KR20140026343A - 신호 증폭 - Google Patents

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KR20140026343A
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에블린 메이리아 리나르디
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스피디엑스 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 표적의 존재를 나타내는 신호를 발생 및 증폭시키기 위해 핵산으로 구성된 효소 및/또는 단백질 효소를 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 부분 또는 완전 효소 기질로서의 역할을 하는 핵산 구조체를 포함하는 조성물, 및 표적 검출을 촉진시키기 위해 상기 구조체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

신호 증폭{SIGNAL AMPLIFICATION}
상호 참조 포함
본 출원은 2010년 11월 19일 출원된 호주 가특허 출원 번호 제2010905152호를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 상호 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 표적의 존재를 나타내는 신호를 발생 및 증폭시키기 위해 핵산으로 구성된 효소 및/또는 단백질 효소를 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 부분 또는 완전 효소 기질로서의 역할을 하는 핵산 구조체를 포함하는 조성물, 및 표적 검출을 촉진시키기 위해 상기 구조체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
뉴클레아제
뉴클레아제는 뉴클레오티드 서브유니트 핵산 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소이다. 데옥시리보뉴클레아제는 DNA에 대하여 작용하는 반면, 리보뉴클레아제는 DNA에 대하여 작용하지만, 일부 뉴클레아제는 기질로서 DNA 및 RNA, 둘 모두를 이용한다.
비록 일부 효소는 다기능을 가질 수 있고, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 활성, 2가지 모두를 보일 수도 있지만, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제로 추가로 분류될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단한다. 그에 반해, 엑소뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 쇄 말단의 포스포디에스테르 결합을 절단한다. 엑소뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터, 또는 양 말단 모두로부터 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 플랩(Flap) 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 분기된 말단을 인식하고, 첫번째 중첩 염기 다음의 단일 가닥 5' 아암을 제거함으로써 두 올리고뉴클레오티드 사이에 3' 히드록실 닉을 남기는 구조 특이 5' 엔도뉴클레아제이다.
뉴클레아제는 분자 생물학에서의 도구로서 광범위하게 사용된다. 단백질 엔도뉴클레아제의 예로는 제한 엔도뉴클레아제, 멍빈(Mung Bean) 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 IV(E. 콜라이(E. coli)), RN아제 A, RN아제 I(E. 콜라이), RN아제 III E. 콜라이) 또는 RN아제 H(E. 콜라이)를 포함한다. 단백질 엑소뉴클레아제의 예로는 엑소뉴클레아제 I(E. 콜라이), 엑소뉴클레아제 III(E. 콜라이), 엑소뉴클레아제 VII 및 T7 엑소뉴클레아제를 포함한다. DNA자임, 리보자임 및 MNA자임을 비롯한 촉매성 핵산은 또한 엔도뉴클레아제로서 작용할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있다.
제한 효소
제한 효소(RE: restriction enzyme) 또는 제한 엔도뉴클레아제는 핵산의 특이 제한 효소 인식(RER: Restriction Enzyme Recognition) 부위 또는 제한 효소 인식 서열(RERS: Restriction Enzyme Recognition Sequence)을 인식하여 RERS의 핵산 또는 RERS로부터 원거리에 있는 핵산을 절단하는 촉매성 단백질이다. 제한 효소는 분자 생물학에서 가장 광범위하게 사용되는 도구 중 하나이며, 이는 전형적으로 박테리아 또는 고세균으로부터 정제된다. 예를 들어, EcoRI는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 정제된 것이고, Hind III은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터 정제된 것이다. 수천 개의 제한 효소가 정제되었고, 그의 특징이 규명되어 있으며, 250개 초과의 상이한 제한 효소 인식 서열이 확인되었다.
제한 효소 절단에 의해 생성된 말단의 유형으로는 5' 오버행(overhang) 또는 3' 오버행이 존재하는 말단을 포함하거나, 절단부는 블런트(오버행 없는 것)일 수 있다. 대부분의 제한 효소는 이중 가닥 이중체(duplex)의 양쪽 가닥 모두를 절단한다. 닉 형성 효소는 이중 가닥 DNA 기질을 필요로 하지만, 단 하나의 가닥만이 절단된다. 이러한 유형의 효소에 대한 예로는 서열 GGATCNNNN/N을 인식하여 사선(/) 표시된 위치에서 상기 가닥을 절단하는 Nt.AlwI가 있다. 비록 대다수의 제한 효소는 기질로서 이중 가닥 DNA를 필요로 하기는 하지만, 몇몇은 단일 가닥 DNA를 인식하여 절단하는 것으로 보고된 바 있다.
촉매성 핵산 효소
촉매성 핵산 효소는 핵산 기질을 변형시킬 수 있는 핵산(비단백질 효소)로 구성된 효소이다. 예를 들어, 촉매성 핵산 효소는 (당업계에 DNA자임 또는 데옥시리보자임 또는 DNA 효소로서 알려져 있는) DNA 분자, 또는 (당업계에 리보자임으로서 알려져 있는) RNA 분자 또는 (당업계에 MNA자임으로서 알려져 있는) 다중 DNA 또는 RNA 분자로 구성된 다성분(multi-component) 핵산 효소일 수 있다. 촉매성 핵산 엔도뉴클레아제는 별개의 핵산 기질 서열을 특이적으로 인식하고 절단한다. DNA자임 및 리보자임은 RNA 기질, DNA 기질 및/또는 키메라 DNA/RNA 기질을 절단할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 기질 서열이 최소한의 서열 요건을 충족시킨다면, 촉매성 핵산 효소는 핵산 기질(표적)을 절단만 할 수 있다. 표적 기질은 촉매성 핵산의 기질 인식 도메인(결합 아암)과 상보적일 수 있고, 기질은 절단 부위에 특이 서열을 함유할 수 있다. 절단 부위의 상기 서열 요건에 관한 예로는 DNA자임 절단(10-23 모델)의 경우, 퓨린:피리미딘 서열 요건, 및 해머헤드 리보자임의 경우, 서열 우리딘:X(여기서, X는 G를 제외한, A, C 또는 U일 수 있다) 요건을 포함한다. 10-23 DNA자임은 특이 RNA 포스포디에스테르 결합에서 핵산 기질을 절단할 수 있는 DNA자임이다. 상기 DNA자임은 2개의 기질 인식 도메인(결합 아암) 측면에 위치하는 15개의 데옥시뉴클레오티드로 이루어진 촉매성 도메인을 가진다. DNA자임 및 리보자임의 경우에서, 인식되는 표적 기질 서열은 절단되는 동일 분자이다.
MNA자임은 조립된 것으로서, 조립 촉진제(assembly facilitator)의 존재하에서 오직 촉매적으로만 활성을 띠는 다성분 핵산 효소이다. 상기 효소는 하나 이상의 조립 촉진제의 존재하에서 자기 조립하고, 기질을 촉매적으로 변형시키는 활성 MNA자임을 형성하는 다중 부분 효소, 또는 파트자임(partzyme)으로 구성된다. 기질 및 조립 촉진제(표적)는 별개의 핵산 분자이다. 파트자임은 (i) 조립 촉진제(예컨대, 표적 핵산)에 결합하는 센서 아암; (ii) 기질에 결합하는 기질 아암; 및 (iii) 조립시 결합하여 완전 촉매성 코어 서열을 제공하는 것인 부분 촉매성 코어 서열을 비롯한, 다중 도메인을 가진다. MNA자임은 예를 들어, 상이한 표적 핵산 서열을 비롯한, 매우 광범위한 조립 촉진제를 인식하도록 디자인될 수 있다. 조립 촉진제의 존재에 대한 반응으로, MNA자임은 그의 기질을 변형시킨다. 이러한 기질 변형은 신호 발생과 연관이 있을 수 있고, 따라서, MNA자임은 효소적으로 증폭된 출력 신호를 발생시킬 수 있다. 조립 촉진제는 생물 또는 환경 시료 중에 존재하는 표적 핵산일 수 있다. 그러한 경우, MNA자임에 의한 기질 변형 검출이 표적이 존재함을 나타낸다. 핵산 기질을 절단할 수 있는 수개의 MNA자임이 보고된 바 있으며, 핵산 기질을 결찰(ligation)시킬 수 있는 추가의 MNA자임 또한 당업계에 공지되어 있다.
표적 검출 또는 신호 증폭을 위해 제한 효소를 사용하는 방법
표적 핵산 검출을 위한 제한 효소(RE)를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이는 DNA 중 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)을 특이적으로 인식함으로써 유전자 대립 인자를 구별할 수 있다. 그러나, 이는 오직 SNP가 한 대립 인자 중에 존재하는 천연적으로 발생된 RERS를 변경시킨 경우에만 달성될 수 있다. 상기 방법에서는 서열 분석할 필요없이 제한 효소를 사용하여 DNA 시료의 유전자형을 분석할 수 있다. RE로 게놈 DNA를 분해한 후, 생성된 DNA 단편을 분리할 수 있고, 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 드물게는, 후천성 돌연변이가 천연적으로 발생된 RERS 범위 내에 존재하는 일이 발생된 경우에는 이 또한 검출될 수 있다.
상이한 전략법을 사용하여 표적 검출을 위해 RE를 사용하는 다수의 다른 방법도 공개되어 있다. 제한 증폭 검정법으로 알려져 있는 한 방법은, 검출하고자 하는 표적에 상보적이며, 특이 RER 부위를 포함하는 표적 영역에 걸쳐 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다(미국 특허 5,102,784). 표지된 프로브를 표적과 하이브리드화한 후, 생성된 이중체를 RE로 절단하고, 절단된 프로브 검출은 표적이 존재함을 나타낸다. 이어서, 또 다른 온전한 프로브는 제2 상보성 올리고뉴클레오티드에 및 절단된 표적 단편에 결합할 수 있다. 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 절단된 표적 단편에 바로 인접하게 결합하여 RE 부위를 재구성하고, 이로써 또 다른 프로브가 절단될 수 있도록 한다. 이러한 접근법이 가지는 단점으로는 (i) 표적은 관심의 대상이 되는 영역 중에 특이 RERS를 포함하여야 한다는 요건, 및 (ii) 언제든 절단가능한 이중체의 최대 개수는 존재하는 표적 분자의 원래의 개수와 동일하기 때문에 감도가 제한되어 있다는 점을 포함한다. 표적은 관심의 대상이 되는 영역 중에 특이 RERS를 포함하여야 한다는 요건이 상기 검정법의 유연성을 현저히 제한한다. 언제든 상기 검정법에 존재하는 신호 발생 복합체의 양은, 신호 강도 및 만족할 만한 신호 강도를 달성하는 데 요구되는 소요 시간에 불리한 영향을 미치는 존재하는 표적 분자의 개수로 제한이 되는 바, 상기 언급된 2번째 단점 또한 특히 중요하다. RE를 사용하는 표적 검정 검정법의 또 다른 예는 닉 형성 엔도뉴클레아제 신호 증폭(NESA: Nicking Endonuclease Signal Amplification)으로 불린다. 닉 형성 RE에 대한 상기와 같은 경우에, 제한 증폭 검정법과 유사한 상기 방법은 검출하고자 하는 표적에 상보적이며, 특이 RER 부위를 포함하는 표적 영역에 걸쳐 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다(문헌 [Kiesling et al., NAR; 35; 18; e117, 2007]). 표지된 프로브를 표적과 하이브리드화시킨 후, 생성된 이중체 중 한 가닥을 닉 형성 RE로 절단하고, 상기 절단을 통해 표적은 온전한 상태 그대로 유지시키면서, 프로브를 해리시킨다. 프로브 절단을 통해 신호가 발생되는데, 이 신호는 특이 표적이 존재함을 나타낸다. 이어서, 표적을 추가의 프로브에 하이브리드화시켜 신호를 증가시킨다. 추가로, 본 접근법의 단점은 (i) 표적은 관심의 대상이 되는 영역 중에 특이적인 천연적으로 발생된 RER를 포함하여야 한다는 요건(이러한 경우, 구체적으로 표적에 인접해 있는 몇몇의 닉 형성 RERS 중 하나인 RERS), 및 (ii) 언제든 절단가능한 이중체의 최대 개수는 표적 분자의 원래의 개수와 동일하기 때문에 상기 접근법의 감도가 제한되어 있다는 점이다.
