任何衍生物、部分或组合。
MNA酶部分酶、MNA酶底物、EAS1、EAS2、SIO或至少一种核酸酶中的至少一个可以附接至固体支持物。
在另一方面，提供了用于放大信号的试剂盒，该试剂盒包括；
核酸酶；以及
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补，并且其中EAS1和EAS2形成全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列和切割序列。
在另一方面，提供了用于检测靶标的试剂盒，该试剂盒包括；
核酸酶；
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补，
多种部分酶，该多种部分酶被设计为装配对应于靶标的MNA酶，以及
MNA酶底物，其中一部分所述底物与一部分EAS1互补；并且
其中EAS1和EAS2形成一种全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列和切割序列。
在另一方面，提供了用于检测靶标的试剂盒，该试剂盒包括；
核酸酶；
EAS1和EAS2，其中一部分EAS1和EAS2互补；
多种SIO，被设计为与该靶标杂交以形成核酸酶底物；
其中一部分所述核酸酶底物与一部分EAS1互补；并且
其中EAS1和EAS2形成一种全酶信号放大器复合体（CESA），该复合体只有在与一种驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的识别序列和切割序列。
本发明的这些和其他方面将在下文并且参照附图及实例而得以更详细地描述，这些附图及实例对本发明的一些方面是说明性的，并不涵盖本发明的全部内容，技术人员将容易理解的是能够在所附权利要求书的意义和范围内作出变化和变更。
附图简要说明
现在将仅通过实例，参照这些附图来说明本发明的优选实施例，其中：
图1提供了不同可切割和不可切割的双链体寡聚核苷酸结构的示例性图示。每个寡聚核苷酸片段的5’端由圆圈指示。结构A(i)展示了全酶信号放大器（CESA）复合体的实例，该复合体是易于由核酸酶进行切割的多寡聚核苷酸复合体。此CESA由三个寡聚核苷酸组成，即酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1）、酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2）以及驱动片段（DF）。在A(i)中展示的CESA中，DF的5’端与EAS2的3’端邻接。在A(ii)中展示的第二CESA中，DF的3’端与EAS2的5’端邻接。
结构B(i)展示了酶抑制复合体（EIC）的实例，该复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体对核酸酶（例如RE）的切割有抗性，这是由于额外序列的存在，该额外序列破坏了易于切割的双链体结构的形成。此EIC是由三种寡聚核苷酸组成，即EAS1、EAS2以及抑制片段（InF）。InF包含DF序列加上额外序列，该额外序列破坏与EAS2的接合，并且使得EIC复合体对核酸酶的酶解具有抗性。在B(i)EIC中，InF的5’端破坏EAS2的3’端。一个第二EIC展示在B(ii)中，其中InF的3’端破坏EAS2的5’端。
结构C(i)展示了部分酶信号放大器（PESA）复合体的实例，该复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体对核酸酶（例如RE）的切割有抗性，这是由于缺乏用来形成易于切割的双链体结构所需的序列。在此图示中，PESA由两种寡聚核苷酸组成，即EAS1和EAS2。此PESA不包含用于由核酸酶识别和/或切割的足够的双链体序列。在C(i)PESA中，在EAS1的5’端有不充足的双链体序列。在C(ii)中展示的第二PESA中，其中在EAS1的3’端有不充足的双链体序列。
图2示出了对于不同的完全装配的全酶信号放大器（CESA）复合体的示例性图解，这些复合体被设计为由限制性核酸内切酶（RE）切割。在这些简图中，顶部黑色实线表示酶放大器底物寡聚核苷酸片段1（EAS1），并且底部黑色线表示CESA的酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2）。驱动片段（DF，由具有白色中心的黑色线表示）可以被需要来完成RE（表示为阴影线框）的识别序列，和/或可以提供RE切割所需要的、毗邻于RE识别位点的额外序列。一个或多个切割位点由实心黑色垂直箭头表示。
由RE进行的切割可以导致5’突出、3’突出的任一种，或它可以产生平头末端。该RE可以切割双链装配的CESA（包括EAS1、EAS2以及DF）的一条或两条链。EAS2和DF邻接的位置可以是在RE将要正常切割连续（未中断）双链的双链体的位置处，或者它可以是在具有RE的识别和切割所需要的序列的别处。与EAS2邻接的DF的末端可以已经在先前的步骤中由更长的寡聚核苷酸（例如抑制片段（InF））的切割产生。InF可以包括例如，由核酸酶可切割的合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、或由MNA酶可切割的MNA酶底物。由蛋白酶或MNA酶对此类更长的寡聚核苷酸的切割可以导致5’和3’片段，这两种片段中的一个或两者可以充当DF用于形成CESA。在此类情况下，与EAS2邻接的DF的末端必须是经切割的寡聚核苷酸的3’片段的5’端、或经切割的寡聚核苷酸的5’片段的3’端。
小图(a)：具有DF的装配的CESA，其中需要该DF来完成RE的识别序列，并且RE切割导致3’突出。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(b)：具有DF的装配的CESA，其中需要该DF来完成RE的识别序列，并且RE切割导致5’突出。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(c)：具有DF的装配的CESA，其中需要该DF来完成RE的识别序列，并且RE切割导致平头末端。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(d)：具有DF的装配的CESA，其中需要该DF来完成RE的识别序列，并且RE仅切割一条链（在此图示中为EAS1）。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(e)：具有DF的装配的CESA，其中不需要该DF来完成RE的识别序列，而是提供RE切割所需要的、毗邻于RE识别位点的序列。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(f)：具有DF的装配的CESA，其中需要该DF来完成RE的识别序列，并且RE切割导致5’突出。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是5’切割片段的3’端。
小图(g)：具有DF的装配的CESA，其中该DF通过提供RE切割所需要的、完整RE识别序列的一条链来完成RE的识别序列。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是3’切割片段的5’端。
小图(h)：具有DF的装配的CESA，其中该DF通过提供RE切割所需要的、完整RE识别序列的一条链来完成RE的识别序列。在此实例中，与EAS2邻接的DF的末端是5’切割片段的3’端。
图3是实例1中不同的可切割和不可切割的双链体寡聚核苷酸结构的示例性图示。每个寡聚核苷酸片段的5’端由圆圈指示。完整的或部分的限制性内切酶识别位点被指示为虚线框，并且这些限制性内切酶切割位点被指示为垂直的实心箭头。小图A展示了全酶信号放大器（CESA）复合体的实例，该复合体是易于由核酸酶进行切割的多寡聚核苷酸复合体。在此图和在实例1中，酶是限制性内切酶（RE）Mnl I，该酶在从它的识别位点的一个距离处进行切割。此CESA由三个寡聚核苷酸组成，即用荧光团和淬灭剂标记的酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1，由上部的实心黑线表示）、用淬灭剂标记的酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2，由下部的实心黑线表示）以及驱动片段（DF，由具有白色中心的黑线表示）。在此CESA中，DF的5’端与EAS2的3’端邻接。由于由RE对EAS1和EAS2寡聚核苷酸的切割，此CESA的切割导致荧光的增加，然而，DF不被切割并且这样会是可利用的以便结合至另一部分酶信号放大器（PESA）复合体。一种反应，例如借助CESA的切割的手段来放大信号的反应，称为“EzyAmp”反应。
小图B展示了酶抑制复合体（EIC）的实例，该复合体是对RE的切割有抗性的多寡聚核苷酸复合体。此EIC是由三种寡聚核苷酸组成，即EAS1、EAS2以及抑制片段（InF）。InF包括DF的整个序列（包括需要完成RER的那些碱基），但是还包括额外序列，该额外序列破坏RE切割所需要的结构的形成。在此EIC中，InF的5’端邻接EAS2的3’端，并且破坏在EAS2的3’端处的结合。InF可以包括寡聚核苷酸序列，该寡聚核苷序列能仅在靶标的存在下被切割以产生DF。例如，InF可以包括：由核酸酶以靶标特异性的方式可切割的SIO、或由MNA酶可切割的MNA酶底物。
小图C展示了部分酶信号放大器复合体（PESA）的实例，该复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体对核酸酶（例如RE，Mnl I）的切割有抗性。此PESA由两种寡聚核苷酸组成，即EAS1和EAS2。此PESA不包含RE所需的双链识别序列。
小图D展示了对照实例，该对照实例仅包含EAS1，并且因此不易于由RE切割。切割不能发生，因为需要与EAS1互补的序列来形成RE识别和切割位点。
图4展示了EzyAmp反应的一个实例。驱动片段（DF）（由靶标依赖性酶修饰产生的，或直接添加至反应混合物中的）存在于包含PESA复合体的反应中，该PESA复合体包括第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）和第二酶放大器底物（EAS2）寡聚核苷酸。该DF与PESA复合体装配以创造包含核酸酶识别和切割位点的CESA，在此图示中该核酸酶是限制性内切酶。EAS1、EAS2以及DF的每一个上的圆圈指示各个寡聚核苷酸的5’端。限制性内切酶识别位点被指示为虚线框，并且这些限制性内切酶切割位点是由垂直的实心箭头指示。在此图示中，第一EAS1是用荧光团（F）标记，并且第二EAS2是用淬灭剂（Q）标记。装配的CESA的切割后，组分随后解离，导致荧光信号的产生以及完整DF的释放。DF然后游离，以便与另一个PESA关联以形成另一个CESA，导致寡聚核苷酸的另外的酶切割以及随后的荧光。因此该过程继续并且导致信号放大，从而荧光信号由核酸酶（例如，限制性内切酶）介导的对另外的CESA的切割产生。
图5是用于MNA酶启动的EzyAmp反应的一个示例性图解，该反应中信号放大是由RE对CESA的切割所介导的。框A展示了装配的MNA酶（实心灰线）结合到它的底物上（具有白色中心的黑线）；并且框B展示了两个部分酶信号放大器（PESA）复合体（实心黑线），这两个各自构成了在此图示中用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1），以及在此图示中用淬灭剂（Q）标记的酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2）。框C展示了全酶信号放大器（CESA）复合体，该复合体是由EAS1、EAS2、以及经切割的MNA酶底物的、现在发挥驱动片段（DF）功能的一个片段形成。EAS1、EAS2、MNA酶部分酶、MNA酶底物、以及DF的每一个上的圆圈指示各个寡聚核苷酸的5’端。限制性内切酶识别位点被指示为虚线框，并且这些限制性内切酶切割位点被指示为垂直的实心箭头。在反应中的不同步骤被标为数字1至6。该反应允许使用下列步骤检测靶标DNA或RNA。在步骤1中，靶标与部分酶装配以形成MNA酶，该MNA酶切割MNA酶底物。在步骤2中，经切割的MNA酶底物的一个片段与PESA结合在一起，其中该片段发挥DF的功能并且导致CESA的形成。在步骤3中，完全装配的CESA由RE切割。在步骤4中，经切割的CESA片段解离，导致荧光团和淬灭剂的分离，因此产生荧光的增加，该荧光指示靶标核酸的存在。因为在此方案中DF实际上不是由RE对其本身切割，该DF是游离的，从而与另一个PESA关联（步骤5），从而形成新的CESA，该新的CESA可以由RE切割（步骤6），因此导致荧光信号的进一步放大。
图6是由MNA酶启动的EzyAmp反应产生的荧光信号的图示，在该反应中信号放大是由RE（在此实例中为Mnl I）对CESA的切割所介导的。在此实例中，通过观察与每个步骤关联的荧光的变化来同时监测启动（通过MNA酶）与信号放大（通过RE）的两个步骤。在靶标装配促进物（AF-PD1）的存在下MNA酶对MNA酶报道底物（Sub1(8:9)-FB）进行切割的靶标依赖性启动步骤是通过在FAM与淬灭剂（两者存在于MNA酶报道底物上）分离后FAM的增加来监测的。信号放大的EzyAmp步骤是在此EAS1并入由EAS1、EAS2以及DF形成的CESA复合体中时，通过在JOE和淬灭剂之间的EAS1寡聚核苷酸的切割之后JOE荧光的增加来监测的。这些反应的所有组分，包含靶标（AF-PD1）亦或缺少靶标（对照），均存在于一个反应室中，并且FAM和JOE两者的荧光被同时监测。在FAM通道中，在靶标装配促进物AF-PD1（(i)靶标AF-PD1）的存在下MNA酶介导的对Sub1(8:9)-FB的切割导致FAM荧光随着时间的推移而增加并且产生DF。在缺乏AF-PD1（(ii)没有靶标的对照）的反应中，FAM荧光随着时间的推移而没有增加。在JOE通道中，在由MNA酶在靶标AF-PD1（(iii)靶标AF-PD1）存在下对Sub1-FB进行切割而产生的DF的存在下，RE活性导致CESA的切割以及JOE荧光随着时间的推移而增加。相反，缺乏AF-PD1（(iv)没有靶标的对照）的反应未示出JOE荧光随着时间的推移而增加。
图7是EzyAmp系统的一个示例性图解，该系统包含多个CESA复合体。EAS1、EAS2以及DF的每一个上的圆圈指示每个寡聚核苷酸的5’端。限制性内切酶识别位点被指示为虚线框，并且这些限制性内切酶切割位点被指示为垂直的实心箭头。在此图示中，CESA A*是由PESA A与DF-a组合形成。CESA B*是由PESA B与DF-b组合形成。DF-a是在靶标分析物的存在下在一些条件下形成，由此分析物的存在导致较大的寡聚核苷酸片段的切割，例如SIO的靶标依赖性核酸酶切割或MNA酶底物的靶标依赖性MNA酶切割。DF-a与PESA A组合形成CESA A*，该CESA A*由RE在不修饰DF-a的情况下进行切割以产生DF-b，并且信号可以产生。DF-a可以进而形成新的CESA A*并且放大DF-b分子的信号和数目两者。此外，DF-b可以与PESA B组合形成CESA B*，该CESA B*可以由RE在不修饰DF-b的情况下进行切割以产生额外的信号。因此DF-b可用于形成加成CESA B*并且进一步放大信号。
图8展示了使用来自大肠杆菌的核酸外切酶I的3’到5’核酸外切酶活性来产生驱动片段（DF）的机制。此酶从DNA双链体去除3’单链突出端。条纹灰线表示靶标DNA，并且实心黑线表示添加至混合物中以协助驱动片段产生的合成起始物寡聚核苷酸（SIO）。闭合的圆圈表示寡聚核苷酸的5’端。实心灰线表示PESA，该PESA通过DF的杂交转化为CESA。开放的圆圈（open circle）表示在3’突出端的硫代磷酸酯，该硫代磷酸酯被并入以防止在这个位置处由核酸外切酶I对复合体的切割。在左边小图中，驱动片段衍生自靶标。在右边小图中，DF衍生自合成起始物寡聚核苷酸。在右边小图的方案中，该靶标可以被再利用以产生更多DF。
图9展示了用于使用绿豆核酸酶的核酸外切酶活性来产生驱动片段的机制。这个核酸内切酶从3’亦或5’方向降解来自DNA双链体的单链突出端，留下平头末端。条纹灰线表示靶标DNA，并且实心黑线表示添加至混合物中以协助DF产生的合成起始物寡聚核苷酸（SIO）。闭合的圆圈表示寡聚核苷酸的5’端。实心灰线表示PESA，该PESA通过DF的杂交转化为CESA。在左边小图中，驱动片段衍生自靶标。在右边小图中，DF衍生自合成起始物寡聚核苷酸。在左边（L）或右边（R）小图两者中描绘的方法可以用2个步骤（1和2）来进行，这2个步骤防止绿豆核酸酶对PESA或CESA的酶解。这可以通过物理分离或其他手段来达到。
图10展示了用于使用核酸外切酶III的核酸外切酶活性来产生驱动片段的机制。此酶从DNA双链体的3’末端去除核苷酸。该酶在平头或凹的3’末端上是有活性的，但在单链DNA上是没有活性的，并且因此将不会切割3’突出末端。该酶还可以从双链体DNA中的切口启动水解，从而产生单链缺口。在寡聚核苷酸上的硫代磷酸酯核苷酸的存在（由空心圆指示）阻断此核酸外切酶活性。条纹灰线表示靶标DNA，并且实心黑线表示添加至混合物中以协助DF产生的合成起始物寡聚核苷酸。闭合的圆圈表示寡聚核苷酸的5’端。实心灰线表示PESA，该PESA通过DF的杂交转化为CESA。在DF的3’侧翼中的硫代磷酸酯防止在此片段形成CESA时创造的切口处的切割。DF衍生自SIO，并且完整的靶标可以被再利用以产生更多DF。
图11展示了用于使用T7核酸外切酶的核酸外切酶活性来产生驱动片段的机制。此酶从DNA双链体或DNA/RNA双链体的5’端去除核苷酸，在磷酸化的5’核苷酸上具有更高活性。在磷酸化底物的存在下，在不具有5’磷酸的5’端上的活性大大降低。条纹灰线表示靶标RNA，并且实心黑线表示添加至混合物中以协助DF产生的合成起始物寡聚核苷酸。P代表在5’末端的磷酸化核苷酸。实心灰线表示PESA，该PESA通过DF的杂交转化为CESA。DF衍生自合成起始物寡聚核苷酸（SIO），并且该RNA靶标可以被再利用以产生更多DF。该PESA是由DNA组成，但可以在双链体的5’末端具有一些RNA（虚线框）以便防止由T7核酸外切酶降解。
图12是由MNA酶启动的EzyAmp反应所产生的荧光信号的图示，在该反应中信号放大是通过由RE（例如Mnl I）对CESA的切割所介导的。在此实例中，通过观察与每个步骤关联的荧光的变化来同时监测启动与信号放大的两个步骤。在靶标装配促进物（AF-PD1）的存在下MNA酶对MNA酶报道底物（Sub1-TRB2-用TXR和淬灭剂标记的）进行切割的靶标依赖性启动步骤是通过在TXR与淬灭剂分离后TXR的增加来监测的。信号放大的EzyAmp步骤是在此EAS1并入由EAS1、EAS2以及DF形成的CESA复合体中时，通过在JOE和淬灭剂之间的EAS1寡聚核苷酸的切割之后JOE荧光的增加来监测的。这些反应的所有组分，包含靶标（AF-PD1）亦或缺少靶标（对照），均存在于一个反应室中，并且TXR和JOE两者的荧光被同时监测。在TXR通道中，在靶标装配促进物AF-PD1（(i)靶标AF-PD1）的存在下MNA酶对Sub1-TRB2的切割导致TXR荧光随着时间的推移而增加并且产生DF。在缺乏AF-PD1（(ii)没有靶标的对照）的反应中，TXR荧光没有随着时间的推移而增加。在JOE通道中，在MNA酶在靶标AF-PD1（(iii)靶标AF-PD1）存在下进行的切割所产生的DF的存在下，RE活性导致CESA的切割以及JOE荧光随着时间的推移而增加。相反，缺乏AF-PD1（(iv)没有靶标的对照）的反应未示出JOE荧光随着时间的推移而增加。
图13展示了用于对任何组靶标的多路等温通用信号放大的策略。寡聚核苷酸的每一个上的圆圈指示每个寡聚核苷酸的5’端。限制性内切酶识别位点被指示为虚线框。用于多个靶标多路分析的策略使用多个MNA酶，这些MNA酶切割多个通用底物从而产生可以与多个通用PESA装配的多个通用驱动片段，从而形成多个通用CESA。该策略被展示为用于三种靶标（靶标1、靶标2以及靶标3）的检测。靶标1可以导致MNA酶的装配，该MNA酶能够切割通用MNA酶底物1。通用MNA酶底物1的切割可以导致通用驱动片段1的产生，该通用驱动片段1可以与PESA1装配形成CESA1。CESA1可以用独特的荧光团1来标记，该CESA1在用核酸酶切割时会产生唯一的波长的荧光，指示靶标1的存在。类似地靶标2可以导致MNA酶的装配，该MNA酶能够切割通用MNA酶底物2。通用MNA酶底物2的切割可以导致通用驱动片段2的产生，该通用驱动片段2可以与PESA2装配形成CESA2。CESA2可以用独特的荧光团2来标记，该CESA2在用核酸酶切割时会产生唯一的波长的荧光，指示靶标2的存在。靶标3可以导致MNA酶的装配，该MNA酶能够切割通用MNA酶底物3。通用MNA酶底物3的切割可以导致通用驱动片段3的产生，该通用驱动片段3可以与PESA3装配形成CESA3。CESA3可以用独特的荧光团3来标记，该CESA3在用核酸酶切割时会产生唯一的波长的荧光，指示靶标3的存在。在CESA1和2以及3的切割时，可以在单个反应中同时监测与荧光团1和2以及3关联的荧光。
在这样的通用多路系统中，可以容易地将新的靶标置换入该多路反应中。例如，通用MNA酶底物1/PESA1/CESA1/荧光团1系统将仅需要新的MNA酶的合成，该新的MNA酶具有特异性针对新靶标的传感臂，但保留适用于结合至MNA酶底物1上的底物臂。因为MNA酶底物1的切割始终产生相同的驱动片段1，新的靶标将如以前一样导致CESA1的装配和随后的切割。
图14示出了分析不同双链体结构的结果。在小图A、B和C中的所有双链体结构包括一个用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的顶部实心黑色寡聚核苷酸（EAS1）、以及一个用淬灭剂标记的底部实心黑线（EAS2）。EAS1和EAS2一起包括PESA。此外，小图A具有条纹的底部寡聚核苷酸，它表示驱动片段（DF），并且小图B具有条纹的底部寡聚核苷酸，它表示抑制片段（InF）。
在小图A中，在反应中EAS1、EAS2以及DF1的存在导致对于RE MnlI而言可切割的CESA双链体底物的形成，如通过观察到FAM荧光随着时间的推移而增加所指示的（图14A）。此观察与限制性内切酶识别并切割包含断口或切口的双链复合体的能力一致，这些断口或切口在RE识别和切割所需区域内的两条链的至少一条中。相反，在小图B中，反应中缺少DF1片段但包含InF，形成的双链体不被切割并且因此随着时间的推移的过去没有观察到荧光的增加（图14B）。尽管存在InF包含DF1的整个序列的事实，这仍发生。存在于InF中的序列（该序列对于也存在于DF中的特异序列是额外的）抑制了可切割双链体底物的形成。确实，额外序列导致不可切割复合体（称为酶抑制复合体（EIC））的形成。
在小图C中，反应仅包含EAS1和EAS2并且缺少DF1和InF两者，没有观察到荧光的增加，指示单独的这两个寡聚核苷酸（EAS1和EAS2）对于RE对双链体的识别和切割是不够的（图14C）。寡聚核苷酸EAS1和EAS2杂交以形成部分的酶信号放大器（PESA）复合体，然而，需要额外的寡聚核苷酸即DF来将不可切割的PESA转化为可切割的CESA。
图15展示了不同的结构，在这些结构中DF可以结合至候选PESA，由此一些变化导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA双链体底物。在实例5的反应1至8中，测试了这些结构。在这个实例中，通过观察在DF的存在（标记(i)的轨迹）或不存在（标记(ii)的轨迹）下，与荧光团和淬灭剂部分的分离关联的荧光变化来监测Mnl I切割。每个小图，编号为1至8，指示候选PESA的结构（实心黑线）以及候选DF的位置（条纹线）。圆圈指示寡聚核苷酸的5’端。RERS指示为虚线框。“N”等同于在形成RERS所需的DF中存在的脱氧核糖核苷酸（即，来自从PESA丢失的RERS的核苷酸），除了在反应7中N是指存在于DF和RERS之间的脱氧核糖核苷酸外。在反应4中“n”指示核糖核苷酸。实心垂直箭头指示Mnl I的切割位点，‘^’指示在毗邻核苷酸之间磷酸二酯键的不存在。在候选PESA和DF结构的示意图之下是如在实例5中所述的在用Mnl I孵育这些寡聚核苷酸期间荧光水平随着时间的推移的曲线图。示出了两个重复反应的平均值。
在小图1中（实例5的反应1），DF被设计为3’序列刚好在5’GAGG3’部分Mnl I识别位点之前（GAGG^）。与DF的不存在下荧光的增加相比(ii)，在DF的存在下观察到荧光增加的更快速率(i)。在此反应中PESA包含整个RER序列，但是在RERS侧翼的额外序列的添加（由DF提供）导致更快切割。
在小图2中（实例5的反应2），DF被设计为通过来自3’端的一个核苷酸完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’（GAG^G）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF通过来自3’端的一个核苷酸（G）来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’时形成。
在小图3中（实例5的反应3），DF被设计为通过来自3’端的两个核苷酸来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’（GA^GG）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF通过来自3’端的两个核苷酸（GG）来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’时形成。
在小图4中（实例5的反应4），DF被设计为通过来自3’端的两个核苷酸（伴随第二个碱基是核糖核苷酸）来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’（GA^gG）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF通过来自3’端的两个核苷酸（GG）来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’时甚至在第二核苷酸是核糖核苷酸（Gg）时形成。
在小图5中（实例5的反应5），DF被设计为通过来自3’端的三个核苷酸来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’（G^AGG）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF通过来自3’端的三个核苷酸（GGA）来完成部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’时形成。
在小图6中（实例5的反应6），DF被设计为正好结合为Mnl I识别序列5’GAGG3’上游的5’序列（^GAGG）。在DF的存在下(i)或DF的不存在下(ii)没有观察到荧光随着时间的推移而增加。这个结果指示在DF正好结合在Mnl I识别序列5’GAGG3’的上游5’端时没有可切割的CESA形成。
在小图7中（实例5的反应7），DF被设计为结合为Mnl I识别序列5’GAGG3’上游两个核苷酸处的5’序列（^NNGAGG）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF结合Mnl I RERS上游两个核苷酸从而完成RE切割位点时形成。
在小图8中（实例5的反应8），DF被设计为通过来自5’端的两个核苷酸来完成部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’（CC^TC）。在DF的存在下观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有DF存在时没有观察到荧光随着时间的推移而增加(ii)。这个结果指示可切割的CESA可以在DF通过来自5’端的两个核苷酸（CC）来完成部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’时形成。
图16展示了由RE StyD4I（小图Panel I）、Rsa I（小图II）、Msp I（小图III）以及BssK I（小图IV）对示例的不同结构进行切割的模式，如在实例6中所述。这些反应包含如下所列的结构：反应A：CESA；反应B：PESA加InF；反应C：PESA；反应D：标记的EAS1寡聚核苷酸；反应E（阳性对照）以及F（阴性对照）：双链的邻接的RE底物。反应A至E包含RE，然而阴性对照反应F不包含RE。示出了两个重复反应的平均值。
在此实验中分析的这些酶以及所有的其他酶（数据未示出）展现出对于阳性对照（反应E）而言荧光随着时间的推移而增加。这些观察与RE识别并切割包含全RERS的邻接双链复合体的能力一致。所有的阴性对照反应（反应F）未展现荧光随着时间的推移而增加。
小图I示出了对于RE StyD4I而言获得的数据，如表13I排所述。在对于此RE的反应A至D中，随着时间推移没有观察到荧光的增加。这指示在测试的条件下此RE切割双链复合体的能力，这些双链复合体包含由RE识别和切割所需的区域内的两条链的至少一条中的一个切口。另外，在反应仅包含部分形成的RERS时此RE不能切割。
小图II示出了对于RE Rsa I而言获得的数据，如表13II排所述。两种其他RE—Pme I和Hpy8I也示出了与对于Rsa I报道的相似模式。在反应A中，EAS1、EAS2和DF的存在导致可切割的CESA的形成，如随着时间推移观察到的荧光增加所指示的。这些观察指示在测试的反应条件下这些RE识别和切割包含RERS中的切口的双链复合体的能力。相反，在反应B中，该反应缺少DF但包含InF，随着时间推移没有观察到荧光的增加，指示形成的双链复合体未被切割。在此反应条件下，形成EIC。随着时间推移，对于用于这些RE的反应C和D，没有观察到荧光的增加，指示此RE不能切割包含不完整RERS的结构。
小图III示出了对于RE Msp I而言获得的数据，如表13III排所述。REEar I也示出了如对于Msp I所报道的那些相似的结果模式。对于反应A和反应B，随着时间推移观察到了荧光的增加。在反应A中，EAS1、EAS2和DF的存在导致可切割的CESA的形成，如随着时间推移荧光的增加所指示的。这些观察指示RE识别和切割包含RERS中的切口的双链复合体的能力。然而，在缺少DF但包含InF的反应B中，RE也展现出荧光的增加。这些观察指示在反应条件下InF未形成EIC。对于用于这些RE的反应C和D，没有观察到荧光的增加，指示出此RE不能切割包含不完整RERS的结构。
图16的小图IV示出对于RE BssK I而言获得的数据，如表13IV排所述。RE Alw I也示出了与对于BssK I所报道的那些相似的结果模式。在反应A至D中，随着时间推移观察到了荧光的增加。在这些反应中，这些复合体包含完整的亦或部分的RERS。这指示这些RE能够在测试的条件下识别并切割完整的和部分的RERS两者。
图17小图A展示了EzyAmp反馈级联反应的策略。在此实例中，存在两个PESA（PESA A和PESA B）。PESA A（黑色）是由ESA1A（顶部链）和EAS2A（底部链）组成；并且PESA B（灰色）是由EAS1B（顶部链）和EA2B（底部链）组成。两个PESA包含RE（在此实例中为Mnl I）的部分的识别位点。当PESA A（顶部结构；左手边）与DF-a（白线，灰边界）杂交时，可切割的CESA A复合体（中间结构，左手边）形成，该复合体包含Mnl I的完整识别位点（虚线黑框）。CESA A（底部片段，左手边）的切割导致荧光的增加，这是由于荧光团（例如JOE（J））和淬灭剂（Q）的分离。此外，CESA A的切割导致多个切割片段的释放，这些片段中之一可以发挥新DF-b（条纹线）的功能。当PESA B（顶部结构；右手边）与DF-b杂交时，CESA B（中间结构，右手边）形成，该CESA B包含Mnl I的完整识别位点（虚线灰框）。CESA B的切割导致荧光的增加，这是由于荧光团（例如FAM（F））和淬灭剂（Q）（底部片段，右手边）的分离。此外，CESA A的切割导致多个切割片段的释放，这些片段中之一可以发挥新DF-a的功能。每个CESA A的切割产生新的DF，新的DF可以导致新的CESA B的形成，并且每个CESA B的切割产生新的DF，新的DF可以导致新的CESA A的形成，因此创造了反馈级联反应。除了在每个步骤创造新的DF之外，已经存在于混合物中的这些DF可以被再利用从而形成额外的CESA。这个策略可以用于响应DF-a亦或DF-b的靶标依赖性产生来放大信号。
小图B和C示出来自在小图A中所述的级联反应的实例的荧光结果。示出的数据表示两次重复的平均值。小图B（反应A）示出在将DF-a添加到PESA A和B时JOE和FAM通道两者中荧光的增加。在JOE通道中的增加的信号（标记“(ii)JOE:CESA A+DF-a”的轨迹）指示DF-a与PESA A杂交以形成CESA A。CESA A由Mnl I切割，导致EAS1A和EAS2A的寡聚核苷酸片段的解离，该解离引起JOE荧光团与两个淬灭剂部分的分离。在FAM通道中的增加的信号（标记“(i)FAM:CESA B+DF-a”的轨迹）示出DF-b—EASA2的切割片段之一，与切割的CESA A解离并且与PESA B杂交，从而产生CESA B。CESA B由Mnl I切割，导致EAS1B和EAS2B的寡聚核苷酸片段的解离，该解离引起FAM荧光团与一个淬灭剂部分的分离。EAS2B的切割片段之一是新的DF-a分子，该DF-a分子与PESA A杂交以产生更多的CESA A。这完成了PESA A、PESA B、CESA A和CESA B之间的反馈级联反应。在FAM通道中的荧光增加的延迟指示此反应依赖于来自CESA A的切割的DF-b的产生。在缺少DF-a的反应中JOE或FAM荧光没有增加（“(II)没有DF-a的对照”标记的轨迹）。
小图B（反应B）示出在将DF-b添加到包含PESA A和PESA B两者的反应中时FAM和JOE通道两者中荧光的增加。在FAM通道中的增加的信号（标记“(v)FAM:CESA B+DF-b”的轨迹）指示DF-b与PESA B杂交以形成CESA B。CESA B由Mnl I切割，导致EAS1B和EAS2B的寡聚核苷酸片段的解离，该解离引起FAM荧光团与一个淬灭剂部分的分离。在JOE通道中的增加的信号（标记“(vi)JOE:CESA A+DF-b”的轨迹）示出DF-a—EAS2B的切割片段之一，与切割的CESA B解离并且与PESA A杂交，从而形成CESA A。CESA A由Mnl I切割，导致EAS1A和EAS2A的寡聚核苷酸片段的解离，该解离引起JOE荧光团与两个淬灭剂部分的分离。EAS2A的切割片段之一是新的DF-b分子，该DF-b分子与PESA B杂交以形成更多的CESA B。这完成了PESA A、PESA B、CESA A和CESA B之间的反馈级联反应。在JOE通道中的荧光增加的延迟指示此反应依赖于来自CESA B的切割的DF-a的产生。在缺少DF-b的反应中JOE或FAM荧光没有增加（“(IV)没有DF-b的对照”标记的轨迹）。
在此实验中，PESA A和PESA B是用不同的荧光团（FAM和JOE）标记，以便证明在两个CESA复合体之间的级联反应。在其他形式中，PESA A和PESA B两者可以用相同的荧光团标记，使得来自CESA A和CESA B的切割的信号是累加的。
图18小图A展示了EzyAmp反馈级联反应的策略，该策略采用形成发夹PESA的ESA寡聚核苷酸。在此级联反应中，存在两个双重标记（荧光团-淬灭剂）的PESA发夹寡聚核苷酸。两者包含RE（在此实例中为Mnl I）的部分位点。当PESA A（顶部结构；左手边）与DF-a（白线）杂交时，CESAA（中间结构，左手边）形成，该CESA A现在包含Mnl I的完整识别位点（虚线框）。CESA A（底部片段，左手边）的切割导致荧光的增加，这是由于在PESA A上的荧光团（F）和淬灭剂（Q）部分的分离。此外，CESA A的切割导致多个切割片段的释放，这些片段中之一可以发挥新DF-b（条纹线）的功能。当PESA B（顶部结构；右手边）与DF-b杂交时，CESA B（中间结构，右手边）形成，该CESA B现在包含Mnl I的完整识别位点（虚线框）。CESA B的切割导致荧光的增加，这是由于在PESA B上的荧光团和淬灭剂部分的分离（底部片段，右手边）。此外，CESA A的切割导致多个切割片段的释放，这些片段中之一可以发挥新DF-a的功能。每个CESA A复合体的切割产生新的DF-b，该新的DF-b可以导致新的CESA B的形成，并且每个CESA B复合体的切割产生新的DF-a，该新的DF-a可以导致新的CESA A的形成，因此创造了反馈级联反应。除了在每个步骤创造新的DF之外，已经存在于混合物中的这些DF可以被再利用从而形成额外的CESA。这个策略可以用于响应DF-a亦或DF-b的靶标依赖性产生来放大信号。
小图B示出在实例7中获得的结果，该实例7采用小图A中的策略。在此实验中，CESA A是由PESA A和DF-a组成，并且CESA B是由PESA B和DF-b组成。PESA A包含一个在它之中的区域，该区域可以发挥DF-b的功能，并且PESA B包含一个在它之中的区域，该区域可以发挥DF-a的功能。在每个反应中，所有的组分存在于一个反应室中。通过与双重标记的PESA的切割关联的荧光变化来监测RE活性。荧光示出为两次重复反应的归一化平均值。
在小图B中的结果证明了DF-a和发夹PESA A的存在导致可切割的CESA A的形成（反应(i)），如随着时间推移由荧光的增加所指示的。相反，在不存在任何DF的情况下包含PESA A的反应（反应(ii)）示出荧光随着时间推移没有改变，指示单独的PESA A不是可切割的寡聚核苷酸。在反应(iii)中，DF-b伴随发夹PESA B的存在导致可切割的CESA B的形成，如随着时间推移荧光的增加所指示的。相反，在不存在任何DF的情况下包含PESA B的反应(iv)中，随着时间推移没有观察到荧光的变化，指示单独的PESA B不是可切割的寡聚核苷酸。在反应(v)中，与反应(i)相比，DF-a连同PESA A和PESA B两者的存在导致随着时间推移几乎双倍的荧光增加。这指示来自CESA A切割的DF-b的释放，然后形成可切割的CESA B，该CESA B进而被切割并且释放更多DF-a。此反应表示由DF-a的存在所启动的信号放大反馈级联反应。在反应(vi)中，与反应(iii)相比，DF-b与PESA A和PESA B两者的存在导致随着时间推移几乎双倍的荧光增加。这指示来自CESA B切割的DF-a的释放，然后形成可切割的CESA A，该CESA A进而释放更多DF-b。此反应表示由DF-b的存在所启动的信号放大反馈级联反应。反应(vii)是一个阴性对照反应，该反应包含PESA A和PESA B，不存在DF。此反应示出随着时间推移荧光没有增加，指示在不存在DF的情况下在PESA A和PESA B之间没有形成可切割的CESA结构。反应(viii)是一个阳性对照反应，该反应包含处于相等浓度的DF-a、DF-b、PESA A以及PESAB，使得存在的所有PESA可以形成CESA并且被切割，因此给出系统中可获得的最大荧光的指示。在反应(viii)、(vi)以及(v)中70分钟处的最终荧光水平是相似的，指示在反应(v)和(vi)中的反馈级联反应达到完成。
图19小图A展示了EzyAmp级联系统的示例性图解，由此起始DF序列不是MNA酶底物序列的部分。此系统的组分展示于小图A的左手边上的表中。在这些结构上，填充的圆圈指示每个寡聚核苷酸的5’端；RE识别位点指示为虚线框；限制性内切酶切割位点指示为实心箭头；荧光团和淬灭剂部分的存在对应地由F和Q指示。结构(i)展示靶标特异性部分酶，这些部分酶在靶标的存在下关联从而形成MNA酶。复合体(ii)展示了底物阻断体-DF-a复合体，该复合体由部分地包含DF-a（如在(v)中）的寡聚核苷酸以及称为底物阻断体寡聚核苷酸的第二寡聚核苷酸组成，该第二寡聚核苷酸包含底物序列，该底物序列侧翼为与DF寡聚核苷酸互补的序列。这些寡聚核苷酸通过杂交被锁定以形成双链寡聚核苷酸复合体，该复合体包含环状外区，该环区域是MNA酶的底物（底物环由圆形区域指示，在圆形区域中灰色交叉（X）