캐스케이드(cascade) 효소 신호 증폭(문헌 [Zou et al., Angew. Chem. Int Ed; 49 p1-5; 2010])이라고 불리는 또 다른 프로토콜은 다단계, 즉, (i) 2개의 프로브를 표적에 결합시켜 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 오버랩을 형성하는 단계; (ii) 절단된 플랩 단편을, 또한 분자 비콘의 루프에 결합된 또 다른 올리고뉴클레오티드에 인접한 위치에서 상기 루프에 결합시킨 후, T4 리가제를 이 두 올리고뉴클레오티드에 결합(결찰)시키고, 이를 통해 비콘을 개방시키고, 닉 형성 RE에 대한 RERS를 형성하는 단계; 이어서, 최종적으로 (iii) 닉 형성 RE를 통해 비콘을 절단하고, 결찰된 단편을 유리시켜 또 다른 비콘에 결합시키는 단계를 요구한다. 이러한 방법을 통해서는 닉 형성 RERS가 표적에서 천연적으로 발생되어야 한다는 구체적인 필요성을 극복할 수 있지만, 상기 방법은 두 단편이 결찰되어야 하고, 이를 통해 새로운 RER 부위가 형성되어야 한다는 것을 교시한다. 추가로, 상기 방법은 각각의 엔도뉴클레아제, 결찰 및 절단 활성에 대하여 특이적인 3가지 순차적 완충제를 필요로 한다는 점에서 번거롭다.
이들 방법 중 어느 것도 특이 표적이 편리한, 천연적으로 발생된 RERS를 가지는지 여부와는 상관없이, 개시 표적 인식 이벤트 후 표적과는 독립적으로 신호를 증폭시키는 방식으로 표적 검출에 의해 발생되는 신호 증폭을 위한 간단한 프로토콜을 제공하지 않는다.
다른 표적 및 신호 증폭 기술
표적 검출의 감도를 증가시키기 위해, 표적 증폭 또는 신호 증폭에 대한 전략법을 사용하여 왔다. 표적 증폭을 사용하는 방법의 예로는 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 가닥 치환 증폭법(SDA: strand displacement amplification), 루프 매개 등온 증폭법(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 회전 환 증폭법(RCA: rolling circle amplification), 전사체 매개 증폭법(TMA: transcript-mediated amplification); 자기 부양 서열 복제(3SR: self-sustained sequence replication), 또는 핵산 서열 기반 증폭법(NASBA: nucleic acid sequence based amplification)을 포함한다.
촉매성 핵산을 사용하는 신호 증폭 캐스케이드에 관한 몇몇 예가 당업계에 공지되어 있다. 결찰 캐스케이드는 2개의 RNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 결찰시키는 제1 리보자임(A)을 사용하여 제2 리보자임(B)을 형성한다. 이어서, 리보자임(B)은 2개의 다른 RNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 새로운 제1 리보자임(A)을 형성함으로써 캐스케이드 반응을 일으킨다. 다른 신호 증폭 캐스케이드는 환형화된 DNA자임/기질 분자를 사용한다. DNA자임(A)은 환형일 때에는 불활성이지만, 환형 DNA자임(A)을 절단하는 제2 DNA자임(B)에 의한 선형화에 의해 활성화된다. 이어서, 활성을 띠는 선형 DNA자임(A)은 환형 DNA자임(B) 분자를 절단함으로써 그를 선형화시키고 활성화시킨다. 서로 절단하고/선형화시킬 수 있는 두 DNA자임을 통해 촉매성 핵산 활성의 캐스케이드가 이루어진다.
예를 들어, 다재다능한 압타머와 함께, 및/또는 전통 단백질 효소의 촉매력과 함께 DNA자임 사용을 조합한 것을 비롯한, 다른 접근법도 이용가능하다. 상기 방법을 통해 단백질 효소는 유리되고, 그 결과 검출가능한 분자 형성은 촉매화되어 신호가 발생 및 증폭될 수 있다. 상기 접근법을 통해 고감도로 검출할 수는 있지만, 각 검정법에 대하여 고도로 맞춤화된 분자가 요구되기 때문에 비용이 많이 든다. 대안 방법으로는 예를 들어, 반응을 매개하는 표지된 프로브에 부착된 2차 리포터 분자(예컨대, 알칼리성 포스파타제)를 이용함으로써 신호를 증폭시키는 분지형 DNA 검정법(bDNA: branched DNA assay)을 포함한다. 티라미드 신호 증폭(TSA: Tyramide Signal Amplification) 방법은 티라미드를, 단백질 중 티로신 잔기에 결합하는 티라미드의 활성 형태로 전환시키는 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용한다. 인베이더 검정법(Invader assay)을 통해서는 뉴클레아제가 절단되며, 이로써 시간이 경과함에 따라 표적 분자 1개당 1,000개 초과의 절단 이벤트가 일어난다. 그러나, 공지된 신호 증폭 방법에는 한계 및 결함이 있다. 예를 들어, bDNA 검정법은 표적 증폭 방법 만큼의 감도를 가지지 않는다. 감도 이외에도, 공지된 신호 증폭 검정법은 장기간의 소요 시간, 지나치게 복잡한 프로토콜 및/또는 비용 증가를 비롯한 다른 단점과 관련이 있다.
따라서, 신호 증폭을 포함한 핵산 서열 및 다른 표적을 검출하고 정량화하는 신규의 개선된 방법이 계속하여 요구되고 있다.
본 발명의 요약
제1 측면에서, 본 발명은 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1: first Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2: second Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide)를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF: first Driver Fragment oligonucleotide)와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA: Complete Enzyme Signal Amplifier) 복합체를 형성하고, 여기서, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고, 여기서, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 다성분 핵산 효소(MNA자임), MNA자임 기질, EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
MNA자임은 MNA자임 조립 촉진제의 존재하에서 자기 조립되어 MNA자임을 형성하는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 제1 및 상기 제2 파트자임은 각각 기질 아암부, 촉매성 코어부, 및 센서 아암부를 포함하고, 센서 아암은 상기 MNA자임 조립 촉진제와 상호작용하여 제1 및 제2 파트자임을 이들의 각각의 촉매성 코어부의 회합을 위한 근접한 위치에 유지시켜 MNA자임의 촉매성 코어를 형성하고, 상기 촉매성 코어는 상기 MNA자임 기질을 변형시켜 제1 DF를 형성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 제1 DF는 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 적어도 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인, 조성물을 제공한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 제2 가닥은 제1 DF를 포함한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 가닥은 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결된다.
제3 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 조립 촉진제는 확인하고자 하는 표적이다.
제4 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제(initiator) 올리고뉴클레오티드(SIO: Synthetic Initiator oligonucleotide), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 기질을 형성할 수 있고, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 이중체 기질을 절단함으로써 제1 단편을 생성할 수 있으며;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 조성물을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO); EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 구조체를 형성할 수 있고, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 상기 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 상기 SIO를 절단함으로써 제1 DF를 생성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 조성물을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 구조체를 형성할 수 있고, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 상기 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 상기 표적을 절단함으로써 제1 DF를 생성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하며;
제1 뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제가 아닌 것인 조성물을 제공한다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 제한 효소가 아니다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제이다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 상이한 뉴클레아제이다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제2 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 닉은 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치한다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제4 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열을 완성한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 절단 서열을 완성한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 1 이상의 염기를 상기 서열에 제공(contribute)한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 2 이상의 염기를 상기 서열에 제공한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 3 이상의 염기를 상기 서열에 제공한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 염기는 상기 EAS1 및 EAS2의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 3' 바로 옆에(immediately) 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 염기는 상기 EAS1 및 EAS2의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 5' 바로 옆에 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및 EAS2는 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비(non)올리고뉴클레오티드 링커이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 상기 EAS1 또는 EAS2 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 상기 EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 상기 헤어핀 루프부의 일부는 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF 및 상기 제2 DF는 동일한 것이 아니다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF 및 상기 제2 DF는 동일한 것이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF는 상기 제1 DF의 단편이거나, 또는 상기 제1 DF는 상기 제2 DF의 단편이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF, EAS1, 및 EAS2는 조립되어 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3: third Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide) 및 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4: fourth Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide)를 추가로 포함하고, 여기서, EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고, EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS3 및 EAS4는 오직 제2 DF와의 조립시에만 추가 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, EAS3 또는 EAS4가 제3 DF를 포함한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제3 DF는 상기 제1 DF와 동일하다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제3 DF는 상기 제1 DF와 동일하지 않다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 조성물 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 조성물 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하지 않고, 여기서, 상기 조성물은 상기 추가 뉴클레아제를 포함한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF의 상기 EAS3에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 뉴클레아제 절단 서열을 완성한다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF는 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, EAS3 및 EAS4는 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커이다.
제1 내지 제6 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 상기 EAS3 또는 EAS4 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함한다.
제7 측면에서, 본 발명은 골격(backbone) 올리고뉴클레오티드, EAS1, EAS2, EAS3, 및 EAS4를 포함하는 제1 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) 상기 EAS1을 포함하는 제1부(portion)로서, 여기서, 상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS2의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부;
(ii) 상기 EAS3을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS3의 일부는 상기 EAS4의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS3 및 EAS4는 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 골격 올리고뉴클레오티드, 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5: fifth Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide), 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6: sixth Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide), 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7: seventh Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide), 및 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8: eighth Enzyme Amplifier Substrate oligonucleotide)를 포함하는 제2 복합체를 추가로 포함하는 것으로서,
여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) 상기 EAS5를 포함하는 제1부로서, 여기서, 상기 EAS5의 일부는 상기 EAS6의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5의 일부는 상기 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 또는 EAS6의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS5 및 EAS6은 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제3 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제3 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부; 및
(ii) 상기 EAS7을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS7의 일부는 상기 EAS8의 일부에 상보적이고, 상기 EAS8의 일부는 상기 제1 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 DF를 포함하고, EAS7 및 EAS8은 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제4 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제4 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부를 포함한다.
제7 측면의 한 실시양태에서, EAS1은 EAS7과 동일하고/거나, EAS2는 EAS8과 동일하고/거나, EAS3은 EAS5와 동일하고/거나, EAS4는 EAS6과 동일하다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 제3 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제2 뉴클레아제는 제4 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레아제는 동일하다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 복합체는 이들의 각각의 상보적인 제3부를 통해 하이브리드화함으로써 제1 이중 복합체를 형성한다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 제2 이중 복합체에 연결된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 연결은 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 공유 결합 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 연결은 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제는 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 DF의 상기 EAS2 또는 EAS8에의 결합 및/또는 상기 제2 DF의 상기 EAS3 또는 EAS5에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 서열을 완성한다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 DF의 상기 EAS2 또는 EAS8에의 결합 및/또는 상기 제2 DF의 상기 EAS3 또는 EAS5에의 결합은 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는다.
제7 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되는 효소 증폭제 기질 쌍은 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커이다.
제7 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함한다.
제8 측면에서, 본 발명은 SIO를 포함하는 조성물로서, 상기 SIO는
(i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서, 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인 제1부 및 제2부; 및
(ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서,
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 포함하는 이중체 구조체를 제공하고,
EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고,
EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 의한 분해(digestion)가 가능한 오목형(recessed) 3' 말단을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 EAS1 및 EAS2를 포함하는 것인, 조성물을 제공한다.
제8 측면의 한 실시양태에서, SIO는 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드이다.
제8 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제8 측면의 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 5개 이상의 염기로 이루어진 3' 오버행을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(linkage)을 분해할 수 없다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 제1 DF는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 사용하여 생성된다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 III이다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 T7 엔도뉴클레아제 I, RN아제 H, 플랩 뉴클레아제, 또는 멍빈 뉴클레아제이다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS를 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS는 형광단(fluorophore) 부분 및/또는 소광제(quencher) 부분을 포함한다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 파트자임, 조립 촉진제, MNA자임 기질, DF, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, 또는 SIO는 포스포로티오에이트, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시히드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실퀘오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 퀘오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘 및 베타 D-아라비노실 티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오티드 치환 또는 부가를 포함한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 파트자임, MNA자임 기질 또는 그의 조합 중 1 이상은 압타머 또는 그의 일부를 추가로 포함한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 압타머 또는 그의 일부는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 그의 유도체, 또는 그의 조합 중 1 이상을 포함한다.
제1 내지 제8 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, SIO, DF 또는 뉴클레아제는 고체 지지체에 부착되어 있다.
제1, 제2 및 제7 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 DF는 오직 표적의 존재하에서만 생성된다.
제3 측면, 및 제4 내지 제7 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 DF는 상기 표적과는 별개의 것이다.
제1 및 제2 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 표적을 검출하기 위한 것이고, 제1 DF는 상기 표적과는 별개의 것이다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS는 또 다른 EAS와 하이브리드화함으로써 1 초과의 DF와 하이브리드화할 수 있는 부분 효소 신호 증폭제(PESA: Partial Enzyme Signal Amplifier) 복합체를 형성할 수 있다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 표적 분자의 상이한 부분에 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 포함한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 상기 표적 분자의 상이한 부분에 특이적인 MNA자임은 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은(same) 기질을 인식하고 절단한다.
제3 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 별개의 표적들에 대한 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 포함한다.
제4 내지 제6, 및 제8 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 별개의 표적들에 대하여 상보성(complementarity)을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 포함한다.
제4 내지 제6, 및 제8 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 상이한 제1 DF와 조립된 2 이상의 별개의 제1 CESA 복합체를 포함한다.
제9 측면에서, 본 발명은
(a) 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 다성분 핵산(MNA자임) 기질을 제공하는 단계로서, 여기서, 파트자임은 표적의 존재하에서 자기 조립되어 1 이상의 MNA자임을 형성하는 것인 단계;
(b) MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성(catalytic activity)을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 MNA자임의 촉매 활성을 통해 상기 1 이상의 MNA자임 기질로부터 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)가 생성되는 것인 단계;
(c) 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(d) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
(e) 제1 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
(f) 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제1 뉴클레아제를 제1 CESA 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과(detectable effect)를 얻는 것인 단계
를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 상기 제1 뉴클레아제에 대한 상기 인식 부위 및/또는 상기 절단 부위를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 MNA자임 기질의 절단에 의해 생성된다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 2 이상의 MNA자임 기질의 결찰에 의해 생성된다.
제9 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제2 가닥은 제1 DF를 포함한다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 가닥은 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결된다.
제9 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있다. 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치한다.
제10 측면에서, 본 발명은
(a) 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)를 제공하는 단계;
(b) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 뉴클레아제에 대한 이중체 기질을 형성하는 단계;
(c) SIO 및 표적의 하이브리드화에 의해 형성된 이중체 기질을 절단할 수 있는 제1 뉴클레아제를 제공하는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 이중체 기질의 절단을 통해 제1 DF가 생성되는 것인 단계;
(d) EAS1 및 EAS2를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(e) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
(f) 제2 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
(g) 제2 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제2 뉴클레아제를 제1 CESA와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제11 측면에서, 본 발명은
(a) 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)를 제공하는 단계;
(b) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 뉴클레아제에 대한 이중체 구조체를 형성하는 단계;
(c) 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단할 수 있는 제1 뉴클레아제와 이중체 구조체를 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 SIO를 절단함으로써 제1 DF를 생성하는 것인 단계;
(d) EAS1 및 EAS2를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(e) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
(f) 제2 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
(g) 제2 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제2 뉴클레아제를 제1 CESA와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제12 측면에서, 본 발명은
(a) 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)를 제공하는 단계;
(b) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 뉴클레아제에 대한 이중체 구조체를 형성하는 단계;
(c) 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단할 수 있는 제1 뉴클레아제와 이중체 구조체를 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 표적을 절단함으로써 제1 DF를 생성하는 것인 단계;
(d) EAS1 및 EAS2를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(e) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
(f) 제2 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
(g) 제2 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제2 뉴클레아제를 제1 CESA와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 오직 상기 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 상기 SIO를 절단하여 상기 제1 DF를 생성한다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 오직 상기 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 상기 표적을 절단하여 상기 제1 DF를 생성한다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 제한 효소가 아니다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제1 CESA 복합체의 절단을 통해 추가의 DF가 유리될 수 있고, 추가의 DF가 추가의 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가의 CESA 복합체를 형성하고, 1 이상의 뉴클레아제를 사용하여 추가의 CESA 복합체를 절단함으로써 추가의 검출가능한 결과를 얻고 추가의 DF를 유리시킴으로써 검출가능한 결과의 추가 증가를 촉진시킨다.
제13 측면에서, 본 발명은
(a) 제1 DF를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 DF는 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
(b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적이고;
EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하는 것인, EAS1 및 EAS2; 및
(ii) 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3)의 일부가 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4)의 일부에 상보적이고;
EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS3 및 EAS4를 제공하는 단계;
(c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
(ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA 복합체를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
(d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하고;
(ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA 복합체를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제2 CESA 복합체를 절단하는 것인 단계를 포함하고;
여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제13 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 CESA 복합체 및 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는다.
제13 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제 및 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제이다.
제13 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제 및 제2 뉴클레아제는 상이한 뉴클레아제이다.
제13 측면의 한 실시양태에서, 상기 EAS3 또는 상기 EAS4의 일부는 추가의 DF를 포함하고, 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리된다.
제13 측면의 한 실시양태에서, 상기 추가의 DF의 일부는 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5)의 제1부에 상보적이고, 여기서, 상기 EAS5의 제2부는 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6)의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 및 EAS6은 상기 추가의 DF와 조립됨으로써 제3 CESA 복합체를 형성한다.
제13 측면의 한 실시양태에서:
(i) 추가의 DF의 일부는 상기 제1 DF와 동일하거나;
(ii) 추가의 DF는 상기 제1 DF와 동일하거나;
(iii) 추가의 DF는 상기 제1 DF의 단편이고;
여기서, 상기 추가의 DF는 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있다.
제14 측면에서, 본 발명은
(a) 적어도 제1 DF 및 제2 DF를 생성하는 단계로서, 상기 제1 DF는 오직 제1 표적의 존재하에서만 생성되고, 상기 제2 DF는 오직 제2 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
(b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS1 및 EAS2; 및
(ii) EAS3의 일부가 EAS4의 일부에 상보적이고:
EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS3 및 EAS4를 제공하는 단계;
(c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
(ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA 복합체를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제1 CESA 복합체를 절단함으로써 제1 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계;
(d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하고;
(ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA 복합체를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제2 CESA 복합체를 절단함으로써 제2 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계를 포함하고;
여기서, 상기 제1 검출가능한 결과는 상기 제2 검출가능한 결과와는 별개의 것인, 캐스케이드를 사용하여 복수 개의 별개의 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제14 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제이다.
제14 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제는 상이한 뉴클레아제이다.
제14 측면의 한 실시양태에서:
(i) 상기 EAS1 또는 상기 EAS2의 일부는 추가의 DF를 포함하고, 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리되고;
(ii) 상기 추가의 DF가 2 이상의 추가 EAS 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가 CESA 복합체를 형성하고, 뉴클레아제에 의한 상기 추가 CESA 복합체의 절단을 통해 상기 제1 검출가능한 결과가 증가된다.
제14 측면의 한 실시양태에서:
(i) 상기 EAS3 또는 상기 EAS4의 일부는 추가의 DF를 포함하고, 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리되고;
(ii) 상기 추가의 DF가 2 이상의 추가 EAS 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가 CESA 복합체를 형성하고, 뉴클레아제에 의한 상기 추가 CESA 복합체의 절단을 통해 상기 제2 검출가능한 결과가 증가된다.
제15 측면에서, 본 발명은
(a) 제1 구동자 단편을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 구동자 단편은 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
(b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적이고;
EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하고;
EAS1 또는 EAS2가 지지체에 테더링(tethering)되어 있는 것인, EAS1 및 EAS2; 및
(ii) EAS3의 일부가 EAS4의 일부에 상보적이고;
EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적이고;
EAS3 또는 EAS4의 일부가 제3 DF를 포함하고;
EAS3 또는 EAS4가 지지체에 테더링되어 있는 것인, EAS3 및 EAS4를 제공하는 단계;
(c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 상기 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
(ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
(d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA를 형성하고;
(ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있는 제3 DF가 유리되는 것인 단계를 포함하고;
여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제1 DF는,
SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고,
여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제1 DF가 유리된다.
제14 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제2 DF는,
SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고,
여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제2 DF가 유리된다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단하여 상기 DF를 생성한다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단하여 상기 DF를 생성한다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 제한 효소가 아니다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, SIO는 지지체에 부착되어 있다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제1 DF는 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하고, 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제1 DF를 제공함으로써 생성된다.