指示MNA酶的切割位点）。复合体(ii)被设计为使得由MNA酶对底物环的切割因更长双链寡聚核苷酸复合体的单链延伸而导致结合至DF-a的经切割片段发生解离，因此释放DF-a。结构(iii)展示了第一PESA（PESA A），该第一PESA需要DF-a序列以形成CESA A。此PESA A在它的序列内包含一个区域，该区域构成DF-b（寡聚核苷酸vi），该DF-b被设计为在由RE对CESA A进行切割后释放。结构(iv)展示了第二PESA（PESA B），该第二PESA需要DF-b以形成CESA B。此PESA B在它的序列内包含一个区域，该区域发挥DF-a的功能，该DF-a被设计为在由RE对CESA B进行切割后释放。结构(v)示出DF-a，该DF-a被需要来从PESA A形成CESA A。结构(vi)示出DF-b，该DF-b被需要来从PESA B形成CESA B。
在小图A的右手边的方案展示了此设计的分析中的步骤。在步骤1，部分酶在靶标上装配，并且形成设计为切割结构(ii)的底物环的MNA酶。在步骤2，由MNA酶的切割导致与DF-a互补的序列的解离，因此允许DF-a与PESA A杂交并且形成CESA A（如在步骤3中所描绘的）。在步骤4，CESAA的切割释放DF-b。如果CESA A的切割将荧光团和淬灭剂部分分离，此步骤还可以产生荧光的伴随性增加。在步骤4中，释放的DF-b可以与PESA B关联，以形成CESA B，该CESA B然后由RE可切割。CESA B的切割导致DF-a的释放，并且如果切割将荧光团与淬灭剂部分分离，还可以导致荧光的伴随性增加。在步骤5和6中，系统形成反馈级联反应，由此CESA A和CESA B连续形成并且被切割从而释放更多DF-a和DF-b，导致更多的CESAA和CESA B的形成。在更复杂的反应中，可以有多个的底物-阻断体-DF复合体，这些复合体各自包含独特的DF，这些DF被设计为由独特的MNA酶进行释放（指示独特的靶标）。
小图B示出了在实例9中所描述的数据，证明了使用类似于在小图A中描述的图解的MNA酶启动的EzyAmp反应。在EzyAmp反应中的组分包括：底物-阻断体寡聚核苷酸；DF-a寡聚核苷酸（它们一起形成底物-阻断体-DF-a复合体）；可以与靶标杂交并且形成可切割环状底物的MNA酶的部分酶；PESA A和PESA B。PESA A由EAS1A和EAS2A组成，其中ESA2A包括可以发挥DF-b功能的序列。PESA B由EAS1B和EAS2B组成，其中ESA2B包括可以发挥DF-a功能的序列。反应中所有的组分存在于单个反应腔室中，并且任一个包含靶标（靶标）或缺少靶标（没有靶标的对照）。通过在EAS1A和EAS1B的切割导致FAM和淬灭剂部分的分离之后FAM荧光的增加来监测信号放大。在靶标的存在下，环状底物的MNA酶切割导致双链底物阻断体-DF-b寡聚核苷酸复合体的部分解离。解离复合体的DF-a部分与PESA A杂交，导致CESA A的形成，该CESA A然后被Mnl I切割。这进而释放DF-b，允许CESA B的形成，导致CESA B由Mnl I的切割，因此释放更多DF-a以完成CESA A和CESA B之间的反馈级联反应。
相反，缺少靶标的反应（没有靶标的对照）没有示出随着时间推移荧光的指数增加（只在80分钟后观察到低水平的荧光漂移）。这指示需要靶标来启动MNA酶对环状底物的切割，以便释放DF-a，该DF-a进而启动随后的EzyAmp级联反应。
图20展示了一个EzyAmp系统的示例性图解，该系统包含被拴系至固体支持物的多个CESA复合体。此系统的组分展示如下：实心圆指示每个寡聚核苷酸的5’端；RERS指示为虚线框；切割位点指示为实心箭头。站1展示了拴系的寡聚核苷酸（MNA酶底物或SIO），当以靶标依赖性方式被切割时（步骤1-例如使用MNA酶来切割MNA酶底物），该拴系的寡聚核苷酸将导致一个第一DF（条纹线）的释放。此DF可以进而迁移至在站2处的拴系的PESA A，并且杂交以形成CESA A（步骤2）。CESA A由RE的切割（步骤3）会释放一个第二DF（实心黑线），该第二DF可以迁移至站3处的PESAB。如果该第二DF与PESA B杂交，将形成CESA B（步骤4）。CESA B由RE的切割将导致能够发挥第一DF（条纹线）功能的序列的释放。第一DF可以进而迁移至站2（步骤5），并且形成更多的CESA A，该CESA A可以被切割以释放更多第二DF。以此方式，可以启动一个级联反应，允许CESA A和CESA B连续的形成和切割（步骤3、4和5）。如果用荧光团（F）和淬灭剂（Q）部分来标记PESA，则EAS的在这些部分之间的切割可以产生荧光信号。例如如果荧光团和淬灭剂部分的位置是反向的，此信号可以保留在站2或3的固体表面上（如在此图中所展示的）或者可以释放于溶液中。
图21示出了在实例11中所描述的EzyAmp靶标滴定的结果。这些反应是通过由MNA酶对底物的靶标依赖性切割启动的，从而产生DF、随后产生使用EzyAmp反馈级联反应的信号放大，该EzyAmp反馈级联反应包含两个PESA复合体，这两个PESA复合体的每一个为另一个产生DF。所有的步骤是在单个试管中进行的。小图A和B示出在包含降低浓度的靶标（i至vii）的MNA酶启动的EzyAmp反应中随着时间的推移荧光的变化（对应地为线性和对数曲线）。在包含靶标的反应中，随着时间的推移荧光的变化呈指数增加。反应(viii)是没有靶标的对照（NTC）。小图C示出了通过绘制靶标浓度对Ct的图所产生的标准曲线，其中Ct是浓度达到检测阈值的时间点。在Ct和靶标浓度对数之间的关系显示了具有0.99的回归值的线。
图22展示了用于通过将PESA复合体并入分支结构中来定位EzyAmp组分的示例性方法。小图A展示了第一基础构造块，这些第一基础构造块被需要来形成分支结构，该分支结构可以由以下项组成：(i)第一寡聚核苷酸（构造块1），包含（从5’到3’）EAS1B、主链1以及EAS2A；(ii)第二寡聚核苷酸EAS1A，它将与EAS2A互补，并且其中(i)和(ii)可以杂交以形成PESAA；以及(iii)第三寡聚核苷酸EAS2B，它将与ESA1B互补，并且其中(i)和(iii)可以杂交以形成PESA B。小图B展示了第四寡聚核苷酸，该第四寡聚核苷酸可以构成构造块2(iv)，该构造块由以下项组成（从5’到3’）：EAS1B、主链2以及EAS2A；(ii)第二寡聚核苷酸EAS1A，它将与EAS2A互补，并且其中(i)和(ii)可以杂交以形成PESA A；以及(iii)第三寡聚核苷酸EAS2B，它将与ESA1B互补，并且其中(i)和(iii)可以杂交以形成PESA B。主链1可以与主链2互补。这可以导致分支复合体的形成，该复合体包含构造块1和2。每个构造块将具有结合的EAS1A和EAS2B，使得该复合体将包含两个PESA A和两个PESA B。可以用荧光团（F）来标记构造块1和2，并且可以用淬灭剂（Q）来标记每个构造块的第二和第三寡聚核苷酸，该淬灭剂被定位为使得在与构造块1和2结合时来自在这些寡聚核苷酸上的标记的荧光可以被淬灭。
小图C展示了EzyAmp级联反应中的步骤，该级联反应可以在DF-a以靶标特异性方式产生后使用如在小图B中所展示的分支复合体。在步骤1中，DF-a与PESA A的杂交（例如，在构造块1上）将导致CESA A在此位置处的形成。在步骤2中，CESA A由限制性内切酶（例如，Mnl I）的切割将导致EAS1A切割片段的解离，由于荧光团和淬灭剂的分离引起荧光的增加，并且引起DF-b的产生。在步骤2中，DF-b与构造块1或2的EAS1B区域的杂交将导致CESA B的形成。在步骤3中，CESA B由一种限制性内切酶（例如，Mnl I）的切割将导致EAS2B切割片段的解离，引起荧光的增加以及DF-a的产生。这些步骤可以进而在相同的复合体或另一个相似的复合体上重复。该过程可以继续进行直到所有的构造块已经被切割。可替代地，相似的级联反应可以按靶标特异性方式经由DF-b的产生来启动。
分支结构的复杂性可以通过一些策略来增加。通过举例，如果EAS1A的5’端被生物素化，则如在小图D中所示的结构可以通过构造块与抗生物素蛋白的孵育来形成。这将导致使构造块复合体通过抗生物素蛋白分子而拴系在一起。此分支结构及其变体（通过在任何寡聚核苷酸组分上添加生物素或其他拴系分子）将允许释放的DF与PESA复合体的定位。
图23是EzyAmp反应的一个示例性图解，其中信号放大可以由核酸外切酶III（Exo III）来启动并且介导。已知此酶是从DNA双链体的3’羟基末端去除核苷酸，这时该末端是平头的亦或是凹的。该酶不酶解单链寡聚核苷酸，包括具有带至少5个碱基的3’突出端的双链体。已知硫代磷酸酯核苷酸的存在（由寡聚核苷酸上的空心方块指示）阻断核酸外切酶活性。条纹灰线表示DNA靶标（T），并且实心黑线表示合成起始物寡聚核苷酸（SIO），该寡聚核苷酸将被添加至混合物中以协助DF的产生。可以用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的SIO表示为具有突出3’末端的发夹构型。在靶标结合之前，由于SOI包含多于五个碱基的3’突出端，Exo III不能酶解SOI。在SIO中的硫代磷酸酯核苷酸将防止从这个位置向前的水解，因此留下完整DF。闭合的圆圈表示SIO、PESA和CESA寡聚核苷酸的5’端。实心灰线表示PESA，具有包含至少5个碱基的两个3’突出端。PESA被表示为两个寡聚核苷酸（EAS1和EAS2），其中EAS1是用荧光团和淬灭剂标记。Exo III不能在DF结合之前酶解PESA，因为PESA的3’端包含多于五个碱基的3’突出端。
EzyAmp反应将具有以下步骤：在步骤1中，SIO可以结合至靶标的互补区域，并且在步骤2中，SIO的现在凹的3’端将被Exo III水解直到硫代磷酸酯碱基，因此释放完整的DF并且导致荧光的增加。DF将对应于与靶标不互补的SIO5’部分。将不再结合至SIO的靶标将进而呈游离的以便被再利用来与另一种SIO结合，并且因此产生另一个DF（步骤3）。DF可以进而结合到PESA的EAS1（步骤4）并且形成CESA，其中EAS1的3’端现在是凹的。Exo III可以进而水解CESA的EAS1链（步骤5），导致荧光的增加以及DF的释放。DF现在会是游离的以便被再利用（步骤6）以将更多的PESA转化为CESA。
图24是一个示例性图解，展示了用于使用靶标依赖性MNA酶来产生驱动片段（DF）的不同方法。DF表示为具有黑色轮廓的白线；MNA酶底物切割位点表示为交叉；包含底物序列的寡聚核苷酸表示为灰线；RE切割位点表示为箭头；RERS表示为虚线框；靶标表示为黑色和白色条纹线；可以与DF组合形成CESA的PESA寡聚核苷酸表示为条纹灰线；并且MNA酶表示为实心黑线。
小图A展示了DF经由MNA酶底物的直接切割的产生，其中DF序列是底物序列的部分。在靶标的存在下，催化活性的MNA酶装配并且切割它的底物。经切割的底物的一个片段与PESA结合在一起，其中该片段发挥DF的功能并且导致CESA的形成。完全装配的CESA可以进而由RE进行切割。实例2、4和11证明了使用此策略产生DF。
小图B展示了将允许DF经由MNA酶底物的切割而产生的方法，其中DF序列不是在由MNA酶识别的底物序列的部分内，但是仍然被包含在作为底物的相同的寡聚核苷酸内。包含底物的寡聚核苷酸可以形成一个发夹结构，使得会由MNA酶识别的底物的区域将形成发夹环，并且DF将通过杂交而被锁定在该发夹的茎内。在靶标的存在下，催化活性的MNA酶将装配并且切割它的底物。底物的切割将破坏发夹，导致茎部的解离以及因此经切割片段的分离。经切割的片段之一可以与PESA结合在一起，其中该片段可以发挥DF的功能并且导致CESA的形成。完全装配的CESA可以然后由RE切割。
小图C展示了DF经由双链底物-阻断体-DF复合体的MNA酶切割而产生。在此复合体中，DF序列不是由MNA酶识别的底物序列的部分，并且不被包含在作为底物的相同的寡聚核苷酸内。该DF是被包含在与底物寡聚核苷酸杂交的第二寡聚核苷酸内。在底物寡聚核苷酸中，可以被识别作为MNA酶底物的序列在侧翼为与DF寡聚核苷酸互补的额外序列。既充当底物又结合（因此阻断）DF的这种寡聚核苷酸称为底物-阻断体寡聚核苷酸。由MNA酶识别的、在底物-阻断体寡聚核苷酸内的序列不与DF寡聚核苷酸互补，并且因此这种底物序列被圈出（looped out）。在靶标的不存在下，双链底物-阻断体-DF复合体的形成是有利的，防止了DF与PESA相互作用。在靶标的存在下，催化活性的MNA酶装配并且切割底物环。底物环的切割导致结合至DF的底物-阻断体寡聚核苷酸的部分的解离，因此释放DF以便该DF可以与PESA结合以形成CESA。完全装配的CESA可以然后由RE切割。实例9证明了使用此策略以产生DF。
小图D展示了DF经由发夹底物-阻断体-DF复合体的MNA酶切割而产生。在此复合体中，DF序列不是由MNA酶识别的底物序列的部分，尽管它仍然被包含在作为底物的相同的寡聚核苷酸内。发夹底物-阻断体-DF复合体类似于在小图C中描述的双链底物-阻断体-DF复合体，除了现在存在导致发夹形成的、底物-阻断体寡聚核苷酸和DF寡聚核苷酸之间的连接序列。在靶标的不存在下，底物-阻断体-DF发夹结构的形成是有利的，防止了DF与PESA相互作用。在靶标的存在下，催化活性的MNA酶装配并且切割环状底物部分。底物环的切割导致结合至DF的茎部的解离。单链DF序列现在可以结合至PESA以形成CESA。完全装配的CESA可以进而由RE进行切割。实例14证明了使用此策略产生DF。
图25证明了多路分析，其中两个EzyAmp反应同时发生在单个试管中并且被独立地监测。在PESA A和PESA B的存在下用DF-a和/或DF-b中的任一个来启动反应。DF-a结合至PESA A导致CESA A的形成，该CESA A在被切割时产生JOE荧光（粗实心黑线）的增加。DF-b结合至PESA B导致CESA B的形成，该CESA B在被切割时产生FAM荧光（粗黑虚线）的增加。测试反应包括每个PESA100nM以及(i)100nM DF-a、(ii)90nM DF-a和10nM DF-b、(iii)100nM DF-a和100nM DF-b，(iv)10nM DF-a和90nM DF-b亦或(v)100nM DF-b。对照反应不包含DF，并且由实心细线（JOE）或细虚线（FAM）指示。以FAM和/或JOE的荧光的增加对时间来绘制曲线。在反应(i)中，存在JOE荧光的增加但不存在FAM荧光的增加，指示DFa仅允许PESA A的形成。在反应(v)中，存在FAM荧光的增加但不存在JOE荧光的增加，指示DF-b仅允许PESA B的形成。在反应(ii)、(iii)(iv)和(v)中，存在FAM和JOE荧光两者的增加，指示在DF-a和DF-b两者存在时CESA A和CESA B的切割，并且荧光信号与所使用DF的浓度相关。
图26展示了MNA酶启动的EzyAmp反应，该反应允许人cDNA靶标（PPIA cDNA）的检测。EzyAmp信号放大是由于Mnl I对形成反馈回路的多个CESA的切割造成的。在此实例中，启动和信号放大两者是通过观察荧光的累积变化来监测，该荧光是通过以下项产生的：(i)报道MNA酶底物的靶标依赖性MNA酶切割以及(ii)在DF-a从MNA酶底物的切割产生之后CESAA和CESA B的切割。该图示出了随着时间而绘制的归一化的荧光。与cDNA的不存在下仅有的低水平的荧光（细线）相比，在150分钟时观察到在包含115pg（粗实心黑线）以及23pg（虚线）的cDNA的反应中的强荧光信号。
图27展示了用于由一种RE，Mnl I对CESA进行切割的示例性策略。CESA被设计为产生DF，该DF能够结合至PESA以形成相同的CESA（小图A）。CESA（顶部复合体，小图A）由PESA（底部复合体，小图A）以及DF（由条纹黑线指示）组成。每一个线上的圆圈指示每个寡聚核苷酸的5’端。RERS指示为虚线框，并且RE切割位点指示为垂直的实心箭头。荧光团和淬灭剂部分的存在是各自地由F和Q指示。
小图A展示了其中CESA可以为它对应的PESA产生DF的策略。PESA是由EAS1和EAS2组成，由此EAS2包含在其内的一种序列，该序列一旦从EAS2被切割时可以发挥DF功能。初始DF的靶标依赖性产生以及随后结合至PESA，将导致CESA的形成（步骤1）。CESA可以然后由RE切割，导致切割片段的解离，该切割片段包括可以发挥DF功能的片段（步骤2）。此片段可以然后结合至另一个PESA以作为DF发挥作用，允许更多CESA的形成（步骤3）。
小图B示出了对应于在小图A中所展示的CESA的MnlI切割的荧光增加。在DF存在下，观察到荧光随着时间的推移而增加(i)。相反，在没有添加DF的对照反应中没有观察到荧光增加(ii)。这指示需要DF来形成由RE切割的CESA。CESA的切割导致片段的解离，这些片段其中之一包含缩短形式的原始DF。
定义
在此使用了某些术语和短语，它们将具有如下列出的含义。
如在本申请中所使用的，单数形式“一种/个”（“a”、“an”）和“该”（“the”）包括复数的引用，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。例如，术语“MNA酶”或“全酶信号放大器复合体”或“部分酶信号放大器复合体”还各自地包括多种MNA酶或全部分酶信号放大器复合体或部分酶信号放大器复合体。除非上下文在其他地方或明确地进行相反地说明，在此所叙述的本发明的整数、步骤、或元素作为单数的整数、步骤或元素清楚地涵盖了单数和复数这两种形式的所叙述的整数、步骤或元素。
术语“包括”意为“主要地但不是必然单独地包括”。并且，文字“包括”（“comprising”）的变体，例如“包括”（“comprise”）和“包括”（“comprises”）对应地具有不同含义。因此，例如，“包括”（“comprising”）一个给定步骤的一种方法，可以排他地由那个步骤组成或可以包括一个或多个额外步骤。
在此可互换地使用“全酶信号放大器复合体”、“CESA复合体”、以及“CESA”，并且它们具有相同的含义。如在此提及，CESA复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体可以由酶（例如，核酸酶）识别并切割并且包含酶识别序列/位点和酶切割序列/位点。酶可以是例如核酸酶（例如限制性内切酶、核酸外切酶或核酸内切酶）。酶切割序列/位点可以是在酶识别序列/位点内部、外部、或与之重叠。在此提及的CESA复合体包括至少两个酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸以及至少一个驱动片段（DF），各自如下所定义。CESA复合体的一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分与在复合体中的另一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补。此外，所述EAS寡聚核苷酸之一的至少一部分还与至少一种DF的至少一部分互补。DF可以向酶识别序列/位点和/或酶切割序列/位点贡献一个或多个碱基，尽管它不需要必然这样做。将注意的是在此的CESA复合体可以用数字指出而不偏离以上说明的含义，例如像“第一”CESA复合体、“第二”CESA复合体、“第三”CESA复合体等。
“酶放大器底物寡聚核苷酸”、“酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸”、“EAS寡聚核苷酸”、“EAS寡聚核苷酸”、以及“EAS”在此可互换地使用，并且具有相同的含义。在此提及的EAS寡聚核苷酸是一种寡聚核苷酸，其中该寡聚核苷酸的至少一部分与另一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补，使得杂交在适当条件下在这两个之间发生。EAS寡聚核苷酸可以可任选包括与如下所定义的驱动片段（DF）的至少一部分互补的至少一部分。EAS寡聚核苷酸可以是复合体（例如像，CESA复合体以及部分酶信号放大器（PESA）复合体（如下所定义））的组分。将注意的是在此的EAS寡聚核苷酸可以用数字指出而不偏离以上说明的含义，例如像“第一”酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）、“第二”酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2）、“第三”酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）等。在一些实施例中，EAS寡聚核苷酸可以通过一个接头连接至另一个EAS寡聚核苷酸。例如，EAS1和EAS2可以存在于相同的寡聚核苷酸内，在该相同的寡聚核苷酸内它们是通过连接核酸序列来连接，该连接核酸序列可以允许发夹结构的形成。
“部分酶信号放大器复合体”、“部分酶信号放大器（PESA）复合体”、“PESA复合体”以及“PESA”在此可互换地使用，并且具有相同的含义。如在此提及的PESA复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体包含至少两个酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸，其中一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分与复合体中的另一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补。此外，所述EAS寡聚核苷酸之一的至少一部分还与至少一种DF（如下所定义）的至少一部分互补。尽管具有与DF杂交的能力，但DF不杂交并且因此不是PESA复合体的组分。PESA复合体包括一种酶的至少一个部分识别序列/位点和/或至少一个部分切割序列/位点，并且可以包含一种酶的全识别序列/位点和/或全切割序列/位点。该酶可以是例如核酸酶（例如限制性内切酶、核酸外切酶或核酸内切酶）。在一些实施例中，PESA复合体的两个EAS寡聚核苷酸可以由接头连接。例如，两个EAS寡聚核苷酸可以存在于相同的寡聚核苷酸内，在该相同的寡聚核苷酸内它们是通过处于发夹结构形式的连接核酸序列来连接。将注意的是在此的PESA复合体可以用数字指出而不偏离以上说明的含义，例如像“第一”PESA复合体、“第二”PESA复合体、“第三”PESA复合体等等。
“驱动片段寡聚核苷酸”、“驱动片段（DF）寡聚核苷酸”、“驱动片段寡聚核苷酸”、“DF寡聚核苷酸”、“DF寡聚核苷酸”、以及“DF”在此可互换地使用，并且具有相同含义。在此提及的DF寡聚核苷酸是一种寡聚核苷酸，其中该寡聚核苷酸的至少一部分与至少一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补，使得杂交在适当条件下在这两个之间发生。DF寡聚核苷酸可以或可以不是有待通过本发明的方法检测的靶标分子（例如，核酸）。DF寡聚核苷酸可以是复合体（例如像CESA复合体）中的组分。在此类情况下，DF寡聚核苷酸可以向可存在于该复合体中的酶识别序列/位点和/或酶切割序列/位点贡献一个或多个核苷酸，尽管它不需要必然这样做。酶可以是例如核酸酶（例如限制性内切酶、核酸外切酶或核酸内切酶）。将注意的是在此的DF寡聚核苷酸可以用数字指出而不偏离以上说明的含义，例如像“第一”DF复合体、“第二”DF复合体、“第三”DF复合体等。
“合成起始物寡聚核苷酸”或“SIO”是可以与样品中的靶标核酸杂交的寡聚核苷酸，并且由此形成易于由核酸酶切割的底物，使得这个切割产生能发挥驱动片段（DF）功能的更短寡聚核苷酸。SIO可以在它有核酸酶切割之前发挥抑制片段（Inf）的功能。SIO可以由处于部分或完全双链的构型的一个或多个寡聚核苷酸组成。具有多个寡聚核苷酸的SIO在此称为“SIO复合体”。将注意的是在此的SIO可以用数字指出而不偏离以上说明的含义，例如像“第一”SIO、“第二”SIO、“第三”SIO等。
“酶抑制复合体”或“EIC”是由两个或更多个互补核酸片段或寡聚核苷酸形成的复合体，由于额外序列的存在（该额外序列破坏易于由一种酶切割的双链体结构的形成）这些互补核酸片段或寡聚核苷酸形成不易于由酶切割的双链体。在一个实施例中，EIC包括EAS1、EAS2以及抑制片段（InF）。在另一个实施例中，EIC包括PESA和InF。在一个另外的实施例中，InF包括作为DF是有用的序列，但是具有额外的核苷酸，这些额外的核苷酸防止易于切割的双链体CESA的形成。在另外的实施例中，InF是一种只有能在靶标分析物的存在下才被切割为更小寡聚核苷酸片段的寡聚核苷酸，这些更小寡聚核苷酸片段可以发挥DF的功能以完成CESA的装配。在一些实施例中，InF可以是只有在靶标存在下能被核酸酶切割以产生DF的“合成起始物寡聚核苷酸”或“SIO”。在其他实施例中，InF可以是只有在靶标存在下能被MNA酶切割而变成DF的“MNA酶底物”。在一些实施例中，InF的切割取决于核酸酶或适体酶。在一些实施例中，核酸酶或适体酶包括MNA酶。在其他实施例中，切割是由蛋白酶介导的。在一些实施例中，酶是核酸内切酶。在一些实施例中，酶是核酸外切酶。仍在其他实施例中，切割是通过化学手段达到的。
“Ezy-amp”或“EzyAmp”反应是一个过程，经由该过程由核酸酶对CESA的靶标特异性切割协助信号的产生和/或放大，其中信号指示靶标存在。EzyAmp反应可以包含一种或多种PESA和CESA复合体。在一些实施例中，来自多个PESA复合体的多个CESA的形成可以形成反馈环路，由此第一DF（从靶标依赖性事件产生）结合至第一PESA形成第一CESA，该第一CESA的切割释放第二DF，该第二DF结合至第二PESA，形成了第二CESA，并且该第二CESA的切割释放第一DF，第一DF能够结合第一PESA以形成另一个第一CESA。第一CESA可以然后被切割产生另一个第二DF，该另一个第二DF可以结合至另一个第二PESA，形成另一个第二CESA，以此类推。可检测的信号可以在第一和/或第二CESA的每次切割时产生，因此提供了放大从单个靶标依赖性事件衍生的信号的手段。将理解，如在此提及的EzyAmp反应涵盖线性和反馈信号放大级联反应两者。
“酶”是指可以催化化学反应的任何分子。“催化性蛋白”、“催化性氨基酸”、以及“蛋白酶”具有相同的含义，并且在此可互换使用，以便描述识别底物并且催化化学修饰的、由氨基酸链组成的分子。酶可以识别另一种酶、适体、分子、或核酸以便切割、添加、或修饰一个键。
“催化性核酸分子”、“催化性核酸”、“核酸酶”以及“催化性核酸序列”具有相同的含义，并且在此可互换使用，以便描述所有识别底物并且催化底物的化学修饰的DNA分子或包含DNA的分子（在本领域中也称为“DNA酶”、“脱氧核酶”或“DNA酶”）或RNA或包含RNA的分子（在本领域中也称为“RNA酶”或“核酶”）或“MNA酶”。在MNA酶、MNA酶适体（Apta-MNAzyme）、DNA酶、核酶、适体酶、EAS、CESA复合体、PESA复合体、SIO、驱动片段或抑制片段中的核苷酸残基可以包括碱基A、C、G、T、以及U，连同它们的衍生物或类似物，它们的实例列于表1中。MNA酶、适体MNA酶（Apta-MNAzymes）、DNA酶、核酶、适体酶、EAS、CESA复合体、PESA复合体、SIO、驱动片段或抑制片段的一个或多个组分可以附接至固体支持物上，这些固体支持物可以包括但不限于珠粒、芯片、阵列、微载体、纳米载体、编码的微载体、编码的纳米载体。
当与本发明的核酸或核苷酸关联使用时，术语“衍生物”包括任何功能上对等的核酸或核苷酸，包括一体地（例如，通过重组手段）或增加的后合成（例如，通过化学手段）产生的任何融合分子。此类融合体可以包括具有添加至其中的RNA或DNA的、或结合至多肽（例如嘌呤霉素或其他多肽）、小分子（例如补骨脂素）或抗体的本发明的寡聚核苷酸。
当与本发明的核酸或核苷酸关联使用时，术语“类似物”包括具有与DNA或RNA分子或残基相关的物理结构的一种化合物，并且可以能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键（即它能够易于与DNA或RNA残基或其类似物退火而形成碱基对），但这样的键合对于有待涵盖在术语“类似物”内的所述化合物不是如此必需的。此类类似物可以对它们在结构上关联的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基具有不同的化学和生物特性。甲基化的、碘化的、溴化的或生物素化的残基是类似物的实例。已经描述了包含核苷酸类似物的有活性的DNA酶，这些核苷酸类似物包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-脱氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’O-甲基帽。其他类似物还与DNA酶和MNA酶的催化活性可相容。具有催化活性的核酸的变更（例如通过一个碱基对另一个的替换，通过一个类似物对一个碱基的替换）或者糖组分或磷酸二酯主链的变更对于技术人员而言可以是直截了当的。例如，可以在合成期间作出变更或通过在合成之后特定碱基的修饰来作出变更。并入变更（例如碱基变化或碱基类似物）的催化性核酸的根据经验的测试允许用于变更序列、或特定类似物对催化活性的影响的评估。碱基A、C、G、T和U的类似物在本领域中是已知的，并且一个子集列于表1中。可以抑制核酸酶的酶解的类似物的实例在本领域中也是熟知的。策略上，此类类似物可以位于寡聚核苷酸内以防止由核酸外切酶和/或核酸内切酶进行的切割。通过举例，已知的是硫代磷酸酯键联的Sp立体异构体很大地抑制许多核酸酶的切割，这些核酸酶包括λ核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶III（大肠杆菌）、核酸外切酶I（大肠杆菌）、核酸外切酶T以及RecJ。多个硫代磷酸酯连键的包括可以很有效地阻断核酸酶活性。
表1：核苷酸类似物的实例
Figure BDA00003457832000941
“装配促进物分子”、“装配促进物”、“MNA酶装配促进物分子”、“MNA酶装配促进物”具有相同的含义，并且在此可互换使用，是指可以协助组分部分酶的自我装配以形成催化活性MNA酶的分子。在优选实施例中，需要装配促进物用于MNA酶的自我装配。在一些实施例中，装配促进物分子包括“靶标”、“靶标分析物”或“分析物”，如在此使用的它们是指其存在有待通过具体的MNA酶来检测或测量的分子。装配促进物分子包括与一个或多个寡聚核苷酸“部分酶”成对或结合的一个或多个区域，这些“部分酶”构成MNA酶的组分或部分。装配促进物与每个组分部分酶或寡聚核苷酸相互作用、成对、或结合不是必需的，其条件是它与MNA酶的组分部分酶的至少一个相互作用、成对、或结合。如在此使用的，MNA酶装配促进物分子旨在包括最广范围的、可以协助MNA酶的自我装配的组分。靶标和分析物还旨在包括最广范围的、灵敏检测的方法对于其是适宜的可检测组分。一些示例性靶标包括核酸序列、病毒、细菌、朊病毒、蛋白、抗体、以及小分子。还考虑了其他靶标分析物在此的用途。
“底物”、“底物分子”、以及“化学底物”具有相同的含义并且在此可互换地使用，意指由催化性分子识别和化学修饰的任何分子。在具体实施例中，底物是由一种酶识别和修饰，在其他实施例中，底物是由一种催化性核酸分子识别和修饰。在具体实施例中，底物是由一种蛋白酶识别和修饰，在其他实施例中，底物是由核酸酶识别和修饰。在具体实施例中，底物可以包括一种或多种单链核酸分子，在其他实施例中，底物可以包括一种或多种双链核酸分子。在另外的实施例中，底物可以形成发夹分子。底物的化学修饰可以通过反应产物的出现或增加、或者通过反应底物的消失或减少来测量。一种特定的催化分子可以识别一种或多种不同的底物分子，其条件是每个底物分子具有对于该催化分子的催化活性而言是可识别的至少一个最小结构。
如在此使用的，术语“部分酶”和“组分部分酶”具有相同的含义，并且在此可互换地使用，意指包含DNA或包含RNA的寡聚核苷酸，这种寡聚核苷酸的两种或更多种只有在MNA酶装配促进物分子的存在下才可以一起形成“MNA酶”。在某些优选实施例中，一种或多种组分部分酶，优选至少两种，包括三个区或结构域：“催化”结构域，形成催化化学修饰的MNA酶催化核心的部分；“传感臂”结构域，与靶标分析物关联和/或结合；以及底“物臂”结构域，与底物关联和/或结合。技术人员将理解的是当部分酶必然形成MNA酶结构的部分时，它不需要特异性识别，也不需要直接与MNA酶装配促进物分子结合或配对。因此，应清楚的是用于给定的MNA酶的一种或多种部分酶可以在全部或部分上缺少一个、或多个、或所有的前述结构域。在某些实施例中，一种或多种部分酶与其他部分酶相互作用，但必然与装配促进物分子相互作用。在其他实施例中，一种或多种特定部分酶可以仅间接地与装配促进物分子相互作用，而不直接结合至它或与它配对。
如在此使用的术语“MNA酶”以及“多组分核酸酶”是指两种或更多种核苷酸序列（例如部分酶），这些序列只有在MNA酶装配促进物分子（例如，靶标分析物）的存在下才形成可催化地修饰一种或多种底物分子的核酸酶。在一个实施例中，部分酶A和B各自结合至靶标分析物（例如，通过与核酸靶标的Watson（沃森）-Crick（克里克）碱基配对）。只有在部分酶A和B的传感臂在靶标上彼此毗邻地杂交时，MNA酶才形成。MNA酶的底物臂接合底物，该底物的切割是通过MNA酶的催化核心来催化，通过在部分酶A和B上的部分催化结构域的相互作用形成。在一些实施例中，MNA酶切割荧光团与淬灭剂染料对之间的底物，因此产生信号。DNA/RNA嵌合体（底物）的切割举例说明于附图中（图5A）。在其他实施例中，MNA酶可以在底物分子结合至部分酶后连接底物分子。
将理解的是，如在此使用的术语“部分酶”和“多组分核酸酶”包括所有已知的MNA酶以及修饰的MNA酶，包括在PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536、以及2011-0143338的任何一个或多个中披露的那些（这些文件的每一个的全部内容都通过交叉引用结合在此）。由术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”所包括的MNA酶和修饰的MNA酶的非限制性实例包括：具有切割催化活性的MNA酶（如在此举例说明的）、分解的或部分装配的MNA酶（包括一种或多种装配抑制物）、包括一种或多种适体的MNA酶（“适体MNA酶”（apta-MNAzymes））、包括一种或更多种截短传感臂以及可任选一种或多种稳定寡聚核苷酸的MNA酶、包括一种或多种活性抑制物的MNA酶、多组分核酸非活化的的酶原（MNAi）、以及具有连接酶催化活性的MNA酶（“MNA酶连接酶”），它们的每一个详细描述于WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US2007-0231810、US2010-0136536、和/或US2011-0143338中的一个或多个中。
如在此使用的“适体”包括一种核酸或肽序列，这种核酸或肽序列由于它们更高水平的结构（例如3-D结合结构域或口袋）而具有以高亲和力和特异性而识别一种或多种配体的能力。适体可以结合核酸、蛋白、朊蛋白、小有机化合物、或整个有机体。在此优选的适体是可以通过吸附、回收、以及再扩增的迭代过程从合成核酸的复合库中分离的短单链DNA或RNA寡聚体。适体可以针对范围为从小分子（例如氨基酸、或抗生素）到蛋白和核酸结构的几乎任何靶标而产生。
如在此使用，“寡聚核苷酸”（“Oligonucleotide”）或“寡聚核苷酸”（“oligo”）指代DNA或包含DNA的核酸分子的、或者RNA或包含RNA的分子的区段或片段。寡聚核苷酸的实例包括核酸靶标；底物，例如可以由MNA酶修饰的那些；引物，例如，用于通过诸如PCR的方法进行体外靶标扩增的那些；以及MNA酶的组分。在某些实施例中，MNA酶装配促进物包括如在此定义的寡聚核苷酸。如在此使用的部分酶还包括寡聚核苷酸。寡聚核苷酸的其他实例包括EAS、InF、SIO以及DF。在此提及的寡聚核苷酸可以与另一种寡聚核苷酸“互补”。在此提及的任何与第二核酸分子“互补”的核酸分子能够在适当条件下经由Watson（沃森）-Crick（克里克）碱基配对而与那个第二核酸分子杂交（整体亦或部分）。
如在此使用的，术语“碱基”将被理解为涵盖碱基附接至其上的全部核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
如在此使用的“发夹寡聚核苷酸”、或“发夹”指代这样一种寡聚核苷酸：它在自身内包含序列互补性，该序列互补性导致分子内杂交键形成。互补部分称为“茎”，而形成茎的那些之间的区域称为“环”。发夹可以具有在5’亦或3’末端从茎延伸的额外序列。发夹可以包含与另一种寡聚核苷酸（例如，像DF）互补的序列。
“荧光标记”和“荧光团”指能够展现荧光的物质或部分。“淬灭剂”是当两个部分（荧光团和淬灭剂）很靠近时能够吸收荧光团的发射能量的部分。荧光团可以吸收并且发射不同波长的能量，并且因此在不同的波长被淬灭。可以易于将荧光团和淬灭剂操作成很靠近的。例如，可以将两者在零至二十个碱基单元距离内放在DNA的相同的链上、或者放在DNA链的相反的末端。这种空间的定位可以导致在荧光团的发射波长处基本上没有信号。在物理分离时，例如，由于DNA链的酶切，淬灭剂和荧光团可以对于淬灭剂而言相隔太远而不能有效吸收来自荧光团的能量，导致在荧光团的发射波长处的可检测信号。
如在此使用的术语“级联反应”（“cascade”）是指在连续阶段中发生的任何连续的过程或操作，其中每个阶段的发生典型地依赖于前一阶段的发生。因此级联反应可以包括但不限于酶的级联反应或任何其他信号转导级联反应。在一些实施例中，级联反应可以包括由于核酸酶的催化活性导致的信号放大。在优选实施例中，这样一种放大级联可以涉及信号的重复的以及因此循环的放大，其中一种或多种第一分子的或由该一种或多种第一分子造成的催化修饰使得可获得对于一种或多种第二分子的或由该一种或多种第二分子造成的催化修饰而言所需要的分子，进而使得可获得对于一种或多种第一分子的或由该一种或多种第一分子造成的催化修饰而言所需要的分子。在一些实施例中，该所需要的分子可以包括驱动片段、部分酶、酶、装配促进物、底物、靶标、它们的一部分或片段或者它们的组合。在一些实施例中，级联反应可以因此涉及累积效应的产生，并且因此通过使信号产生到一个它可以被检测的水平来检测低丰度的靶标。在其他实施例中，可以采用多于两个的催化阶段。级联反应可以是线性的。在一个优选实施例中，级联反应可以是指数的。
如在此使用的，术语“反馈级联反应”是指在连续阶段中发生的任何连续的过程或操作，其中更迟阶段的发生依赖于更早阶段的发生，并且那个相同的更早阶段的发生至少部分依赖于该更迟阶段的发生。
缩写
在此并且贯穿本说明书使用了以下缩写：
RE：限制性核酸内切酶，限制性内切酶
CESA：全酶信号放大器复合体
PESA：部分酶信号放大器复合体
SIO：合成起始物寡聚核苷酸
EIC：酶抑制复合体
RERS：限制性内切酶识别位点/序列
RER：限制性内切酶识别
EAS：酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS1：第一酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS2：第二酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS3：第三酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS4：第四酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS5：第五酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS6：第六酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS7：第七酶放大器底物寡聚核苷酸