제14 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제2 DF는 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하고, 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제2 DF를 제공함으로써 생성된다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제2 가닥은 상기 DF를 포함한다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 가닥은 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결된다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커이다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치한다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS3 및 EAS4는 상기 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분 사이에 형성된 이중 가닥부, 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분이다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및 EAS2는 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분 사이에 형성된 이중 가닥부, 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분이다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커이다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체는 한(one) EAS 올리고뉴클레오티드로부터 신장된 5' 또는 3' 오버행잉형 단일 가닥부를 더 포함한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 루프부는 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS3 및/또는 EAS4는 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS3은 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, EAS4는 추가의 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 추가의 소광제 부분은 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및/또는 EAS2는 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, EAS1은 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, EAS2는 추가의 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 추가의 소광제 부분은 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 검출가능한 부분은 형광단이다.
제9 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제10 내지 제12 측면의 한 실시양태에서, 제2 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있고/거나, 상기 제2 뉴클레아제는 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 닉은 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF의 상기 EAS2에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, DF가 1 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공한다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, DF가 2 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공한다.
150. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, DF가 3 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공하는 것인 방법.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 염기는 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 3' 바로 옆에 있다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 염기는 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 5' 바로 옆에 있다.
제9 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 부위 또는 상기 뉴클레아제 절단 부위에 제공하지 않는다.
제13 내지 제15 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF는 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 부위 또는 상기 뉴클레아제 절단 부위에 제공하지 않는다.
제16 측면에서, 본 발명은
(a) 제1 구동자 단편을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 구동자 단편은 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
(b) 제1 골격 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) EAS1을 포함하는 제1부로서, 여기서,
상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고;
EAS2의 일부는 제1 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 구동자 단편을 포함하는 것인 제1부;
(ii) EAS3을 포함하는 제2부로서, 여기서,
상기 EAS3의 일부는 상기 EAS4의 일부에 상보적이고;
상기 EAS3의 일부는 제2 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 구동자 단편을 포함하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부를 포함하는 것인 단계; 및
(c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 상기 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA를 형성하고;
(ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
(d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA를 형성하고;
(ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있는 제1 DF가 유리되는 것인 단계를 포함하고;
여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 CESA 복합체의 절단 및 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 본 방법은
(a) 골격 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 복합체를 제공하는 단계로서, 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5)를 포함하는 것인 제1부로서, 여기서,
상기 EAS5의 일부는 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6)의 일부에 상보적이고;
EAS5의 일부는 제2 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
EAS5 또는 EAS6의 일부는 제1 구동자 단편을 포함하는 것인 제1부; 및
(ii) 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7)를 포함하는 것인 제2부로서, 여기서,
상기 EAS7의 일부는 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8)의 일부에 상보적이고;
상기 EAS8의 일부는 제1 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
상기 EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 구동자 단편을 포함하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부를 포함하는 것인 단계; 및
(b) 상기 제1 복합체의 제3부와 상기 제2 복합체의 제3부의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 상기 제1 및 제2 복합체를 접촉시켜 제1 이중 복합체를 형성하는 단계;
(c) (i) 제2 DF가 EAS5 및 EAS6과 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS5 및 EAS6을 상기 (a)의 제2 DF와 접촉시켜 제3 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제3 CESA를 형성하고;
(ii) 제3 뉴클레아제와 제3 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제3 CESA를 제3 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제3 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있고 상기 EAS7 및 EAS8과 조립됨으로써 상기 제4 CESA를 형성할 수 있는 제1 DF가 유리되는 것인 단계; 및
(d) (i) 제1 DF가 EAS7 및 EAS8과 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS7 및 EAS8을 제1 DF와 접촉시켜 제4 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제4 CESA를 형성하고;
(ii) 제4 뉴클레아제와 제4 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제4 CESA를 제4 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제4 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS3 및 EAS4와 조립됨으로써 상기 제2 CESA를 형성할 수 있고 상기 EAS5 및 EAS6과 조립됨으로써 상기 제3 CESA를 형성할 수 있는 제2 DF가 유리되는 것인 단계를 추가로 포함하고;
여기서, 상기 제3 CESA 복합체 및/또는 상기 제4 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 상기 제3 CESA 복합체의 절단 및 상기 제4 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는다.
제16 측면의 한 실시양태에서, EAS1은 EAS7과 동일하고/거나, EAS2는 EAS8과 동일하고/거나, EAS3은 EAS5와 동일하고/거나, EAS4는 EAS6과 동일하다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 제2 이중 복합체에 연결된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 연결은 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 연결은 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제1 DF는,
SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고,
여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제2 DF가 유리된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단하여 상기 DF를 생성한다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단하여 상기 DF를 생성한다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 개시제 뉴클레아제는 제한 효소가 아니다.
제16 측면의 한 실시양태에서, (a)의 제1 DF는 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하고, 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제1 DF를 제공함으로써 생성된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 상기 EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7 및 EAS8 중 임의의 하나 이상은 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, 여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제16 측면의 한 실시양태에서:
(i) EAS1은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS2는 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
(ii) EAS3은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS4는 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
(iii) EAS5는 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS6은 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
(iv) EAS7은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS8은 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고;
여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 상기 제1, 제2 또는 제3 뉴클레아제에 대한 상기 인식 서열을 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제16 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 DF의 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성한다.
제9 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 효소 증폭제 기질 쌍은 EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되고, 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제9 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 제1 DF는 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제로부터 선택되는 뉴클레아제를 사용하여 생성된다.
제9 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제9 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 T7 엔도뉴클레아제 I, RN아제 H, 플랩 뉴클레아제, 또는 멍빈 뉴클레아제이다.
제17 측면에서, 본 발명은
(a) (i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서, 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인 제1부 및 제2부; 및
(ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 포함하는 이중체 구조체를 제공하고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS1 및 EAS2;
(iii) 제1 엑소뉴클레아제를 제공하는 단계;
(b) (i) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 상기 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 엑소뉴클레아제에 대한 이중체 기질을 형성하며, 여기서, 제1 엑소뉴클레아제에 의한 이중체 구조체의 변형을 통해 상기 이중체 기질로부터 상기 제1 DF가 유리되고;
(ii) 제1 DF가 상기 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (b)의 제1 DF와 접촉시켜 제2 엑소뉴클레아제에 대한 기질을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
(iii) 제2 엑소뉴클레아제와 제1 CESA 복합체와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제2 엑소뉴클레아제와 접촉시키고, 여기서, 제2 엑소뉴클레아제에 의한 제1 CESA 복합체의 변형을 통해, 추가 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 추가의 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 상기 제1 DF가 상기 제1 CESA 복합체로부터 유리되는 것인 단계를 포함하고;
여기서, 이중체 구조체의 상기 변형 및/또는 제1 CESA 복합체의 상기 변형을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제17 측면의 한 실시양태에서, 이중체 구조체의 변형 및 제1 CESA 복합체의 상기 변형을 통해 검출가능한 결과를 얻는다.
제17 측면의 한 실시양태에서, SIO는 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드이다.
제17 측면의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 III이다.
제17 측면의 한 실시양태에서, SIO 및/또는 상기 EAS1은 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, 여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 상기 엑소뉴클레아제에 의한 변형시 분리될 수 있고, 이로써 검출가능한 결과를 얻을 수 있다.
제17 측면의 한 실시양태에서, 검출가능한 부분은 형광단이다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 검출가능한 결과는 형광 분광법, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법, 원편광 이색법, 면역검정법, 크로마토그래피, 방사선 측정법, 광도 측정법, 섬광조영술, 전자 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광법, 효소법 또는 그의 임의 조합에 의해 검출된다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 검출가능한 결과를 측정하고, 여기서, 상기 측량의 규모 및/또는 검출가능한 결과의 누적 속도가 표적의 양(quantity)을 나타낸다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 표적은 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소형 분자, 중합체, 금속 이온, 금속 염, 프리온, 핵산 또는 그의 임의의 유도체, 일부 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프레(pre)- 및 프리(pri)-마이크로RNA, 다른 비코딩 RNAs, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 핵산의 공급원은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 핵산은 증폭된다.
제10 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF는 상기 표적과는 별개의 것이다.
제9 내지 제17 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS는 또 다른 EAS와 하이브리드화함으로써 1 초과의 DF와 하이브리드화할 수 있는 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 형성할 수 있다.
제9 및 제13 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 본 방법은 표적 분자의 상이한 부분에 대하여 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 사용하는 단계를 포함한다.
제9 및 제13 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 상기 표적 분자의 상이한 부분에 대하여 특이적인 MNA자임는 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은 기질을 인식하고 절단한다.
제9 및 제13 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 본 방법은 별개의 표적들에 대한 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 사용하는 단계를 포함한다.
제10 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 본 방법은 별개의 표적들에 대하여 상보성을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 사용하는 단계를 포함한다.
제9 내지 제16 측면의 한 실시양태에서, 본 방법은 상이한 제1 DF와 조립된 2 이상의 별개의 제1 CESA 복합체를 사용하는 단계를 포함한다.
제18 측면에서, 본 발명은
뉴클레아제; 및
EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인 EAS1 및 EAS2를 포함하는, 신호 증폭용 키트를 제공한다.
제19 측면에서, 본 발명은
뉴클레아제;
EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
표적에 상응하는 MNA자임으로 조립되도록 디자인된 복수 개의 파트자임; 및
MNA자임 기질로서, 여기서, 상기 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적인 것인 MNA자임 기질을 포함하고;
여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트를 제공한다.
제20 측면에서, 본 발명은
뉴클레아제;
EAS1 및 EAS2로서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부가 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
표적에 하이브리드화하여 뉴클레아제 기질을 형성하도록 디자인된 복수 개의 SIO를 포함하고;
여기서, 상기 뉴클레아제 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적이고;
여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트를 제공한다.
제21 측면에서, 본 발명은 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 포함하는 키트로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 키트를 제공한다.
제22 측면에서, 본 발명은 EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 키트를 제공한다.
제23 측면에서, 본 발명은 다성분 핵산 효소(MNA자임), MNA자임 기질, EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
MNA자임은 MNA자임 조립 촉진제의 존재하에 자기 조립하여 MNA자임을 형성하는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하고, 상기 적어도 제1 및 상기 제2 파트자임은 각각 기질 아암부, 촉매성 코어부, 및 센서 아암부를 포함하고, 센서 아암은 상기 MNA자임 조립 촉진제와 상호작용하여 제1 및 제2 파트자임을 이들의 각각의 촉매성 코어부의 회합을 위한 근접한 위치에 유지시켜 MNA자임의 촉매성 코어를 형성하고, 상기 촉매성 코어는 상기 MNA자임 기질을 변형시켜 제1 DF를 형성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 제1 DF는 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 적어도 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인, 키트를 제공한다.
제23 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있다.
제23 측면의 한 실시양태에서, 제2 가닥은 제1 DF를 포함한다.
제23 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 가닥은 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결된다.
제23 측면의 한 실시양태에서, MNA자임 기질은 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치한다.
제23 측면의 한 실시양태에서, 조립 촉진제는 확인하고자 하는 표적이다.
제24 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 기질을 형성할 수 있고, 상기 제1 뉴클레아제는 이중체 기질을 절단함으로써 제1 DF을 생성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 키트를 제공한다.
제25 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 구조체를 형성할 수 있고, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 상기 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 상기 SIO를 절단함으로써 제1 DF를 생성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 키트를 제공한다.
제26 측면에서, 본 발명은 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 구조체를 형성할 수 있고, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 상기 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 상기 표적을 절단함으로써 제1 DF를 생성할 수 있고;
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하며;
제1 뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제가 아닌 것인 키트를 제공한다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 제한 효소가 아니다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제이다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 상이한 뉴클레아제이다.
제21 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제24 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제2 뉴클레아제는 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제21 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 닉은 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치한다.
제21 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및 EAS2는 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 상기 EAS1 또는 EAS2 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함한다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 상기 EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 상기 헤어핀 루프부의 일부는 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF 및 제2 DF는 동일한 것이 아니다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제1 DF 및 상기 제2 DF는 동일한 것이다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF는 상기 제1 DF의 단편이거나, 또는 상기 제1 DF는 상기 제2 DF의 단편이다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제2 DF, EAS1, 및 EAS2는 조립되어 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 키트는 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3) 및 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4)를 추가로 포함하고, 여기서, EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고, EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS3 및 EAS4는 오직 제2 DF와의 조립시에만 추가 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성한다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, EAS3 또는 EAS4는 제3 DF를 포함한다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제3 DF는 상기 제1 DF와 동일하다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 제3 DF는 상기 제1 DF와 동일하지 않다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 키트 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 키트 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하지 않고, 여기서, 상기 키트는 상기 추가 뉴클레아제를 포함한다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 추가 뉴클레아제는 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, EAS3 및 EAS4는 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제18 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 상기 EAS3 또는 EAS4 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함한다.
제27 측면에 있어서, 본 발명은 골격 올리고뉴클레오티드, EAS1, EAS2, EAS3, 및 EAS4를 포함하는 제1 복합체를 포함하는 키트로서, 여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) 상기 EAS1을 포함하는 것인 제1부로서, 여기서, 상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS2의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부;
(ii) 상기 EAS3을 포함하는 것인 제2부로서, 여기서, 상기 EAS3의 일부는 상기 EAS4의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, 여기서, EAS3 및 EAS4는 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 것인 제3부를 포함하는 것인 키트를 제공한다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 키트는 골격 올리고뉴클레오티드, 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5), 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6), 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7), 및 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8)를 포함하는 제2 복합체를 추가로 포함하는 것으로서,
여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
(i) 상기 EAS5를 포함하는 것인 제1부로서, 여기서, 상기 EAS5의 일부는 상기 EAS6의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5의 일부는 상기 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 또는 EAS6의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, 여기서, EAS5 및 EAS6은 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제3 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제3 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부; 및
(ii) 상기 EAS7을 포함하는 것인 제2부로서, 여기서, 상기 EAS7의 일부는 상기 EAS8의 일부에 상보적이고, 상기 EAS8의 일부는 상기 제1 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 DF를 포함하고, 여기서, EAS7 및 EAS8은 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제4 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제4 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
(iii) 제1부와 제2부를 연결하는 것인 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부를 포함한다.
제27 측면의 한 실시양태에서, EAS1은 EAS7과 동일하고/거나, EAS2는 EAS8과 동일하고/거나, EAS3은 EAS5와 동일하고/거나, EAS4는 EAS6과 동일하다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 뉴클레아제는 제3 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제2 뉴클레아제는 제4 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레아제는 동일하다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 복합체는 그의 각각의 상보적인 제3부를 통해 하이브리드화함으로써 제1 이중 복합체를 형성한다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 제2 이중 복합체에 연결된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 이중 복합체는 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 연결은 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 공유 결합 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 연결은 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제는 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
제27 측면의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제27 측면의 한 실시양태에서, EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되는 효소 증폭제 기질 쌍은 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분이다.
제28 측면에서, 본 발명은 SIO를 포함하는 키트로서, 상기 SIO는
(i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서, 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인 제1부 및 제2부; 및
(ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서,
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 포함하는 이중체 구조체를 제공하고,
EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고,
EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 의한 분해가 가능한 오목형 3' 말단을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 EAS1 및 EAS2
를 포함하는 것인 키트를 제공한다.
제28 측면의 한 실시양태에서, SIO는 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드이다.
제28 측면의 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이다.
제18 내지 제28 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS는 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다.
제18 내지 제28 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 EAS는 형광단 부분 및 소광제 부분을 포함한다.
제18 내지 제28 측면의 한 실시양태에서, 임의의 상기 MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, SIO, DF 또는 뉴클레아제는 고체 지지체에 부착되어 있다.
제19, 제20, 및 제23 내지 제26 측면의 한 실시양태에서, 임의의 제1 DF는 상기 표적과는 별개의 것이다.
제19 및 제23 측면의 한 실시양태에서, 키트는 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 포함한다.
제19 및 제23 측면의 한 실시양태에서, 상기 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 MNA자임은 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은 기질을 인식하고 절단한다.
제19 및 제23 측면의 한 실시양태에서, 키트는 별개의 표적들에 대한 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 포함한다.
제20, 제24 내지 제26, 및 제28 측면의 한 실시양태에서, 키트는 별개의 표적들에 대하여 상보성을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 포함한다.
제29 측면에서, 본 발명은 제1 내지 제8 측면 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
제19 내지 제29 측면의 한 실시양태에서, 키트는 상기 키트 사용을 위한 설명서를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 적어도 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 적어도 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하고, 여기서, DF의 일부가 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 적어도 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 적어도 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2) 및 적어도 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 상기 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하고, 여기서, DF의 일부 DF는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물을 제공한다. 뉴클레아제는 제한 효소일 수 있다.
또 다른 측면에서, 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), 적어도 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1), 적어도 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2), 적어도 제1 뉴클레아제 및 적어도 제2 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서,
여기서, SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 기질을 형성할 수 있고, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 이중체 기질을 절단함으로써 구동자 단편(DF)을 생성할 수 있으며; 여기서,
EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하는 것인 조성물을 제공한다.
제1 및 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제일 수 있거나, 별법으로, 제1 및 제2 뉴클레아제는 상이한 뉴클레아제일 수 있다.
또 다른 측면에서, 1 이상의 MNA자임, 1 이상의 MNA자임 기질 및 적어도 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 적어도 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2) 및 적어도 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
MNA자임은 MNA자임 조립 촉진제의 존재하에 자기 조립하여 MNA자임을 형성하는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 제1 및 상기 제2 파트자임은 각각 기질 아암부, 촉매성 코어부, 및 센서 아암부를 포함하고, 여기서, 센서 아암은 상기 MNA자임 조립 촉진제와 상호작용하여 제1 및 제2 파트자임을 이들의 각각의 촉매성 코어부의 회합을 위한 근접한 위치에 유지시켜 MNA자임의 촉매성 코어를 형성하고, 상기 촉매성 코어는 상기 MNA자임 기질을 변형시켜 구동자 단편(DF)을 형성할 수 있고;
여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, DF는 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 적어도 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성할 수 있는 것인, 조성물을 제공한다.
조립 촉진제는 확인하고자 하는 표적일 수 있다. 제1 및/또는 제2 뉴클레아제는 제한 효소, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 멍빈 뉴클레아제일 수 있다. 엑소뉴클레아제는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 1, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 T일 수 있다. 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 III이다.
또 다른 측면에서,
(a) 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)를 제공하는 단계;
(b) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 뉴클레아제에 대한 이중체 기질을 형성하는 단계;
(c) SIO 및 표적의 하이브리드화에 의해 형성된 이중체 기질을 절단할 수 있는 제1 뉴클레아제를 제공하는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 이중체 기질의 절단을 통해 구동자 단편(DF)이 생성되는 것인 단계;
(d) 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(e) (1) DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 구동자 단편과 접촉시키는 단계;
(f) 제2 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
(g) 제2 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제2 뉴클레아제를 CESA와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서,
(a) 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하는 단계로서, 여기서, 파트자임은 표적의 존재하에서 자기 조립되어 1 이상의 MNA자임을 형성하는 것인 단계;
(b) MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 MNA자임의 촉매 활성을 통해 상기 1 이상의 MNA자임 기질로부터 구동자 단편(DF)이 생성되는 것인 단계;
(c) 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1의 일부는 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
(d) (1) DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
(2) 뉴클레아제 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 구동자 단편과 접촉시키는 단계;
(e) 뉴클레아제를 제공하는 단계;
(f) 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 뉴클레아제를 CESA 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계를 포함하는, 표적을 검출하는 방법을 제공한다.
제5 및 제6 측면의 방법에서 뉴클레아제는 제한 효소, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 T7 엔도뉴클레아제 I 또는 멍빈 뉴클레아제일 수 있다. 엑소뉴클레아제는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 1, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 T일 수 있다. 한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 III이다.
구동자 단편은 MNA자임 기질의 절단에 의해 또는 2 이상의 MNA자임 기질의 결찰에 의해 생성될 수 있다.
EAS1은 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함할 수 있고, 여기서, 뉴클레아제에 의한 EAS1의 절단시 검출가능한 부분을 통해 얻게 되는 검출가능한 결과는 증가하거나, 감소된다. 또 다른 실시양태에서, EAS1은 검출가능한 부분을 포함할 수 있고, EAS2는 소광제 부분을 포함할 수 있다. 별법으로, EAS2는 검출가능한 부분을 포함할 수 있고, EAS1은 소광제 부분을 포함할 수 있다. 뉴클레아제에 의한 절단시 검출가능한 부분을 통해 얻게 되는 검출가능한 결과는 증가하거나, 감소될 수 있다.
CESA의 절단을 통해 추가의 구동자 단편이 유리될 수 있고, 구동자 단편은 추가의 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 추가의 CESA를 형성할 수 있으며, 여기서, 1 이상의 추가의 뉴클레아제가 추가의 CESA를 절단함으로써 추가의 검출가능한 결과(들)를 얻게 되고, 추가의 구동자 단편이 유리됨으로써 검출가능한 결과의 추가 증가는 촉진된다.
검출가능한 결과는 형광 분광법, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법, 원편광 이색법, 면역검정법, 크로마토그래피, 방사선 측정법, 광도 측정법, 섬광조영술, 전자 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광법, 효소법 또는 그의 임의 조합에 의해 검출될 수 있다. 검출가능한 결과를 측정할 수 있고, 측량의 규모가 표적의 양을 나타내는 것일 수 있다.
표적은 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소형 분자, 중합체, 금속 이온, 금속 염, 프리온, 핵산 또는 그의 임의의 유도체, 일부 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프레- 및 프리-마이크로RNA, 다른 비코딩 RNAs, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산의 공급원은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 증폭될 수 있다. 증폭법으로는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭법(SDA), 루프 매개 등온 증폭법(LAMP), 회전 환 증폭법(RCA), 전사체 매개 증폭법(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭법(NASBA), 또는 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
파트자임, 조립 촉진제, MNA자임 기질, 구동자 단편, EAS1, EAS2 또는 SIO 중 1 이상은 포스포로티오에이트, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시히드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실퀘오신, 2-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 퀘오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘 및 베타 D-아라비노실 티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오티드 치환 또는 부가를 포함한다.