EAS8：第八酶放大器底物寡聚核苷酸
InF：抑制片段
DF：驱动片段
MNA酶（MNAzyme）：多组分核酸酶
DNA酶（DNAzyme）：脱氧核糖核酸酶；
PCR：聚合酶链式反应；
dH2O：去离子蒸馏水；
LNA：锁核酸；
PNA：肽核酸；
bDNA：分支DNA分析；
FCS：荧光相关光谱；
TSA：酪胺信号放大；
An：分析物或靶标；
F：荧光染料分子；
Q：淬灭剂分子；
N=A、C、T、G、或它们的任何类似物；
N’=任何与N互补的、或能够与N碱基配对的核苷酸；
(N)x：任何数目的N；
(N’)x：任何数目的N’；
n=可与rN互换
W：A或T；
K：A、G、或AA；
rN：任何核糖核苷酸碱基；
(rN)x：任何数目的rN；
rR：a或g；
rY：c或u；
M：A或C；
H：A、C、或T；
D：G、A、或T；
JOE或6-JOE：6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
Oligo：寡聚核苷酸
BHQ=黑洞淬灭剂（black hole quencher）
BHQ1=黑洞淬灭剂1
BHQ2=黑洞淬灭剂2
TXR=德克萨斯红或硫氰酸盐
IabFQ或IAbkFQ=爱荷华黑荧光淬灭剂（Iowa black fluorescence quencher）
详细说明
在开头应理解的是在此提供的图和实例是为了举例说明而不限制本发明和它的不同实施例。
提供了组合物、方法以及试剂盒用于靶标的检测、鉴别和/或定量。这些方法大体上包括组合物的使用，这些组合物包括用于驱动片段（DF）的靶标依赖性产生（target-dependent generation）的组分，该驱动片段在并入全酶信号放大器复合体时协助可检测信号的核酸酶介导放大。在某些实施例中，提供了反馈级联反应，其中不论是否提供了新的靶标分子，从驱动片段（DF）靶标依赖性产生起发的起始信号可以放大（即，在起始的靶标识别事件之后的信号放大可以独立于靶标分子而发生）。尽管在手段方面不存在具体的限制（通过该手段DF可以从靶标识别事件产生），但在一些实施例中，DF是通过由多组分核酸酶（MNA酶）对底物的切割产生的。MNA酶优选是通过多个核酸部分酶形成的，这些部分酶在装配促进物的存在下自我装配以形成活性核酸酶。在优选实施例中，装配促进物是靶标，并且因此只有在靶标的存在下MNA酶才形成。在其他实施例中，DF是通过靶标依赖性核酸酶对双链体的切割产生的，该双链体是通过在合成起始物寡聚核苷酸（SIO）与靶标序列之间的杂交形成的。
1.组合物和试剂盒
在此提供了用于执行本发明的方法的组合物以及试剂盒。仅通过非限制实例的方式，这些组合物和试剂盒可以包括以下项中的任何一个或多个：酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸、驱动片段（DF）、部分酶信号放大器（PESA）复合体、全酶信号放大器（CESA）复合体、酶抑制复合体（EIC）、抑制片段（InF）、合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、催化性核酸、MNA酶、MNA酶组分、部分酶、装配促进物、MNA酶底物、酶、限制性内切酶、核酸外切酶、核酸内切酶、底物、适体、和/或发夹寡聚核苷酸。
1.1MNA酶
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种MNA酶。MNA酶是有催化活性的核酸酶，它们能够从两种或更多种寡聚核苷酸组分（在此还称为部分酶）自我装配。部分酶寡聚核苷酸在MNA酶自我装配促进物的存在下自我装配以形成MNA酶。在一些实施例中，MNA酶的存在可以被检测到，并且指示靶标的存在，这是因为只有在靶标的存在下MNA酶才形成，其中该靶标包括装配促进物。MNA酶在本领域中是熟知的，并且被更详细地描述于PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536、以及2011-0143338的任何一个或多个中（这些文件的每一个的全部内容都通过交叉引用结合在此）。
在优选实施例中，MNA酶结构是基于一种或多种DNA酶和/或核酶。更优选的是那些基于特定DNA酶结构的MAN酶结构。目前优选的结构是基于包含10:23和8:17DNA酶的DNA酶。在不同实施例中，MNA酶包括核糖核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基的任一个或两者。在更优选的实施例中，MNA酶结构至少部分是基于DNA酶的结构。在其他优选实施例中，MNA酶包括至少一些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施例中，MNA酶的催化核心包括一种或多种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在再更优选的实施例中，一种或多种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物涉及底物的催化。在其他实施例中，在催化核心中的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物改进催化活性。在另外的其他实施例中，相对于没有脱氧核糖核苷酸碱基存在的可比的MNA酶的那个，对于用于以可测量的速率发生的催化的MNA酶的催化核心中的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物而言存在严格的要求。
MNA酶可以包含对于本领域的普通技术人员而言熟知的一种或多种替换物，例如类似物、衍生物、修饰的或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸酯主链的改变物、不同的删除、插入、替换、重复或其他修饰、或这些的任何组合。此类修饰、替换、删除、插入等可以在传感和/或底物臂和/或在催化核心部分中创造，使得分子保持催化活性。对结合底物或装配促进物的臂的替换和修饰可以良好地耐受并且允许针对不同的底物/装配促进物来定制分子。例如，传感臂的修饰允许针对不同装配促进物的定制，而底物臂的修饰允许针对不同底物的定制。
通过仅改变部分酶的传感臂、但不改变剩下的底物臂，可以设计特异性针对多种靶标的每一种的各种各样的MNA酶，所有的MNA酶采用通用的MNA酶底物用于检测。技术人员将理解这些优势，这是就消除对于每个靶标而言定制的或独特的底物的需要而言提供的。每个新靶标仅需要部分酶传感臂部分的一个或多个中的一个或多个改变；底物臂部分和催化核心部分可以保持不变。因此，使用一种MNA酶，单个MNA酶底物可以用于单个靶标，而使用改变的MNA酶，在一系列分析中可以用于多个靶标。多种MNA酶底物允许：使用多个MNA酶（一种MNA酶用于每个靶标）的单个分析中多路检测多个靶标。使用MNA酶的此类多路方法易于在溶液中或附接至支持系统时完成。在此考虑了多路分析可以因此在涉及使底物、或MNA酶部分酶或装配促进物、或额外的酶活性中的一种或多种附接至如在此所述的支持物的系统中完成。
技术人员将理解的是MNA酶包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的任一个或两者。那些包括至少一种或多种优选全部脱氧核糖核苷酸组分寡聚核苷酸的MNA酶是目前优选的。还优选的是那些在MNA酶催化核心内包括至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物的MNA酶。甚至更优选的是需要这样一种碱基用于催化活性的那些实施例。
在一些实施例中，部分酶、装配促进物或底物中的至少一者还可以包括（include）/包括（comprise）能够结合至靶标的适体。
优选的适体可以包括能通过吸附、回收、以及再扩增的迭代过程而从合成核酸或肽的复合库中分离的短单链DNA或RNA寡聚体或肽。因此适体可以针对范围为从小分子（例如氨基酸、或抗生素）到蛋白和核酸结构的几乎任何靶标而产生。在优选实施例中，适体包括例如优选通过进化和选择技术产生的核酸结合分子。优选地，适体可以包括DNA或RNA分子，或两者的组合，包括但不限于根据例如上表1的核苷酸类似物。
用于将适体的用途与MNA酶结合的策略在本领域中是已知的。例如，MNA酶的至少一种部分酶可以并入一种适体（适体部分酶）以及一种能够形成发夹并且因此抑制MNA酶装配的互补序列。有待检测的分析物或靶标可以结合至该适体部分酶，因此使活性MNA酶能够装配。在靶标分析物的不存在下，适体部分酶采用发夹结构，该结构抑制活性MNA酶的装配。在靶标分析物的存在下，靶标分析物结合至适体部分酶的适体结构域，因此破坏发夹结构并且允许适体部分酶参与活性MNA酶的装配。活性MNA酶可以进而修饰MNA酶底物以产生驱动片段。
在其他实施例中，适体可以作为装配促进物的部分而存在，其中该装配促进物并入一种适体以及能够形成发夹结构的互补抑制序列。在靶标分析物的不存在下，装配促进物采用发夹结构，该结构抑制此组分指导活性MNA酶装配的能力。在靶标分析物的存在下，靶标分析物结合至装配促进物的适体结构域，因此破坏发夹结构并且允许该组分指导活性MNA酶的装配。活性MNA酶可以进而修饰MNA酶底物以产生驱动片段。
本领域的普通技术人员将理解适体可以并入一种或多种装配促进物分子的任一端中。此外将理解的是多个适体可以并入一种或多种部分酶寡聚核苷酸组分中。
在一个另外的实施例中，适体序列可以按一种构型被并入部分酶的末端（适体部分酶），由此只有在靶标分析物的存在下活性MNA酶才形成。在这种情况下，MNA酶检测策略所需要的寡聚核苷酸组分包括：标准部分酶；适体部分酶，它是具有并入其一个末端中的适体的部分酶；装配促进物，它结合至适体部分酶和部分酶两者，使得活性MNA酶能够装配（在靶标存在下）；底物；以及装配抑制物，它与适体部分酶在跨越适体序列的至少部分以及部分酶序列的底物结合臂的部分的区域内杂交。在靶标的不存在下，装配抑制物结合至适体部分酶，因此阻断MNA酶底物的结合（以及切割）。在靶标的存在下，靶标结合至适体部分酶的适体序列，防止装配抑制物的结合并且允许MNA酶底物的结合和切割。这样，只有在靶标的存在下，活性MNA酶才可以形成并且修饰MNA酶底物以产生切割片段，例如驱动片段。
另外，本领域普通技术人员将理解，装配抑制物可以是单独的分子或可以并入参与MNA酶复合体的组分的一个中。
本领域普通技术人员还将理解的是一种或多种适体可以并入任何寡聚核苷酸组分（包括部分酶、装配促进物或MNA酶底物）中。另外，适体可以并入这些寡聚核苷酸的任一个的任一端中。
1.2MNA酶底物
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种MNA酶底物。底物可以对于给定MNA酶是特异性的，或可以是能够由具有不同靶标特异性的MNA酶修饰的通用/一般底物。在某些能够利用通用或一般底物的实施例中，MNA酶具有有利的特性。通过允许易做的设计变化来创造新的识别不同靶标的MNA酶，通用的MNA酶底物允许快速分析发展。部分酶的底物臂部分和催化核心部分可以保持不变，而仅改变用于新靶标的一种或多种部分酶的传感臂部分。提供了通用底物序列，并且因此相同底物可以并入用于许多不同靶标的分析中。另外，相同底物可以并入在此的不同实施例中的方法中，这些实施例包括其中底物在溶液中游离或者拴系或附接至支持物的分析。可以在多路反应中使用一系列通用底物，允许多个靶标的同时检测。
使用通用底物的MNA酶策略提供了超过检测技术（例如需要特异性针对每个新靶标的探针的设计和使用的
Figure BDA00003457832001071
或分子信标或杂交探针）的主要优势。
在某些实施例中，MNA酶底物可以作为结合至部分酶底物放大器复合体（PESA）并且形成酶抑制复合体（EIC）的抑制片段，这些酶抑制复合体不易于由核酸酶（例如限制性核酸内切酶）切割。
MNA酶对MNA酶底物的修饰可以提供用于在本发明的方法（例如，EzyAmp反应）中使用的一种或多种组分。修饰可以例如是MNA酶底物的切割或者多个MNA酶底物的连接。
在一些实施例中，MNA酶底物的切割可以产生更小片段，这些更小片段能发挥驱动片段的功能并且与PESA装配以形成易于由限制性内切酶或其他核酸酶切割的CESA。由于MNA酶底物对于任何靶标来说可以是通用的和有用的，通用MNA酶底物的切割可以导致通用驱动片段的产生。因此，通用DF可以结合至通用PESA并且导致通用CESA，该通用CESA可以在任何靶标的存在下被切割、允许信号的放大。
在其他实施例中，多个MNA酶底物的连接可以产生更大片段，这些更大片段能发挥驱动片段的功能并且与PESA装配以形成易于由限制性内切酶或其他核酸酶切割的CESA。由于MNA酶底物对于任何靶标来说可以是通用的和有用的，通用MNA酶底物的连接可以导致通用驱动片段的产生。因此，通用DF可以结合至通用PESA并且导致通用的CESA，该通用的CESA在任何靶标的存在下可以被切割、允许信号的放大。
1.3驱动片段
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种驱动片段（DF）。另外地或可替代地，DF可以在依据本发明的方法的组合物和试剂盒的使用期间产生。
在某些实施例中，可以提供驱动片段作为寡聚核苷酸的组分。寡聚核苷酸可以是单链寡聚核苷酸或双链寡聚核苷酸。例如，该寡聚核苷酸可以是酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸、合成起始寡聚核苷酸、MNA酶底物寡聚核苷酸、发夹寡聚核苷酸（例如包括多个EAS、以及优选两种EAS的发夹寡聚核苷酸）、拴系的寡聚核苷酸、或在一条链中具有内环部分的双链寡聚核苷酸。双链和/或发夹寡聚核苷酸可以包括突出部分，其中一条链与它的互补链相比延伸地较远（例如5’或3’突出）。该寡聚核苷酸可以与复合体（例如PESA或CESA）中的其他组分复合。
在某些实施例中，提供驱动片段作为EAS寡聚核苷酸的一个组分，其中EAS寡聚核苷酸的至少一部分与另一个不同的EAS寡聚核苷酸互补，并且其中那个不同的EAS寡聚核苷酸的至少一部分与驱动片段的至少一部分互补。
驱动片段可以用于启动在此披露的信号放大方法（例如，EzyAmp反应）。例如，只有在靶标检测时才可获得的驱动片段可以用于在结合至PESA复合体中的EAS时启动信号放大级联反应。在此类实施例中，在驱动片段的不存在下级联反应不能开始，该驱动片段可以因此称为“起始”驱动片段，尽管将理解的是为此命名法在描述此类驱动片段中仅是指示性的而不是必要的。
例如，驱动片段可以通过由MNA酶对MNA酶底物的切割产生，该MNA酶只有在靶标序列的存在下才装配。还应考虑的是驱动片段可以通过由具有连接酶活性的MNA酶对多个底物的连接来产生，该MNA酶只有在靶标的存在下才装配。驱动片段可以通过适体MNA酶或适体酶（DNA、RNA或嵌合体）的催化活性产生，这些适体MNA酶或适体酶只有在靶标配体（包括蛋白、脂类、小分子、病毒或其他由并入适体的这些类型的催化性核酸可检测的配体）的存在下才切割MNA酶底物。
在某些实施例中，驱动片段可以使用如例如在图19和24以及实例9和14中所述的靶标依赖性MNA酶来产生。这些实施例描述了驱动片段从双链寡聚核苷酸复合体的产生，这些复合体均充当底物并且结合并因此阻断DF并且因此在此称为底物-阻断体寡聚核苷酸。
仅通过非限制性实例的方式，MNA酶底物可以是包含第一和第二链的双链寡聚核苷酸复合体的组分，其中该第一链包括内环部分，该内环部分可以通过MNA酶的催化活性修饰（例如切割）。在一些实施例中，第一和第二链可以通过发夹环部分连接，其中一条链的5’端连接至另一条链的3’端。在内环部分内的碱基不与第二链的碱基杂交。寡聚核苷酸复合体包括在环部分外部的、并且与相对链的一部分杂交的至少一个驱动片段。例如，驱动片段可以是该复合体的第二链的组分。在靶标的存在下，MNA酶可以装配并且切割环部分，由此以释放能够与另一实体（例如，EAS）杂交的单链驱动片段的方式来修饰复合体。例如，环的切割可以从复合体去除环的部分，由此去除先前与驱动片段杂交的双链复合体的一部分。已经以靶标依赖性方式产生的驱动片段可以触发放大级联反应。
可替代地，MNA酶底物可以是包含第一和第二链的双链寡聚核苷酸复合体的组分，其中该第一和第二链是由一个发夹环部分连接，该发夹环部分将一条链的5’端连接至另一条链的3’端。可以通过在靶标存在下装配时的MNA酶的催化活性来修饰（例如，切割）发夹环部分。寡聚核苷酸复合体包括在发夹部分外部的、与一部分相对链杂交的至少一个驱动片段。在靶标的存在下，MNA酶可以装配并且切割发夹环部分，由此以提供能够与另一个实体（例如，EAS）杂交的单链驱动片段的方式来修饰复合体。例如，发夹环的切割可以从复合体释放环的一部分，由此去除先前与驱动片段杂交的双链复合体的一部分。已经以靶标依赖性方式产生的驱动片段可以触发放大级联反应。
还应考虑的是驱动片段可以通过限制性内切酶切割来产生。例如，双链的基因组DNA模板的一条亦或两条链的切割可以产生特定的片段，这些片段可以解离并且然后发挥起始驱动片段的功能，这些起始驱动片段可以结合PESA以形成CESA并且因此触发EzyAmp级联反应，该EzyAmp级联反应一旦启动，则不单独依赖于衍生自基因组DNA的起始驱动片段的存在而是依赖于通过CESA的切割产生的新驱动片段。甲基化敏感的RE可以用于甲基化靶标DNA中的胞嘧啶残基。
在其他实施例中，应考虑的是驱动片段可以使用识别并切割错配的异源双链体序列亦或DNA/RNA双链体序列的酶或化学品来产生。该错配可以是与被询问的序列相关的天然错配，并且可以是例如获得的突变或遗传的SNP。
起始驱动片段还可以通过与靶标复合的合成起始物寡聚核苷酸（SIO）（包括例如拴系至不可溶的支持物的SIO）的切割来产生。
包含在本发明的组合物和试剂盒中的驱动片段可以通过CESA复合体的核酸酶的酶解来产生。该核酸酶可以是限制性内切酶、核酸外切酶、或核酸内切酶。可以使用任何适合的限制性内切酶、核酸外切酶、或核酸内切酶。
在某些实施例中，该核酸酶是限制性内切酶。该限制性内切酶可以能够识别并且切割包括至少一个切口的双链体寡聚核苷酸。该切口或这些切口可以在限制性内切酶的识别位点的内部或外部。该切口或这些切口可以在限制性内切酶的切割位点的内部或外部。尽管可以潜在地使用任何限制性内切酶，但适合的限制性内切酶的非限制实例包括Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I和TspR I以及在表2和表3中指示的任何一种或多种限制性内切酶。
在某些实施例中，该核酸酶是核酸内切酶。在不限于任何具体类型的核酸内切酶的情况下，适合的实例包括T7核酸内切酶I、绿豆核酸酶、RNaseH、侧翼核酸酶、以及MNA酶。
在某些实施例中，核酸酶是核酸酶外切酶，其非限制性实例包括核酸酶BAL-31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I以及核酸外切酶T。
1.4合成起始物寡聚核苷酸（SIO）
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种合成起始物寡聚核苷酸（SIO）。SIO是被添加至样品中以引发在SIO与存在于样品中的靶标核酸之间形成双链体的寡聚核苷酸。由核酸酶对SIO/靶标双链体的配对亦或未配对区域的切割可以用于产生能发挥驱动片段功能的核酸片段。
在一些实施例中，应考虑的是驱动片段可以使用识别并切割错配的异源双链体序列亦或DNA/RNA双链体序列的酶或化学品来产生。在这个实施例中不需要SIO。该错配可以是与被询问的序列相关的天然错配，并且可以是例如获得的突变或遗传的SNP。如果希望在一个点而不是突变或SNP发生的地方切割序列，则可以将合成起始物寡聚核苷酸（SIO）添加至样品中以引发存在于生物样品中的核酸在一个特定位点处的切割。与靶标生物模板相比，SIO可以包含一个或多个错配。可替代地，SIO可以是RNA/DNA嵌合寡聚核苷酸，这些嵌合寡聚核苷酸结合至例如DNA序列使得形成短的RNA/DNA双链体，该双链体可以提供用于使用识别此类杂交序列的酶来切割的位点。
在此类另外的实施例中，驱动片段可以通过以下方法产生：将生物样本与SIO以及具有核酸外切酶或核酸内切酶活性的酶孵育在一起使得酶来酶解更大片段从而创造驱动片段。可以按此方式利用的酶的非限制性实例列于表2（下文）中。一些酶可以需要两步方案，而其他的可以易于进行单个步骤反应。本领域的普通技术人员将认识到许多其他的酶（由DNA和/或RNA以及具有核酸外切酶亦或核酸内切酶活性的酶组成）可以用于使用匹配的或错配的SIO来产生驱动片段。
通过参照图8-11可以更好地理解示例性核酸外切酶和核酸内切酶的使用机制。
图8展示了使用来自大肠杆菌的核酸外切酶I的3’到5’核酸外切酶活性来产生驱动片段的两个机制。此酶从DNA双链体水解3’单链突出端。合成起始物寡聚核苷酸（SIO）被添加至包含靶标DNA的样品中以协助驱动片段的产生。在右边小图中DF是衍生自SIO的切割，留下部分靶标片段，该DF是完整的并且是可获得的从而被再利用以产生更多DF。在左边小图中，DF是衍生自靶标的切割。硫代磷酸酯碱基可以并入PESA复合体的3’突出延伸中从而防止此复合体被核酸外切酶I切割。一旦DF产生，它就与PESA杂交因此使该PESA转化为CESA复合体。
图9展示了用于使用绿豆核酸酶的核酸外切酶活性来产生DF的两个机制。这个核酸内切酶从3’亦或5’方向降解来自DNA双链体的单链突出端，留下平头末端。合成起始物寡聚核苷酸（SIO）被添加至包含靶标DNA的样品中以协助驱动片段的产生。在右边小图中DF是衍生自SIO，而在左边小图中驱动片段是衍生自靶标。在左边（L）或右边（R）示出的反应可以按2个步骤（1和2）来进行，这2个步骤防止核酸酶对PESA或CESA的酶解。这可以通过物理分离来达到。一旦DF产生，它就与PESA杂交因此使该PESA转化为CESA复合体。
图10展示了用于使用核酸外切酶III的核酸外切酶活性来产生DF的机制。此酶从DNA双链体的3’末端去除核苷酸。该酶在平头或凹的3’末端上是有活性的，但在单链DNA上是没有活性的，并且因此将不会切割3’突出末端。该酶还可以从双链体DNA中的切口启动水解，从而产生单链缺口。在组分寡聚核苷酸上的硫代磷酸酯核苷酸的存在阻断此核酸外切酶活性。SIO被添加至包含靶标DNA的样品中以协助DF的产生。并入SIO的硫代磷酸酯防止当DF片段与PESA或CESA杂交时在切口处创造的切割。DF衍生自SIO，并且靶标可以被再利用以产生更多DF。在此实施例中，SIO可以包含靶标特异性区域，该区域与靶标和通用非靶标结合区域形成双链体。核酸外切酶III对靶标特异性区域的切割可以导致通用驱动片段（对应于SIO的非靶标结合区域）的产生，该通用驱动片段可以结合至通用PESA因此形成通用CESA。
图11展示了用于使用T7核酸外切酶的核酸外切酶活性来产生DF的机制。此酶从DNA双链体或DNA/RNA双链体的5’方向去除核苷酸，特别是从磷酸化的5’末端。在磷酸化底物的存在下，在不具有5’磷酸的其他5’端上的活性大大降低。SIO被添加至包含靶标DNA或RNA的样品中以协助DF的产生。DF衍生自合成起始物寡聚核苷酸（SIO），并且RNA或DNA靶标可以被再利用以产生更多DF。该PESA是由DNA组成，但可以在双链体的5’末端具有一些双链体RNA（虚线框）以便防止由T7核酸外切酶降解。在此实施例中，SIO可以包含靶标特异性区域，该区域与靶标和通用非结合区域形成双链体。T7核酸外切酶对靶标特异性区域的切割可以导致通用驱动片段（对应于SIO的非靶标结合区域）的产生，该通用驱动片段可以结合至通用PESA因此形成通用CESA。
另外，SIO可以可替代地或额外地并入以下实体：例如标记的核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、适体、或它们的任何组合。例如，纳米颗粒可以是金纳米颗粒。
在某些实施例中，本发明的组合物和试剂盒包括拴系至一种或多种不可溶支持物的SIO。
在某些实施例中，SIO可以以发夹构型提供。通过非限制性实例的方式，SIO可以包括双链茎部分以及发夹环部分，该双链茎部分产生自导致分子内键形成的寡聚核苷酸部分之间的序列互补性，该发夹环部分在茎的一个末端且其中的碱基不是互补的。发夹SIO可以具有额外序列，该额外序列在5’末端亦或3’末端从茎延伸由此形成单链序列的5’或3’突出。发夹SIO可以包含与另一种寡聚核苷酸（例如，像DF）互补的序列。图23提供了发夹SIO的非限制性实例。
1.5全酶信号放大器（CESA）复合体以及部分酶信号放大器（PESA）复合体
本发明的组合物以及试剂盒可以包含一种或多种全酶信号放大器（CESA）复合体和/或一种或多种部分酶信号放大器（PESA）复合体。
全酶信号放大器（CESA）复合体典型地包括两种酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸（例如，第一酶放大器底物（EAS1）寡聚核苷酸以及第二酶放大器底物（EAS2）寡聚核苷酸）以及驱动片段。EAS1典型地包括双链体的一条链，当呈双链时，该链将核酸酶的识别序列和切割序列并入。该核酸酶可以是例如限制性内切酶、核酸外切酶、或核酸内切酶。在优选实施例中，EAS1包括双链体的一条链，当呈双链时，该链将限制性内切酶识别序列和切割位点的一条链并入。
示例性CESA复合体提供于图14和15中。CESA复合体的一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分与复合体中的另一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补，并且所述EAS寡聚核苷酸其中之一的至少一部分还与至少一个DF的至少一部分互补。如上所指出，CESA复合体包括核酸酶的识别序列和切割序列。DF可以向识别序列和/或核酸酶切割序列贡献一个或多个碱基，尽管它不需要必然这样做。
DF向由两个EAS寡聚核苷酸形成的部分识别序列和/或部分酶切割序列贡献一个或多个核苷酸，提供了在DF结合至PESA复合体以形成CESA复合体时对核酸酶介导的切割的触发。在DF确实向识别序列和/或切割序列贡献一个或多个核苷酸的实施例中，DF可以贡献任何数目的核苷酸，例如像1、2、3、4、5、或多于5个核苷酸。可替代地，DF可以贡献少于5个、少于4个、或少于三个核苷酸。由DF贡献的核苷酸可以例如刚好是由两个EAS寡聚核苷酸形成的部分核酸酶识别序列或部分核酸酶切割序列的5’或刚好是其3’。可替代地，由DF贡献的核苷酸可以位于距离由两个EAS寡聚核苷酸形成的全核酸酶识别序列或全核酸酶切割序列5’或3’的1、2、3、4、5、或多于5个核苷酸处。
在可替代的实施例中，DF不向CESA复合体的核酸酶识别序列和/或核酸酶切割序列贡献任何核苷酸。虽然如此，如本说明书的实例5中提供的实验数据所证明的，DF结合至已经包含全核酸酶识别和切割序列的PESA可以增强CESA复合体的切割时产生的信号。
CESA复合体的切割典型地用于产生指示特定事件的可检测信号。参照图3和5，第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）包括可检测部分（F）以及淬灭剂部分（Q）。第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2）也包括淬灭剂部分（Q）。淬灭剂部分被适配为减弱或消除来自第一EAS1的可检测部分的可检测信号，直到CESA由限制性内切酶或其他核酸酶切割。例如，淬灭剂部分可以包括“黑洞淬灭剂1”（“Black Hole Quencher1”，BHQ1）或“黑洞淬灭剂2”（BHQ2）。本领域普通技术人员将理解的是任何适合的荧光团-淬灭剂染料对可以用于此类方案中。另外，CESA复合体的一种或多种EAS寡聚核苷酸（例如EAS1）可以可替代地或额外地并入以下实体：例如标记的核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、适体、或它们的任何组合。例如，纳米颗粒可以是金纳米颗粒。
由于核酸酶对CESA的切割，产生可检测效应，并且该效应的幅度和/或速度可以因此指示样品中靶标的量。该可检测效应可以通过多种方法检测：包括荧光光谱、表面等离子体共振、质谱、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、圆二色性谱、免疫测定、色谱法、放射分析法、亮度测定法、闪烁照相术、电子法、UV、可见光或红外光谱、酶法或它们的任何组合。
在一些实施例中，CESA复合体的一种EAS寡聚核苷酸包括双链体的一条链，该链包括一部分限制性内切酶识别序列和/或一部分限制性内切酶切割序列。参照图1、2和3，第一和第二酶放大器底物寡聚核苷酸EAS1和EAS2在它们长度的至少一部分上是互补的，使得第一和第二EAS寡聚核苷酸的互补部分可以杂交以形成部分双链的限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶切割序列。参照图4和5，第二EAS（EAS2）可以包含淬灭剂部分，在结合至EAS1时该淬灭剂部分可以淬灭位于EAS1上的可检测部分。可替代地，EAS2可以包含可检测部分，该部分的荧光是由位于EAS1上的淬灭剂部分淬灭。由EAS1和EAS2杂交形成的复合体称为部分酶信号放大器（PESA）复合体。
PESA复合体是多寡聚核苷酸复合体，该复合体包含至少两个酶放大器底物（EAS）寡聚核苷酸，其中一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分与复合体中的另一个EAS寡聚核苷酸的至少一部分互补。此外，所述EAS寡聚核苷酸之一的至少一部分还与至少一个DF的至少一部分互补。尽管具有与DF杂交的能力，但DF不杂交并且因此不是PESA复合体的组分。PESA复合体包括一种酶的至少一个部分识别序列/位点和/或至少一个部分切割序列/位点，并且可以包含一种酶的全识别序列/位点和/或全切割序列/位点。示例性PESA展示于图1C、3C、4、5B、7A、7B、8（左边和右边小图两者）、14C、17A、18A、19A、20和22中。
通过MNA酶对MNA酶底物的切割或者通过其他核酸酶（包括蛋白核酸外切酶和核酸内切酶）对SIO/靶标双链体的切割所产生的驱动片段（DF）可以被需求以便完成限制性内切酶识别序列（图2中表示为阴影线框）和/或它可以提供毗邻于限制性内切酶切割所需要的限制性内切酶识别序列的另外序列。参照图2，切割位点由实心黑色垂直箭头表示。驱动片段的至少一部分与第一酶放大器底物寡聚核苷酸EAS1的至少一部分互补。参照图1、2和3，驱动片段和第一EAS1在它们长度的至少一部分上是互补的，使得驱动片段与第一酶放大器底物寡聚核苷酸的互补部分可以装配，例如通过杂交以形成包含全部或部分限制性内切酶识别的双链序列。并入CESA的全部或部分双链限制性内切酶切割序列也可以按此方式形成。通过EAS1、EAS2以及DF的杂交装配成的CESA包含所有需要用于由RE识别和切割的序列。
在一个实施例中，由适当的RE对CESA的切割导致第一酶放大器底物寡聚核苷酸EAS1在可检测部分与淬灭剂部分之间的切割，允许这两个部分分离由此允许在淬灭剂部分远离或有效去除于可检测部分的局部环境时可检测信号出现或增加。在其他实施例中，CESA的切割可以导致新驱动片段的产生，这些新驱动片段能够与额外的PESA杂交以形成额外的CESA（例如，图7、17A、18A、19A、20、和22）。额外的CESA可以易于进行用相同的RE或不同的RE的切割。
参照图2和15，在一些实施例中，完全装配的CESA可以具有不同的设计。可以需要DF（具有白色中心的黑线）来完成限制性内切酶的识别序列和/或它可以提供毗邻于限制性内切酶切割所需要的限制性内切酶识别位点的额外序列。由限制性内切酶进行的切割可以导致5’突出、3’突出的任一种，或它可以产生平头末端。该限制性内切酶可以切割具有EAS1、EAS2和DF的双链装配复合体的一条或两条链。EAS2和DF邻接的位置可以是在RE将正常切割连续双链双链体的位置处，或者它可以是在具有限制性内切酶识别和切割所需要的序列的别处。与EAS2邻接的DF的末端一定是在之前步骤中从较长分子的切割生成的。例如，如果驱动片段是通过MNA酶将MNA酶底物的切割成5’和3’片段产生的，则邻接的末端一定是经切割的MNA酶底物的3’片段的5’端或5’片段的3’端。在另一个实例中，如果驱动片段是通过核酸外切酶III对SIO的切割（图10）而产生因此创造5’片段，则邻接的末端一定是这个5’片段的3’端。
参照图1B，“酶抑制复合体”或“EIC”是由可以包含EAS1、EAS2以及抑制片段（InF）的多个寡聚核苷酸形成的复合体。EIC包含存在于多个寡聚核苷酸上的酶识别位点和切割位点的序列，但还包含导致对限制性内切酶或其他核酸酶切割造成抑制的额外序列。
在EIC包含PESA和InF的实施例中，它到CESA的转化需要抑制片段（InF）的切割，因此产生更小片段，该更小片段可以发挥驱动片段（DF）的功能以完成CESA。InF的切割可以通过若干手段达到。InF可以是MNA酶的底物，该MNA酶在靶标分析物的存在下装配并且切割InF/MNA酶底物以产生DF。可替代地，InF可以是合成起始物寡聚核苷酸（SIO），该寡聚核苷酸与靶标序列杂交以形成由蛋白核酸外切酶或核酸内切酶识别的双链体，使得InF/靶标复合体的配对或未配对的碱基被切割以产生完成CESA的DF。
在某些实施例中，以发夹结构的形式提供了PESA复合体和CESA复合体。通过非限制性实例的方式，PESA复合体可以包括双链茎部分以及发夹环部分，该双链茎部分产生自复合体中每个EAS寡聚核苷酸的至少一部分之间的序列互补性，该发夹环部分在茎的一个末端且其中环的碱基不是互补的。发夹PESA复合体可以具有额外序列，该额外序列在5’末端亦或3’末端从茎延伸由此形成单链序列的5’或3’突出。发夹PESA复合体可以包含与另一种寡聚核苷酸（例如，像DF）互补的序列。发夹CESA复合体可以在DF结合至发夹PESA复合体时形成。图18提供了发夹PESA复合体以及发夹CESA复合体的非限制性实例。
具有形成CESA复合体潜力的PESA复合体可以被并入复合的结构中从而定位并且促进组分（例如多个复合体之间的驱动片段）的转移。图22展示了用于通过将PESA复合体并入分支结构中来定位EzyAmp组分的示例性方法。提供了第一复合体，该第一复合体包含主链寡聚核苷酸、EAS1、EAS2、EAS3、以及EAS4。主链寡聚核苷酸包含EAS1、EAS3以及将EAS1和EAS3分开的介入部分。一部分EAS1与一部分EAS2互补（它与EAS2的该部分杂交），一部分EAS2与一部分第一DF互补，并且一部分EAS1或EAS2包括第二DF。一部分EAS3与一部分EAS4互补（它与EAS4的该部分杂交），一部分EAS3与一部分第二DF互补，并且一部分EAS3或EAS4包括第二DF。第一复合体采用C-形，该C-形具有介入部分，该介入部分将EAS1和EAS3分开，EAS1和EAS3被定位用于与包含互补序列的第二复合体的相对应部分杂交。如图22的小图B中所示，这允许具有四个单独PESA复合体的双重复合体的形成。通过使用任何适合的试剂（例如生物素/抗生物素蛋白、化学试剂、抗体、肽接头以及类似物），每个单个或双重复合体的一个或多个臂可以与另一个单个或双重复合体的一个或多个臂连接，如在图22D中所展示的。将不同PESA复合体带到靠近彼此之处，允许在CESA复合体的形成和切割时驱动片段在不同PESA复合体之间的有效转移。
1.6寡聚核苷酸
驱动片段、抑制片段、合成起始物寡聚核苷酸以及酶放大器底物是寡聚核苷酸，并且可以包含一种或多种替换物，例如类似物（例如，列于表1中的那些）、衍生物、修饰的或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸酯主链的改变物、不同的删除、插入、替换、重复或其他修饰、或这些的任何组合对于本领域普通技术人员而言是熟知的。可以在寡聚核苷酸中的任何位置处制得此类修饰、替换、删除、插入等，其条件是它基本上保持它的功能。寡聚核苷酸的替换和修饰可以被良好地耐受，并且允许将分子定制为在涉及全酶信号放大器复合体的反应的条件下发挥功能或者发挥功能用于改进该反应的效率。例如，通过将一种或多种核苷酸类似物包含在内而进行的酶放大器底物或驱动片段的修饰可以协助更不稳定的全酶信号放大器复合体的装配，由此提高例如核酸酶对全酶信号放大器复合体的切割效率。
技术人员将理解本发明的寡聚核苷酸（例如，像驱动片段、合成起始物寡聚核苷酸、抑制片段、底物、适体、以及酶放大器底物寡聚核苷酸）可以包括脱氧核糖核苷酸亦或核糖核苷酸或者两者。在某些实施例中，这些寡聚核苷酸包括至少一个脱氧核糖核苷酸。在优选实施例中，这些寡聚核苷酸包括占主导的脱氧核糖核苷酸，并且仍然更优选地只包括脱氧核糖核苷酸。
1.7限制性内切酶
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种限制性内切酶、核酸外切酶、核酸内切酶、或它们的组合。在本发明的组合物、方法以及试剂盒中有用的限制性内切酶可以是I型、II型、III型或IV型限制性内切酶。基于亚基组合物、切割位置、序列特异性以及辅因子需求，限制性内切酶大体上分为这些类型（参见表2）。
表2：限制性内切酶的类型
Figure BDA00003457832001211
Figure BDA00003457832001221
出于举例说明的目的，列于表2中的限制性内切酶被单独地提供，并且不以任何方式限制本发明的范围。本领域普通技术人员将理解，宽范围的限制性内切酶将与CESA和EzyAmp反应的发展相容。例如，列于限制性内切酶数据库（REBASE）（http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html）中的许多限制性内切酶将与CESA和EzyAmp反应的发展相容。下表3提供了本发明中具有不同特异性和特征的限制性内切酶的实例。
表3：限制性内切酶的实例（组不是互斥的）
Figure BDA00003457832001231
Figure BDA00003457832001241
再次仅通过实例的方式，Mnl I是用于EzyAmp反应中特别有用的酶。Mnl I需要四个核苷酸双链识别序列。切割位点是在离RERS的一个距离处，并且该酶不需要在介入空间（intervening space）内的任何特定序列。DNA的每条链提供了部分的识别序列，该识别序列一定与它的互补部分杂交从而提供完整的双链识别序列。识别序列、介入序列以及切割位点可以描绘如下（其中N可以是任何脱氧核糖核苷酸并且“/”指示切割位点：
5’C C T C N N N N N N N/5’
3’G G A G N N N N N N/3’
在双链序列的一条链是非邻接的情况下（即毗邻的脱氧核糖核苷酸不与磷酸二酯键连接），该DNA双链体被描述为包含“切口”。Mnl I的典型识别序列是由邻接的双链DNA组成，而没有任何切口。
对表征Mnl I切割不同双链体结构（包括在RERS内的不同位置处具有切口的那些）以及包含错配核苷酸、含硫基团以及核糖核苷酸的结构的能力进行了广泛的研究。这些研究的意图是确定允许一系列包含部分Mnl I识别位点的PESA和DF的设计的灵活性水平（表4）。对其他RE进行的这样一种广泛的表征将提供用于在EzyAmp反应中使用其他RE的信息。
表4：对于被Mnl I切割的能力进行测试的结构
Figure BDA00003457832001261
Figure BDA00003457832001271
*其中：-CCTC或GGAG是构成Mnl I识别位点的部分序列
-N是任何核苷酸，并且N’与N互补
-rN是核糖核苷酸
-↓↑是RE指导切割的位点
-^指示切口
1.8.具有核酸外切酶或核酸内切酶活性的酶。
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种具有核酸外切酶或核酸内切酶活性的酶。
除了限制性内切酶和催化性核酸酶外，其他具有切割核酸序列能力的蛋白酶在此处描述的组合物、方法和试剂盒中是有用的。这些酶中的一些具有核酸外切酶活性，该活性导致核苷酸从单或双链核酸的末端去除。其他酶具有核酸内切酶活性，并且在内部的键处切割序列以产生更小片段。