일부 실시양태에서, CESA의 표적화된 절단에 의한 신호 발생을 방해할 수 있는 부위(들)에서의 올리고뉴클레오티드 단편의 특이적인 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 분해를 막기 위해 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레아제, 예컨대, T7 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III 및/또는 엑소뉴클레아제 I의 절단을 억제시키기 위해 포스포로티오에이트 연결부가 사용될 수 있다.
MNA자임 파트자임, MNA자임 기질 또는 그의 조합 중 1 이상은 1 이상의 압타머 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 압타머 또는 그의 일부는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 유도체 또는 조합물 중 1 이상을 포함할 수 있다.
압타머, 또는 그의 일부는 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소형 분자, 중합체, 금속 이온, 금속 염, 프리온 또는 그의 임의의 유도체, 일부 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합할 수 있다.
MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, EAS1, EAS2, SIO 또는 1 이상의 뉴클레아제 중 1 이상은 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다.
또 다른 측면에서,
뉴클레아제; 및
EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적이고; 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하는 것인 EAS1 및 EAS2
를 포함하는, 신호 증폭용 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서,
뉴클레아제;
EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
표적에 상응하는 MNA자임으로 조립되도록 디자인된 복수 개의 파트자임; 및
MNA자임 기질로서, 여기서, 상기 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적인 것인 MNA자임 기질을 포함하고;
여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서,
뉴클레아제;
EAS1 및 EAS2로서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부가 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
표적에 하이브리드화하여 뉴클레아제 기질을 형성하도록 디자인된 복수 개의 SIO를 포함하고;
여기서, 상기 뉴클레아제 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적이고;
여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 완전 효소 신호 증폭제 복합체(CESA)를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 측면은 하기에서 도면 및 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 기술될 것이며, 여기서, 도면 및 실시예는 본 발명의 일부 측면을 예시하는 것이지, 본 발명의 전체를 포함하는 것은 아니고, 당업자가 분명하게 이해하는 내용은 첨부되는 특허청구범위의 의미 및 범주 내에서 변형 및 변경될 수 있다.
이에, 첨부된 도면을 참고로 하여, 단지 일례로서 본 발명의 바람직한 실시양태를 기술한다:
도 1은 다양한 절단가능한 이중체 올리고뉴클레오티드 구조체 및 절단불가능한 이중체 올리고뉴클레오티드 구조체의 예시적인 일례를 제공하는 것이다. 각 올리고뉴클레오티드 단편의 5' 말단은 원으로 표시되어 있다. 구조체 A(i)은 뉴클레아제에 의해 쉽게 절단될 수 있는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체의 일례를 보여주는 것이다. 상기 CESA는 3가지 올리고뉴클레오티드, 즉, 효소 증폭제 기질 올리고 1(EAS1), 효소 증폭제 기질 올리고 2(EAS2) 및 구동자 단편(DF)으로 구성된다. A(i)에 도시된 CESA에서, DF의 5' 말단은 EAS2의 3' 말단에 인접해 있다. 제2 CESA는 A(ii)에 도시되어 있는데, 여기서, DF의 3' 말단은 EAS2의 5' 말단에 인접해 있다.
구조체 B(i)은 쉽게 절단되는 이중체 구조체 형성을 파괴하는 추가 서열의 존재에 기인하여 뉴클레아제, 예컨대, RE에 의한 절단에 대해 내성을 띠는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 효소 억제 복합체(EIC: Enzyme Inhibitory Complex)의 일례를 보여주는 것이다. 상기 EIC는 3가지 올리고뉴클레오티드, 즉, EAS1, EAS2 및 억제 단편(InF)으로 구성된다. InF는 EAS2와의 접합부를 파괴하여 EIC 복합체가 뉴클레아제 분해에 대하여 내성을 띠도록 만드는 추가 서열과 함께 DF 서열을 포함한다. EIC B(i)에서, InF의 5' 말단이 EAS2의 3' 말단을 파괴한다. 제2 EIC는, InF의 3' 말단이 EAS2의 5' 말단을 파괴하는 것인 B(ii)에 도시되어 있다.
구조체 C(i)은 쉽게 절단되는 이중체 구조체를 형성하는 데 필요한 서열이 없기 때문에, 뉴클레아제, 예컨대, RE에 의한 절단에 대해 내성을 띠는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체의 일례를 보여주는 것이다. 본 도해에서, PESA는 두 올리고뉴클레오티드, 즉, EAS1 및 EAS2로 구성된다. 이러한 PESA는 뉴클레아제에 의한 인식 및/또는 절단을 위해 충분한 이중체 서열을 포함하지 않는다. PESA C(i)에서, EAS1의 5' 말단에는 이중체 서열이 불충분하게 존재하다. 제2 PESA는, EAS1의 3' 말단에 이중체 서열이 불충분하게 존재하는 것인 C(ii)에 도시되어 있다.
도 2는 제한 엔도뉴클레아제(RE)에 의해 절단되도록 디자인된 다양한 완전하게 조립된 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 상기 다이어그램에서, 상부 검은색 실선은 효소 증폭제 기질 올리고 단편 1(EAS1)을 나타내고, 하부 검은색 실선은 CESA의 효소 증폭제 기질 올리고 2(EAS2)를 나타낸다. 구동자 단편(중심부가 흰색으로 된 검은색 선으로 표시된 DF)은 RE(점선으로 된 박스로 표시된 것)의 인식 서열을 완성시키는 데 필요할 수 있고/거나, RE에 의한 절단에 필요한 RE 인식 부위에 인접해 있는 추가 서열을 제공할 수 있다. 절단 부위(들)는 실선으로 그려진 검은색 수직 화살표로 표시되어 있다.
RE에 의한 절단을 통해 5' 오버행, 3' 오버행이 형성될 수 있거나, 또는 블런트 말단이 생성될 수 있다. RE는 EAS1, EAS2 및 DF를 포함하는 이중 가닥의 조립된 CESA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단할 수 있다. EAS2 및 DF가 인접해 있는 위치는 정상적으로는 RE에 의한 연속(절단되지 않은) 이중 가닥 이중체 절단이 이루어지는 위치에 존재할 수 있거나, 또는 RE에 의한 인식 및 절단에 필요한 서열을 포함하는 다른 곳일 수 있다. EAS2에 인접해 있는 DF의 말단은 이전 단계에서 보다 긴 장쇄의 올리고, 예를 들어, 억제 단편(InF)의 절단에 의해 생성될 수 있다. InF는 예를 들어, 뉴클레아제에 의해 절단가능한 합성 개시제 올리고(SIO), 또는 MNA자임에 의해 절단가능한 MNA자임 기질을 포함할 수 있다. 단백질 효소 또는 MNA자임에 의한 상기 보다 긴 장쇄의 올리고의 절단으로 5' 및 3' 단편이 생성될 수 있는데, 이중 하나 또는 그 둘 모두는 CESA를 완성시키기 위한 DF로서의 역할을 할 수 있다. 그러한 경우, EAS2에 인접해 있는 DF의 말단은 절단된 올리고의 3' 단편의 5' 말단이거나, 또는 절단된 올리고의 5' 단편의 3' 말단이어야 한다.
패널 (a): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 필요하고, RE 절단을 통해 3' 오버행이 형성되는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (b): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 필요하고, RE 절단을 통해 5' 오버행이 형성되는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (c): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 필요하고, RE 절단을 통해 블런트 말단이 형성되는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (d): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 필요하고, RE가 단 한 가닥만을, 본 도해에서는 EAS1만을 절단하는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (e): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 요구되지 않고, RE에 의한 절단에 필요한 RE 인식 부위에 인접해 있는 서열을 제공하는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (f): RE의 인신 서열을 완성하는 데 DF가 필요하고, RE 절단을 통해 5' 오버행이 형성되는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 5' 절단 단편의 3' 말단이다.
패널 (g): DF가 RE에 의한 절단에 필요한 완전 RE 인식 서열의 한 가닥을 제공함으로써 RE의 인식 서열을 완성하는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
패널 (h): DF가 RE에 의한 절단에 필요한 완전 RE 인식 서열의 한 가닥을 제공함으로써 RE의 인식 서열을 완성하는 것인, DF를 포함하는 조립된 CESA. 본 일례에서, EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 3' 절단 단편의 5' 말단이다.
도 3은 실시예 1의 다양한 절단가능한 이중체 올리고뉴클레오티드 구조체 및 절단불가능한 이중체 올리고뉴클레오티드 구조체의 예시적인 일례이다. 각 올리고뉴클레오티드 단편의 5' 말단은 원으로 표시되어 있다. 완전 또는 부분 제한 효소 인식 부위는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고, 제한 효소 절단 부위는 실선으로 그려진 수직 화살표로 표시되어 있다. 패널 A는 효소에 의해 쉽게 절단될 수 있는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체의 일례를 보여주는 것이다. 본 도면 및 실시예 1에서, 효소는 그의 인식 부위로부터 원거리에 있는 부위를 절단하는 제한 효소(RE) Mnl I이다. 상기 CESA는 3가지 올리고뉴클레오티드, 즉, 형광단 및 소광제로 표지된 효소 증폭제 기질 올리고 1(상단 검은색 실선으로 표시된 EAS1), 소광제로 표지된 효소 증폭제 기질 올리고 2(하단 검은색 실선으로 표시된 EAS2), 및 구동자 단편(중심부가 흰색으로 된 검은색 선으로 표시된 DF)으로 구성된다. 상기 CESA에서, 5' 말단 DF는 EAS2의 3' 말단에 인접해 있다. 상기 CESA가 절단되면, RE에 의해 EAS1 및 EAS2 올리고뉴클레오티드가 절단됨으로써 형광이 증가하게 되지만, DF는 절단되지 않고, 따라서, 또 다른 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체에의 결합에 이용될 수 있게 된다. CESA의 절단에 의해 신호를 증폭시키는 반응, 예컨대, 상기와 같은 반응을 "EzyAmp" 반응이라 명명한다.
패널 B는 RE에 의한 절단에 대해 내성을 띠는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 효소 억제 복합체(EIC)의 일례를 보여주는 것이다. 상기 EIC는 3가지 올리고뉴클레오티드, 즉, EAS1, EAS2 및 억제 단편(InF)으로 구성된다. InF는 (RER을 완성하는 데 필요한 염기를 포함하는) DF의 전체 서열을 포함할 뿐만 아니라, RE에 의한 절단을 위해 필요한 구조체 형성을 파괴하는 추가 서열도 포함한다. 상기 EIC에서, InF의 5' 말단은 EAS2의 3' 말단에 인접해 있고, 상기 말단에서의 결합을 파괴한다. InF는 오직 표적의 존재하에서만 절단됨으로써 DF를 생성할 수 있는 올리고 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, InF는 표적에 특이적인 방식으로 뉴클레아제에 의해 절단가능한 SIO 또는 MNA자임에 의해 절단가능한 MNA자임 기질을 포함할 수 있다.
패널 C는 뉴클레아제, 예를 들어, RE인 Mnl I에 의한 절단에 대해 내성을 띠는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체인 부분 효소 신호 증폭제 복합체(PESA)의 일례를 보여주는 것이다. 상기 PESA는 두 올리고뉴클레오티드, 즉, EAS1 및 EAS2로 구성된다. 이러한 PESA는 RE에 의해 요구되는 이중 가닥 인식 서열을 포함하지 않는다.
패널 D는 오직 EAS1만을 포함하고, 이에, RE에 의해 쉽게 절단되지 않는 것인 대조군의 일례를 보여주는 것이다. RE 인식 부위 및 절단 부위를 형성하는 데에는 EAS1에 상보적인 서열이 필요하기 때문에, 절단이 일어날 수 없다.
도 4는 EzyAmp 반응의 일례를 도시한 것이다. 제1 효소 증폭제 기질 올리고(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질(EAS2) 올리고를 포함하는 PESA 복합체를 포함하는 반응 중에 (표적 의존 효소 변형에 의해 생성된, 또는 직접 반응 믹스에 첨가된) 구동자 단편(DF)이 존재한다. DF는 PESA 복합체와 조립됨으로써, 뉴클레아제 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 CESA를 형성하고, 본 도해에서, 뉴클레아제는 제한 효소이다. 각각의 EAS1, EAS2 및 DF에서 원이 각 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 제한 효소 인식 부위는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고, 제한 효소 절단 부위는 실선으로 그려진 수직 화살표로 표시되어 있다. 본 도해에서, 제1 EAS1은 형광단(F)으로 표지되고, 제2 EAS 2는 소광제(Q)로 표지된다. 조립된 CESA가 절단된 후, 이어서, 성분이 해리되면, 형광 신호가 발생하게 되고, 온전한 DF가 유리된다. 이어서, DF는 자유롭게 또 다른 PESA와 회합하여 또 다른 CESA를 형성하고, 이는 올리고의 추가의 효소적 절단 및 이어서 형광으로 이어진다. 따라서, 상기 과정은 계속 진행되고, 이를 통해 추가의 CESA가 뉴클레아제(예컨대, 제한 효소) 매개로 절단됨으로써 형광 신호가 발생됨에 따라 신호가 증폭된다.
도 5는 신호 증폭이 RE에 의한 CESA의 절단에 의해 매개되는 것인, MNA자임에 의해 개시된 EzyAmp 반응에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 박스 A는 조립된 MNA자임(회색 실선)이 그의 기질(중심부가 흰색으로 된 검은색 선)에 결합되어 있는 것을 도시한 것이고, 박스 B는 두 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체(검은색 실선)를 도시한 것인데, 여기서, 상기 두 부분이 각각 본 도해에서 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지된 효소 증폭제 기질 올리고 1(EAS1), 및 본 도해에서 소광제(Q)로 표지된 효소 증폭제 기질 올리고 2(EAS2)를 구성한다. 박스 C는 EAS1, EAS2, 및 이제 구동자 단편(DF)으로서 작용하는 절단된 MNA자임 기질의 한 단편에 의해 형성된 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체를 도시한 것이다. 각각의 EAS 1, EAS2, MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, 및 DF에서 원이 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 나타낸다. 제한 효소 인식 부위는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고, 제한 효소 절단 부위는 실선으로 그려진 수직 화살표로 표시되어 있다. 반응에서 다양한 단계는 번호를 매겨 1부터 6으로 표시되어 있다. 상기 반응을 통해 하기 단계를 이용함으로써 표적 DNA 또는 RNA를 검출할 수 있다. 1단계에서, 표적은 파트자임과 조립됨으로써 MNA자임을 형성하고, 이는 MNA자임 기질을 절단한다. 2단계에서, DF로서 작용하는 절단된 MNA자임 기질의 한 단편이 PESA와 결합하게 되는데, 이를 통해 CESA가 형성된다. 3단계에서, 완전하게 조립된 CESA는 RE에 의해 절단된다. 4단계에서, 절단된 CESA 단편은 해리되고, 이로써, 형광단 및 소광제가 분리되고, 그 결과, 형광은 증가하게 되는데, 이는 표적 핵산이 존재함을 나타내는 것이다. 상기 도식에서는 DF가 실제로는 그 자체만으로는 RE에 의해 절단되지 않기 때문에, 이는 자유롭게 또 다른 PESA와 회합하여(5단계) 새로운 CESA를 형성하고, 이 CESA는 RE에 의해 절단될 수 있고(6단계), 이를 통해 형광 신호는 추가로 증폭될 수 있다.
도 6은 신호 증폭이 RE, 본 일례에서는, Mnl I에 의한 CESA의 절단에 의해 매개되는 것인, MNA자임에 의해 개시된 EzyAmp 반응에 의해 발생된 형광 신호에 관한 도해이다. 본 일례에서는, 각 단계와 관련된 형광 변화를 관찰함으로써 (MNA자임에 의한) 개시 및 (RE에 의한) 신호 증폭에 관한 두 단계를 동시에 모니터링하였다. 소광제로부터의 FAM의 분리 후(소광제 및 FAM, 둘 모두 MNA자임 리포터 기질 상에 존재) FAM의 증가에 의해, 표적 조립 촉진제(AF-PD1)의 존재하에서의 MNA자임 리포터 기질(Sub1(8:9)-FB)의 MNA자임 절단에 대한 표적 의존 개시 단계를 모니터링하였다. 신호 증폭 EzyAmp 단계는 EAS1 올리고가 EAS1, EAS2 및 DF로부터 형성된 CESA 복합체 내로 포함되었을 때, JOE와 소광제 사이의 상기 EAS1의 절단 후, JOE 형광 증가에 의해 모니터링하였다. 표적(AF-PD1)을 포함하거나, 또는 표적을 포함하지 않는(대조군) 반응의 모든 성분은 하나의 반응 챔버에 존재하였고, FAM 및 JOE, 둘 모두의 형광은 동시에 모니터링되었다. FAM 채널에서, 표적 조립 촉진제 AF-PD1의 존재하에 Sub1(8:9)-FB가 MNA자임 매개로 절단되자((i) 표적 AF-PD1), 시간 경과에 따라 FAM 형광은 증가하였고, DF가 생성되었다. AF-PD1을 포함하지 않는 반응((ii) 표적 부재 대조군)에서, 시간 경과에 따른 FAM 형광 증가는 없었다. JOE 채널에서, 표적 AF-PD1의 존재하에서 Sub1-FB의 MNA자임 절단에 의해 생성된 DF의 존재하의 RE 활성((iii) 표적 AF-PD1)을 통해 CESA가 절단되었고, 시간 경과에 따라 JOE 형광은 증가하였다. 대조적으로, AF-PD1을 포함하지 않는 반응((iv) 표적 부재 대조군)에서, 시간 경과에 따른 JOE 형광 증가는 관찰되지 않았다.
도 7은 다중 CESA 복합체를 포함하는 EzyAmp 시스템에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 각각의 EAS1, EAS2 및 DF에서 원이 각 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 제한 효소 인식 부위는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고, 제한 효소 절단 부위는 실선으로 그려진 수직 화살표로 표시되어 있다. 본 도해에서, CESA A*는 DF-a와 조합된 PESA A로부터 형성된 것이다. CESA B*는 DF-b와 조합된 PESA B로부터 형성된 것이다. 피분석물이 존재함으로써 보다 큰 올리고뉴클레오티드 단편의 절단이 일어나는, 예를 들어, 표적에 의존하는 방식으로 뉴클레아제에 의한 SIO의 절단이 일어나거나, 또는 표적에 의존하는 방식으로 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단이 일어나는 조건하에 표적 피분석물의 존재하에서 DF-a가 형성된다. DF-a는 PESA A와 조합하여 CESA A*를 형성하고, 이는 RE에 의해 절단됨으로써 DF-a에 대한 변형없이, DF-b가 생성되고, 신호가 발생될 수 있다. 이어서, DF-a는 새로운 CESA A*를 형성할 수 있고, DF-b 분자의 신호 및 개수를 증폭시킬 수 있다. 추가로, DF-b는 PESA B와 조합하여 CESA B*를 형성하고, 이는 RE에 의해 절단됨으로써 DF-b에 대한 변형없이, 추가 신호가 발생될 수 있다. 따라서, DF-b는 추가의 CESA B*를 형성하고, 추가로 신호를 증폭시키는 데 이용될 수 있다.
도 8은 E. 콜라이로부터 유래된 엑소뉴클레아제 I의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 구동자 단편(DF)을 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체로부터 3' 단일 가닥 오버행을 제거한다. 줄무늬 회색 선은 표적 DNA를 나타내고, 검은색 실선은, 구동자 단편의 생성을 촉진시키기 위해 믹스에 첨가되는 합성 개시제 올리고(SIO)를 나타낸다. 폐쇄형 원은 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 회색 실선은 DF의 하이브리드화에 의해 CESA로 전환되는 PESA를 나타낸다. 개방형 원은 해당 위치에서 복합체가 엑소뉴클레아제 I에 의해 절단되지 못하도록 막기 위해 포함되는 3' 오버행 상의 포스포로티오에이트를 나타내는 것이다. 좌측 패널에서, 구동자 단편은 표적으로부터 유도된 것이다. 우측 패널에서, DF는 합성 개시제 올리고로부터 유도된 것이다. 우측 패널의 도식에서, 표적은 재순환되어 추가의 DF를 생성할 수 있다.
도 9는 멍빈 뉴클레아제의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 구동자 단편을 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 엔도뉴클레아제는 블런트 말단은 남겨 두면서, DNA 이중체로부터 단일 가닥 오버행을 3' 또는 5' 방향으로부터 분해한다. 줄무늬 회색 선은 표적 DNA를 나타내고, 검은색 실선은, DF의 생성을 촉진시키기 위해 믹스에 첨가되는 합성 개시제 올리고(SIO)를 나타낸다. 폐쇄형 원은 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 회색 실선은 DF의 하이브리드화에 의해 CESA로 전환되는 PESA를 나타낸다. 좌측 패널에서, 구동자 단편은 표적으로부터 유도된 것이다. 우측 패널에서, DF는 합성 개시제 올리고로부터 유도된 것이다. 좌측(L) EHsms 우측(R) 패널, 둘 모두에 도시된 방법은 멍빈 뉴클레아제에 의한 PESA 또는 CESA의 분해를 막기 위해 2 단계(1 및 2)로 수행될 수 있다. 이는 물리적 분리 또는 다른 수단에 의해 달성될 수 있다.