适合的核酸外切酶的非限制性实例包括核酸酶BAL-31、核酸外切酶I（大肠杆菌）、核酸外切酶III（大肠杆菌）、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I、核酸外切酶T、以及核酸酶BAL-31。适合的核酸内切酶的非限制性实例包括T7核酸内切酶I、RNase H、侧翼核酸酶、绿豆核酸酶、以及MNA酶。
适合的核酸酶的一个子集其特性列于表5中。
表5：核酸酶特性
Figure BDA00003457832001281
Figure BDA00003457832001291
1.9适体
本发明的组合物和试剂盒可以包括一种或多种适体。适体是一种核酸或肽序列，该核酸或肽序列由于它们更高水平的结构（例如3-D结合结构域或口袋）而具有以高亲和力和特异性来识别一种或多种配体的能力。例如，适体可以结合至蛋白、多肽、肽、核酸糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古生菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、整个有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或它们的任何衍生物、部分或组合、或任何其他实体。
在一些实施例中，适体可以包含具有识别一种或多种配体能力的核酸、蛋白、多肽、肽、或其组合。在此优选的适体包括短单链DNA、RNA寡聚体、或肽。这些可以通过吸附、回收、以及再扩增的迭代过程而从合成核酸的复合库分离。适体可以针对范围为从小分子（例如氨基酸、或抗生素）到蛋白和核酸结构的几乎任何靶标而产生。优选地，适体可以包括DNA或RNA分子，或两者的组合，包括但不限于根据例如上表1的核苷酸类似物。
本领域的普通技术人员将理解适体可以并入在本发明的方法中使用的任何其他组分（例如，MNA酶组分）中。
1.10试剂盒
本发明还提供了用于实践在此披露的方法的试剂盒。典型地，用于执行本发明的方法的试剂盒包含进行该方法的所有必要试剂。
这些试剂盒包含本发明的任何一种或多种组合物，和/或本发明的组合物的任何一种或多种组分。例如，在一个实施例中，一种试剂盒可以包含具有MNA酶组分的第一容器、具有MNA酶底物的第二容器、以及具有PESA组分的第三容器、以及具有限制性内切酶的第四容器。MNA酶的自我装配需要装配促进物或存在于测试样品中的靶标的关联。因此，在这种实施例中，在试剂盒的组分组合时，MNA酶在装配促进物或存在于测试样品中的靶标的存在下装配并且切割底物以形成DF。DF然后与PESA组分装配以提供CESA，该CESA包含限制性内切酶的识别和切割位点。
在其他实施例中，一种试剂盒可以包含具有SIO的第一容器、具有PESA组分的第二容器、以及具有能够在SIO和靶标之间形成双链体时进行切割的核酸酶的第三容器、以及包含限制性内切酶的第四容器。在使用过程中，双链体是通过SIO与存在于测试样品中的靶标的关联来形成。因此，在这种实施例中，在试剂盒的组分组合时，SIO在存在于测试样品中的靶标的存在下形成双链体，并且核酸酶在双链体形成时进行切割以形成DF。DF然后与PESA组分装配以提供CESA，该CESA包含用于限制性内切酶的识别和切割位点。
典型地，本发明的试剂盒将还包含一种或多种其他容器，这些容器包含例如洗涤试剂、和/或其他在执行本发明方法中需要的试剂。
在本发明的背景下，试剂盒可以包括其中试剂被包含在分开的容器中的任何试剂盒，并且可以包括小的玻璃容器、塑料容器或塑料或纸的条带。此类容器可以允许试剂从一个区室有效地转移至另一个区室，同时避免样品和试剂的交叉污染，并且允许每个容器的试剂或溶液以定量的形式从一个区室添加至另一个。此类试剂盒还可以包括一种将接收测试样品的容器、包含在分析中使用的试剂的容器、包含洗涤试剂的容器、以及包含检测试剂的容器。典型地，本发明的试剂盒将还包括使用试剂盒组分以进行适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可以用于与自动分析设备和系统结合，例如包括但不限于实时PCR机。
为了应用于不同靶标的检测、鉴定或定量，本发明的单个试剂盒可以是可应用的，或可替代地可以需要不同试剂盒，这些不同试剂盒例如包含特异性针对每个靶标的试剂。本发明的方法和试剂盒发现在任何希望检测、鉴定或定量任何实体的环境中的应用。
2.检测和信号放大
本发明提供了用于至少一种靶标的检测、鉴别和/或定量的不同方法。另外本发明提供了用于从靶标检测起发的信号的放大的不同方法。
这些方法可以使用本发明的组合物和试剂盒、以及它们的组分（包括在以上部分1中所述的那些）来执行。
2.1起始物驱动片段
依据本发明的方法对靶标的检测、定量或放大典型地依赖于一种或多种驱动片段（DF）的使用。具体而言，这些方法典型地依赖于起始DF（initialDF）的产生（在此还称为“起始物DF”（“initiator DF”）），该起始DF在靶标分子的检测时出现。一旦产生，起始DF可以启动信号的产生，例如，通过与PESA复合体杂交以形成CESA复合体，该CESA复合体能够由酶识别并修饰。酶（例如核酸酶）对CESA复合体的修饰（例如切割）提供了可检测效应，并且可以释放另外的DF，该DF能够结合至额外的PESA复合体，由此协助信号放大。
在优选实施例中，起始物DF与靶标相异，尽管在一些实施例中，起始物DF可以包括一部分靶标，并且在其他实施例中起始物DF可以是靶标。
在优选实施例中，起始物DF的产生不涉及由限制性内切酶对靶标的酶切，尽管这个可能性不是必然被排外。起始物DF可以通过靶标特异性事件产生，并且这充当一种触发物以激活本发明的信号检测以及信号放大方法。总体上，起始物DF的产生涉及靶标分子结合至本发明的寡聚核苷酸（例如，SIO、MNA酶或PESA复合体），从而形成能够由酶（例如核酸酶）进行修饰的复合体。例如，靶标结合至寡聚核苷酸可以完成部分酶识别和/或切割位点。在一些实施例中，靶标结合至其上的寡聚核苷酸包含DF，并且这样形成的复合体的酶修饰用于从该寡聚核苷酸释放起始物DF（参见，例如，图8B、9B、10、11和23）。在其他实施例中，靶标结合至寡聚核苷酸协助靶标的酶修饰，从而从靶标直接形成起始物DF（参见，例如，图8A和9A）。在仍是其他的实施例中，寡聚核苷酸在结合至靶标时变得有催化活性，并且修饰一种或多种底物，从而形成DF（参见例如图5、13、19和24）。
仅通过非限制性实例的方式，起始物DF可以通过MNA酶对底物的切割或连接来产生，如在以上小节1.3中所述。底物可以是底物-阻断体寡聚核苷酸（参见小节1.3，图19和24B、24C、24D和实例9和14）。
在其他实施例中，起始物DF可以通过限制性内切酶对靶标（例如基因组DNA）的切割、对与靶标复合的合成起始物寡聚核苷酸（SIO）的切割（参见，例如以上小节1.4、图8-11以及图23）、或者通过使用识别和切割错配异源双链体序列亦或DNA/RNA双链体序列的酶或化学品产生。该错配可以是与被询问的序列相关的天然错配，并且可以是例如获得的突变或遗传的SNP。
有技能的读者将认识到，用于产生以上提及的起始物驱动片段的方法仅是出于例证说明的目的而被提供，并且其他适合的方法也可以被采用。
2.2靶标检测
本发明的方法可以用于提供指示靶标存在的信号。
在某些实施例中，起始物DF的产生可以提供可检测效应。如在以上小节2.1中所指出的，起始物DF可以通过对由靶标结合至本发明的寡聚核苷酸形成的复合体进行酶修饰（例如切割）来产生。例如，靶标结合至用荧光团和淬灭剂部分标记的SIO可以按一种方式协助SIO的酶修饰，该方式将这些部分分离因此在起始物DF的释放过程中提供可检测效应（参见例如图23）。另外或可替代地，靶标的存在可以基于一些特征而被检测和潜在地定量，这些特征例如产自寡聚核苷酸/靶标复合体的酶修饰的产物的大小和序列。
2.2.1线性级联反应
在优选实施例中，在靶标识别事件时产生的起始物DF被用于经由PESA复合体的完成以形成CESA复合体而产生信号。CESA复合体的酶切割可以用于产生可检测效应和/或提供一种或多种额外的DF，该额外的DF能够结合至另一个PESA复合体以形成另外的CESA复合体，该另外的CESA复合体能够发生酶切割和信号产生，因此提供线性级联反应。
此过程展示于图4中，其中在先前步骤中产生的驱动片段（例如起始物DF）与PESA复合体装配，该PESA复合体包括第一酶放大器底物（EAS1）寡聚核苷酸和第二酶放大器底物（EAS2）寡聚核苷酸。当DF与PESA复合体装配时，产生CESA，该CESA包含限制性核酸内切酶识别位点（图4中的虚线框）和限制性核酸内切酶切割位点（图4中垂直实心箭头）。在一个实施例中，第一EAS1是用淬灭剂（Q）标记，并且第二EAS2是用荧光团（F）标记。装配的CESA的切割后，组分随后解离，导致荧光团和淬灭剂的分离以及伴随的荧光信号的产生和完整DF的释放（图4）。DF然后游离，以便与另一个PESA关联以形成另一个CESA，导致另外的限制性核酸内切酶切割以及荧光的增加。该过程因此继续并且导致信号放大，由此荧光信号通过限制性内切酶介导的对另外EAS1的切割而产生，如在图4中所展示。在另外的其他实施例中，切割CESA的酶是一种不是限制性核酸内切酶的核酸酶。
在另一个实施例中，展示于图5中，第一和第二部分酶在与包含装配促进物的样品接触时自我装配成催化活性的MNA酶。MNA酶结合至MNA酶底物，并且协助MNA酶底物的修饰，所述修饰由此指示装配促进物的存在，其中装配促进物是靶标（图5A）。在其他实施例中，例如像涉及适体的那些，装配促进物可以不是靶标，并且因此可以仅包含MNA酶自我装配所需的元件。
由催化活性的MNA酶对MNA酶底物的切割（图5A，步骤1）产生了可以与PESA装配的驱动片段（DF）（图5B）（图5，步骤2），从而创造CESA（图5C），该CESA包括第一EAS（EAS1）和第二EAS（EAS2）以及DF，该CESA形成限制性内切酶识别位点（虚线框）和限制性内切酶切割位点（垂直黑箭头）。在一个实施例中，第一酶放大器底物寡聚核苷酸是用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记，并且EAS2是用淬灭剂（Q）标记。由限制性内切酶对此装配结构的切割（图5，步骤3）以及随后的组分的解离（图5，步骤4）导致荧光信号的产生和DF的释放。DF然后游离，以便与另一个PESA关联以形成另一个CESA（图5，步骤5），导致另外的限制性核酸内切酶切割（图5，步骤6，如步骤3）。该过程因此继续并且导致信号放大，由此荧光信号通过限制性内切酶介导的对另外EAS1的切割而产生，如在图5步骤4、5、和6中所展示。
由于MNA酶的性质以及包括RE的核酸酶的不同特性，反应可以在宽范围的温度上进行，仅受到MNA酶装配、MNA酶底物的催化修饰（例如切割）的要求以及CESA从PESA和DF的装配和核酸酶活性的要求。该方法的每个阶段可以在不同的温度进行，例如，在靶标的存在下MNA酶的形成以及MNA酶底物的随后切割可以在一个温度达到，而包含DF的CESA的形成以及随后由限制性内切酶的切割以产生信号放大可以在一个不同的温度发生。可替代地，所有的步骤可以在一种环境中的单个温度下进行，该环境中的单个温度支持MNA酶和核酸酶（包括限制性内切酶）两者的催化活性。
在驱动片段是通过使用蛋白核酸外切酶或核酸内切酶进行靶标定向切割而产生的其他实施例中，那时与EzyAmp所需要的所有蛋白酶相容的反应条件可以易于由本领域普通技术人员确定。
如在此进一步提供的，一些用于采用包括限制性内切酶（或单独或与MNA酶组合）的核酸酶进行靶标检测的方法不需要靶标的热循环和/或变性。等温法与需要热循环的方法相比是更灵活的，并且还可以使得能在包含单链和双链核酸的靶标之间进行区分。另外，对热循环的需要的缺乏可以使得此类方法更容易并且更廉价。依据在此的方法提供了简单、快速、有成本效益的、等温的并且程序灵活的检测样品中感兴趣靶标（可以是合成的或天然的）的方法。
2.2.2反馈级联反应
在本发明的优选实施例中，在靶标识别事件时产生的起始物DF被用于产生反馈级联反应中的信号，该反馈级联反应涉及多个PESA和CESA复合体。
仅通过非限制性实例以及参照图17A和18A的方式，起始物DF（DF-a）可以结合至第一PESA复合体（PESA A），由此形成第一CESA复合体（CESA A），该第一CESA复合体具有核酸酶的识别位点和切割位点。PESA A可以包含第一和第二EAS寡聚核苷酸（EAS1和EAS2），其中一部分EAS1与EAS2互补，并且一部分EAS1与DF-a互补。还可以用定位为十分接近在一起的荧光团和淬灭剂部分来标记EAS1，从而防止或基本上防止产生任何信号，同时EAS1是完整的。EAS2可以包括与DF-a相异的第二DF（DF-b）。由核酸酶对PESA A的切割切割EAS1，由此将荧光团与淬灭剂部分分离，提供了一个可检测信号，并且还切割EAS2，释放DF-b，使得它可以与PESA B复合并且形成CESA B。CESA B可以包含第三和第四EAS寡聚核苷酸（EAS3和EAS4），其中一部分EAS3与EAS4互补，并且一部分EAS3与DF-b互补。还可以用定位为十分接近在一起的荧光团和淬灭剂部分来标记EAS3，从而基本上防止产生任何信号，同时EAS3是完整的。EAS4可以包括DF-a。由核酸酶对PESA B的切割切割EAS3，由此将荧光团与淬灭剂部分分离，提供了一个可检测信号，并且还切割EAS4，释放DF-a，使得它可以与新的PESA A复合并且形成新的CESA A，由此提供反馈信号放大环路。由新DF-a和DF-b的连续产生所刺激的随后几轮的CESA A和CESA B切割用于放大由于起始物DF（DF-a）起始结合至PESA A所产生的信号，并且不论额外的靶标分子是否存在而这样做。虽然如此，新的起始物DF寡聚核苷酸（即，DF-a）还可以在额外的靶标分子的识别时进入系统。因此，该方法可以用于放大从最小数目的靶标分子起发的信号，并且充当对存在的靶标分子进行检测和对其量进行定量的手段。在某些实施例中，PESA A和/或PESA B是发夹寡聚核苷酸（参见图18A）。
图19提供了涉及MNA酶的反馈信号放大级联反应的另一个实例。在此实例中，起始DF序列不是MNA酶底物序列的部分。寡聚核苷酸部分酶在识别存在于底物阻断体-DF-a寡聚核苷酸的环部分内的靶标时装配，形成能够切割环的MNA酶。在此实施例中，起始DF（DF-a）存在于底物-阻断体寡聚核苷酸的相对链上（相对于环）。由MNA酶对环的切割导致一部分与DF-a互补的底物-阻断体寡聚核苷酸解离，由此允许DF-a与PESA A杂交并且形成CESA A。随后CESA A的切割可以产生可检测信号（例如，通过荧光团与淬灭剂部分的分离）、并且释放DF-b。释放的DF-b可以与PESA B关联以形成可以由RE切割的CESA B。CESA B的切割可以产生可检测信号（例如，通过荧光团与淬灭部分的分离）并且导致可以发挥DF-a功能的寡聚核苷酸的释放。因此，形成反馈级联反应，由此CESA A和CESA B连续形成并且被切割从而释放更多DF-a和DF-b，导致更多的CESA A和CESA B的形成。在更复杂的反应中，可以有多个的双链寡聚核苷酸复合体，这些复合体各自包含独特的起始DF，这些DF被设计为由独特的MNA酶进行释放。
在图22中提供了另外的反馈信号放大级联反应的非限制性实例。如以上在图22的不同说明中列出的（参见小节1.5以及“附图简要说明”），通过将PESA复合体并入分支结构中进行的EzyAmp组分的定位可以提高反馈级联反应系统的效率。这些结构将多个PESA复合体带到靠近彼此之处，允许在CESA复合体的形成和切割时驱动片段在不同PESA复合体之间的更有效的转移。例如，如在图22A中所示的实施例中所指示的，单个分支结构可以包括至少两个PESA复合体（PESA A和PESA B），每个复合体能够在相异的DF（DF-a或DF-b）结合时进行核酸酶切割。在DF-a结合至PESA A时形成的CESA复合体（CESA A）的核酸酶切割提供了可检测效应并且释放DF-b。DF-b可以结合PESA B以形成CESA B，该CESA B可以由核酸酶切割，提供另外的可检测效应并且释放另外的DF-a，该另外的DF-a可以结合至另外的PESA A，因此形成反馈环路。如在图22B中所示的实施例中所指示的，单分支结构可以经由它们各自的主链部分杂交，以形成双分支结构，因此有效地使存在于该结构中的PESA A和PESA B复合体的数目加倍。单分支结构和双重分支结构可以使用一种或多种连接试剂而连接至其他单分支结构和/或其他双重分支结构，从而形成分支结构的网络。例如，通过使用任何适合的试剂（例如，生物素/抗生物素蛋白、化学试剂、抗体、肽接头以及类似物），单分支结构和/或双分支结构的一个或多个臂可以与其他单分支结构和/或双分支结构的一个或多个臂连接，如在图22D中所示的实施例中所指示的。
图23展示了另外的实施例，其中反馈级联反应是使用单个PESA结构和SIO产生的。在此实例中，信号放大是由一种适合的核酸外切酶（例如核酸外切酶III（Exo III））启动并介导的。Exo III可以从DNA双链体的3’羟基末端去除核苷酸，这时该末端是平头亦或凹的，并且不酶解单链寡聚核苷酸（包括具有带至少5个核苷酸的3’突出端的双链体）。硫代磷酸酯核苷酸阻断核酸外切酶活性也是已知的。可以用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的SIO表示为具有突出3’末端的发夹构型。在靶标结合之前，由于SIO包含多于五个碱基的3’突出端，Exo III不能酶解SIO。在SIO中的硫代磷酸酯核苷酸防止超过在SIO中的那个点之处的水解，因此留下完整DF。SIO可以结合至靶标的互补区域，形成了SIO中的凹的3’端，该SIO能够由Exo III水解直到硫代磷酸酯碱基，因此释放完整的DF并且导致荧光的增加。在此实例中，DF对应于与靶标不互补的SIO5’部分（即序列5’到硫代磷酸酯核苷酸）。不再结合至SIO的靶标进而呈游离的以便被再利用以与另一种SIO结合，并且因此产生另一个DF。这样产生的DF可以结合至PESA的EAS1，形成CESA，其中EAS1的3’端是凹的。Exo III可以进而水解CESA的EAS1链，导致荧光的增加以及DF的释放，该DF可以被再利用以将更多的PESA转化为CESA。
2.2.3多路化
本发明的方法可以用于检测单个EzyAmp反应中的多个靶标，并且可以同时放大从相异靶标检测起发的单独信号。
总体上，使用在此所述方法进行的不同靶标的多路检测/信号放大可以通过产生一系列不同的起始物驱动片段（每个衍生自特定靶标）来完成。可以对每个特定类型的起始物DF提供对应的PESA复合体，每个PESA复合体包含相异的可检测元件（例如，独特荧光团），该可检测元件能够与其他PESA复合体的那种元件区分开来。用于此类反应的起始物驱动片段可以按任何适合的方式产生，包括在以上小节2.1中提及的任何一种或多种方法。
在某些实施例中，可以使用两种或更多种合成起始物寡聚核苷酸（它们具有不同靶标特异性并且包含相异的驱动片段）、两种或更多种MNA酶（它们具有相异的靶标特异性并且能够通过一种或多种MNA酶底物的催化修饰来产生相异的驱动片段）、或者一种或多种合成起始物寡聚核苷酸以及一种或多种MNA酶（这些MNA酶每个具有不同的特异性并且每个能够产生相异的DF）的组合来产生多个相异的起始物驱动片段（每个衍生自不同靶标）。
技术人员将因此认识到，在此提供的组合物和方法可以用于检测每个反应的单个靶标或检测单个反应中的多个靶标。当检测多个靶标时，可以取决于分析以及有待检测的物质来使用一种或多种MNA酶。例如，单个MNA酶可以满足检测多个相关结构的情况，这些多个相关结构例如，共享一个关键序列（由MNA酶识别的）并且仅在例如长度、或关键序列之外的序列上有所不同的一组序列。可以检测任何具有该关键序列的序列。多个MNA酶被考虑为在检测由如单个核苷酸那么小所区分的相关序列时或者甚至在将要检测极大不同的靶标时是有用的，并且令人希望的是知道每个的存在或不存在。类似地，在一些实施例中，单个MNA酶底物将足够，而在其他实施例中则需要独特的MNA酶底物来形成独特的DF，从而允许一些靶标中的每个的检测。
在一些情况中，多路化方法需要相异的或独特的MNA酶的形成，该MNA酶将协助该方法的设计。在底物贴至一种或多种支持物上并且可以经由它们在该一种或多种支持物上的定位而被区分时，可以不需要相异的或独特的DF。这些设计特征将易于由本领域普通技术人员理解。在一些实施例中，这些方法允许在一个反应中各种不同类型的靶标（例如，核酸靶标和蛋白）的检测。
类似地，使用定向到多个靶标的多个SIO的反应将允许多个测定，该多个测定同时分析有待发展的多个靶标。在此方案或其他方案中，CESA可以由限制性内切酶或另一核酸酶切割从而协助信号放大。
仅通过非限制性实例的方式，可以使用多个MNA酶来检测多个靶标，该多个MNA酶修饰一系列的通用底物，每个底物的修饰导致相异的DF，该相异的DF将与相异的PESA装配以产生用于相异限制性内切酶的CESA，由此导致相异的可检测信号（例如不同的荧光）。
用于多路EzyAmp系统的示例性策略展示于图13中，其中各种相异的起始物驱动片段是使用具有不同靶标特异性的一系列三种MNA酶以靶标特异性方式产生。产生的每个不同的DF结合至相异的PESA复合体，每个相异的PESA复合体包含相异的荧光团。这样形成的三个CESA复合体可以由核酸酶切割，在每种情况中，经由三个不同的荧光团产生相异的信号。图25示出了多路分析的结果，其中两个EzyAmp反应同时发生在单个试管中并且以此方式被独立地监测。
将理解，如上所述的从不同靶标的识别起发的相异信号可以独立地以同时或基本上同时的方式被放大。例如，从相异靶标的检测产生的、并且与相异起始物驱动片段形成的CESA复合体可以各自并入单独的线性和/或反馈级联反应中从而放大每个相异信号，例如，使用在以上小节2.2.2和/或2.2.3中所述的方法。线性和/或反馈级联反应可以一起运行用于不同信号的独立放大。
还可以使用本发明的方法同时或基本上同时地检测在靶标内的多个区域。在此类情况中，一系列相异或相同的起始驱动片段可以产生自一系列基于在给定靶标内的不同区域的靶标识别事件。例如，对靶标内的不同区域具有特异性的多个不同的MNA酶可以用于此目的。MNA酶可以使用单个通用底物以产生多个拷贝的单类型DF，每个拷贝结合至单个类型的PESA，形成一系列相同的CESA，从而产生相同的可检测效应。可替代地，MNA酶可以催化地修饰一系列不同的通用底物，每个底物的修饰导致相异的DF，该相异的DF将与相异的PESA装配从而产生相异的CESA，产生相异的可检测信号。
2.2.4使用不可溶的和固体的支持物的方法
还应理解的是总体上本发明的方法（不论是多路还是非多路）在溶液、或与不可溶的支持物或固体支持物的组合中是可应用的，包括例如以下项的一种或多种分析组分结合、附着或拴系在这种支持物上：MNA酶底物、部分酶、PESA、CESA、EAS、DF、EIC、InF、SIO、限制性内切酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、适体、发夹根据核苷酸、MNA酶装配促进物、和/或靶标。被提供了在此所讨论的方法以及变体的技术人员将大体上理解此类系统的特征。因此，本发明不应被认为限制于在此的文字传授，而是能够在与在此提供的传授的原则和范围以及本领域的知识一致的情况下被修饰和改变。
优选地，支持物是一种不可溶的材料，或一种保持底物并且使其免于游离地在反应混合物本体中移动的基质。此类用于固定化或定位底物（包括核酸寡聚核苷酸）的支持物在本领域中是已知的。技术人员将理解支持物可以选自多种多样的基质、聚合物、以及处于各种形式的类似物（包括用于微分析用途的珠粒以及与反应条件相容的其他材料）。在某些优选实施例中，支持物可以是塑料材料（例如塑料珠粒或晶片），或者在其中进行特定分析的孔或试管的那种。在某些实施例中，支持物可以是微载体或纳米载体。在某些实施例中，支持物可以被编码。
例如，考虑了用于使用锚定至支持物的MNA酶、MNA酶底物、CESA、和/或PESA来检测靶标的方法。在一个优选实施例中，PESA优选附接至支持物。在另一个优选实施例中，SIO附接至支持物。PESA或其组分到支持物的附着被设计为使得在驱动片段与PESA装配以及随后由限制性内切酶对用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的CESA进行切割时，荧光团被释放进入反应混合物本体中，远离仍然附接至支持物的淬灭剂。因此，由于淬灭剂部分和可检测部分在切割时分离，可检测信号极大地增加。在替代实施例中，包含荧光团的可检测部分可以在切割后依然附着。这允许在支持物上的信号定位。在某些实例中，应考虑的是荧光团可以是游离于溶液中的。
在某些实施例中，可以将反应建立为发生在溶液中和/或可以包含附接至固体支持物的一种或多种组分。在图20中展示的反应示出了对于一种使用拴系组分的分析的示例性图解。在此图中，站1被描绘为具有拴系的寡聚核苷酸，该拴系的寡聚核苷酸当以靶标依赖性的方式被切割时（步骤1）将释放第一DF（条纹线）。这个DF可以进而迁移至在站2处的拴系的PESA A，并且与此杂交以形成CESA A（步骤2）。CESA A的切割（步骤3）将释放一个第二驱动片段（实心黑线），该第二驱动片段可以迁移至站3处的PESAB。当该第二DF与PESA B杂交时，CESA B可以形成（步骤4）。CESA B的切割将导致等同于第一DF（条纹线）的序列的释放。第一DF可以进而迁移至站2（步骤5），并且形成更多的CESA A，该CESA A可以被切割以释放更多第二DF。以此方式，可以启动一个级联反应，因此允许CESA连续的形成和切割（步骤3、4和5）。在每个PESA是用荧光团（F）和淬灭剂（Q）标记的分析中，在这些部分之间的切割可以产生荧光信号。例如如果荧光团和淬灭剂的位置是反向的，此信号可以保留在固体表面2或3上（如展示的）或者可以释放于溶液中。
这些站可以是分开的腔室或它们可以是例如在分开的固体表面上（例如在芯片或微载体上）。此策略将增加在发展EzyAmp级联反应中有用的限制性内切酶的数目。在此情况中，唯一的要求将是：由靶标依赖性切割产生的驱动片段完成RE的识别和切割所需的序列。该情况将不再具有以下要求：在它的靶标依赖性切割之前RE被包含驱动片段的全长寡聚核苷酸抑制。该未切割的较长片段现在将物理地与PESA分开，并且仅可以在以靶标依赖性方式的切割之后与PESA接触。因此，不被PESA片段接合处的额外序列的存在抑制的RE以及靶标特异性片段可以用于EzyAmp分析中以创造级联反应。
2.2.5.适体
本领域普通技术人员将易于理解的是在此所述的方法可以用适体执行，其中所述适体可以协助靶标（包括不是核酸的靶标）的检测、鉴别和/或定量。适用于在本发明的方法中使用的适体的非限制性实例包括在以上小节1.8中所述的那些。
例如，考虑了使用MNA酶和限制性内切酶来检测靶标（包括非核酸实体）的方法。本领域的普通技术人员将理解适体可以并入任何MNA酶组分中。此外将理解的是多个适体可以并入一种或多种部分酶寡聚核苷酸组分中。
在靶标不被需要用于MNA酶装配的实施例中，适体可以并入装配促进物中。还设想了相关的策略，其中适体序列以一种构型被并入部分酶的末端（适体部分酶），由此只有在靶标的存在下活性MNA酶才形成。这样的检测策略所需要的寡聚核苷酸组分包括：标准部分酶；适体部分酶，它是具有并入其一个末端中的适体的部分酶；装配促进物，它结合至适体部分酶和部分酶两者，使得活性MNA酶能够装配（在靶标存在下）；MNA酶底物；以及装配抑制物，它与适体部分酶在跨越适体序列的至少部分以及部分酶序列的底物结合臂的部分的区域内杂交。在靶标的不存在下，装配抑制物结合至适体部分酶，因此阻断MNA酶底物的结合（以及切割）。在靶标的存在下，靶标结合至适体部分酶的适体序列，防止装配抑制物的结合并且允许MNA酶底物的结合和切割。正因如此，活性MNA酶可以仅在靶标的存在下形成并产生荧光信号生成。
本领域普通技术人员将理解，在以上策略中，抑制物序列可以是单独的分子或可以并入参与MNA酶复合体的组分的一个中。还将理解的是一种或多种适体可以并入任何寡聚核苷酸组分（包括部分酶、装配促进物或底物）中。另外，适体可以并入这些寡聚核苷酸的任一个的任一端中。
2.2.6.方法的优化
技术人员将易于理解的是在此所述的方法可以使用多种实验参数来优化，以便优化靶标的检测、鉴别和/或定量。被优化的特定的实验参数以及这种优化的水平，将取决于即将采用的方法以及被探索来检测、鉴别和/或定量的具体靶标。此类参数包括但不限于时间、温度、pH、盐浓度、寡聚核苷酸浓度、缓冲液类型和浓度、限制性内切酶辅因子的浓度、洗涤剂、阳离子以及其他试剂，包括但不限于二甲亚砜（DMSO）、EDTA、ATP、甘油，互补性的长度、MNA酶和/或CESA的核酸组分的GC含量以及熔点（Tm）。
在一些实施例中，例如，涉及特定核酸序列检测的那些方法中，实验参数（优选包括执行方法的温度）可以被优化，以便在MNA酶组分到包含或不包含序列变异的靶标核酸的结合之间进行辨别。此类方法可以执行的温度可以是处于约20°C至约96°C、约20°C至约75°C、约20°C至约60°C、或约20°C至约55°C的范围内。
在一个优选实施例中，提供了优化的用于实践在此所述的方法的反应。在此类优化的反应中，检测信号是按超过以上未优化反应的高达10%、20%、或30%而增加。更优选的反应条件提高至少35%、或40%、并且优选高达50%或更多的检测信号。在仍然更优选的实施例中，优化的反应具有增加了多于50%、并且高达66%、75%或甚至100%的催化活性。在又更优选的实施例中，完全优化的反应方法将提供信号检测中的100%、200%或甚至300%或更多的增加。其他优选反应条件可以提高催化活性超过用未优化反应条件实践的方法高达1000%或更多。用于优化在此提供的方法的非常优选的反应条件是某些二价阳离子的包含。大多数核酸酶和蛋白酶的催化活性可以按浓度依赖性形式受二价阳离子的浓度的影响。优选地，优化的反应对于Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、和Pb2+的一个或多个进行优化。
2.2.7方法的应用
本领域普通人员将认识到MNA酶、CESA以及限制性内切酶可以用于宽范围应用领域的靶标的检测、鉴别或定量策略中。这些领域包括但不限于医学、兽医学、农业、食品技术、质量控制、环境测试、生命科学研究、法医学、鉴别测试、成像、以及生物恐怖主义应用。
医学应用的非限制性实例是具体疾病或病症或者发展这样一种疾病或病症的风险的诊断、和/或获得疾病或病症的预后。
对于生物应用，将理解的是尽管不排除可能性，仍对要在活体动物或人的身体上进行的本发明的方法没有特定的要求，并且这些方法可以在体外（invitro）/离体（ex vivo）进行。例如，这些方法可以在预先从受试者分离的生物样品（例如血液或组织样品）上、细胞或核酸（包括此类细胞和核酸的冷冻样品、石蜡包埋的样品）上、以及经培养的细胞上进行。
还将容易清楚的是，在此所述的方法可以用于检测、鉴别和/或定量溶液中的靶标。例如，涉及使用单一底物来检测、鉴别和/或定量单一靶标的策略可应用到这种检测中。在一些实施例中，这可以涉及通用底物的使用。
现在将参照以下具体实例来更详细地进一步描述本发明，这些实例不应以任何方式构成对本发明范围的限制。
实例
实例1
以下实例证明了寡聚核苷酸形成由核酸酶可切割亦或不可切割的不同双链体结构的能力。由核酸酶可切割的结构是双链体底物，例如CESA复合体，并且在此实例中的核酸酶是一种限制性内切酶（RE）。
1.1.寡聚核苷酸
对于以下反应，将寡聚核苷酸片段合并并且测试它们形成可切割双链体结构的能力。示例性结构展示于图3中。在此实例中，双链体包括这样一条链：该链包含形成酶Mnl I的双链限制性内切酶识别位点（RERS）的一条链所需要的所有核苷酸。
RE切割活性是通过双重标记的DNA复合体的切割来监测。在当前实例中，酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1）在5’端处用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及3’端处用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行了末端标记，并且被指定为EAS1-5(23)-BF。第二酶放大器底物寡聚核苷酸EAS2（指定为EAS2-5(16)-B）也是在5’端处用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行了末端标记，并且与EAS1-5(23)-BF退火从而产生PESA。在530nm（FAM发射波长）、伴随485nm（FAM激发波长）激发来监测RE对完全装配的可切割双链体结构（称为全酶信号放大器（CESA）复合体）的切割。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加粗和加下划线形式的碱基形成Mnl I的识别序列的至少部分。贡献于此酶识别序列的碱基加了下划线，并且是顶部链5’NNCCTCN7/3’和底部链3’NNGGAGN6/5’，其中/指示切割位点。对于抑制片段（Sub1(8:9)-TRB2）和DF共同区域用了斜体和下划线。大写字母指示DNA，而小写字母指示RNA。
EAS1-5(23)-BF（EAS1；图3）
CTCTT
Figure BDA00003457832001471
GTCTTCACATCCTA
EAS2-5(16)-B（EAS2；图3）
TAGGATGTGAAGAC
Figure BDA00003457832001472
Sub1(8:9)-TRB2（InF；图3）
CTCACTATa
Figure BDA00003457832001473
DF1（DF；图3）
Figure BDA00003457832001474
1.4.反应组分
反应A、B、C和D被建立为包含如在表6中列出的以下寡聚核苷酸片段，参照在图3中展示的寡聚核苷酸和结构。
表6：用于可切割和不可切割结构的组分
Figure BDA00003457832001481
CESA的由EAS1、EAS2和DF的形成是通过荧光信号的增加来测量，该荧光信号的增加是由于荧光标记的EAS1（EAS1-5(23)-BF）被RE（10UMnl I）的切割导致的。所有的反应A、B、C和D是在37°C在System热循环仪（Cepheid）中进行的，并且所有反应的总体积是25μL。每36秒对每个反应的荧光进行读取，持续总计60分钟。所有的反应包含在1XBSA中的100nM的EAS1-5(23)-BF（新英格兰生物实验室（New EnglandBiolabs））、1.25x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室（New EnglandBiolabs））以及10个单位的Mnl I。除此之外，反应A包含100nM的EAS2-5(16)-B和100nM DF1，反应B包含100nM的EAS2-5(16)-B和100nMSub1(8:9)-TRB2，反应C包含100nM的EAS2-5(16)-B而反应D仅包含EAS1。
1.5.结果：RE切割的检测
在反应A中，EAS1(EAS1-5(23)-BF)、EAS2-5(16)-B以及DF1的添加导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA双链体底物的形成，如由FAM荧光随着时间推移而增加所指示的（图14A；+RE）。此观察与限制性内切酶识别并切割包含断口或切口的双链复合体的能力一致，这些断口或切口在RE识别和切割所需区域内的两条链的至少一条中。换言之，可切割的双链底物不必要从两条未断裂的连续互补链形成，而是可以由形成互补双链体的多个寡聚核苷酸构成。
相反，在反应B中，缺少DF1片段但包含Sub-1(8:9)-TRB2，形成的双链体不被切割是因为Sub-1(8:9)-TRB2起着InF的作用，并且因此荧光随着时间的推移没有增加（图14B；+RE）。尽管存在Sub1(8:9)-TRB2包含DF1的整个序列的事实，这仍发生。存在于Inf Sub1(8:9)-TRB2中的序列（该序列对于也存在于DF中的那个特异序列是额外的）抑制了可切割双链体底物的形成。确实，额外序列导致不可切割复合体（称为酶抑制复合体（EIC））的形成。
在反应C中，反应仅包含EAS1-5(23)-BF和EAS2-5(16)-B并且缺少DF1和Sub1(8:9)-TRB2两者，没有观察到荧光的增加，指示单独的这两个寡聚核苷酸（EAS1和EAS2）对于RE对双链体的识别和切割是不够的（图14C；+RE）。寡聚核苷酸EAS1和EAS2杂交以形成部分酶信号放大器（PESA）复合体，然而，需要额外的寡聚核苷酸即DF来将不可切割的PESA转化为可切割的CESA。
最后，在对照反应D中，随着时间的推移没有观察到荧光的增加，该反应仅包含EAS1，指示尽管存在此结构包含Mnl I识别序列的一条链，此结构仍不能易于切割。切割不能发生，因为需要互补的序列来形成使EAS1并入的可切割的双链体。
实例2
以下实例是基于使用多个寡聚核苷酸片段来创造CESA中的限制性内切酶识别位点，这导致荧光标记的寡聚核苷酸的切割，引起核酸酶（限制性内切酶）介导的信号放大。核酸酶切割导致信号放大的反应称为EzyAmp反应。
2.1.EzyAmp寡聚核苷酸
对于EzyAmp反应，需要两个寡聚核苷酸EAS1和EAS2与驱动片段组合来形成限制性内切酶识别位点。在此实例中，EzyAmp系统1用来形成酶Mn1I的限制性内切酶识别位点（RERS）。EzyAmp系统1（EzyAmp1）是由酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1-1(20)-JB）、酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2-1(13)）以及驱动片段1（DF1）组成，该驱动片段1是通过MNA酶底物Sub1（Sub1(8:9)–FB）的切割创造的。该策略展示于图5中。
EzyAmp活性是通过双重标记的片段的切割来监测。在当前实例中，EAS1（EAS1-1(20)-JB）在5’端用JOE部分以及在3’端黑洞淬灭剂1（“BHQ1”）部分进行了末端标记。EAS2（EAS2-1(13)）与EAS1-1(20)-JB退火。在548nm（JOE发射波长）、伴随520nm（JOE激发波长）激发来监测完全装配的CESA的RE切割。这些寡聚核苷酸的序列从5’至3’在下文列出，其中加下划线的碱基形成Mn1I的识别序列的至少部分（顶部链5’NNCCTCN7/3’和底部链3’NNGGAGN6/5’）。
EzyAmp系统1-EAS1；EAS1-1(20)-JB：
CTCTTCCTCAGCAGTTCATC
EzyAmp系统1-EAS2；EAS2-1(13)：
GATGAACTGCTGA
2.2.部分酶寡聚核苷酸和装配促进物
为了创造驱动片段1（DF1），MNA酶底物Sub1(8:9)-FB是由催化活性的MNA酶切割，该MNA酶在合成靶标（即装配促进物AF-PD1）的存在下形成。装配促进物以及部分酶A和B的序列从5’到3’在下文列出，其中加下 划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标装配促进物杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A PD1A2/1(8)：
Figure BDA00003457832001511
CGGTCGAAATAGTGAG
部分酶B PD1B3/1(9)：
ATCTCTTCTCCGAGC
Figure BDA00003457832001512
靶标装配促进物AF-PD1：
GCCATTGTCGTACACCTGCTGGATGAGGAGC
2.3.MNA酶底物
MNA酶活性是通过双重标记的核酸报道物MNA酶底物（Sub1(8:9)-FB）的切割来监测。MNA酶底物序列是包含RNA和DNA碱基两者的嵌合序列，其中较长的形式已经在先前用作8:17DNA酶底物（Li（李）等人，2000）。在当前实例中，报道物MNA酶底物被指定为Sub1(8:9)-FB，并且在5’端是用6-羧基荧光素（“6-FAM”）部分以及在3’端用黑洞淬灭剂1（“BHQ1”）部分进行末端标记。在530nm（FAM发射波长）、伴随485nm（FAM激发波长）激发时监测由MNA酶对Sub1(8:9)-FB的切割。Sub1(8:9)-FB的标记序列是如下，5’到3’。小写碱基表示RNA，而大写碱基表示DNA。斜体碱基对应于在切割后起着DF作用的部分。
Sub1(8:9)–FB：
CTCACTATaGGAAGAGAT
2.4.反应组分
CESA由EAS1、EAS2和驱动片段的形成是通过荧光信号的增加来测量，该荧光信号的增加是由RE（20U Mn1I；新英格兰生物实验室（NewEngland Biolabs））对荧光标记的EAS1-1(20)-JB的切割导致的。测试反应是通过20nM靶标装配促进物AF-PD1的添加启动的，并且对照反应是通过H2O的添加启动的。所有的反应是在35°C在
Figure BDA00003457832001521
System热循环仪（Cepheid）中进行的，并且所有反应的总体积是25μL。在对应地监测FAM和JOE的通道1（FAM）和通道2（Cy3）中，每72秒读取每个反应的荧光，持续总计120分钟。所有的反应包含以下项的散装混合物：在50mMMgCl2（Ambion）中的50nM的部分酶A（PD1A2/1(8)）、50nM部分酶B（PD1B3/1(9)）、50nM Sub1(8:9)-FB、100nM EAS1-1(20)-JB、以及100nMEAS2-1(13)，1x BSA（新英格兰生物实验室（New England Biolabs））以及1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室（New England Biolabs））。
2.5.结果：EAS1的切割的检测
靶标装配促进物到测试反应的添加允许部分酶A和B装配成切割报道物MNA酶底物Sub1(8:9)-FB的催化活性的MNA酶，这导致(i)驱动片段DF1（DF1：GGAAGAGAT）的创造，以及(ii)可检测信号，该可检测信号在FAM通道中随着时间推移而增加并且可以被实时监测，指示MNA酶对Sub1(8:9)-FB的切割（图6(i)靶标AF-PD1）。DF可以进而结合至PESA复合体（由EAS1和EAS2形成），从而形成CESA复合体，该CESA复合体发挥由Mnl I切割的双链体底物的功能。这导致可检测信号，该可检测信号在JOE通道中随着时间推移而增加，指示RE对存在于CESA复合体内的EAS1的切割，这进而指示靶标AF-PD1的存在（图6(iii)靶标AF-PD1）。
在没有靶标的对照反应中，将装配促进物添加至混合物中，催化活性的MNA酶不形成并且因此报道物MNA酶底物Sub1(8:9)-FB不被切割，没有产生DF并且没有创造CESA。因此，随着时间推移，在FAM亦或JOE信号中没有增加的信号（图6(ii)和(iv)没有靶标的对照）。这指示需要MNA酶对Sub1(8:9)-FB的切割来提供DF以用于形成CESA。相反，在这些没有靶标的反应中，EIC是通过PESA和Sub1(8:9)-FB之间的杂交形成，该Sub1(8:9)-FB在其未切割状态中发挥InF的功能。
实例3
此实例提供了用于设计全酶信号放大器（CESA）复合体和关联的寡聚核苷酸的策略。
通过举例，适用于由基于8-17DNA酶的MNA酶进行切割的MNA酶底物可以具有以下序列；5’CTCACTATaGGAAGAGAT3’（其中大写指示DNA而小写指示RNA）。一旦在适当的装配促进物的存在下MNA酶进行了切割，此MNA酶底物产生两个片段，即CTCACTATa和GGAAGAGAT。在以下表中证明了如何使用3’寡聚核苷酸片段5’GGAAGAGAT3’（3’TAGAGAAGG5’）作为驱动片段来产生CESA复合体的实例。在以下实例这N是任何核苷酸而N’是它的互补核苷酸。EAS1的序列以及Sub1(8:9)的3’切割片段（参见下文）可以被稍作修改以提供许多不同的PESA、以及随后的CESA，被设计为与具有不同识别序列的一系列不同的限制性内切酶一起使用。
Figure BDA00003457832001531
寡聚核苷酸EAS1可以包含一些序列，其中限制性内切酶的限制识别位点例如在沿着以上所示的通用或一般EAS1序列的不同位置处开始。
通过举例，如果RE位点在位置6处开始，BsaW1的识别序列的（TCCGGA）可以并入EAS1、EAS2以及驱动片段中，如下文所展示，其中RER位点加下划线。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15+
EAS1 5’ … T C T C T T C C G G A N N N N…
EAS2 3’ C C T N’ N’ N’ N’
…
DF 3’ T A G A G A A G G
可替代地，如果RE位点在位置7处开始，Mnl1的识别序列的（CCTC）可以并入EAS1、EAS2以及驱动片段中，如下文所展示，其中RER位点加下划线。
Figure BDA00003457832001541
在一个另外的实例中，如果RE位点在位置8处开始，Ear1的识别序列的（CTCTTC）可以并入EAS1、EAS2以及驱动片段中，如下文所展示，其中RER位点加下划线。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15+
EAS1 5’ … T C T C T T C C T C T T C N N…
EAS2 3’ A G A A A N’ N’…
DF 3’ T A G A G A A G G
通过使用此一般策略，用于与此DF一起使用的候选RE将包括具有在其5’端有C亦或CC亦或TCC的识别序列的RE。正因如此，可以将在下表中的RE（与许多其他的一起）进行测试用于与此驱动片段一起使用。
酶 RERS的顶部链（5’到3’）
Aci I CCGC（-3/-1）
Acu I CTGAAG（16/14）
Afl II C/TTAAG
Alw NI CAGNNN/CTG
Ava I C/YCGRG
Avr II C/CTAGG
Bbv CI CCTCAGC（-5/-2）
Bcc I CCATC（4/5）
Bfa I C/TAG
Bmg BI CACGTC（-3/-3）
Bpm I CTGGAG（16/14）
Bpu EI CTTGAG（16/14）
Bsa WI W/CCGGW
Bsi EI CGRY/CG
酶 RERS的顶部链（5’到3’）
Bsi WI C/GTACG
Bsl I CCNNNNN/NNGG
Bsm BI CGTCTC（1/5）
Bso BI C/YCGRG
Bsp CNI CTCAG（9/7）
Bsp EI T/CCGGA
展示的其他实例示出了在与以上那些实例相反方向的相同驱动片段的使用。在这些情况中，候选RE可以具有以G或GG或GGA为末端的RERS。用于在此类系统中使用的EAS1、EAS2以及DF的一般序列如下：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
DF 5’ G G A A G A G A T
EAS2 5’ N’ N’ N’ N’ N’ N’
EAS1 3’ N N N N N N C C T T C N N N
通过举例，如果RE位点在位置4处开始，BstU1的RERS（CGCG）可以并入EAS1、EAS2以及驱动片段中，如下文所展示，其中该位点加下划线。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
DF 5’ G G A A G A G A T
EAS2 5’ N’ N’ N’ C G C
EAS1 3’ N N N G C G C C T T C N N N
可以与任何特定DF一起使用的有用限制性内切酶的范围可以通过利用一些RE对额外序列（有待存在以允许切割的5’亦或3’的识别序列）的要求来延伸。
实例4
以下实例是基于使用多个寡聚核苷酸片段来创造CESA中的限制性内切酶识别位点，这导致荧光标记的寡聚核苷酸的切割，引起核酸酶（限制性内切酶）介导的信号放大。核酸酶切割导致信号放大的反应称为EzyAmp反应。
4.1.EzyAmp寡聚核苷酸
对于EzyAmp反应，需要两个寡聚核苷酸EAS1和EAS2与驱动片段组合来形成限制性内切酶识别位点。在此实例中，EzyAmp系统1用来形成酶Mn1I的限制性内切酶识别位点（RERS）。EzyAmp系统1（EzyAmp1）是由酶放大器底物寡聚核苷酸1（EAS1-1(20)）、酶放大器底物寡聚核苷酸2（EAS2-1(13)）以及驱动片段1（DF1）组成，该驱动片段1是通过MNA酶底物Sub1的切割创造的。该策略展示于图5中。
EzyAmp活性是通过双重标记的片段的切割来监测。在当前实例中，EAS1（EAS1-1(20)-BJ）在5’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用JOE部分进行了末端标记。EAS2（EAS2-1(13)）是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）末端标记并且与EAS1-1(20)-BJ退火。在548nm（JOE发射波长）、伴随520nm（JOE激发波长）激发来监测完全装配的CESA的RE切割。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mn1I的识别序列的至少部分（CCTC）。
EzyAmp系统1a EAS1；EAS1-1(20)-BJa：
CTCTTCCTCAGCAGTTCATT
EzyAmp系统1a EAS2；EAS2-1(13)-Ba：
AATGAACTGCTGA
4.2.部分酶寡聚核苷酸和装配促进物
为了创造驱动片段1（DF1），MNA酶底物Sub1(8:9)-TRB2是由催化活性的MNA酶切割，该MNA酶在合成靶标（即装配促进物AF-PD1）的存在下形成。装配促进物以及部分酶A和B的序列从5’到3’在下文列出，其中加 下划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A PD1A2/1(8)：
Figure BDA00003457832001561
CGGTCGAAATAGTGAG
部分酶B PD1B3/1(9)：
ATCTCTTCTCCGAGC
Figure BDA00003457832001571
靶标装配促进物AF-PD1：
GCCATTGTCGTACACCTGCTGGATGAGGAGC
4.3.MNA酶底物
MNA酶活性是通过双重标记的核酸报道物MNA酶底物（Sub1(8:9)-TRB2）的切割来监测。MNA酶底物序列是包含RNA和DNA碱基两者的嵌合序列，其中较长的形式已经在先前用作8:17DNA酶底物（Li（李）等人，2000）。在当前实例中，报道物MNA酶底物被指定为Sub1(8:9)-TRB2，并且在5’端是用磺酰罗丹明（“TXR”）部分以及在3’端用黑洞淬灭剂2（“BHQ2”）部分进行末端标记。在617nm（TXR发射波长）、伴随598nm（TXR激发波长）激发时监测由MNA酶对Sub1(8:9)-TRB2的切割。Sub1(8:9)-TRB2的标记序列是如下，5’到3’。小写碱基表示RNA，而大写碱基表示DNA。斜体的碱基对应于可以起DF作用的部分。
Sub1(8:9)–TRB2：
CTCACTATaGGAAGAGAT
4.4.反应组分
CESA由EAS1、EAS2和驱动片段的形成是通过荧光信号的增加来测量，该荧光信号的增加是由RE（Mn1I）对荧光标记的EAS1-1(20)-BJ的切割导致的。通过添加10U Mnl I（新英格兰生物实验室）来启动反应。所有的反应是在35°C在
Figure BDA00003457832001572
System热循环仪（Cepheid）中进行的，并且所有反应的总体积是25μL。每72秒对每个反应的荧光进行读取，持续总计120分钟。所有的反应包含以下项的散装混合物：在50mM MgCl2（Ambion）中的50nM部分酶A（PD1A2/1(8)）、50nM部分酶B（PD1B3/1(9)）、100nM Sub1(8:9)-TRB2、100nM EAS1-1(20)-BJ以及100nM EAS2-1(13)-B，1x BSA（新英格兰生物实验室）以及1.2x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）。除此之外，测试反应包含20nM靶标装配促进物（AF-PD1），并且对照反应包含H2O。
4.5.结果:EAS1的切割的检测
靶标装配促进物到测试反应的添加允许部分酶A和B装配为切割报道物MNA酶底物Sub1(8:9)-TRB2的催化活性的MNA酶，这导致(i)驱动片段DF1（DF1：GGAAGAGAT）的创造，以及(ii)可检测信号，该可检测信号随着时间推移而增加并且可以在TXR通道中被实时监测，指示MNA酶对Sub1(8:9)-TRB2的切割。DF可以进而结合至PESA复合体（由EAS1和EAS2形成），从而形成CESA复合体，该CESA复合体发挥由Mnl I切割的双链体底物的功能。这导致可检测信号，该可检测信号在JOE通道中随着时间推移而增加，指示RE对存在于CESA复合体内的EAS1的切割，这进而指示靶标AF-PD1的存在（图12）。
在没有靶标的对照反应中，将装配促进物添加至混合物中，催化活性的MNA酶不形成并且因此报道物MNA酶底物Sub1(8:9)-TRB2不被切割，没有产生DF并且没有创造CESA。因此在TXR亦或JOE通道中的信号没有随着时间推移而增加（图12）。这指示需要MNA酶对Sub1(8:9)-TRB2的切割来提供DF以用于形成CESA。相反，在此反应中，EIC是通过PESA和Sub1(8:9)-TRB2之间的杂交形成，该Sub1(8:9)-TRB2在其未切割状态中发挥InF的功能。
实例5
以下实例证明了Mnl I的下述能力：(i)容许在识别序列的特定碱基毗邻处或之内的不同点处的切口，(ii)容许毗邻于识别序列中的特定碱基的非互补碱基，(iii)容许在识别序列与切割位点之间的非互补碱基以及(iv)容许在识别序列毗邻处或之内的核糖核苷酸的存在。
5.1.寡聚核苷酸
5.1.1反应1：DF结合导致切口，该切口刚好毗邻于RERS“GAGG”的3’端
在以下反应中，PESA是由EAS1（EAS1_10_2）和EAS2（EAS2_11_2(16)）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1退火，并且在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS2在其3’端包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’。DF（DF1(8)）被设计为与EAS1杂交，该DF作为刚好在EAS2中的部分Mnl I识别序列5’GAGG3’前面的3’序列（表4B）。DF不包含Mnl I识别序列的任何部分。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
EAS1_10_2（EAS1）
CATCTCTTCCTCAGAGCCTGACTT
EAS2_11_2(16)（EAS2）
AAGTCAGGTGCTGAGG
DF1(8)（DF）
AAGAGATG
5.1.2反应2：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的3’端内一个碱基处。
在以下反应中，PESA是由EAS1（EAS1_10_2）和EAS2（EAS2_11_2(15)）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1退火，并且在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS2在其3’端包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GAG3’）。DF（DF1(9)）被设计为在毗邻于EAS2处与EAS1杂交。DF包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（3’G），通过添加从EAS2丢失的一个碱基完成了该5’GAGG3’（表4C）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
EAS1_10_2（EAS1）
CATCTCTTCCTCAGAGCCTGACTT
EAS2_11_2(15)（EAS2）
AAGTCAGGTGCTGAG
DF1(9)（DF）
GAAGAGATG
5.1.3反应3：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的3’端内两个碱基处。
在以下反应中，PESA是由EAS1（EAS1_10）和EAS2（EAS2_11）组成。
EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1退火，并且在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS2的3’端包含部分Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GA3’）。DF（DF1）被设计为在毗邻于EAS2处在EAS1上杂交，并且包含部分Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GG3’），通过添加从EAS2丢失的两个碱基（GG）完成了该5’GAGG3’（表4D）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
EAS1_10（EAS1）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2）
AATCAGGTGCTGA
DF1（DF）
GGAAGAGAT
5.1.4反应4：DF结合导致切口和核糖核苷酸碱基，该核糖核苷酸碱基在部分RERS“GAGG”内两个碱基处。
在以下反应中，PESA是由EAS1（Re1F1(20T)(20)-BJ）和EAS2（Re1S1(1A)(13)-5-B）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用Joe_N（“JOE”）部分进行标记，并且包含部分的MnlI识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1退火，并且在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS2包含部分Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GA3’）。DF（rRe1S1(9)-3）被设计为在毗邻于EAS2处与EAS1退火。DF的5’端包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GG3’），通过添加从EAS2丢失的两个碱基完成了该5’GAGG3’。DF还包含核糖核苷酸（Gg）从而将一个核糖核苷酸引入识别序列中（表4E）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列，并且该核糖核苷酸碱基指示为小写的g。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
Re1F1(20)-BJ（EAS1）
CTCTTCCTCAGCAGTTCATT
Re1S1(13)-5-B（EAS2）
AATGAACTGCTGA
rRe1S1(9)-3（DF）
gGAAGAGAT
5.1.5反应5：DF结合导致切口，该切口在部分RERS GAGG的3’端内三个碱基处。
在以下反应中，PESA是由EAS1（EAS1_10_2）和EAS2（EAS2_11_2(13)）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1退火，并且在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS2在其3’端包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’的片段（5’G3’）。DF（DF1(11)）被设计为在毗邻于EAS2处与EAS1杂交。DF的5’端包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’的一个片段（5’GGA3’），通过添加从EAS2丢失的三个碱基完成了该5’GAGG3’（表4F）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
EAS1_10_2（EAS1）
CATCTCTTCCTCAGAGCCTGACTT
EAS2_11_2(13)（EAS2）
AAGTCAGGTGCTG
DF1(11)（DF）
AGGAAGAGATG
5.1.6反应6：DF结合导致切口，该切口刚好毗邻于RERS“GAGG”的5’端。
DF形成识别和切割序列的部分。在以下反应中，PESA是由EAS1（MnlI/DFS_F1-BF）和EAS2（Mnl I/DFS_F2）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1杂交。EAS2的5’端包含部分Mnl I识别序列5’GAGG3’。DF（Mnl I/DFS_DF）被设计为与EAS1退火，该DF作为EAS2中5’-GAGG3’Mnl I识别位点的刚好上游处的5’序列。DF不包含Mnl I识别序列的任何部分，但是包含切割位点（表4G）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
Mnl I/DFS_F1-BF（EAS1）
TCCGCAGCCTCCCTTCTCTAC
Mnl I/DFS_F2（EAS2）
GAGGCTGCGGA
Mnl I/DFS_DF（DF）
GTAGAGAAGG
5.1.7反应7：DF结合导致切口，该切口在部分RERS GAGG的5’端的上游2个碱基处。DF形成切割位点的部分。
在以下反应中，PESA是由EAS1（Mnl IDFS_F1-BF）和EAS2（MnlI/DFS_F2(13)）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分、以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）进行标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’。EAS2被设计为与EAS1杂交并且包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’加此序列5’的两个额外碱基。DF（Mnl I/DFS_DF(8)）被设计为在从EAS2的5’端上游两个碱基处与EAS1杂交。.此DF不包含Mnl I识别序列的任何部分，但是包含切割位点（表4H）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
Mnl I/DFS_F1-BF（EAS1）
TCCGCAGCCTCCCTTCTCTAC
Mnl I/DFS_F2(13)（EAS2）
GGGAGGCTGCGGA
Mnl I/DFS_DF(8)（DF）
GTAGAGAA
5.1.8反应8：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“CCTC”的5’端内两个碱基处。
在以下反应中，PESA是由EAS1（EAS1_28）和EAS2（EAS2_27）组成。EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记，并且包含部分的Mnl I识别序列5’GAGG3’。EAS2被设计为与EAS1杂交，并且在3’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分标记。EAS2包含部分Mnl I识别序列5’CCTC3’的片段（5’TC3’）。EAS2被设计为在识别序列与切割位点之间创造单一的非互补碱基对。DF（DF-3EAS2_26）被设计为与EAS1杂交，并且包含部分Mnl I识别序列5’CCTC3’的一个片段（5’CC3’），通过添加从EAS2丢失的两个碱基完成了该5’CCTC3’（表4I）。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成至少部分的用于Mnl I的识别序列。贡献至Mnl I识别序列的碱基是5’CCTC(N)7/3’和3’GAGG(N)6/5’，其中/指示切割位点。
EAS1_28（EAS1）
TGGTTGAGCAGAGAGGGATCATC
EAS2_27（EAS2）
TCTCTGCTCAACCA
DF-3EAS2_26
GATGATCCC
5.2反应组分
由EAS1、EAS2以及DF组成的候选CESA被RE Mnl I的切割是通过测量响应荧光团与淬灭剂部分的分离而产生的荧光信号的变化来监测的。测试反应是由100nm的DF起始，并且对照反应是由水的添加来起始（对照反应不包含任何DF）。反应是在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的，并且反应的总体积是25μL。反应重复进行两次。所有的寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。反应各自包含100nM的EAS1、100mM的EAS2、1x BSA（新英格兰生物实验室）、1xNE缓冲液4（新英格兰生物实验室）以及核酸酶游离水（Ambion）。在各个反应之间的变量列于表7中。
表7：实例5中的实验的反应条件中的变量
Figure BDA00003457832001651
5.3结果：CESA的切割的检测
DF添加至测试反应中允许DF结合至PESA复合体（由EAS1和EAS2形成）。这形成了包含RE Mnl I的全部限制性位点的CESA复合体。荧光信号的增加指示候选CESA复合体的切割。
5.3.1：DF结合导致切口，该切口刚好毗邻于RERS“GAGG”的3’端。
DF添加至反应1中导致随着时间推移而增加的荧光（图15.1(i)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF结合形成一个刚好毗邻于Mnl I RERS5’GAGG3’的3’端的切口时形成。在此实例中，PESA包含整个RERS、以及切割位点，并且因此还被Mnl I切割，即使是以较低的效率。正因如此，在DF的不存在下，荧光仍然增加，但与包含DF的反应相比是以较低的速率增加（图15.1(ii)）。
5.3.2：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的3’端内一个碱基处。
DF添加至反应2中导致随着时间推移而增加的荧光（图15.2(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到信号随着时间的推移而增加（图15.2(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF通过提供PESA内的此序列的最后一个3’碱基（G）来完成5’GAGG3’部分Mnl I识别序列时形成。
5.3.3：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的3’端内两个碱基处。
DF添加至反应3中导致随着时间推移而增加的荧光（图15.3(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到信号随着时间的推移而增加（图15.3(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF通过提供PESA内的此序列的最后两个3’碱基（GG）来完成5’GAGG3’部分Mnl I识别序列时形成。
5.3.4：DF结合导致切口和一个核糖核苷酸碱基，该核糖核苷酸碱基在部分RERS“GAGG”内两个碱基处。
DF添加至反应4中导致随着时间推移而增加的荧光（图15.4(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到信号随着时间的推移而增加（图15.4(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF通过提供PESA内的此序列的最后两个3’碱基（GG）来完成5’GAGG3’部分Mnl I识别序列时、甚至该第二碱基是核糖核苷酸（Gg）时形成。
5.3.5：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的3’端内三个碱基处。
DF添加至反应5中导致随着时间推移而增加的荧光（图15.5(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到信号随着时间的推移而增加（图15.5(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF通过提供PESA内的此序列的最后三个3’碱基（GGA）来完成5’GAGG3’部分Mnl I识别序列时形成。
5.3.6：DF结合导致切口，该切口刚好毗邻于RERS“GAGG”的5’端。
DF形成识别和切割序列的部分。在DF的存在（图15.6(i)）或不存在（图15.6(ii)）下，随着时间的推移荧光没有增加，指示在DF刚好在部分Mnl I识别序列5’GAGG3’的上游处结合至EAS1的3’端时，没有可切割的CESA形成。DF的添加似乎对PESA具有淬灭作用，可能是由于DF与EAS1的杂交引入了更不灵活的并且更好地淬灭的结构。
5.3.7：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“GAGG”的5’端的上游2个碱基处。
DF形成识别和切割序列的部分。在反应7中，DF的添加导致随着时间推移而增加的荧光（图15.7(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到信号随着时间的推移而增加（图15.7(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF结合至在PESA内的5’GAGG3’部分Mnl I识别位点上游两个碱基处的序列时形成。
5.3.8：DF结合导致切口，该切口在部分RERS“CCTC”的5’端内两个碱基处。
在反应8中，DF的添加导致随着时间推移而增加的荧光（图15.8(i)）。相反，在没有添加DF时没有观察到随着时间推移的信号增加的增加（图15.8(ii)）。这指示由Mnl I可切割的CESA可以在DF通过来自5’端的两个核碱基（CC）来完成部分的Mnl I识别序列5’CCTC3’时形成。
总体来说，来自反应1至8的结果证明了：在本领域普通技术人员如何能设计PESA和对应的DF使得它们产生可切割的CESA结构中存在相当大的灵活性。特别注意的是将核糖核苷酸包括在可以将PESA转化为CESA的DF中的能力（图15.4(i)）。使用包含核糖核苷酸的DF的能力延伸了使用各种MNA酶来启动EzyAmp反应的能力。在使用从10:23DNA酶衍生的MNA酶从而以靶标特异性方式切割底物以直接产生一种或多种DF的形式中，两个经切割的片段将在它们的经切割末端处均包含核糖核苷酸。这些切割的片段将作为EzyAmp反应中的DF是有用的，这是由于核糖核苷酸可以被容许在RERS内。
实例6
以下实例证明了寡聚核苷酸形成由特定酶可切割亦或不可切割的不同双链体结构的能力。由核酸酶可切割的结构是双链体底物，例如CESA复合体，并且在此实例中的核酸酶是一种限制性内切酶（RE）。
6.1.寡聚核苷酸
对于以下反应，将寡聚核苷酸片段进行组合并且用作底物以测试不同RE切割双链体底物的能力。CESA、PESA和EIC的示例性结构展示于图1中。在此实例中，不同的双链体包含一种寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸包括形成经筛选的特定RE的RERS的一条链所需要的所有碱基。
RE切割能力是通过标记复合体的切割来监测，其中荧光团和淬灭剂以这样一种方式位于复合体上：荧光团和淬灭剂之间的物理分离将产生可检测信号。在当前实例中，酶放大器底物寡聚核苷酸1（指定为EAS1）是用荧光团和淬灭剂标记，并且除此之外包含序列，该序列对应于形成每个RE的RERS的一条链所需要的所有碱基。RE1F1(20)-JB在5’端是用JOE以及在3’端用BHQ标记。EAS7-1(21)-FB在5’端是用6-FAM以及在3’端用IaBFQ标记。REF4F1-FlB是在位置4中用荧光素进行内部标记并且在位置15上用IaBFQ进行内部标记。EAS1-4(16)-BF在5’端是用IaBFQ并且在3’端用6-FAM标记。EAS5-1(18)-BF在5’端是用IaBFQ并且在3’端用6-FAM标记。EAS3-1(18)-BF在5’端是用IaBFQ并且在3’端用6-FAM标记。
第二酶放大器底物寡聚核苷酸（指定为EAS2）包含部分的RERS，并且与EAS1退火，并且在一些实例中是用淬灭剂部分标记，例如，EAS6-1(10)-B在5’端是用IaBFQ标记。EAS1和EAS2一起形成PESA复合体的结构等效物（图1C）。对应于驱动片段（DF）的结构等效物的第三片段的杂交导致双链体结构的形成，这些双链体结构在结构上但不必然在功能上等同于全酶信号放大器（CESA）复合体（图1A）。可替代地，对应于抑制片段（InF）的结构等效物的第三片段的杂交导致双链体结构的形成，这些双链体结构在结构上但不必然在功能上等同于酶抑制复合体（EIC）（图1B）。在一些实例中，InF是用荧光团和/或淬灭剂部分标记。Sub1(8:9)TRB2在5’端是用德克萨斯红以及在3’端用BHQ2标记；RE1S1(1A)(13)-5-B在5’端是用IaBFQ标记。最后，包含EAS1的所有完全互补的RE识别序列的反义对照链（ASC）被包含作为用于完整双链体的RE切割的阳性对照。在一些实例中，ASC是用淬灭剂部分标记，例如ASC-EAS6-1(8)-B在5’端是用IaBFQ标记。
将不同RE切割以上所述的完全装配双链体结构的能力或该能力的缺乏在用于存在于EAS1上的荧光团的适当通道中进行监测。存在于每个反应中的这些寡聚核苷酸的名称从5’到3’在下文列于表8中。在表9中提供了贡献至RE的识别序列的碱基，其中‘/’指示切割位点。
表8：在筛选用于EzyAmp的RE中使用的RE和寡聚核苷酸
Figure BDA00003457832001701
Figure BDA00003457832001711
在表9中提供了表8中的每个寡聚核苷酸的序列。
表9
Figure BDA00003457832001712
Figure BDA00003457832001721
6.2.反应组分
反应A、B、C、D、E和F被建立为包含如列于表10中的以下寡聚核苷酸片段。
表10：反应A至F的寡聚核苷酸组分
Figure BDA00003457832001722
所有的反应包含在1x NE缓冲液中的100nM的EAS1（表11）以及限定数目单位的RE（表11）。除此之外，反应A包含各自100nM的EAS2和DF；反应B包含各自100nM的EAS2和InF；反应C包含100nM的EAS2；反应D仅包含EAS1；而反应E和F包含100nM的ASC。寡聚核苷酸购自IDT。一些反应还包括如制造商建议书指导的与那个特定RE一起使用的1x BSA（新英格兰生物实验室）的添加。在表11中示出了反应A至E的具体反应条件。每个反应F与反应E相同，除了没有RE添加至混合物中外。不同的寡聚核苷酸结构的切割或该切割的缺乏是通过监测与荧光标记的EAS1的修饰（由于RE对它的切割）关联的荧光信号的变化来测量。所有的反应A、B、C、D、E和F是CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad公司）中，在指定温度进行，并且所有反应的总体积是25μL。每1秒对每个反应的荧光进行程序化读取，持续总计100个循环。所有反应重复进行两次。
表11：用于每个特定RE的反应条件
*对于包含6-荧光素（FAM）部分或6-JOE（JOE）部分的反应的荧光增加对应地是在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）的FAM或JOE通道（通道1或2）中检测。在使用扫描模式FAM/Sybr的反应中，运行时间是17分钟，在使用扫描模式所有通道的反应中，反应时间是24分钟。
**由富酶泰斯公司（Fermentas）提供（其余的RE和缓冲液由新英格兰生物实验室提供），***浓度未由供应商披露，因此这些反应是基于μL/反应来进行的。
6.3.结果：切割的检测
对于反应A-F，如果检测到荧光增加，这指示荧光团与淬灭剂的分离，则这在表12中记录为‘切割’。在没有检测到荧光增加的情况下，这指示荧光团与淬灭剂没有分离，并且这在表12中记录为“无切割”。
表12：结果
Figure BDA00003457832001741
在所有的阳性对照反应E中观察到荧光信号随着时间推移而增加，这些反应E中包含具有其全部互补链ASC的EAS1，指示此结构易于切割。因为每个RE可以识别并且切割双链复合体，切割可以发生。相反，如所预期的，对于阴性对照反应F没有观察到荧光信号的增加，这些反应F包含具有其全部互补链ASC的EAS1但缺少任何RE。
关于不同的完整的和部分的双链体结构的切割，RE落入四种基本模式（I至IV）之一中，这取决于由不同RE切割的寡聚核苷酸结构。根据每种模式作用的酶的一个实例展示于图16中。呈现于表12中的以上结果的意义总结于表13中。
表13
Figure BDA00003457832001742
然而，应当注意的是每个RE的作用高度取决于许多因素（包括强度、pH、Mg浓度以及RE浓度），并且正因如此这些组和模式可以仅适合于仅在这些反应条件下的这些RE。尽管如此，这些实验示出了一个过程，凭借此过程技术人员可以建立一个筛选分析以发现核酸酶与适合的反应条件的组合，使得核酸酶以这样一种模式切割双链体结构从而使得它们适合被利用来发展EzyAmp反应。
实例7
以下实例证明了在一个反应试管内两种不同的CESA复合体（CESA A和CESA B）在响应它们对应的DF的任一个的启动而完成这些CESA复合体之后，由单一限制性内切酶切割的能力。用于此反应的策略展示于图17A中。在此实例中的CESA被设计为使得每个CESA的切割产生用于另一个CESA的新的DF。在此实例中，CESA A和CESA B是用不同的荧光团标记，使得可以独立地监测通过每个CESA的切割而产生的荧光信号。
7.1寡聚核苷酸
在以下反应中，CESA A是由PESA A和DF-a（DF1）组成，而CESA B是由PESA B和DF-b（DF-3EAS1_11）组成。依次地，PESA A是由EAS1A（EAS1_10）和EAS2A（EAS2_11）组成，而PESA B是由EAS1B（EAS1_12）和EAS2B（EAS2_13）组成，PESA A的EAS2A包含在其内的区域，该区域等同于DF-b的序列，而PESA B的EAS2B包含在其内的区域，该区域等同于DF-a的序列。这样，此实验被设计为使得DF-a或DF-b任一个可以在反应的起始时添加，并且每种DF可以进而在反应过程中对应地通过CESA B或CESA A的切割产生。该过程的示意图展示于图17A中。
通过对应于荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用JOE部分进行末端标记。EAS2A也是在5’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记，并且与EAS1A退火。EAS1B在5’端是用6-荧光素（6”FAM”）部分进行末端标记。EAS2B是在3’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记，并且与EAS1B退火。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且其中斜体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF的那些。
EAS1_10（EAS1A）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2A）
AATCAGGTGCTGA
EAS1_12（EAS1B）
TCAGTCCCACGTGTGA
EAS2_13（EAS2B）
TCAGCACCTCACACGTGGGAAGAG
DF-3EAS1_11（DF-b）
GGTGCTGA
DF1（DF-a）
GGAAGAGAT
7.2反应条件
寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。所有的反应包含以下项的散装混合物：EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、EAS2_13各自100nM以及10mM MgCl2（Ambion公司）、1xBSA（新英格兰生物实验室）、1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）以及0.75U Mnl I（新英格兰生物实验室）。反应A是通过添加100nM DF1(I)或等效体积的水(II)来启动，并且反应B是通过添加100nM DF3ESA1_11(III)或等效体积的水(IV)来启动。所有的反应具有25μl的总反应体积。同时地在通道1（FAM）和通道2（HEX）中测量荧光信号从而对应地监测FAM和JOE。该反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad公司）中进行的。每1秒后对每个样品的荧光进行程序化读取，持续150个循环（扫描模式：所有通道）。总运行时间是40分钟。所有反应重复进行两次。
7.3结果：CESAA和CESAB的切割的检测
每个反应中的荧光变化针对时间绘图，并且示出于图17B中。在反应A中，DF-a的添加导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA A双链体底物的形成，如随着时间推移JOR荧光的增加所指示的（反应A(ii)JOE：CESA A+DF-a）。同时，在此反应中随着时间推移还观察到FAM荧光的增加，指示DF-b从CESA A切割的产生，从而形成对于相同RE Mnl I而言可切割的CESA B双链体底物（反应A(i)FAM：CESA B+DF-a）。相反，在未添加DF-a的对照反应中没有观察到JOE或FAM荧光的增加（反应A(II)没有DF-a的对照），指示了在起始DF-a的不存在下，CESA A或CESA B均没有形成。
在反应B中，DF-b的添加导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA B双链体底物的形成，如随着时间推移FAM荧光的增加所指示的（反应B(v)FAM：CESA B+DF-b）。同时，在此反应中随着时间推移还观察到JOE荧光的增加，指示DF-a从CESA B切割的产生，从而形成对于相同RE Mnl I而言可切割的CESA B双链体底物（反应B(vi)JOE：CESA A+DF-b）。相反，在未添加DF-b的对照反应中没有观察到JOE或FAM荧光的增加（反应B(IV)没有DF-b的对照），指示了在起始DF-b的不存在下，CESA A或CESA B均没有形成。
额外的非可切割EIC复合体也应已被期望通过PESA A（EAS1A和EAS2A）与EAS2B（在此背景中起着InF的作用）之间和/或PESA B（EAS1B和EAS2B）与EAS2A（在此背景中起着InF的作用）之间的杂交形成。
总体而言，实验证明了DF-a的添加可以形成CESA A，导致它被Mnl I切割，这进一步导致a)JOE荧光的增加以及b)通过EAS2A寡聚核苷酸的切割而产生DF-b片段，该DF-b片段进而可以形成CESA B，导致它被Mnl I切割，以及伴随的c)FAM荧光的增加以及d)通过EAS2B寡聚核苷酸的切割而产生DF-a片段。另外，实验证明了DF-b添加至反应B中可以形成CESAB，导致它被Mnl I切割，这进一步导致a)FAM荧光的增加以及b)通过EAS2B寡聚核苷酸的切割而产生DF-a片段，该DF-a片段进而可以形成CESA A，导致它被Mnl I切割，以及伴随的c)JOE荧光的增加以及d)通过EAS1B寡聚核苷酸的切割而产生DF-b片段。这样，CESA A和CESA B两者可以通过它们对应的驱动片段的添加来形成，并且每个CESA的切割能够产生可以完成另一个PESA的驱动片段。
实例8
以下实例证明了在一个反应试管内两种不同的发夹CESA复合体（CESA A和CESA B）在由它们对应的DF的任一个完成这些复合体之后，由单一限制性内切酶切割的能力。在此实例中，PESA A和PESA B是由从5’到3’包含EAS1、连接序列和EAS2的单一寡聚核苷酸组成。PESA A和PESA B能够形成分子内发夹。该策略展示于图18小图A中。另外，在此实例中的发夹CESA被设计为使得每个CESA的切割产生用于另一个CESA的新的DF。在此实例中，PESA A和PESA B两者可以用相同的荧光团标记，使得通过生成的CESA的切割而产生的荧光信号是累加的。
8.1.寡聚核苷酸
在以下反应中，CESA A是由PESA A（PESA_35）和DF-a（D1F-3Sub1）组成；而CESA B是由PESA B（PESA_36）和DF-b（DF-3PESA_35）组成。
PESA A（PESA_35）可以形成发夹，并且它包含在其内的一个区域，该区域等同于DF-b的序列。PESA B（PESA_36）也可以形成发夹，并且它包含在其内的一个区域，该区域等同于DF-a的序列。这样，此实验被设计为使得可以添加DF-a亦或DF-b以启动反应，并且两种DF可以进而在反馈级联反应的反应过程中对应地通过CESA A或CESA B的切割产生。
在当前实例中，通过与各自双重标记的PESA的切割关联的荧光变化来监测RE活性。在此实例中，PESA A（PESA_35）是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行末端标记，并且在内部用荧光素部分进行标记（在位置22处的T碱基上）；而PESA B（PESA_36）是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行5’端标记，并且在内部用荧光素部分进行标记（在位置21处的T碱基上）。
这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且其中斜体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF的那些。内部荧光素的位置指示为粗体。在5’端上的带框碱基指示EAS1，在3’侧上的带框碱基指示EAS2
PESA_35（PESA A）
Figure BDA00003457832001801
TTTTTTTTTTTTTTTTT
Figure BDA00003457832001802
PESA_36（PESA B）
TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
D1F-3Sub1（DF-a）
GGAAGAGATG
DF-3PESA_35（DF-b）
GGTGTGGA
8.2.反应组分
寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。所有的反应包含：游离水（Ambion）、1x NE缓冲液4、1x BSA以及0.75U Mnl I（所有的购自新英格兰生物实验室）的散装混合物。反应接近于25μL的终体积，并且重复两次进行。
反应(i)包含100nM PESA_35和10nM DF1；反应(ii)包含100nMPESA_35；反应(iii)包含100nM PESA_36和10nM DF-3PESA_35；反应(iv)包含100nM PESA_36；反应(v)包含100nM PESA_35、100nM PESA_36和10nM DF1；反应(vi)包含100nM PESA_35、100nM PESA_36和10nM DF-3PESA_35；反应(vii)包含100nM PESA_35和100nM PESA_36；反应(viii)包含100nM PESA_35、100nM PESA_36、100nM DF1以及100nM DF-3PESA_35。
这些反应是在33°C在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）上进行的。在每5秒后对每个反应的荧光进行读取，持续60个循环（扫描模式FAM/SYBR；通道1FAM），然后在每25秒后进行读取，持续100个循环（扫描模式FAM/SYBR；通道1FAM）。总运行时间是65分钟。将荧光针对每个包含相同数目、类型、浓度的PESA但缺少起始DF的相对应反应的循环1进行归一化。
8.3.结果：PESA_35和PESA_36的切割的检测
在反应(i)中，DF-a连同发夹PESA A一起的添加导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA A双链体底物的形成，如随着时间推移荧光的增加所指示的（图18B；反应(i)）。相反，在没有DF-a配至PESA A的反应(ii)中，没有可切割的CESA A双链体底物形成，如随着时间推移由荧光的缺乏所指示的（图18B；反应(ii)）。
在反应(iii)中，DF-b连同发夹PESA B一起的添加导致对于RE Mnl I而言可切割的CESA B双链体底物的形成，如随着时间推移荧光的增加所指示的（图18B；反应(iii)）。相反，在没有DF-b配至PESA B的反应(iv)中，没有可切割的CESA B双链体底物形成，如随着时间推移由荧光增加的缺乏所指示的（图18B；反应(iv)）。
在反应(v)中，与反应(i)相比，将DF-a添加至包含PESA A和PESA B两者的混合物中导致随着时间推移荧光的几乎双倍的增加（图18B；反应(v)）。这指示在CESA A切割之后DF-b的释放，然后该DF-b与PESA B杂交以形成CESA B，该CESA B可以进而被切割导致更多DF-a的释放。在反应(vi)中，与反应(iii)相比，将DF-b添加至包含PESA A和PESA B两者的混合物中导致随着时间推移荧光的几乎双倍的增加（图18B；反应(vi)）。这指示在CESA B切割之后DF-a的释放，然后该DF-a与PESA A杂交以形成CESA A，该CESA A可以进而被切割导致更多DF-b的释放。没有添加任何DF的、包含PESA A和PESA B的混合物的对照反应(vii)示出随着时间推移荧光没有增加（图18B；反应(vii)）。这指示在任何DF的不存在下，可切割的CESA结构不能在PESA A和PESA B之间形成。
最后，反应(viii)（图18B）被设计作为阳性对照，其中DF-a、DF-b、PESA A和PESA B是以等浓度混合（各自100nM），使得所有的两种PESA具有可供使用的DF。这样，所有的PESA应形成CESA，并且被切割以产生在此系统中可获得的荧光的最大变化。与反应(v)和(vii)相比，反应(viii)展示了较快的反应速率，然而最终的荧光类似于在反应(v)和(vii)中观察到的那个。这提供了任一10nM的DF-a（反应v）亦或DF-b（反应vii）可以启动级联反应的额外的证据，其中该级联反应最终导致各自100nM的CESA A和CESA B的切割，这是在CESA B被切割时通过更多DF-a的产生而在CESA A被切割时通过更多DF-b的产生来驱动的。这指示用DF-a亦或DF-b与PESA A和PESA B一起的包含来启动反应，导致在观察反应的时间范围内PESA A和PESA B寡聚核苷酸两者的全部切割。
总之，实验证明了
(a)将DF（DF-a或DF-b）添加至它的匹配发夹PESA（各自地地为PESA A或PESA B）可以形成对于RE Mnl I而言可切割的CESA A或CESAB双链体底物，并且导致荧光的增加。
(b)将DF-a添加至PESA A和PESA B的混合物中导致CESA A形成并且随后被切割，该CESA A的切割产生DF-b，该DF-b可以与PESA B杂交以形成CESA B，该CESA B进而被切割并且释放DF-a。类似地，将DF-b添加至PESA A和PESA B的混合物中导致CESA B形成并且随后被切割，该CESA B的切割产生DF-a，该DF-a可以与PESA A杂交以形成CESA A，该CESA A进而被切割并且释放DF-b。这个反馈继续发生直到所有的PESA A和PESA B被切割。
此放大级联反应可以用于放大信号，允许任何靶标的检测，其条件是DF可以按靶标特异性方式产生。可以改变发夹PESA的特异序列，从而创造额外的PESA，该额外的PESA可以由这个实例中的DF其中之一或与新PESA互补的不同DF活化。
实例9
以下实例证明了MNA酶启动的EzyAmp反应，该反应使用其中DF序列不是MNA酶底物序列部分的策略。在此实例中证明的策略展示于图19A中。在此实例中，底物序列侧翼具有与DF互补的序列以及与DF延伸互补的序列。底物本身的序列与任何这些区域不互补，以使得在包含寡聚核苷酸的底物结合至DF时创造单链底物环。全部底物的结合阻断了DF，致使该DF不能用于与PESA杂交。该系统被设计为使得DF将只有在环底物由在特异性靶标存在下形成的MNA酶切割时才从此复合体释放。MNA酶对底物环的切割释放DF，并且允许EzyAmp信号放大反应的启动。
9.1EzyAmp寡聚核苷酸
对于此EzyAmp反应，两种不同的PESA复合体（PESA A和PESA B）存在于一个反应内。PESA A和DF-a（DF-3EAS2_11(22)）的杂交导致CESAA的形成，而PESA B和DF-b的杂交导致CESA B的形成。PESA A是由EAS1A（EAS1_12）和EAS2A（EAS2_13）组成，而PESA B是由EAS1B（EAS1_10）和EAS2B（EAS2_11）组成。PESA A的EAS2A包含在其内的区域，该区域等同于DF-b的序列。PESA B的EAS2B包含在其内的区域，该区域等同于DF-a的序列。这样，此实验被设计为使得DF-a或DF-b可以通过底物-阻断体的切割亦或在反应过程中对应地通过CESA B或CESA A的切割而产生。该过程的示意图展示于图19小图A中。
通过对应于当寡聚核苷酸被切割时荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1A在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记，并且EAS2A在3’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行末端标记。EAS1A和EAS2A彼此退火以形成PESAA。EAS1B在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记。EAS2B在3’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS1B和EAS2B彼此退火以形成PESA B。
这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且其中斜体粗体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF或其较短形式的那些。
ESA1_12（EAS1A）
TCAGTCCCACGTGTGA
ESA2_13（EAS2A）
TCAGCACCTCACACGTG
Figure BDA00003457832001841
EAS1_10（EAS1B）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2B）
AATCA
Figure BDA00003457832001842
DF-3ESA1_11(22)（DF-a）
GGTGCTGATACTGCGCTCTGGG
9.2部分酶寡聚核苷酸和装配促进物
部分酶被设计为使得催化活性的MNA酶将在合成靶标（即装配促进物AF-RO5）的存在下形成。装配促进物、部分酶A（RO5A4/3(8)）以及部分酶B（RO5B5/3(7)）的序列从5’到3’在下文列出，其中加下划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A RO5A4/3(8)：
Figure BDA00003457832001851
ACAACGAGGTTGTGC
部分酶B RO5B5/3(7)：
TTGGTGAGGCTAGCT
Figure BDA00003457832001852
靶标装配促进物AF-RO5：
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
9.3MNA酶底物-阻断体
MNA酶底物序列是在一个寡聚核苷酸中包含RNA和DNA碱基两者的嵌合序列，该嵌合序列构成已经先前被用作MNA酶（衍生自10:23DNA酶）的底物的序列的延伸。在当前实例中，报道物MNA酶底物被设计为Sub3(8:7)，并且它侧翼具有与DF-a互补的序列、以及与DF延伸互补的序列。MNA酶底物本身的序列与任何这些区域不互补，以使得在底物结合至DF时创造单链底物环。底物-阻断体的序列按5’到3’方向如下。小写碱基表示RNA而大写碱基表示DNA，粗体碱基与部分酶杂交而加下划线的碱基结合至DF-a。
14Sub3(8:7)_16)(21)Inh（D2F-3EAS2_11）（底物-阻断体）
CCCAGAGCGCAGT TCAGCACC
9.4反应组分
在靶标存在下可切割的CESA的形成是通过荧光增加的检测来测量的。测试反应是通过100nM靶标装配促进物AF-RO5的添加启动，而对照反应是通过H2O的添加启动。所有反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad公司）中进行的，其中总的反应体积是25μL。每1分钟后在通道1（FAM）中对每个样品的荧光进行程序化读取，持续100个循环（扫描模式：仅FAM/SYBR）。总运行时间是115分钟。所有的反应包含以下项的散装混合物：200nM部分酶A（RO5A4/3(8)）、200nM部分酶B（RO5B5/3(7)）、200nM的底物-阻断体（14Sub3(8:7)_16）(21)Inh（D2F-3EAS2_11）；在15mM MgCl2（Ambion）中的各自100nM的DF-3ESA1_11(22)、EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、以及EAS2_13，1x BSA（新英格兰生物实验室）、1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）、以及0.75U Mnl I（新英格兰生物实验室）。所有反应重复进行两次。所有的寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNATechnologies，IDT）。
9.5结果：CESA A和CESA B的切割的检测
在存在靶标的测试反应中观察到荧光的指数增加（图19小图B；靶标）。这指示靶标装配促进物允许部分酶A和B装配为切割MNA酶底物的催化活性的MNA酶。底物的切割导致结合至DF-a的片段的解离，因此允许DF-a启动随后的EzyAmp级联反应（由PESA A和PESA B组成）。在释放的DF-a结合至PESA A（由EAS1A和EAS1B形成）以形成CESA A（该CESA A然后被Mnl I切割）时，此反应开始。这进而释放DF-b，并且还产生伴随的荧光的增加，该荧光的增加对应于荧光团与淬灭剂部分的分离。DF-b进而结合至PESA B（由EAS1B和EAS2B形成）形成CESA B，允许它被Mnl I的切割。这释放更多DF-a以完成在另一个CESA A与CESA B之间的反馈级联反应，并且还产生伴随的荧光的增加，该荧光的增加对应于荧光团与淬灭剂部分的分离。
在没有添加靶标装配促进物的“没有靶标的对照”反应中，没有观察到FAM信号的指数增加，仅伴随在80分钟后观察到的低水平的荧光漂移（图19小图B；没有靶标的对照）。这指示需要靶标的存在来启动MNA酶对底物的切割，以便释放DF-a从而启动随后的EzyAmp反应。
这些结果证明了EzyAmp反应可以被设计为由靶标依赖性MNA酶切割步骤启动，由此DF的序列没有必要成为MNA酶底物序列的部分。在此反应中，EIC复合体还已被期望通过PESA A和EAS2B之间、以及PESA B和EAS1A之间的杂交形成，EAS1A在其未切割状态时发挥InF的功能。
实例10
以下实例证明了限制性内切酶切割包含全部限制性位点的两种部分互补的寡聚核苷酸的能力。
10.1寡聚核苷酸
在以下反应中，寡聚核苷酸1（EAS1_1和寡聚核苷酸2（ASC-RE5F2(22)-FB）可以在两个方位部分地杂交，这两个方位的部分杂交将导致部分互补的双链体，这些双链体可以包含Mnl I的全部识别序列；然而，两种双链体将具有在识别位点和切割位点之间的一些未配对碱基。
通过监测由于在双重标记的片段的切割之后荧光团与淬灭剂部分的分离造成的荧光变化来检查RE Mnl I切割部分非互补的双链体的潜力。寡聚核苷酸1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在其3’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）进行末端标记。寡聚核苷酸2在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分以及在3’端用黑洞淬灭剂（“BHQ_1”）部分进行末端标记。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的一条链。
EAS1_1（寡聚核苷酸1）
CTCTTCCTCTCTTCCCGGATGTCGGCCTCCTAGTACAGCG
ASC-RE5F2(25)-FB（寡聚核苷酸2）
TAGGATGTGAAGACGAGGAAGAGAT
10.2反应组分
所有的反应重复进行两次，并且包含100nM寡聚核苷酸2以及在核酸酶游离水、1x BSA（新英格兰生物实验室）以及1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）中的2U的Mnl I（Ambion公司），同时添加(i)100nM寡聚核苷酸1或(ii)H2O。在通道1（FAM）中测量荧光信号。反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad公司）中进行的，其中总的反应体积是25μL。每8秒后对每个样品的荧光进行程序化读取，持续100个循环（扫描模式：仅FAM/SYBR）。总运行时间是40分钟。
10.3结果：寡聚核苷酸1和2的切割的检测
在反应(i)中，寡聚核苷酸1和2两者的存在导致增加的荧光，指示MnlI切割使得在寡聚核苷酸2中的荧光团与淬灭剂分离。相反，在寡聚核苷酸1的不存在下没有观察到增加的荧光（反应(ii)），指示寡聚核苷酸2的切割取决于具有寡聚核苷酸1的部分双链体的形成，并且在Mnl I的存在下的信号不是由于单链寡聚核苷酸2的切割造成的。
这些结果证明了某些RE（例如Mnl I）可以切割部分互补的双链体，该双链体可以包含完全的双链识别序列，但在包含识别和切割位点的整个区域上不是完全互补的。这个观察提供了设计PESA复合体的新工具，这些PESA复合体由一种或多种寡聚核苷酸组成，该一种或多种寡聚核苷酸包括在识别和切割位点之间介入的序列中的错配，因此允许切割片段（这些切割片段可以发挥DF功能）的解离的温度和速率的操作。
实例11
以下实例展示了使用在单个反应中同时发生的以下步骤而对不同浓度的特异靶标的检测和定量；步骤(i)，MNA酶在靶标的存在下形成并且切割MNA酶底物以产生第一DF；步骤(ii)，此DF与PESA杂交以创造CESA，该CESA在被RE切割时产生另一个DF，并且伴随导致荧光团与淬灭剂的分离，导致荧光信号的产生；步骤(iv)，通过第一CESA的切割产生的DF与第二PESA杂交以创造第二CESA，该第二CESA在由RE切割时产生荧光信号并且释放可以履行与第一DF功能相同的DF；步骤(v)，在步骤(iv)和(v)重复时创造反馈环路。核酸酶切割导致信号放大的反应称为EzyAmp反应。在当前实例中，EzyAmp反应是由两种不同的CESA复合体（CESA A和CESAB）组成，在一个反应试管内这些复合体由单一RE切割。在此实例中，用相同的荧光团标记两种PESA复合体，并且这样通过生成的CESA A和CESA B的切割而产生的信号是累加的。
11.1EzyAmp寡聚核苷酸
对于此EzyAmp反应，两种不同的CESA复合体（CESA A和CESA B）存在于一个反应内。CESA A是由PESA A和DF-a组成，而CESA B是由PESA B和DF-b组成。进而，PESA A是由EAS1A（EAS1_10）和EAS2A（EAS2_11）组成，而PESA B是由EAS1B（EAS1_12）和EAS2B（EAS2_13）组成。PESA A的EAS2A包含在其内的区域，该区域在功能上等同于DF-b的序列。PESA B的EAS2B包含在其内的区域，该区域在功能上等同于DF-a的序列。正因如此，此实验被设计为使得DF-a可以靶标存在下在反应的起始时产生，并且每个DF可以进而在反应过程中对应地由CESA B或CESA A的切割产生。可以反馈的CESA复合体的加工的示例性示意图展示于图17A、18A、19A和27A中。
通过对应于荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1A在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记。EAS2A也是在5’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记，并且与EAS1A退火。EAS1B在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记，而EAS2B在3’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行标记并且与EAS1A退火。
这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且斜体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF的那些。
EAS1_10（EAS1A）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2A）
AATCAGGTGCTGA
ESA1_12（EAS1B）
TCAGTCCCACGTGTGA
ESA2_13（EAS2B）
TCAGCACCTCACACGTGGGAAGAG
11.2部分酶寡聚核苷酸和靶标装配促进物
为了创造DF-a，底物（Sub1i-FIB）被设计为由催化活性的MNA酶切割，该MNA酶在合成靶标（即装配促进物AF-TL5）的存在下形成。靶标装配促进物、部分酶A（TL5A2(12)/1）以及部分酶B（TL5B5(12)/1）的序列从5’到3’在下文列出，其中加下划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A TL5A2(12)/1：
TGCTCATCTCAGCGGTCGAAATAGTGAGT
部分酶B TL5B3(12)/1：
CATCTCTTCTCCGAGCGTCTACGACAAT
靶标装配促进物AF-TL5：
ATTGTCGTAGACCTGAGATGAGCA
11.3MNA酶底物
MNA酶活性是通过双重标记的报道物MNA酶底物的切割来监测。MNA酶底物序列是包含RNA和DNA碱基两者的嵌合序列，该嵌合序列已经在先前用作8:17DNA酶底物（Li（李）等人，2000）。在当前实例中，报道物MNA酶底物底物被指定为Sub1i-FIB，并且是用内部的荧光素dT（“iFluorT”）部分以及在3’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行标记。Sub1i-FIB的标记序列从5’到3’如下，其中小写碱基表示RNA而大写碱基表示DNA。斜体碱基表示发挥存在于较长寡聚核苷酸背景中的DF的功能的那些。
底物，Sub1i-FIB；
ACTCACTATaGGAAGAGATG
11.4反应组分
MNA酶底物由催化活性的MNA酶的切割是通过荧光的增加来测量（虽然因为MNA酶底物切割和CESA切割两者释放在相同通道中被检测的荧光团，此荧光与EAS寡聚核苷酸的切割产生的荧光不能区别开）。这些寡聚核苷酸被设计为使得CESA A通过EAS1_10、EAS2_11和DF-1a的杂交形成，并且CESA B由EAS_12、EAS2_13和DF-b形成。荧光标记的CESA组分—EAS1_10和EAS1_12的切割也是通过荧光的增加来测量的。重复两次的测试反应是通过添加以下浓度的靶标装配促进物AF-TL5来启动：(i)1nM，(ii)800pM，(iii)600pM，(iv)400pM，(v)200nM(vi)100nM或(vii)50nM。“没有靶标的对照”（NTC）重复两次的反应是通过添加H2O来启动。所有反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的，其中总的反应体积是25μL。每1分钟后在通道1（FAM）中对每个样品的荧光进行程序化读取，持续110个循环（扫描模式：仅FAM/SYBR）。总运行时间是120分钟。所有的反应包含以下项的散装混合物：300nM部分酶A（TL5A2(12)/1）、150nM部分酶B（TL5B3(12)/1）、以及30nM Sub1i-FIB；在10mM MgCl2（Ambion）、1x BSA（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）以及使用KOH调节pH至8.3的1x NE缓冲液1（新英格兰生物实验室）中的EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、以及EAS2_13各自100nM、连同0.75U Mnl I。所有的寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。从添加至反应中的靶标的浓度的Ct值针对靶标浓度的对数值绘制标准曲线。Ct值是给定的量的靶标产生对应于阈值荧光的信号所占用时间的量（一个循环等于大约1分钟）。在荧光增加的指数期开始处设置阈值。
11.5结果：靶标核酸的检测和定量
图21A和21B示出了对应于添加至测试反应(i)至(vii)中的靶标的量的增加的荧光信号（对数和线性曲线），这些增加的信号在的不同时间点开始。靶标的量决定了在EzyAmp反应中产生信号所需要的时间。靶标存在的越少，它产生DF-a以开始EzyAmp反馈反应所用的时间越长，并且因此达到阈值荧光所用的时间越长。在未添加靶标的对照反应（(viii)NTC）中，在120分钟后没有观察到增加的信号，表明对于DF-产生和随后的EzyAmp信号放大而言需要催化活性MNA酶的靶标依赖性形成。还分析了额外的更低浓度的靶标（数据未示出），并且像1pM那么小的靶标在没有模板的对照信号以上是可检测的。这对应于在25　L反应中的大约25amole或107个拷贝的靶标核酸序列。
图21C示出了通过观察进行的分析的定量能力，线性标准曲线可以在测试的靶标浓度范围内产生。每个限制性内切酶切割事件中DF的产生加倍，导致随着时间推移信号的指数增加。这个指数增加允许使用PCR指数循环阈值方法（描述于14.4反应组分中）来用具有0.99回归值的线性曲线示出Ct与靶标浓度之间的关系。这些结果证明了EzyAmp允许靶标序列的灵敏和定量检测的能力。
实例12
此实例是假设的，并且提供了一种利用核酸外切酶III（ExoIII）的核酸酶能力的策略以启动并且介导信号放大级联反应（图23）。此酶从DNA双链体的3’末端去除核苷酸。它在平头或凹的3’端上是有活性的，但在包括五个或更多个核苷酸的单链DNA上是没有活性的，并且因此将不会切割具有至少五个核苷酸或更长的3’突出末端。它还可以从双链体DNA中的切口启动水解，从而产生单链缺口。在寡聚核苷酸内的硫代磷酸酯核苷酸的存在阻断核酸外切酶活性。
此方法包括启动步骤和信号放大步骤，它们可以存在于一个或分开的、但利用相同核酸酶（ExoIII）的反应腔室中。
12.1启动步骤；以靶标依赖性方式创造驱动片段
合成起始物寡聚核苷酸（SIO）可以被设计为ExoIII的底物，由此该SIO将只有在靶标核酸的存在下才水解（图23）。SIO可以在其3’端具有20个左右的核苷酸，这些核苷酸与靶标互补从而允许特异性靶标的检测。该SIO在与靶标不互补的5’端还可以包含DF的序列。最后，SIO可以包含在靶标结合部分和DF部分的接合处的一种或多种硫代磷酸酯化的核苷酸，并且它可以是用荧光团和淬灭剂来双重标记。在一些实施例中，SIO可以具有发夹结构。
该反应中的步骤展示于图23中。在SIO结合至靶标时（步骤1），SIO的DF部分将形成单链5’突出端，而SIO的靶标结合区域将形成双链体，由此SIO具有3’凹末端，该双链体可以充当Exo III的适合底物。Exo III可以进而水解SIO回到硫代磷酸酯化核苷酸的位置，因此释放SIO的DF部分（步骤2）。伴随地，水解将导致荧光团与淬灭剂的分离，这将导致荧光的增加。该靶标将保持完整并且将呈游离态以被再利用以结合额外的SIO（步骤3）。
12.2信号放大步骤：CESA复合体的形成和切割
信号放大步骤将包含如在EzyAmp反应的其他变体中的类似片段，即互补的寡聚核苷酸EAS1和EAS2。可以用荧光团和淬灭剂来标记EAS1。在结合至彼此时，EAS1和EAS2可以形成在每个末端具有至少五个核苷酸的3’突出端的PESA，从而防止在DF不存在时ExoIII的降解作用。EAS1可以具有较长的突出端，该突出端可以充当DF的结合位点。在DF5’端的序列可以超过与EAS1互补的那个而延伸，并且这样DF结合将创造在EAS1上具有3’凹端的CESA复合体。
当在启动步骤中在靶标的存在下DF从SIO释放时，它然后呈游离态以结合至PESA并且创造CESA，该CESA可以充当Exo III的底物。在DF3’端的硫代磷酸酯化碱基的存在将防止核酸酶从当DF结合至PESA时创造的切口降解。然而，CESA的EAS1链的3’凹端将由Exo III水解（步骤5），并且这将导致由于荧光团与淬灭剂的分离造成的增加的荧光。此外，DF将完整地被释放并且将呈游离态以被再利用（步骤6），并且结合至另一个PESA以创造另一个CESA。在此策略中，启动和放大步骤两者将依赖于用于信号放大以增加灵敏度的靶标和DF再利用。
以上方案的许多变体可以由本领域普通技术人员设计。如前，PESA可以从分开的EAS1和EAS2寡聚核苷酸形成，或者EAS1和EAS2可以通过接头序列连接以创造具有发夹结构的PESA。每个步骤可以在一个腔室内或在分离的腔室内进行。另外，存在关于荧光团和淬灭剂标签的位置的灵活性。
虽然如此，这个提出的策略遵循EzyAmp反应的基本步骤，即(i)寡聚核苷酸（例如SIO）以靶标依赖性方式转化为DF；(ii)提供PESA，该PESA就其本身不是核酸酶的底物，(iii)DF与PESA杂交以创造一个CESA；并且(iv)用核酸酶水解CESA以创造可检测信号并且此外释放DF，使得它能够将更多的PESA转化为CESA复合体。
实例13
以下实例证明了EzyAmp系统多路化的能力，使得可以同时监测在两种不同DF存在下的两种独立的CESA的形成。在此实例中，两种不同的PESA复合体（PESA A和PESA B）是用两种不同的荧光团标记，这样它们可以被独立地监测。只有在DF-a的存在下PESA A才形成CESA A，并且只有在DF-b的存在下PESA B才形成CESA B。完全装配的CESA A和CESA B复合体的形成导致RE MnlI的RERS的完成。
13.1寡聚核苷酸
在以下反应中，CESA A是由PESA A和DF-a组成，而CESA B是由PESA B和DF-b组成。进而，PESA A是由EAS1A和EAS2A组成，而PESAB是由EAS1B和EAS2B组成。此实验被设计为使得只有DF-a可以结合PESA A以形成CESA A，并且只有DF-b可以结合PESA B以形成CESA A。
通过对应于荧光团与淬灭剂部分的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1A（RE1F1(20T)(20)-BJ）在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）以及在3’端用JOE进行末端标记。与EAS1A退火的EAS2A（RE1S1(1A)(13)-5-B）也是在5’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）进行标记。EAS2B（ESA33）在5’端是用6-荧光素（“FAM”）进行末端标记，而与EAS2B退火的EAS1B（ESA34_2）在3’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）进行标记。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成MnlI的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分。
EAS1A(RE1F1(20T)(20)-BJ)
CTCTTCCTCAGCAGTTCATT
EAS2A(RE1S1(1A)(13)-5-B)
AATGAACTGCTGA
EAS1B(ESA34_2)
CGACGTCCTCAACAGGCAACACC
EAS2B(ESA33)
TTCGTTGCCTGTTGA
DF-a(DF1-(10))
GGAAGAGATG
DF-b(D2F-3ESA31(22))
GGACGTCGTACTGCGCTCTGGG
13.2反应条件
寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。所有的反应包含以下项的散装混合物：在15mM MgCl2（Ambion公司）中的各自100nM的EAS1A（RE1F1(20T)(20)-BJ）、EAS2A（RE1F1(20T)(20)-BJ）、EAS1B（ESA34_2）以及EAS2B（ESA33），1xBSA（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）、1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）以及2U MnlI（新英格兰生物实验室）。以25μL为总体积，通过添加DF-a（DF1-(10)）和/或DF-b（D2F-3ESA31(22)）来启动反应，同时通过添加水来启动对照反应。在每个反应中使用的DF-a和/或DF-b提供于表14中。同时地在通道1（监测物FAM）和通道2（监测物JOE）两者中测量荧光信号。该反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的。每1秒后对每个样品的荧光进行程序化读取，持续100个循环（扫描模式：所有通道）。总运行时间是29分钟。
表14.
Figure BDA00003457832001971
13.3结果：切割的检测
将对于每个反应的JOE和FAM两者的荧光信号针对时间绘图于图25中。DF-a的添加导致JOE荧光随着时间推移而增加。JOE信号的增加指示DF-a完成PESA A以变成CESA A，该CESA A进而由Mnl I切割。进而，经切割的EAS1A和EAS2A的寡聚核苷酸片段的解离导致JOE荧光团与淬灭剂的分离。如在反应(i)-(v)中（图25）观察到的，由于存在于每个反应中的DF-a的百分比减小，JOE荧光信号的增加速率减小。
DF-b的添加导致FAM荧光随着时间推移而增加。增加的FAM信号指示DF-b完成PESA B以变成CESA B。CESA B由Mnl I的切割导致经切割的EAS1B和EAS2B的寡聚核苷酸片段的解离，该解离引起FAM荧光团与其淬灭体的分离。如在反应(i)至(v)中（图25）观察到的，由于添加至每个反应中的DF-b的百分比减小，FAM荧光信号的增加速率减小。
在DF-a或DF-b均未添加的对照反应中，没有观察到FAM亦或JOE荧光的增加，证明了双链体EzyAmp反应特异性针对一种或多种DF的存在。
在只有DF-a存在的反应(i)中，仅观察到JOE荧光的增加，而未观察到FAM荧光的增加，指示DF-a特异性针对CESA A的形成。类似地在只有DF-b存在的反应(v)中，仅观察到FAM荧光的增加，而未观察到JOE荧光的增加，指示DF-b特异性针对CESA B的形成。当DF-a占DF-a加DF-b的总和的百分比从(i)100%改变至(ii)90%至(iii)50%至(v)10%时，观察到JOE荧光的对应的减少（图25）。类似地，当DF-b占DF-a加DF-b的总和的百分比从(v)100%改变至(iv)90%至(iii)50%至(ii)10%时，观察到JOE荧光的对应的减少。
多路EzyAmp系统的示例策略展示于图13中。此实验证明了在单个多路EzyAmp反应中对多于一种靶标的多路检测的潜力。例如，DF-a只有在靶标A的存在下才可以按靶标特异性方式产生（例如，通过由一个第一MNA酶对第一MNA酶底物的切割），而DF-b只有在靶标B的存在下才可以按靶标特异性方式产生（例如，通过由一个第二MNA酶对第二MNA酶底物的切割）。如果通过使用在此实例中证明的EzyAmp系统检测到DF-a和/或DF-b的存在，则JOE的增加将指示靶标A的存在，而FAM的增加将指示靶标B的存在。JOE亦或FAM均未增加将指示两种靶标不存在，而JOE和FAM的增加将指示两种靶标的存在。
实例14
以下实例证明了MNA酶启动的EzyAmp反应，该反应使用一种策略，在该策略中DF序列不是由MNA酶识别为底物的序列的部分，即使它仍然被包含在相同的寡聚核苷酸内（图24D）。在此实例中，底物和DF是称为底物-阻断体-DF寡聚核苷酸的长发夹分子的部分。在发夹内的单链环包含由MNA酶识别为底物的序列。此发夹的茎包含DF-a的序列，该DF-a的序列可以与互补的阻断体序列杂交。在此构型中，DF不可用于与PESA杂交。该系统被设计为使得DF将只有在MNA酶底物环由在靶标存在下形成的MNA酶切割时才被释放。MNA酶启动的DF的释放允许EzyAmp信号放大反应的启动。
14.1EzyAmp寡聚核苷酸
对于此EzyAmp反应，两种不同的PESA复合体（PESA A和PESA B）存在于一个反应内。PESA A和DF-a的杂交导致CESA A的形成，而PESA B和DF-b的杂交导致CESA B的形成。PESA A是由EAS1A（EAS1_12）和EAS2A（EAS2_13）组成，而PESA B是由EAS1B（EAS1_10）和EAS2B（EAS2_11）组成。PESA A的EAS2A包含在其内的区域，该区域等同于DF-b的序列。PESA B的EAS2B包含在其内的区域，该区域等同于DF-a的序列。这样，此实验被设计为使得起始DF-a可以按靶标依赖性方式通过MNA酶对底物-阻断体-DF发夹寡聚核苷酸的切割而产生。随后，在EzyAmp级联反应过程中，DF-a和DF-b可以通过对应的CESA B或CESA A的切割而产生。相似的示例性级联反应展示于图19A中；然而，启动步骤如展示于图24D中（与展示于图24C中的步骤相反，该图24C中的步骤类似于图19A中的启动结构）。
通过对应于当寡聚核苷酸被切割时荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1A在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记，并且EAS2A在3’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行末端标记。EAS1A和EAS2A彼此退火以形成PESAA。EAS1B在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记。EAS2B在3’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记。EAS1B和EAS2B彼此退火以形成PESA B。
这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成MnlI的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且其中斜体粗体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF或其较短形式的那些
ESA1_12（EAS1A）
TCAGTCCCACGTGTGA
ESA2_13（EAS2A）
TCAGCACCTCACACGTG
Figure BDA00003457832002001
EAS1_10（EAS1B）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2B）
AATCA
Figure BDA00003457832002002
14.2部分酶寡聚核苷酸和靶标装配促进物
部分酶被设计为使得催化活性的MNA酶将在合成靶标（即装配促进物AF-RO5）的存在下形成。装配促进物、部分酶A（RO5A4/3(8)）以及部分酶B（RO5B5/3(7)）的序列从5’到3’在下文列出，其中加下划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A RO5A4/3(8)：
Figure BDA00003457832002003
ACAACGAGGTTGTGC
部分酶B RO5B5/3(7)：
TTGGTGAGGCTAGCT
靶标装配促进物AF-RO5：
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
14.3MNA酶底物-阻断体-DF
MNA酶底物序列是在一个寡聚核苷酸中包含RNA和DNA碱基两者的嵌合序列，该嵌合序列构成已经先前被用作MNA酶（衍生自10:23DNA酶）底物的序列延伸。底物从发夹底物-阻断体-DF分子的茎外形成环，这是由于该序列与该寡聚核苷酸的序列的任何部分不互补。该茎还包含DF-a的序列。在此发夹分子中间的（非底物）环是由具有非互补dT碱基的一段序列组成。发夹底物-阻断体-DF寡聚核苷酸的序列在下文以5’到3’方向给出。小写碱基表示RNA，而大写碱基表示DNA，粗体碱基与部分酶杂交，加下划线的碱基形成还包含DF-a序列（粗体斜体）的茎，并且斜体的一段T碱基形成该发夹的中间的环。
Hp5(Sub3(8:7))Inh(D2F-3EAS2_11)Hp5D2F-3EAS2_11(Sub3(8:7))（底物-阻断体-DF）：
Figure BDA00003457832002011
TACTGC
Figure BDA00003457832002012
GCAGT ATCAGCACC
14.4反应组分
在靶标的存在下可切割的CESA的形成是通过监测荧光来测量的。测试反应是通过100nM靶标装配促进物AF-RO5的添加启动的，而对照反应是通过H2O的添加启动的。所有反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）中进行的，其中总的反应体积是25μL。每1分钟后在通道1（FAM）中对每个样品的荧光进行程序化读取，持续100个循环（扫描模式：仅FAM/SYBR）。总运行时间是115分钟。所有的反应包含以下项的散装混合物：200nM部分酶A（RO5A4/3(8)）、200nM部分酶B（RO5B5/3(7)）、70nM Hp5(Sub3(8:7))Inh(D2F-3EAS2_11)、在15mMMgCl2（Ambion）中各自100nM的EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、以及EAS2_13，1x BSA（新英格兰生物实验室）、1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）以及0.75U MnlI（新英格兰生物实验室）。所有反应重复进行两次。所有的寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。
14.5结果：CESA A和CESA B的切割的检测
在存在靶标的测试反应中观察到荧光的指数增加。这指示靶标装配促进物允许部分酶A和B装配为催化活性的MNA酶，该MNA酶切割底物-阻断体-DF发夹寡聚核苷酸的MNA酶底物部分。底物的切割导致结合至DF-a的片段的解离，并且因此允许DF-a启动随后的EzyAmp反应（包括PESA A和PESA B）。在释放的DF-a结合至PESA A（由EAS1A和EAS1B形成）形成CESA A时，此EzyAmp级联反应开始。当CESA A由MnlI切割时，DF-b释放。此外，还存在伴随的荧光的增加，该荧光的增加对应于在CESA A上存在的荧光团和淬灭剂部分的分离。接着，DF-b结合至PESA B（由EAS1B和EAS2B形成）形成CESA B，该CESA B由MnlI切割。这释放更多DF-a以完成在另一个CESA A与CESA B之间的反馈级联反应，并且还产生伴随的荧光的增加，该荧光的增加对应于在CESA B上存在的荧光团与淬灭剂部分的分离。
在未添加靶标装配促进物的“没有靶标的对照”反应中，没有观察到FAM信号的对数增加。这指示需要靶标的存在来启动MNA酶对发夹底物-阻断体-DF-寡聚核苷酸内的底物部分的切割，以便释放DF-a并且启动随后的EzyAmp反应。
这些结果证明了EzyAmp反应可以被设计为通过添加前面的MNA酶步骤而成为靶标依赖性的，并且证明了起始DF的序列没有必要成为由MNA酶识别为其底物的序列的部分。
实例15
以下实例展示了使用在单个反应中同时发生的以下步骤而对两种浓度的cDNA（从RNA逆转录）的检测；步骤(i)，MNA酶在靶标cDNA的存在下形成并且切割MNA酶报道物底物以产生第一DF（DF-a）；步骤(ii)，此DF-a与PESA A杂交以创造CESA A，该CESA A在被RE切割时产生另一个DF（DF-b），并且伴随导致荧光团与淬灭剂的分离，导致可检测荧光信号的产生；步骤(iv)，DF-b与第二PESA（PESA B）杂交以创造CESA B，该CESAB在被切割时产生可检测的荧光信号并且释放可以履行与DF-a功能相同的DF；步骤(v)，在步骤(iv)和(v)重复时创造反馈环路。核酸酶切割导致信号放大的反应称为EzyAmp反应。
15.1EzyAmp寡聚核苷酸
对于此EzyAmp反应，两种不同的CESA复合体（CESA A和CESA B）存在于一个反应内。CESA A是由PESA A和DF-a（通过MNA酶对MNA酶底物的切割或通过CESA B的切割产生）组成，而CESA B是由PESA B和DF-b（通过EAS2A（EAS2_11）的切割产生）组成。进而，PESA A是由EAS1A（EAS1_10）和EAS2A（EAS2_11）组成，而PESA B是由EAS1B（EAS1_12）和EAS2B（EAS1_13）组成。PESA A的EAS2A包含在其内的区域，该区域在功能上等同于DF-b的序列，并且PESA B的EAS2B包含在其内的区域，该区域在功能上等同于DF-a的序列。这样，每个DF可以在反应过程中对应地通过CESA B或CESA A的切割而产生。
通过测量对应于荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光来监测RE活性。在当前实例中，EAS1A在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分以及在3’端用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记。EAS2A也是在5’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分标记，并且与EAS1A退火。EAS1B在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）部分进行末端标记，而EAS2B在3’端是用黑洞FQ（“BHQ1”）部分进行标记并且与EAS1A退火。
这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分，并且斜体碱基表示存在于较长寡聚核苷酸的背景中的等同于DF的那些。
EAS1_10（EAS1A）
CTCTTCCTCAGCACCTGATT
EAS2_11（EAS2A）
AATCAGGTGCTGA
EAS1_12（EAS1B）
TCAGTCCCACGTGTGA
EAS2_13（EAS2B）
TCAGCACCTCACACGTGGGAAGAG
15.2部分酶寡聚核苷酸和靶标
部分酶被设计为使得催化活性的MNA酶将在靶标（PPIA的cDNA）的存在下形成。部分酶A（PPIAA2/1）以及部分酶B（PPIAB3/1）的序列从5’到3’在下文列出，其中加下划线的碱基形成经装配的MNA酶的活性催化核心的至少部分，粗体的碱基与靶标杂交，并且斜体碱基与MNA酶底物杂交。
部分酶A PPIAA2/1：
Figure BDA00003457832002041
CGGTCGAAATAGTGAGT
部分酶B PPIAB3/1：
CATCTCTTCTCCGAGC
PPIA cDNA靶标是通过使用基因特异性3’引物（3PPIA）产生。该引物的序列从5’到3’列于下文。
3PPIA
GCGCTCCATGGCCTCCAC
15.3MNA酶底物
MNA酶活性是通过双重标记的核酸报道物MNA酶底物的切割来监测。MNA酶底物序列是包含RNA和DNA核苷酸两者的嵌合序列，该嵌合序列已经在先前用作8:17DNA酶底物（Li（李）等人，2000）。在当前实例中，报道物MNA酶底物底物被指定为（Sub1i-FIB），并且是用内部的荧光素dT（“iFluorT”）部分以及在3’端用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行标记。Sub1i-FIB的标记序列是如下，5’到3’。小写碱基表示RNA，而大写碱基表示DNA。斜体碱基形成DF-a，而加下划线的碱基将形成RE Mnl I的识别序列的部分。
底物，Sub1i-FIB；
ACTCACTATa
Figure BDA00003457832002051
15.4cDNA靶标的产生
靶标cDNA是通过从K562细胞系（Promega）衍生的总RNA的逆转录产生。根据制造商的说明书（Bioline，Aust）使用Tetro cDNA合成试剂盒来进行逆转录，除了使用200nM的基因特异性3’引物（3PPIA）来产生PPIAcDNA外。
15.5EzyAmp反应组分和条件
MNA酶底物由催化活性的MNA酶的切割以及荧光标记的CESA组分（EAS1_10和EAS1_12）由RE Mnl I的切割是通过荧光的增加来测量。测试反应是通过靶标（PPIA cDNA；反应(i)115pg，反应(ii)23pg）的添加启动的；“没有靶标的对照”反应（反应(iii)）是通过H2O的添加启动的。所有反应是在35°C、在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）中、在25μL的总反应体积中进行的。每1分钟后在通道1（FAM）中对每个反应的荧光信号进行读取，持续150个循环（扫描模式：仅FAM/SYBR）。所有的反应包含以下项的散装混合物：300nM部分酶A（PPIAA2/1）、150nM部分酶B（PPIAB3/1）、以及30nM Sub1i-FIB；EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、以及EAS2_13各自100nM，连同在10mM MgCl2（Ambion）、1x BSA（新英格兰生物实验室）、核酸酶游离水（Ambion）以及1x NE缓冲液1（新英格兰生物实验室；使用KOH调节pH至8.5）中的0.75U Mnl I。所有的寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。
15.6结果：靶标cDNA的存在的检测
图26示出了对于包含115pg的cDNA的反应(i)以及包含23pg的cDNA的反应(ii)的荧光的增加。靶标的量决定了在EzyAmp反应中产生荧光信号所需要的时间。存在的靶标分子越少，产生可检测荧光信号所用的时间越长。对于‘没有靶标的对照’反应（反应(iii)）的接近于第一个110分钟中没有观察到信号的增加（即使在这个时间之后观察到了一些荧光的漂移）。这指示催化活性的MNA酶的形成被需要用于DF-产生以及随后的EzyAmp信号放大，并且这只有在适合靶标（在此实例中是PPIA cDNA）的存在下才被启动。
实例16
以下实例证明了寡聚核苷酸形成由热稳定的RE（称为TspRI）可切割亦或不可切割的不同双链体结构的能力。
16.1.寡聚核苷酸
对于以下反应，将寡聚核苷酸片段合并以形成双链体，测试这些双链体的它们充当RE TspRI底物的作用的能力。CESA、PESA和EIC的示例性结构展示于图1中。在此实例中，不同的双链体各自包含一种寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸包括形成用于TspRI的双链RERS的一条链所需要的所有碱基。
通过观察在CESA复合体由TspRI切割之后由于荧光团与淬灭剂部分的分离造成的荧光变化来检测RE切割活性。在此实例中，EAS1在其5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）部分进行末端标记，并且包含对应于形成RETspRI的RERS的一条链所需要的所有碱基的序列。EAS2在其3’端是用6-荧光素（“FAM”）部分进行末端标记，并且包含形成该RERS的第二链所需要的一些碱基。EAS2和EAS1被设计为退火以形成PESA复合体（图1C）。DF-1（仅包括脱氧核糖核苷酸）亦或DF-2（包括脱氧核糖核苷酸和一个核糖核苷酸）与PESA的杂交被设计为形成一个CESA，该CESA对应地包含具有所有DNA核苷酸的RERS或具有一个RNA核苷酸的RERS（图1A）。可替代地，抑制片段（InF）的杂交被设计为形成酶抑制复合体（EIC）（图1B）。InF是用荧光素部分在位置14中的T碱基上进行内部标记，并且用IaBFQ部分进行3’末端标记。最后，包含完全连续的RERS的反义对照链（ASC）被包括作为阳性对照。存在于每个反应中的寡聚核苷酸从5’到3’在下文列于表15中。贡献至TspRI的识别和切割位点的碱基是5’NNCASTGNN/3’和3’/NNGTSACNN5’，其中“N”可以是任何碱基，“S”可以是C或G，并且“/”指示切割位点。
表15：用于TspRI的反应A至F的寡聚核苷酸组分
Figure BDA00003457832002071
Figure BDA00003457832002081
在表16中提供了表15中的每个寡聚核苷酸的序列。大写字母指示DNA，而小写字母指示RNA。可以潜在贡献至TspR1识别和切割位点的碱基书写为粗体。
表16
Figure BDA00003457832002082
16.2.反应组分
反应A、B、C、D、E和F被建立为包含如列于表15中的寡聚核苷酸。所有的反应包含在核酸酶游离水（Ambion）、1x BSA（新英格兰生物实验室）、20mM MgCl2（Ambion）、以及20mM Tris HCl pH8.5（Sigma-Aldrich）中的100nM的EAS1；50mM乙酸钾（Sigma-Aldrich）；1mMDTT（Sigma-Aldrich）以及10mM乙酸镁（Sigma-Aldrich）。反应A至E包含2U TspRI（新英格兰生物实验室），而反应F不包含。除此之外，反应A包含各自100nM的EAS2和DF-1；反应B包含各自100nM的EAS2和DF-2；反应C包含各自100nM的EAS2和InF；反应D包含100nM的EAS2；而反应E和F包含100nM的ASC。寡聚核苷酸购自IDT。反应是在47°C在CFX96TM实时PCR检测系统（Bio-Rad）中、在25μL的总体积中进行的。每1秒后在通道1中（FAM；扫描模式：仅SYBR/FAM）对每个样品的荧光进行程序化读取，持续总共100个循环（总的反应时间接近于17分钟）。
16.3.结果：切割的检测
在反应E中观察到荧光信号随着时间推移而增加，该反应E包含EAS1以及它的全部互补链ASC，指示此结构易于由TspRI切割。对于反应F没有观察到荧光的增加，该反应F包含EAS1以及它的全部互补链ASC，但是缺少TspRI。
在反应A中观察到荧光随着时间推移而增加，指示DF-1（仅包含DNA）可以结合至PESA，完成RER并且形成由RE切割的CESA。这证明了TspRI可以切割在其限制性位点内包含切口的双链体。在反应B中也观察到了荧光的增加，该反应B包含DF-2，该DF-2具有一个核糖核苷酸，该核糖核苷酸作为完成RERS的序列的部分。这指示CESA形成，并且TspRI可以切割包含切口以及在其识别和切割序列内的核糖核苷酸的双链体。相反，在反应C中没有看到荧光的增加，该反应C包含PESA和InF，指示这些寡聚核苷酸已经形成EIC。类似地，在反应D中没有看到荧光的增加，该反应D仅包含PESA，指示全部的RERS被需要用于RE的切割。这样，TspRI类似于展示如在实例6表13中详细描述的模式II的那些酶。
可以得出结论：由于TspRI的活性可以通过改变双链体底物的结构来操纵，它是理想的用于EzyAmp的候选RE。此酶还是高度热稳定的，并且因此对由加热造成的变性是有抗性的。这样，可以将此酶与模板（例如基因组DNA）混合，并且进行加热以将双螺旋的两条链分开，因此提供了适用于用蛋白或核酸酶切割的单链模板。例如，单链DNA模板可以发挥用于MNA酶的装配促进物的功能，并且因此可以用于启动EzyAmp反应。与TspRI类似，MNA酶将不受热变性步骤的影响，由于它已经证明了在PCR反应中的效用。可替代地，单链DNA将对于由合成寡聚核苷酸起始物（SIO）的结合而言是可以进入的，该合成寡聚核苷酸起始物可以进而以类似于图8至11中所展示的那些类似的策略由热稳定蛋白核酸酶来切割。
实例17
以下实例证明了CESA在其匹配的DF的存在下形成之后由RE切割的能力。在此策略中，通过CESA的切割产生的片段之一对应于最初DF的缩短形式。这样，此切割片段具有发挥用于另一个PESA的DF功能的潜力，如在图27A中所展示的，导致自我反馈信号放大。
17.1寡聚核苷酸
在以下反应中，CESA是由PESA和DF（DF1）组成。进而，PESA是由EAS1（EAS1_1）和EAS2（EAS2_2）组成。PESA的EAS2包含在其内的一个区域，该区域等同于DF的缩短序列。
通过对应于荧光团与淬灭剂的分离而产生的荧光变化来监测RE活性。在当前实例中，EAS1在5’端是用爱荷华黑FQ（“IAbFQ”）以及在3’端用黑洞淬灭剂1（“BHQ_1”）进行末端标记。EAS2在5’端是用6-荧光素（“6-FAM”）标记，并且与EAS1退火。这些寡聚核苷酸的序列从5’到3’列于下文中，其中加下划线的碱基形成Mnl I的识别序列（CCTC或GAGG）的至少部分。斜体粗体碱基表示等同于存在于EAS2的背景中的DF1的缩短形式的那些。
EAS1_1（EAS1）
CTCTTCCTCTCTTCCCGGATGTCGGCCTCCTAGTACAGCG
EAS2_2（EAS2）
ATCACATCCG
Figure BDA00003457832002101
DF1（DF）
GGAAGAGAT
17.2反应条件
寡聚核苷酸是购自集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT）。所有的反应包含由以下项的散装混合物：在10mM MgCl2（Ambion）中的各自100nM的EAS1_1和EAS2_2，1x BSA（新英格兰生物实验室），1x NE缓冲液4（新英格兰生物实验室），核酸酶游离水（Ambion）以及0.75U Mnl I（新英格兰生物实验室）。总的反应体积是25μL。测试反应(i)是通过100nM DF的添加启动的，而对照反应(ii)是通过H2O的添加启动的。这些反应是在35°C在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）中重复运行两次。每30秒后对每个样品的荧光进行程序化读取，持续200个循环（扫描模式：仅FAM/SBYR）。总运行时间是125分钟。
17.3结果：CESA切割的检测
将对于每个重复两次的反应的平均荧光读数针对时间绘图，并且示出于图27B中。在反应(i)中，DF的添加导致荧光随着时间推移而增加(i)。相反，在DF的不存在下没有观察到荧光随着时间推移而增加(ii)。
结果证明CESA的形成需要DF的添加。进而，CESA由Mnl I的切割导致一些片段的解离，这些片段包括含有荧光团和淬灭剂部分的那些（如由荧光增加所指示的）。此外，切割片段之一对应于最初DF序列的缩短形式。这个新的DF可以通过结合至另一个PESA而潜在地执行与起始DF相同的功能。

Claims (263)

1.一种组合物，包括一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中该EAS1与EAS2形成一个第一全酶信号放大器（CESA）复合体，该复合体只有与一个第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于第一核酸酶的一个识别序列和一个切割序列，并且其中一部分该第一DF与一部分该EAS1互补。
2.一种组合物，包括一种EAS1、一种EAS2、以及一种第一核酸酶，其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中该EAS1与EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与一个第一DF装配在一起时才包括用于所述第一核酸酶的一个识别序列和一个切割序列，其中一部分该第一DF与一部分该EAS1互补。
3.一种组合物，包括一种多组分核酸酶（MNA酶）、一种MNA酶底物、一种EAS1、一种EAS2、以及一种第一核酸酶，其中：
该MNA酶包括至少一个第一部分酶以及一个第二部分酶，这些部分酶在一种MNA酶装配促进物的存在下自我装配以形成该MNA酶，其中所述至少第一和所述第二部分酶各自包括一个底物臂部分、一个催化核心部分、以及一个传感臂部分，并且其中这些传感臂与所述MNA酶装配促进物相互作用从而维持该第一和第二部分酶相互靠近以用于它们对应的催化核心部分的关联，从而形成该MNA酶的催化核心，并且所述催化核心能够修饰所述MNA酶底物从而形成一个第一DF；
并且其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且其中该第一DF能够与该EAS1与该EAS2装配以形成一个第一CESA复合体，该复合体包含用于所述至少第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述MNA酶底物是包括第一和第二链的一个寡聚核苷酸复合体的一个第一链，其中所述第一链包括一个内部环部分，并且在该内部环部分内的碱基与该第二链的碱基不杂交，并且其中该MNA酶能够切割该内部环部分。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述第二链包括该第一DF。
6.如权利要求4或权利要求5所述的组合物，其中所述第一和第二链在一端由一个发夹环部分连接。
7.如权利要求3所述的组合物，其中所述MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的一个发夹环部分，所述MNA酶能够切割该发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的一个双链茎部分的一条链中。
8.如权利要求3至7中任一项所述的组合物，其中该装配促进物是一种有待鉴定的靶标。
9.一种组合物，包括一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、一种EAS1、一种EAS2、一种第一核酸酶、以及一种第二核酸酶，其中：
该SIO能够与靶标杂交从而形成一种双链体底物，其中所述第一核酸酶能够切割该双链体底物从而产生一个第一DF；并且其中；
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且其中该EAS1与该EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与该第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
10.如权利要求9所述的组合物，其中只有当该SIO与靶标杂交时，所述第一核酸酶才能够切割该SIO以产生所述第一DF。
11.如权利要求9所述的组合物，其中只有当靶标与该SIO杂交时，所述第一核酸酶才能够切割该靶标以产生所述第一DF。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述第一核酸酶不是一种限制性内切酶。
13.如权利要求9至12中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸酶是一种核酸外切酶。
14.如权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中该第一和第二核酸酶是相同的核酸酶。
15.如权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中该第一和第二核酸酶是不同的核酸酶。
16.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
17.如权利要求9至15中任一项所述的组合物，其中所述第二核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
18.如权利要求16或权利要求17所述的组合物，其中所述切口是位于该核酸酶识别位点内、该核酸酶切割位点处、或这些核酸酶识别和切割位点之间。
19.如权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中该第一DF结合到所述EAS1完成了一个部分核酸酶识别序列。
21.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中该第一DF结合到所述EAS1完成了一个部分核酸酶切割序列。
22.如权利要求20或权利要求21所述的组合物，其中该第一DF向所述序列贡献至少一个碱基。
23.如权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中该第一DF向所述序列贡献至少两个碱基。
24.如权利要求20至23中任一项所述的组合物，其中该第一DF向所述序列贡献至少三个碱基。
25.如权利要求22至24中任一项所述的组合物，其中所述碱基刚好是由所述EAS1和EAS2的结合形成的一个部分核酸酶识别位点的3’。
26.如权利要求22至24中任一项所述的组合物，其中所述碱基刚好是由所述EAS1和EAS2的结合形成的一个部分核酸酶识别位点的5’。
27.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中该第一DF不向所述核酸酶识别或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
28.如权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述EAS1和EAS2是一种发夹寡聚核苷酸的组分，该发夹寡聚核苷酸包括由所述EAS1和EAS2的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的一个发夹环部分。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述发夹环部分是一种寡聚核苷酸接头或一种非寡聚核苷酸接头。
30.如权利要求28或权利要求29所述的组合物，其中所述发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS1或EAS2的任一个延伸的一个单链的5’或3’突出部分。
31.如权利要求1至30中任一项所述的组合物，其中所述一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF，并且其中所述第二DF可以在由该核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
32.如权利要求28至30中任一项所述的组合物，其中一部分所述发夹环部分包括一个第二DF，并且其中所述第二DF可以在由该核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
33.如权利要求31或权利要求32所述的组合物，其中所述第一DF和所述第二DF不是相同的。
34.如权利要求31或权利要求32所述的组合物，其中所述第一DF和所述第二DF是相同的。
35.如权利要求31或权利要求32所述的组合物，其中所述第二DF是所述第一DF的一个片段，或者所述第一DF是所述第二DF的一个片段。
36.如权利要求34或权利要求35所述的组合物，其中所述第二DF、EAS1、和EAS2能够装配以形成所述第一CESA复合体。
37.如权利要求31至33中任一项所述的组合物，进一步包括一种第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及一种第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4），其中一部分该EAS3与一部分该EAS4互补，并且一部分该EAS3与一部分该第二DF互补，并且其中该EAS3与该EAS4形成一个第二CESA复合体，该复合体只有在与该第二DF装配在一起时才包含用于一种额外的核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
38.如权利要求37所述的组合物，其中该EAS3或该EAS4包括一个第三DF。
39.如权利要求38所述的组合物，其中该第三DF与所述第一DF是相同的。
40.如权利要求38所述的组合物，其中该第三DF与所述第一DF不是相同的。
41.如权利要求37至40中任一项所述的组合物，其中所述额外的核酸酶与在所述组合物中的另一核酸酶是相同的。
42.如权利要求37至40中任一项所述的组合物，其中所述额外的核酸酶与在所述组合物中的另一核酸酶不是相同的，并且其中所述组合物包括所述额外的核酸酶。
43.如权利要求37至42中任一项所述的组合物，其中所述额外的核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
44.如权利要求37至43中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspRI。
45.如权利要求37至44中任一项所述的组合物，其中该第二DF结合到所述EAS3完成了一个部分核酸酶识别序列和/或一个核酸酶切割序列。
46.如权利要求37至44中任一项所述的组合物，其中该第二DF不向所述核酸酶识别序列或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
47.如权利要求37至46中任一项所述的组合物，其中所述EAS3和EAS4是一种发夹寡聚核苷酸的组分，该发夹寡聚核苷酸包括由EAS3和EAS4的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的一个发夹环部分。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述发夹环部分是一种寡聚核苷酸接头或一种非寡聚核苷酸接头。
49.如权利要求47或权利要求48所述的组合物，其中所述发夹寡聚核苷酸包括从所述EAS3或EAS4的任一个延伸的一个单链的5’或3’突出部分。
50.一种包括一种第一复合体的组合物，所述第一复合体包括一个主链寡聚核苷酸、一个EAS1、一个EAS2、一个EAS3、以及一个EAS4，其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS1的一个第一部分，其中一部分所述EAS1与一部分的一个EAS2互补，一部分该EAS2与一部分的一个第一DF互补，并且一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF，并且其中该EAS1与该EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包含用于一种第一核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；
(ii)包括所述EAS3的一个第二部分，其中一部分所述EAS3与一部分所述EAS4互补，一部分所述EAS3与一部分该第二DF互补，并且一部分所述EAS3或EAS4包括所述第一DF，并且其中该EAS3与该EAS4形成一个第二CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于一种第二核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分。
51.如权利要求50所述的组合物，进一步包括一种第二复合体，所述第二复合体包括一个主链寡聚核苷酸、一个第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）、一个第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）、一个第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）、以及一个第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8），其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS5的一个第一部分，其中一部分所述EAS5与一部分所述EAS6互补，一部分所述EAS5与一部分所述第二DF互补，并且一部分所述EAS5或EAS6包括所述第一DF，并且其中该EAS5与该EAS6形成一个第三CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于一种第三核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(ii)包括所述EAS7的一个第二部分，其中一部分所述EAS7与一部分所述EAS8互补，一部分所述EAS8与一部分所述第一DF互补，并且一部分所述EAS7或EAS8包括所述第二DF，并且其中该EAS7与该EAS8形成一个第四CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包含用于一种第四核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补。
52.如权利要求51所述的组合物，其中EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
53.如权利要求51或权利要求52所述的组合物，其中该第一核酸酶与该第三核酸酶相同，和/或该第二核酸酶与该第四核酸酶相同，和/或该第一、第二、第三以及第四核酸酶是相同的。
54.如权利要求51至53中任一项所述的组合物，其中第一和第二复合体经由它们对应的互补的第三部分进行杂交，形成一个第一双重复合体。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述第一双重复合体连接至一个第二双重复合体。
56.如权利要求55所述的组合物，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
57.如权利要求55或权利要求56所述的组合物，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
58.如权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中所述连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、共价键合以及肽接头中的任何一种或多种来达到的。
59.如权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中所述连接是经由一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的经生物素化的多个酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
60.如权利要求50至59中任一项所述的组合物，其中所述第一和/或所述第二核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
61.如权利要求50至60中任一项所述的组合物，其中所述第一和/或所述第二核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、MspI、Ear I、以及TspR I。
62.如权利要求51至61中任一项所述的组合物，其中所述第一DF结合到所述EAS2或EAS8和/或所述第二DF结合到所述EAS3或EAS5完成了一个部分核酸酶识别序列和/或一个部分核酸酶切割序列。
63.如权利要求51至61中任一项所述的组合物，其中所述第一DF到所述EAS2或EAS8的结合和/或所述第二DF到所述EAS3或EAS5的结合不向所述核酸酶识别序列或所述核酸酶切割序列贡献任何碱基。
64.如权利要求51至63中任一项所述的组合物，其中选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是一个发夹寡聚核苷酸的一个组件，该发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的一个发夹环部分。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述发夹环部分是一种寡聚核苷酸接头或一种非寡聚核苷酸接头。
66.如权利要求64或权利要求65所述的组合物，其中所述发夹寡聚核苷酸包括一个单链的5’或3’突出部分。
67.包括一种SIO的一种组合物，所述SIO包括：
(i)与一个靶标链互补的一个第一部分以及与所述靶标链不互补的一个第二部分，其中所述第一和第二部分是由一种硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括一个第一DF；以及，
(ii)一个EAS1以及一个EAS2，其中
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且该EAS1与该EAS2的杂交提供了在任一端具有一个3’突出端的一个双链体结构，
一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且
该EAS1与该EAS2能够形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包括能够由一种第一核酸酶所酶解的一个凹3’端。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述SIO是一种发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的一个双链茎、一个单链发夹环、以及一个3’突出端。
69.如权利要求67或权利要求68所述的组合物，其中该核酸酶是一种核酸外切酶。
70.如权利要求69所述的组合物，其中该核酸外切酶不能酶解单链寡聚核苷酸、包括具有5个或更多个碱基的一个3’突出端的双链寡聚核苷酸，或硫代磷酸酯核苷酸间连键。
71.如权利要求1至70中任一项所述的组合物，其中任何所述第一DF是使用一种核酸内切酶或一种核酸外切酶产生的。
72.如权利要求71所述的组合物，其中该核酸外切酶是选自下组，该组由以下各项组成：核酸酶BAL-31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I以及核酸外切酶T。
73.如权利要求71或权利要求72所述的组合物，其中该核酸外切酶是核酸外切酶III。
74.如权利要求71所述的组合物，其中该核酸内切酶是T7核酸内切酶I、RNase H、侧翼核酸酶、或绿豆核酸酶。
75.如权利要求1至74中任一项所述的组合物，其中任何所述EAS包括一种或多种可检测标记。
76.如权利要求1至75中任一项所述的组合物，其中任何所述EAS包括一个荧光团部分和/或一个淬灭剂部分。
77.如权利要求1至76中任一项所述的组合物，其中任何所述部分酶、装配促进物、MNA酶底物、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、或SIO包括至少一个选自下组的核苷酸替换物或增加物，该组由以下各项组成：硫代磷酸酯、4-乙酰胞苷、5-(羟甲基羧基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、βD-半乳糖辫苷、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、βD-甘露糖甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、βD-阿糖尿苷以及βD-阿糖胸苷。
78.如权利要求3至8中任一项所述的组合物，其中该MNA酶部分酶、MNA酶底物或其组合的至少一个进一步包括一个适体或其部分。
79.如权利要求78所述的组合物，其中该适体或其部分包括以下项中的至少一个：一种核酸、肽、多肽、蛋白，其一种衍生物，或它们的一个组合。
80.如权利要求1至79中任一项所述的组合物，其中任何所述的MNA酶部分酶、MNA酶底物、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF或核酸酶附接至一个固体支持物上。
81.如权利要求1、2、或50中任一项所述的组合物，其中所述第一DF只有在一种靶标的存在下才产生。
82.如权利要求3、9、或50中任一项所述的组合物，其中所述第一DF与所述靶标是相异的。
83.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述组合物是用于检测一种靶标，并且第一DF与所述靶标是相异的。
84.如权利要求1至83中任一项所述的组合物，其中任何所述EAS可以与另一EAS杂交从而形成一个部分酶信号放大器（PESA）复合体，该复合体能够与多于一种DF杂交。
85.如权利要求3至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括特异性针对一种靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
86.如权利要求85所述的组合物，其中特异性针对所述靶标分子的不同部分的所述MNA酶，在所述靶标的存在下装配时识别并且切割相同底物。
87.如权利要求3至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括对于相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
88.如权利要求9或权利要求67所述的组合物，其中所述组合物包括对于相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
89.如权利要求1至3、9、50或67中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括与一种不同的第一DF装配的、至少两种相异的第一CESA复合体。
90.用于检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)提供两种或更多种部分酶以及至少一种多组分核酸（MNA酶）底物，其中这些部分酶在靶标的存在下进行自我装配以形成至少一种MNA酶；
(b)在允许该MNA酶的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含该靶标的一个样品接触，并且其中所述MNA酶的催化活性从所述至少一种MNA酶底物产生一种第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）；
(c)提供一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）和一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中一部分该EAS1与一部分该第一DF互补并且；
(d)在允许以下项的条件下使该EAS1与该EAS2与该第一DF接触；
(1)该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配，从而形成一个第一全酶信号放大器（CESA）复合体，以及
(2)用于一种第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的形成；
(e)提供该第一核酸酶；并且
(f)在允许该核酸酶与该识别位点相互作用并且在该切割位点处切割的条件下，使该第一核酸酶与该第一CESA复合体接触，其中由所述第一核酸酶进行的切割产生指示该靶标的存在的一种可检测效应。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述第一核酸酶能够切割一个双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一核酸酶的所述识别位点和/或所述切割位点的两条链的至少一条中的一个切口。
92.如权利要求90或权利要求91所述的方法，其中该第一DF是通过该MNA酶底物的切割而产生。
93.如权利要求90或权利要求91所述的方法，其中该第一DF是通过两种或更多种MNA酶底物的连接而产生。
94.如权利要求90至92中任一项所述的方法，其中所述MNA酶底物是包括第一和第二链的一个寡聚核苷酸复合体的一个第一链，其中所述第一链包括一个内部环部分，并且在该内部环部分内的碱基与该第二链的碱基不杂交，并且其中该MNA酶能够切割该内部环部分。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述第二链包括该第一DF。
96.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述第一和第二链在一端由一个发夹环部分连接。
97.如权利要求90至92中任一项所述的方法，其中所述MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的一个发夹环部分，所述MNA酶能够切割该发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的一个双链茎部分的一条链中。
98.用于检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)提供至少一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）；
(b)在允许该SIO与该靶标的杂交的条件下，使该SIO与推定包含该靶标的一个样品接触，因此为一种第一核酸酶创造一种双链体底物；
(c)提供一个能够切割由该SIO与该靶标的杂交形成的该双链体底物的第一核酸酶，其中由该第一核酸酶对该双链体底物的切割产生一个第一DF；
(d)提供一种EAS1和一种EAS2，其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中一部分该EAS1与一部分该第一DF互补并且；
(e)在允许以下项的条件下使该EAS1与该EAS2与该第一DF接触：
(1)该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配，从而形成一个第一CESA，以及
(2)用于一种第二核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的形成；
(f)提供一种第二核酸酶；并且
(g)在允许该第二核酸酶与识别位点相互作用并且在切割位点处切割的条件下，使该第二核酸酶与该第一CESA接触，其中由该第二核酸酶进行的切割产生指示该靶标的存在的一种可检测效应。
99.如权利要求98所述的方法，其中只有在所述SIO与该靶标杂交时，该第一核酸酶切割所述SIO以产生所述第一DF。
100.如权利要求98所述的方法，其中只有在所述靶标与该SIO杂交时，该第一核酸酶切割所述靶标以产生所述第一DF。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述第一核酸酶不是一种限制性内切酶。
102.如权利要求98至101中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶是一种核酸外切酶。
103.如权利要求90至102中任一项所述的方法，其中该第一CESA复合体的切割允许一个另外的DF的释放，并且该另外的DF与另外的酶放大器底物寡聚核苷酸装配以形成一个另外的CESA复合体，并且至少一种核酸酶被用来切割该另外的CESA复合体，从而产生另外的可检测效应并且释放另外的DF，由此协助可检测效应的一个进一步增大。
104.使用一种级联反应检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)产生一种第一DF，其中所述第一DF仅在所述靶标的存在下产生，
(b)提供：
(i)一种EAS1以及一种EAS2其中：
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补：
一部分该EAS1与一部分该第一DF互补；并且
一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF；
以及，
(ii)一个第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及一个第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4）其中：
一部分该EAS3与一部分该EAS4互补；
一部分该EAS3与一部分该第二DF互补；
(c)接触：
(i)在允许该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配的条件下，该EAS1与该EAS2与(a)的第一DF接触，以形成包括用于一种第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第一CESA复合体；
(ii)在允许该第一核酸酶与该第一CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第一CESA复合体与该第一核酸酶接触，其中由该第一核酸酶在该切割位点处进行的切割释放该第二DF；
(d)接触：
(i)在允许该第二DF与该EAS3与该EAS4的装配的条件下，该EAS3与该EAS4与该第二DF接触，以形成包括用于一种第二核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第二CESA复合体；
(ii)在允许该第二核酸酶与该第二CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第二CESA复合体与该第二核酸酶接触，其中该第二核酸酶在所述切割位点处切割所述第二CESA复合体；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生一种可检测效应。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述第一CESA复合体以及所述第二CESA复合体的切割各自产生一种可检测效应。
106.如权利要求104和权利要求105所述的方法，其中所述第一核酸酶和所述第二核酸酶是相同的核酸酶。
107.如权利要求104和权利要求105所述的方法，其中所述第一核酸酶和所述第二核酸酶是不同的核酸酶。
108.如权利要求104至107中任一项所述的方法，其中一部分所述EAS3或所述EAS4包括一种额外的DF，并且由该第二核酸酶在该第二CESA复合体的所述切割部位处的切割释放所述额外的DF。
109.如权利要求108所述的方法，其中一部分所述额外的DF的与一个第一部分的一个第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）互补，其中一个第二部分的所述EAS5与一部分的一个第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）互补，并且其中所述EAS5和EAS6与所述额外的DF装配以形成一个第三CESA复合体。
110.如权利要求108所述的方法，其中：
(i)一部分该额外的DF与所述第一DF相同；
(ii)该额外的DF与所述第一DF相同；或
(iii)该额外的DF是所述第一DF的一个片段；
并且其中所述额外的DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA复合体。
111.使用一种级联反应检测多种相异靶标的一种方法，该方法包括：
(a)产生至少一种第一DF和一种第二DF，其中所述第一DF仅在一个第一靶标的存在下产生，并且所述第二DF仅在一个第二靶标的存在下产生；
(b)提供：
(i)一种EAS1和一种EAS2其中：
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补：
一部分该EAS1与一部分该第一DF互补；以及
(ii)一种EAS3和一种EAS4其中：
一部分该EAS3与一部分该EAS4互补：
一部分该EAS3与一部分该第二DF互补；
(c)接触：
(i)在允许该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配的条件下，该EAS1与该EAS2与(a)的第一DF接触，以形成包括用于一种第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第一CESA复合体；
(ii)在允许该第一核酸酶与该第一CESA复合体的所述识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第一CESA复合体与该第一核酸酶接触，其中所述第一核酸酶在所述切割位点处切割所述第一CESA复合体，产生一种第一可检测效应；
(d)接触：
(i)在允许该第二DF与该EAS3与该EAS4的装配的条件下，该EAS3与该EAS4与该第二DF接触，以形成包括用于一种第二核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第二CESA复合体；
(ii)在允许该第二核酸酶与该第二CESA复合体的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第二CESA复合体与该第二核酸酶接触，其中所述第二核酸酶在所述切割位点处切割所述第二CESA复合体，产生一种第二可检测效应；
并且其中所述第一可检测效应与所述第二可检测效应相异。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述第一核酸酶和所述第二核酸酶是相同的核酸酶。
113.如权利要求111和权利要求112所述的方法，其中所述第一核酸酶和所述第二核酸酶是不同的核酸酶。
114.如权利要求111至113中任一项所述的方法，其中
(i)所述EAS1或所述一部分EAS2包括一种额外的DF，并且由该第一核酸酶在该第一CESA复合体的所述切割位点处进行的切割释放所述额外的DF；并且
(ii)所述额外的DF与至少两种额外的EAS寡聚核苷酸装配以形成一个额外的CESA复合体，并且由一种核酸酶对所述额外的CESA复合体的切割增大所述第一可检测效应。
115.如权利要求111至114中任一项所述的方法，其中
(i)一部分所述EAS3或所述EAS4包括一种额外的DF，并且由该第二核酸酶在该第二CESA复合体的所述切割位点处进行的切割释放所述额外的DF；并且
(ii)所述额外的DF与至少两种额外的EAS寡聚核苷酸装配以形成一个额外的CESA复合体，并且由一种核酸酶对所述额外的CESA复合体的切割增大所述第二可检测效应。
116.使用一种级联反应检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)产生一种第一驱动片段，其中仅在所述靶标的存在下提供所述第一驱动片段；
(b)提供：
(i)一种EAS1和一种EAS2其中：
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补；
一部分该EAS1与一部分该第一DF互补；
一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF；并且
该EAS1或该EAS2被拴系至一个支持物上；
(ii)一种EAS3和一种EAS4其中：
一部分该EAS3与一部分该EAS4互补：
一部分该EAS3与一部分该第二DF互补；
一部分该EAS3或EAS4包括一个第三DF；并且
该EAS3或该EAS4被拴系至一个支持物上；
(c)接触：
(i)在允许该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配的条件下，该EAS1与该EAS2与(a)的所述第一DF接触，以形成包括用于一种第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第一CESA；
(ii)在允许该第一核酸酶与该第一CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第一CESA与该第一核酸酶接触，其中由该第一在所述切割位点处进行的切割释放该第二DF；
(d)接触：
(i)在允许该第二DF与该EAS3与该EAS4的装配的条件下，该EAS3与该EAS4与该第二DF接触，以形成包括用于一种第二核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第二CESA；
(ii)在允许该第二核酸酶与该第二CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第二CESA与该第二核酸酶接触，其中由该第二核酸酶在所述切割位点进行的切割释放该第三DF，该第三DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生一种可检测效应。
117.如权利要求104至116中任一项所述的方法，其中(a)的所述第一DF是通过以下项产生
在允许该SIO与该靶标的杂交的条件下，使该SIO与推定包含该靶标的一个样品接触，从而形成易于由一种起始物核酸酶修饰的一个双链体结构，并且
使该双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由该起始物核酸酶对在该双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第一DF。
118.如权利要求111至115中任一项所述的方法，其中(a)的所述第二DF是通过以下项产生
在允许该SIO与该靶标的杂交的条件下，使该SIO与推定包含该靶标的一个样品接触，从而形成易于由一种起始物核酸酶修饰的一个双链体结构，并且
使该双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由该起始物核酸酶对在该双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第二DF。
119.如权利要求117或权利要求118所述的方法，其中只有在该SIO与该靶标杂交时，所述起始物核酸酶切割该SIO以产生所述DF。
120.如权利要求117或权利要求118所述的方法，其中只有在该靶标与该SIO杂交时，所述起始物核酸酶切割该靶标以产生所述DF。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述起始物核酸酶不是一种限制性内切酶。
122.如权利要求117至121中任一项所述的方法，其中所述起始物核酸酶是一种核酸外切酶。
123.如权利要求117至112中任一项所述的方法，其中所述SIO被附接至一个支持物上。
124.如权利要求104至116中任一项所述的方法，其中(a)的所述第一DF是通过以下项产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含该靶标的一个样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第一DF。
125.如权利要求111至115中任一项所述的方法，其中(a)的所述第二DF是通过以下项产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含该靶标的一个样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第二DF。
126.如权利要求124或权利要求125所述的方法，其中所述MNA酶底物是包括第一和第二链的一个寡聚核苷酸复合体的一个第一链，其中所述第一链包括一个内部环部分，并且在该内部环部分内的碱基与该第二链的碱基不杂交，并且其中该MNA酶能够切割该内部环部分。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述第二链包括所述DF。
128.如权利要求126或权利要求127所述的方法，其中所述第一和第二链在一端由一个发夹环部分连接。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述发夹环部分是一种寡聚核苷酸接头或一种非寡聚核苷酸接头。
130.如权利要求124或权利要求125所述的组合物，其中所述MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的一个发夹环部分，所述MNA酶能够切割该发夹环部分，并且所述驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的一个双链茎部分的一条链中。
131.如权利要求104至130中任一项所述的方法，其中所述EAS3和EAS4是一种发夹寡聚核苷酸复合体的组分，该发夹寡聚核苷酸复合体包括在所述EAS3和EAS4的互补部分之间形成的一个双链部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的一个发夹环部分。
132.如权利要求90至130中任一项所述的方法，其中所述EAS1和EAS2是发夹寡聚核苷酸复合体的组分，该发夹寡聚核苷酸复合体包括在所述EAS1和EAS2的互补部分之间形成的一个双链部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的一个发夹环部分。
133.如权利要求131或权利要求132所述的方法，其中所述发夹环部分是一种寡聚核苷酸接头或一种非寡聚核苷酸接头。
134.如权利要求131至133中任一项所述的方法，其中所述发夹寡聚核苷酸复合体进一步包括从一个EAS寡聚核苷酸延伸的一个5’或一个3’突出单链部分。
135.如权利要求131至134中任一项所述的方法，其中所述发夹环部分包括一个可检测部分和/或一个淬灭剂部分。
136.如权利要求104至130中任一项所述的方法，其中该EAS3和/或EAS4包括一个可检测部分和/或一个淬灭剂部分，并且在由该第二核酸酶对该第二CESA进行切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供了一种可检测效应。
137.如权利要求136所述的方法，其中该EAS3包括一个可检测部分和一个淬灭剂部分，EAS4包括另外的淬灭剂部分，并且在由该第二核酸酶对该第二CESA进行切割时所述可检测部分和另外的淬灭剂部分分离，提供了一种可检测效应。
138.如权利要求90至130中任一项所述的方法，其中该EAS1和/或EAS2包括一个可检测部分和/或一个淬灭剂部分，并且在由该第一核酸酶对该第一CESA进行切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供了一种可检测效应。
139.如权利要求138所述的方法，其中该EAS1包括一个可检测部分和一个淬灭剂部分，该EAS2包括一个另外的淬灭剂部分，并且在由该第一核酸酶对该第一CESA进行切割时所述可检测部分和另外的淬灭剂部分分离，提供了一种可检测效应。
140.如权利要求135至139中任一项所述的方法，其中所述可检测部分是一个荧光团。
141.如权利要求90至97中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的一个切口。
142.如权利要求98至103中任一项所述的方法，其中所述第二核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的一个切口。
143.如权利要求104至137中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口，和/或所述第二核酸酶能够切割双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
144.如权利要求141至143中任一项所述的方法，其中所述切口是位于该核酸酶识别位点内、该核酸酶切割位点处、或这些核酸酶识别和切割位点之间。
145.如权利要求141至144中任一项所述的方法，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
146.如权利要求90至145中任一项所述的方法，其中该第一DF结合到所述EAS1完成了一个部分核酸酶识别位点和/或一个部分核酸酶切割位点。
147.如权利要求104至137中任一项所述的方法，其中该第二DF结合到所述EAS2完成了一个部分核酸酶识别位点和/或一个部分核酸酶切割位点。
148.如权利要求146或权利要求147所述的方法，其中该DF向所述部分核酸酶识别序列和/或一个部分核酸酶切割位点贡献至少一个碱基。
149.如权利要求146至148中任一项所述的方法，其中该DF向所述部分核酸酶识别位点和/或一个部分核酸酶切割位点贡献至少两个碱基。
150.如权利要求146至149中任一项所述的方法，其中该DF向所述部分核酸酶识别位点和/或一个部分核酸酶切割位点贡献至少三个碱基。
151.如权利要求148至150中任一项所述的方法，其中所述碱基刚好是由所述酶放大器底物寡聚核苷酸的结合形成的一个部分核酸酶识别位点的3’。
152.如权利要求148至150中任一项所述的方法，其中所述碱基刚好是由所述酶放大器底物寡聚核苷酸的结合形成的一个部分核酸酶识别位点的5’。
153.如权利要求90至145中任一项所述的方法，其中该第一DF不向所述核酸酶识别位点或所述核酸酶切割位点贡献任何碱基。
154.如权利要求104至137中任一项所述的方法，其中该第一DF不向所述核酸酶识别位点或所述核酸酶切割位点贡献任何碱基。
155.使用一种级联反应检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)产生一种第一驱动片段，其中所述第一驱动片段仅在所述靶标的存在下产生；
(b)提供包括一个主链寡聚核苷酸的一个第一复合体，所述第一主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括一个EAS1的一个第一部分，其中
一部分所述EAS1与一部分的一个EAS2互补；
一部分该EAS2与一部分该第一驱动片段互补；以及
一部分该EAS1或EAS2包括一个第二驱动片段；
(ii)包括一个EAS3的一个第二部分，其中
一部分所述EAS3与一个EAS4互补；
一部分所述EAS3与一部分该第二驱动片段互补；并且一部分该EAS3或EAS4包括所述第一驱动片段；以及，
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分；并且，
(c)接触：
(i)在允许该第一DF与该EAS1与该EAS2的装配的条件下，该EAS1与该EAS2与(a)的所述第一DF接触，以形成包括用于一种第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第一CESA；
(ii)在允许该第一核酸酶与该第一CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第一CESA与该第一核酸酶接触，其中由该第一核酸酶在所述切割位点处进行的切割释放该第二DF；
(d)接触：
(i)在允许该第二DF与该EAS3与该EAS4的装配的条件下，该EAS3与该EAS4与该第二DF接触，以形成包括用于一种第二核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第二CESA；
(ii)在允许该第二核酸酶与该第二CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第二CESA与该第二核酸酶接触，其中由该第二核酸酶在所述切割位点进行的切割释放该第一DF，该第一DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA；
并且其中所述第一CESA复合体和/或所述第二CESA复合体的切割产生一种可检测效应。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述第一CESA复合体的切割以及所述第二CESA复合体的切割各自产生一种可检测效应。
157.如权利要求155或权利要求156所述的方法，进一步包括：
(a)提供一个第二复合体，所述第二复合体包括一个主链寡聚核苷酸，该主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括一个第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）的一个第一部分，其中
一部分所述EAS5与一部分的一个第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）互补；并且
一部分该EAS5与一部分该第二驱动片段互补；并且
一部分该EAS5或EAS6包括该第一驱动片段；以及
(ii)包括一个第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）的一个第二部分，其中
一部分所述EAS7与一部分的一个第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8）互补；
一部分所述EAS8与一部分该第一驱动片段互补；
一部分该EAS7或EAS8包括所述第二驱动片段；以及，
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补；并且，
(b)在允许所述第一复合体的第三部分与所述第二复合体的第三部分杂交的条件下使所述第一和第二复合体接触，由此形成一个第一双重复合体；
(c)接触：
(i)在允许该第二DF与该EAS5与该EAS6的装配的条件下，该EAS5与该EAS6与(a)的所述第二DF接触，以形成包括用于一种第三核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第三CESA；
(ii)在允许该第三核酸酶与该第三CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第三CESA与该第三核酸酶接触，其中由该第三核酸酶在所述切割位点进行的切割释放该第一DF，该第一DF可以与所述EAS1和EAS2装配以形成所述第一CESA，并且与所述EAS7和EAS8装配以形成所述第四CESA；并且，
(d)接触：
(i)在允许该第一DF与该EAS7与该EAS8的装配的条件下，该EAS7与该EAS8与该第一DF接触，以形成包括用于一种第四核酸酶的一个识别位点和一个切割位点的一个第四CESA；
(ii)在允许该第四核酸酶与该第四CESA的识别位点和切割位点相互作用的条件下，该第四CESA与该第四核酸酶接触，其中由该第四核酸酶在所述切割位点进行的切割释放该第二DF，该第二DF可以与所述EAS3和EAS4装配以形成所述第二CESA，并且与所述EAS5和EAS6装配以形成所述第三CESA；
并且其中所述第三CESA复合体和/或所述第四CESA复合体的切割产生一种可检测效应。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述第三CESA复合体的切割以及所述第四CESA复合体的切割各自产生一种可检测效应。
159.如权利要求157或权利要求158所述的方法，其中EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
160.如权利要求157至159中任一项所述的方法，其中所述第一双重复合体连接至一个第二双重复合体。
161.如权利要求160所述的方法，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
162.如权利要求160或权利要求161所述的方法，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
163.如权利要求161或权利要求162所述的方法，其中所述连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、以及肽接头中的任何一种或多种来达到的。
164.如权利要求161或权利要求162所述的方法，其中所述连接是经由一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的经生物素化的多个酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
165.如权利要求155至164中任一项所述的方法，其中(a)的所述第一DF是通过以下项产生
在允许该SIO与该靶标的杂交的条件下，使该SIO与推定包含该靶标的一个样品接触，从而形成易于由一种起始物核酸酶修饰的一个双链体结构，并且
使该双链体结构与所述起始物核酸酶接触，
其中由该起始物核酸酶对在该双链体结构中配对或未配对的区域的修饰释放所述第二DF。
166.如权利要求165所述的方法，其中只有在该SIO与该靶标杂交时，所述起始物核酸酶切割该SIO以产生所述DF。
167.如权利要求165所述的方法，其中只有在该靶标与该SIO杂交时，所述起始物核酸酶切割该靶标以产生所述DF。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述起始物核酸酶不是一种限制性内切酶。
169.如权利要求155至164中任一项所述的方法，其中(a)的所述第一DF是通过以下项产生：提供两种或更多种部分酶以及至少一种MNA酶底物，并且在允许MNA酶在所述靶标存在下的自我装配和催化活性的条件下，使这些部分酶与推定包含该靶标的一个样品接触，其中所述催化活性修饰所述底物由此提供所述第一DF。
170.如权利要求157至169中任一项所述的方法，其中所述EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7和EAS8中的任何一种或多种包括一个可检测部分和一个淬灭剂部分，并且在该第一、第二、第三、和/或第四CESA的切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供一种可检测效应。
171.如权利要求157至169中任一项所述的方法，其中：
(i)该EAS1包括一个可检测部分并且所述EAS2包括一个淬灭剂部分或反之亦然；和/或
(ii)该EAS3包括一个可检测部分并且所述EAS4包括一个淬灭剂部分或反之亦然；和/或
(iii)该EAS5包括一个可检测部分并且所述EAS6包括一个淬灭剂部分或反之亦然；
(iv)该EAS7包括一个可检测部分并且所述EAS8包括一个淬灭剂部分或反之亦然；并且，
其中在该第一、第二、第三、和/或第四CESA的切割时所述可检测部分和淬灭剂部分分离，提供一种可检测效应。
172.如权利要求155至171中任一项所述的方法，其中任何所述核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一、第二或第三核酸酶的所述识别序列的两条链的至少一条中的一个切口。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspRI。
174.如权利要求155至171中任一项所述的方法，其中任何所述DF结合至一种酶放大器底物寡聚核苷酸完成了一个部分核酸酶识别位点和/或一个部分核酸酶切割位点。
175.如权利要求157至168中任一项所述的方法，其中选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是一个发夹寡聚核苷酸的一个组件，该发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的一个发夹环部分。
176.如权利要求90至175中任一项所述的方法，其中任何所述第一DF是使用选自一种核酸内切酶和一种核酸外切酶的核酸酶产生的。
177.如权利要求176所述的方法，其中该核酸外切酶是选自下组，该组由以下各项组成：核酸酶BAL-31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I以及核酸外切酶T。
178.如权利要求176所述的方法，其中该核酸内切酶是T7核酸内切酶I、RNaseH、侧翼核酸酶、或绿豆核酸酶。
179.使用一种级联反应检测一种靶标的一种方法，该方法包括：
(a)提供：
(i)与一个靶标链互补的一个第一部分以及与所述靶标链不互补的一个第二部分，其中所述第一和第二部分是由一种硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括一个第一DF；以及，
(ii)一种EAS1和一种EAS2，其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且该EAS1与该EAS2的杂交提供了在任一端具有一个3’突出端的一个双链体结构，并且一部分该EAS1与一部分该第一DF互补；
(iii)一种第一核酸外切酶；并且
(b)接触：
(i)在允许该SIO与该靶标杂交的条件下，所述SIO与推定包含该靶标的一个样品接触，因此创造用于一种第一核酸外切酶的一个双链体结构，其中由该第一核酸外切酶对该双链体结构修饰从所述双链体底物释放所述第一DF；
(ii)在允许该第一DF与所述EAS1和EAS2的装配的条件下，该EAS1与EAS2与(b)的第一DF接触，以形成包括用于一种第二核酸外切酶的一种底物的一个第一CESA复合体；
(iii)在允许该第二核酸外切酶与该第一CESA复合体相互作用的条件下，该第一CESA与该第二核酸外切酶接触，其中由该第二核酸外切酶对该第一CESA复合体修饰从所述第一CESA复合体释放所述第一DF，所述第一CESA复合体可以与额外的EAS1和EAS2装配以形成一个额外的第一CESA复合体；
并且其中该双链体结构的所述修饰和/或该第一CESA复合体的所述修饰提供一种可检测效应。
180.如权利要求179所述的方法，其中该双链体结构的所述修饰以及该第一CESA复合体的所述修饰提供一种可检测效应。
181.如权利要求179或权利要求180所述的方法，其中所述SIO是一种发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的一个双链茎、一个单链发夹环、以及一个3’突出端。
182.如权利要求179至181中任一项所述的方法，其中该第一和/或第二核酸外切酶是核酸外切酶III。
183.如权利要求179至182中任一项所述的方法，其中所述SIO和/或所述EAS1包含一个可检测部分以及一个淬灭剂部分，并且其中所述可检测部分和淬灭剂部分在由所述核酸外切酶进行修饰时可以分离以提供一种可检测效应。
184.根据权利要求183所述的方法，其中所述可检测部分是一个荧光团。
185.如权利要求90至184中任一项所述的方法，其中所述可检测效应是由荧光光谱、表面等离子体共振、质谱、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、圆二色性谱、免疫测定、色谱法、放射分析法、亮度测定法、闪烁照相术、电子法、UV、可见光或红外光谱、酶法或它们的任何组合来检测。
186.如权利要求90至185中任一项所述的方法，其中测量该可检测效应，并且其中该可检测效应的所述测量的幅度和/或积累率指示一种靶标的量。
187.如权利要求90至186中任一项所述的方法，其中靶标选自下组，该组由以下各项组成：核酸、蛋白、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古生菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、核酸或它们的任何衍生物、部分或组合。
188.如权利要求187所述的方法，其中核酸选自下组，该组由以下各项组成：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前-以及初级-小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、它们的衍生物、它们的扩增子以及它们的任何组合。
189.如权利要求187或权利要求188所述的方法，其中核酸的来源选自下组，该组由以下各项组成：合成的、哺乳动物的、人的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的、古生菌的、以及它们的任何组合。
190.如权利要求187至189中任一项所述的方法，其中扩增该核酸。
191.如权利要求98、104、111、116或155中任一项所述的方法，其中所述第一DF与所述靶标是相异的。
192.如权利要求90至191中任一项所述的方法，其中任何所述EAS可以与另一EAS杂交从而形成一个部分酶信号放大器（PESA）复合体，该复合体能够与多于一种DF杂交。
193.如权利要求90至97、124、125或169中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用特异性针对一种靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
194.如权利要求193所述的方法，其中特异性针对所述靶标分子的不同部分的所述MNA酶，在所述靶标的存在下装配时识别并且切割相同底物。
195.如权利要求90至97、124、125或169中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用对于相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
196.如权利要求98、117、118、以及165中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用对于相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
197.如权利要求90、98、104、11、116或155中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用与一个不同的第一DF装配的至少两种相异的第一CESA复合体。
198.用于扩增一种信号的一个试剂盒，该试剂盒包括；
一种核酸酶；以及
一种EAS1和一种EAS2，其中一部分该EAS1与EAS2互补，并且其中该EAS1与EAS2形成一个复合体，该复合体只有在与一个驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的一个识别序列以及一个切割序列。
199.用于检测一种靶标的一个试剂盒，该试剂盒包括；
一种核酸酶；
一种EAS1和一种EAS2，其中一部分该EAS1与EAS2互补
多种部分酶，该多种部分酶设计为装配对应于该靶标的一种MNA酶以及
一种MNA酶底物，其中一部分所述底物与一部分该EAS1互补；并且
其中该EAS1与EAS2形成一个复合体，该复合体只有在与一个驱动片段寡聚核苷酸装配在一起时才包括用于所述核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
200.用于检测一种靶标的一个试剂盒，该试剂盒包括
一种核酸酶；
一种EAS1和一种EAS2，其中一部分该EAS1与EAS2互补；
多种SIO设计为与该靶标杂交以形成一种核酸酶底物；
其中一部分所述核酸酶底物与一部分该EAS1互补
其中该EAS1与EAS2形成一个复合体，该复合体只有在与一个驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于所述核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
201.一个试剂盒，包括一种第一酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS1）以及一种第二酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS2），其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中该EAS1与EAS2形成一个第一全酶信号放大器（CESA）复合体，该复合体只有在与一个第一驱动片段寡聚核苷酸（DF）装配在一起时才包括用于一种第一核酸酶的一个识别和一个切割序列，并且其中一部分该第一DF与一部分该EAS1互补。
202.一个试剂盒，包括一种EAS1、一种EAS2、以及一种第一核酸酶，其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且其中该EAS1与EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有在与一个第一DF装配在一起时才包括用于所述第一核酸酶的一个识别序列和一个切割序列，其中一部分该第一DF与一部分该EAS1互补。
203.一个试剂盒，包括一种多组分核酸酶（MNA酶）、一种MNA酶底物、一种EAS1、一种EAS2、以及一种第一核酸酶，其中：
该MNA酶包括至少一个第一部分酶以及一个第二部分酶，这些部分酶在一种MNA酶装配促进物的存在下自我装配以形成该MNA酶，其中所述至少第一和所述第二部分酶各自包括一个底物臂部分、一个催化核心部分、以及一个传感臂部分，并且其中这些传感臂与所述MNA酶装配促进物相互作用从而维持该第一和第二部分酶相互靠近以用于它们对应的催化核心部分的关联，从而形成该MNA酶的催化核心，并且所述催化核心能够修饰所述MNA酶底物从而形成一个第一DF；
并且其中一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且其中该第一DF能够与该EAS1与该EAS2装配以形成一个第一CESA复合体，该复合体包含用于所述至少第一核酸酶的一个识别位点和一个切割位点。
204.如权利要求203所述的试剂盒，其中所述MNA酶底物是包括第一和第二链的一个寡聚核苷酸复合体的一个第一链，其中所述第一链包括一个内部环部分，并且在该内部环部分内的碱基与该第二链的碱基不杂交，并且其中该MNA酶能够切割该内部环部分。
205.如权利要求204所述的试剂盒，其中所述第二链包括该第一DF。
206.如权利要求204或权利要求205所述的试剂盒，其中所述第一和第二链在一端由一个发夹环部分连接。
207.如权利要求203所述的试剂盒，其中所述MNA酶底物是一种发夹寡聚核苷酸的一个发夹环部分，所述MNA酶能够切割该发夹环部分，并且所述第一驱动片段位于所述发夹寡聚核苷酸中的一个双链茎部分的一条链中。
208.如权利要求203至207中任一项所述的试剂盒，其中该装配促进物是一种有待鉴定的靶标。
209.一个试剂盒，包括一种第一合成起始物寡聚核苷酸（SIO）、一种EAS1、一种EAS2、一种第一核酸酶、以及一种第二核酸酶，其中：
该SIO能够与靶标杂交从而形成一种双链体底物，其中所述第一核酸酶能够切割该双链体底物从而产生一个第一DF；并且其中；
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且其中该EAS1与该EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有在与该第一DF装配在一起时才包含用于所述第二核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
210.如权利要求209所述的试剂盒，其中只有当该SIO与靶标杂交时，所述第一核酸酶才能够切割该SIO以产生所述第一DF。
211.如权利要求209所述的试剂盒，其中只有当靶标与该SIO杂交时，所述第一核酸酶才能够切割该靶标以产生所述第一DF。
212.如权利要求211所述的试剂盒，其中所述第一核酸酶不是一种限制性内切酶。
213.如权利要求209至212中任一项所述的试剂盒，其中所述第一核酸酶是一种核酸外切酶。
214.如权利要求209至213中任一项所述的试剂盒，其中该第一和第二核酸酶是相同的核酸酶。
215.如权利要求209至213中任一项所述的试剂盒，其中该第一和第二核酸酶是不同的核酸酶。
216.如权利要求201至209中任一项所述的试剂盒，其中所述第一核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的一个切口。
217.如权利要求209至215中任一项所述的试剂盒，其中所述第二核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第一CESA复合体的两条链中的至少一条中的一个切口。
218.如权利要求216或权利要求217所述的试剂盒，其中所述切口是位于该核酸酶识别位点内、该核酸酶切割位点处、或这些核酸酶识别和切割位点之间。
219.如权利要求216至218中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
220.如权利要求198至219中任一项所述的试剂盒，其中所述EAS1和EAS2是一种发夹寡聚核苷酸的组分，该发夹寡聚核苷酸包括由所述EAS1和EAS2的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接所述EAS1的一端与所述EAS2的一端的一个发夹环部分。
221.如权利要求220所述的试剂盒，其中所述发夹寡聚核苷酸包含从所述EAS1或EAS2的任一个延伸的一个单链5’或3’突出部分。
222.如权利要求198至221中任一项所述的试剂盒，其中所述一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF，并且其中所述第二DF可以在由该核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
223.如权利要求220至221中任一项所述的试剂盒，其中一部分所述发夹环部分包括一个第二DF，并且其中所述第二DF可以在由该核酸酶对所述第一CESA复合体进行修饰时得以释放。
224.如权利要求222或权利要求223所述的试剂盒，其中所述第一DF和所述第二DF不是相同的。
225.如权利要求222或权利要求223所述的试剂盒，其中所述第一DF和所述第二DF是相同的。
226.如权利要求222或权利要求223所述的试剂盒，其中所述第二DF是所述第一DF的一个片段，或者所述第一DF是所述第二DF的一个片段。
227.如权利要求225或权利要求226所述的试剂盒，其中所述第二DF、EAS1、和EAS2能够装配以形成所述第一CESA复合体。
228.如权利要求222至224中任一项所述的试剂盒，进一步包括一种第三酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS3）以及一种第四酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS4），其中一部分该EAS3与一部分该EAS4互补，并且一部分该EAS3与一部分该第二DF互补，并且其中该EAS3与该EAS4形成一个第二CESA复合体，该复合体只有在与该第二DF装配在一起时才包含用于一种额外的核酸酶的一个识别序列和一个切割序列。
229.如权利要求228所述的试剂盒，其中该EAS3或该EAS4包括一个第三DF。
230.如权利要求229所述的试剂盒，其中该第三DF与所述第一DF是相同的。
231.如权利要求229所述的试剂盒，其中该第三DF与所述第一DF不是相同的。
232.如权利要求228至231中任一项所述的试剂盒，其中所述额外的核酸酶与在所述试剂盒中的另一核酸酶是相同的。
233.如权利要求228至231中任一项所述的试剂盒，其中所述额外的核酸酶与在所述试剂盒中的另一核酸酶不是相同的，并且其中所述试剂盒包括所述额外的核酸酶。
234.如权利要求228至233中任一项所述的试剂盒，其中所述额外的核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
235.如权利要求228至234中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
236.如权利要求228至235中任一项所述的试剂盒，其中所述EAS3和EAS4是一种发夹寡聚核苷酸的组分，该发夹寡聚核苷酸包括由EAS3和EAS4的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接所述EAS3的一端与所述EAS4的一端的一个发夹环部分。
237.如权利要求236所述的试剂盒，其中所述发夹寡聚核苷酸包含从所述EAS3或EAS4的任一个延伸的一个单链5’或3’突出部分。
238.一种包括一种第一复合体的试剂盒，所述第一复合体包括一个主链寡聚核苷酸、一个EAS1、一个EAS2、一个EAS3、以及一个EAS4，其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS1的一个第一部分，其中一部分所述EAS1与一部分的一个EAS2互补，一部分该EAS2与一部分的一个第一DF互补，并且一部分该EAS1或EAS2包括一个第二DF，并且其中该EAS1与该EAS2形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与该所述第一DF装配在一起时才包含用于一种第一核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；
(ii)包括所述EAS3的一个第二部分，其中一部分所述EAS3与一部分所述EAS4互补，一部分所述EAS3与一部分该第二DF互补，并且一部分所述EAS3或EAS4包括所述第一DF，并且其中该EAS3与该EAS4形成一个第二CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于一种第二核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分。
239.如权利要求238所述的试剂盒，进一步包括一种第二复合体，所述第二复合体包括一个主链寡聚核苷酸、一个第五酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS5）、一个第六酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS6）、一个第七酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS7）、以及一个第八酶放大器底物寡聚核苷酸（EAS8），其中所述主链寡聚核苷酸包括：
(i)包括所述EAS5的一个第一部分，其中一部分所述EAS5与一部分所述EAS6互补，一部分所述EAS5与一部分所述第二DF互补，并且一部分所述EAS5或EAS6包括所述第一DF，并且其中该EAS5与该EAS6形成一个第三CESA复合体，该复合体只有与所述第二DF装配在一起时才包含用于一种第三核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(ii)包括所述EAS7的一个第二部分，其中一部分所述EAS7与一部分所述EAS8互补，一部分所述EAS8与一部分所述第一DF互补，并且一部分所述EAS7或EAS8包括所述第二DF，并且其中该EAS7与该EAS8形成一个第四CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包含用于一种第四核酸酶的一个识别序列和一个切割序列；以及
(iii)连接该第一和第二部分的一个第三部分，其中所述第三部分与所述第一复合体的主链的第三部分互补。
240.如权利要求239所述的试剂盒，其中EAS1与EAS7相同，EAS2与EAS8相同，EAS3与EAS5相同，和/或EAS4与EAS6相同。
241.如权利要求239或权利要求240所述的试剂盒，其中该第一核酸酶与该第三核酸酶相同，和/或该第二核酸酶与该第四核酸酶相同，和/或该第一、第二、第三以及第四核酸酶是相同的。
242.如权利要求239至241中任一项所述的试剂盒，其中第一和第二复合体经由它们对应的互补的第三部分进行杂交，形成一个第一双重复合体。
243.如权利要求242所述的试剂盒，其中所述第一双重复合体连接至一个第二双重复合体。
244.如权利要求243所述的试剂盒，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个与所述第二双重复合体的EAS1-EAS8中的任何一个或多个，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
245.如权利要求243或权利要求244所述的试剂盒，其中通过连接所述第一双重复合体的EAS2和/或EAS8与所述第二双重复合体的EAS2和/或EAS8，而使所述第一双重复合体连接至所述第二双重复合体。
246.如权利要求244或权利要求245所述的试剂盒，其中所述连接是使用化学杂交、抗体、寡聚核苷酸接头、非寡聚核苷酸接头、以及肽接头中的任何一种或多种来达到的。
247.如权利要求244或权利要求245所述的试剂盒，其中所述连接是经由一种或多种所述酶放大器底物寡聚核苷酸的生物素化作用、以及使用抗生物素蛋白的经生物素化的多个酶放大器底物寡聚核苷酸的络合作用来达到的。
248.如权利要求239至247中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和/或所述第二核酸酶能够切割一种双链寡聚核苷酸，该双链寡聚核苷酸包括形成所述第二CESA复合体的两条链的至少一条中的一个切口。
249.如权利要求239至248中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和/或所述第二核酸酶选自下组，该组由以下各项组成：Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy8I、Msp I、Ear I、以及TspR I。
250.如权利要求239至249中任一项所述的试剂盒，其中选自EAS1和EAS2；EAS3和EAS4；EAS5和EAS6；以及EAS7和EAS8的一对酶放大器底物是一个发夹寡聚核苷酸的一个组件，该发夹寡聚核苷酸包括由所述对的每个成员的互补部分的杂交形成的一个双链茎部分、以及连接至该茎部分的一端的一个发夹环部分。
251.包括一种SIO的一个试剂盒，所述SIO包括：
(i)与一个靶标链互补的一个第一部分以及与所述靶标链不互补的一个第二部分，其中所述第一和第二部分是由一种硫代磷酸酯分开，并且所述第二部分包括一个第一DF；以及，
(ii)一个EAS1以及一个EAS2，其中
一部分该EAS1与一部分该EAS2互补，并且该EAS1与该EAS2的杂交提供了在任一端具有一个3’突出端的一个双链体结构，
一部分该EAS1与一部分该第一DF互补，并且
该EAS1与该EAS2能够形成一个第一CESA复合体，该复合体只有与所述第一DF装配在一起时才包括能够由一种第一核酸酶所酶解的一个凹3’端。
252.如权利要求251所述的试剂盒，其中所述SIO是一种发夹寡聚核苷酸，该发夹寡聚核苷酸包括由两个互补部分的杂交形成的一个双链茎、一个单链发夹环、以及一个3’突出端。
253.如权利要求251或252所述的试剂盒，其中该核酸酶是一种核酸外切酶。
254.如权利要求198至253中任一项所述的试剂盒，其中任何所述EAS包括一种或多种可检测标记。
255.如权利要求198至254中任一项所述的试剂盒，其中任何所述EAS包括一个荧光团部分和一个淬灭剂部分。
256.如权利要求198至255中任一项所述的试剂盒，其中任何所述的MNA酶部分酶、MNA酶底物、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF或核酸酶附接至一个固体支持物上。
257.如权利要求199、200、208、或209中任一项所述的试剂盒，其中所述第一DF与所述靶标是相异的。
258.如权利要求199或权利要求203所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含特异性针对一种靶标分子的不同部分的第一和第二MNA酶。
259.如权利要求258所述的试剂盒，其中特异性针对所述靶标分子的不同部分的所述MNA酶，在所述靶标的存在下装配时识别并且切割相同底物。
260.如权利要求199或权利要求203所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含对于相异的靶标具有特异性的至少两种不同的MNA酶。
261.如权利要求200、209或251所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含对于相异的靶标具有互补性的至少两种不同的SIO。
262.一个试剂盒，包括如权利要求1至89中任一项所述的组合物。
263.如权利要求198至262中任一项所述的试剂盒，进一步包括用于所述试剂盒的使用的说明书。
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