도 10은 엑소뉴클레아제 III의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 구동자 단편을 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체의 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거한다. 효소는 블런트 또는 오목형 3' 말단 상에서는 활성을 띠지만, 단일 가닥 DNA 상에서는 활성을 띠지 않는 바, 이에 3' 돌출 말단을 절단하지 않을 것이다. 효소는 또한 이중체 DNA 중 닉으로부터의 가수분해를 개시함으로써 단일 가닥 갭을 생성할 수 있다. 올리고 상에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드(속이 빈 원 표시)가 존재하면, 상기 엑소뉴클레아제 활성은 차단된다. 줄무늬 회색 선은 표적 DNA를 나타내고, 검은색 실선은, DF의 생성을 촉진시키기 위해 믹스에 첨가되는 합성 개시제 올리고를 나타낸다. 폐쇄형 원은 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 회색 실선은 DF의 하이브리드화에 의해 CESA로 전환되는 PESA를 나타낸다. DF의 3' 플랩 중의 포스포로티오에이트는, 상기 단편이 CESA를 완성하였을 때 형성된 닉에서 절단이 일어나지 못하도록 막는다. DF는 SIO로부터 유도된 것이고, 온전한 표적은 재순환되어 추가의 DF를 생성할 수 있다.
도 11은 T7 엑소뉴클레아제의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 구동자 단편을 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체 또는 DNA/RNA 이중체의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거하고, 인산화된 5' 뉴클레오티드에 대한 활성이 더 높다. 5' 포스페이트를 포함하지 않는 5' 말단에 대한 활성은 인산화된 기질의 존재하에서 크게 감소된다. 줄무늬 회색 선은 표적 DNA를 나타내고, 검은색 실선은, DF의 생성을 촉진시키기 위해 믹스에 첨가되는 합성 개시제 올리고를 나타낸다. P는 5' 말단의 인산화된 뉴클레오티드를 나타낸다. 회색 실선은 DF의 하이브리드화에 의해 CESA로 전환되는 PESA를 나타낸다. DF는 합성 개시제 올리고(SIO)로부터 유도된 것이고, RNA 표적은 재순환되어 추가의 DF를 생성할 수 있다. PESA는 DNA로 구성되지만, T7 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위해 이중체의 5' 말단에 일부 RNA를 가질 수 있다(점선으로 된 박스 표시).
도 12는 신호 증폭이 RE, 예컨대, Mnl I에 의한 CESA의 절단에 의해 매개되는 것인, MNA자임에 의해 개시된 EzyAmp 반응에 의해 발생된 형광 신호에 관한 도해이다. 본 일례에서는, 각 단계와 관련된 형광 변화를 관찰함으로써 개시 및 신호 증폭에 관한 두 단계를 동시에 모니터링하였다. 소광제로부터의 TXR의 분리 후, TXR의 증가에 의해, 표적 조립 촉진제(AF-PD1)의 존재하에서의 MNA자임 리포터 기질(TXR 및 소광제로 표지된 Sub1-TRB2)의 MNA자임 절단에 대한 표적 의존 개시 단계를 모니터링하였다. 신호 증폭 EzyAmp 단계는 EAS1 올리고가 EAS1, EAS2 및 DF로부터 형성된 CESA 복합체 내로 포함되었을 때, JOE와 소광제 사이의 상기 EAS1의 절단 후, JOE 형광 증가에 의해 모니터링하였다. 표적(AF-PD1)을 포함하거나, 또는 표적을 포함하지 않는(대조군) 반응의 모든 성분은 하나의 반응 챔버에 존재하였고, TXR 및 JOE, 둘 모두의 형광은 동시에 모니터링되었다. TXR 채널에서, 표적 조립 촉진제 AF-PD1의 존재하에 Sub1-TRB2가 MNA자임에 의해 절단되자((i) 표적 AF-PD1), 시간 경과에 따라 TXR 형광은 증가하였고, DF가 생성되었다. AF-PD1을 포함하지 않는 반응((ii) 표적 부재 대조군)에서, 시간 경과에 따른 TXR 형광 증가는 없었다. JOE 채널에서, 표적 AF-PD1의 존재하에서 MNA자임 절단에 의해 생성된 DF의 존재하의 RE 활성((iii) 표적 AF-PD1)을 통해 CESA가 절단되었고, 시간 경과에 따라 JOE 형광은 증가하였다. 대조적으로, AF-PD1을 포함하지 않는 반응((iv) 표적 부재 대조군)에서, 시간 경과에 따른 JOE 형광 증가는 관찰되지 않았다.
도 13은 임의의 표적 세트에 대한 다중화 등온 범용 신호 증폭 전략법을 도시한 것이다. 각 올리고뉴클레오티드에서 원이 각 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 제한 효소 인식 부위는 는 점선으로 된 박스로 표시되어 있다. 다중 표적에 대한 다중화 분석 전략법은 다중 MNA자임을 사용하는데, 여기서, 상기 다중 MNA자임은 다중 범용 기질을 절단하여 다중 범용 구동자 단편을 생성하고, 이는 다중 범용 PESA와 조립됨으로써 다중 범용 CESA를 형성할 수 있다. 본 전략법은 3개의 표적, 표적 1, 표적 2 및 표적 3 검출에 대한 것으로 예시되어 있다. 표적 1은 범용 MNA자임 기질 1을 절단할 수 있는 MNA자임을 조립시킬 수 있다. 범용 MNA자임 기질 1이 절단되면, 범용 구동자 단편 1이 생성될 수 있고, 이는 PESA 1과 조립됨으로써 CESA 1을 형성할 수 있다. CESA 1은 독특한 형광단 1로 표지될 수 있으며, 뉴클레아제에 의한 절단시, 독특한 파장에서 형광이 발생되는데, 이는 표적 1이 존재함을 나타내는 것이다. 유사하게, 표적 2는 범용 MNA자임 기질 2를 절단할 수 있는 MNA자임을 조립시킬 수 있다. 범용 MNA자임 기질 2가 절단되면, 범용 구동자 단편 2가 생성될 수 있고, 이는 PESA 2와 조립됨으로써 CESA 2를 형성할 수 있다. CESA 2는 독특한 형광단 2로 표지될 수 있으며, 뉴클레아제에 의한 절단시, 독특한 파장에서 형광이 발생되는데, 이는 표적 2가 존재함을 나타내는 것이다. 표적 3은 범용 MNA자임 기질 3을 절단할 수 있는 MNA자임을 조립시킬 수 있다. 범용 MNA자임 기질 3이 절단되면, 범용 구동자 단편 3이 생성될 수 있고, 이는 PESA 3과 조립됨으로써 CESA 3을 형성할 수 있다. CESA 3은 독특한 형광단 3으로 표지될 수 있으며, 뉴클레아제에 의한 절단시, 독특한 파장에서 형광이 발생되는데, 이는 표적 3이 존재함을 나타내는 것이다. CESA 1 및 2 및 3 절단시, 형광단 1 및 2 및 3 과 관련된 형광을 단일 반응에서 동시에 모니터링할 수 있다.
상기 범용 다중화 시스템에서, 새로운 표적은 쉽게 다중화 반응으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 범용 MNA자임 기질 1/PESA 1/CESA 1 /형광단 1 시스템은 단지 새로운 표적에 대하여 특이적인 센서 아암을 가지지만, MNA자임 기질 1에의 결합에 적합한 기질 아암은 보유하는 새로운 MNA자임의 합성만을 필요로 할 것이다. MNA자임 기질 1의 절단을 통해서는 항상 동일한 구동자 단편 1이 생성되기 때문에, 새로운 표적을 통해 상기와 같이 CESA 1의 조립, 및 이어서 절단이 일어나게 될 것이다.
도 14는 다양한 이중체 구조체 분석 결과를 보여주는 것이다. 패널 A, B 및 C에 도시된 이중체 구조체는 모두 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지된 상부 검은색 실선 올리고(EAS1) 및 소광제로 표지된 하부 검은색 실선(EAS2)을 포함한다. EAS1 및 EAS2는 함께 PESA를 포함한다. 추가로, 패널 A는 구동자 단편(DF)을 나타내는 줄무늬 하부 올리고를 포함하고, 패널 B는 억제 단편(InF)을 나타내는 줄무늬 하부 올리고를 포함한다.
패널 A에서, 반응에 EAS1, EAS2 및 DF1이 존재함으로써, 시간 경과에 따라 FAM 형광이 증가된 것으로 관찰되는 바와 같이(도 14A), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA 이중체 기질이 형성되었다. 이러한 관찰 결과는, RE에 의한 인식 및 절단을 위해 필요한 영역내, 두 가닥 중 1 이상에 절단부 또는 닉을 포함하는 이중 가닥 복합체를 인식하고 절단할 수 있는 제한 효소의 능력과 일관된다. 대조적으로, 반응이 DF1 단편은 포함하지 않지만, InF를 포함하는 것인 패널 B에서, 형성된 이중체는 절단되지 않았고, 이에, 시간 경과함에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았다(도 14B). InF가 DF1의 전체 서열을 포함하였다는 사실에도 불구하고, 상기와 같은 반응이 일어났다. 이 역시 DF에 존재하는 것인 상기 특이 서열 이외의 것인, InF에 존재하는 서열이 절단가능한 이중체 기질의 형성을 억제하였다. 실제로, 추가 서열을 통해 효소 억제 복합체(EIC)라고 명명되는 절단불가능한 복합체가 형성되었다.
EAS1 및 EAS2만을 함유하고, DF1 및 InF, 둘 모두는 함유하지 않는 것인 패널 C에서는 형광 증가가 관찰되지 않았는데, 이는 RE에 의한 이중체의 인식 및 절단을 위해서는 상기 두 올리고(EAS1 및 EAS2)만으로는 충분하지 못하다는 것을 나타낸다(도 14C). 올리고 EAS1 및 EAS2가 하이브리드화하여 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 형성하지만, 절단불가능한 PESA를 절단가능한 CESA로 전환시키기 위해서는 추가 올리고, 즉, DF가 필요하다.
도 15는 DF가 후보 PESA에 결합할 수 있고, 이를 통해 일부 변이가 RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA 이중체 기질을 생성하는 것인 다양한 구조체를 보여주는 것이다. 이러한 구조체는 실시예 5의 반응 1 내지 8에서 테스트하였다. 본 실시예에서, DF의 존재((i)로 표지된) 트레이스) 또는 부재하에((ii)로 표지된 트레이스) 형광단 및 소광제 모이어티의 분리와 관련된 형광 변화를 관찰함으로써 Mnl I 절단을 모니터링. 1부터 8까지로 번호가 매겨진 각 패널은 후보 PESA(검은색 실선)의 구조, 및 후보 DF(줄무늬 선)의 위치를 보여준다. 원이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 나타낸다. RERS는 점선으로 된 박스로 표시되어 있다. "N"는 RERS를 완전하는 데 필요한, DF 중에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드(들)(즉, PESA로부터 누락된 RERS로부터의 뉴클레오티드)와 같고, 단, 반응 7에서, N은 DF와 RERS 사이에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드(들)를 의미한다. 반응 4에서, "n"는 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 실선으로 그려진 수직 화살표는 Mnl I에 대한 절단 부위를 나타내고, '∧'는 인접한 뉴클레오티들 간의 포스포디에스테르 결합 부재를 나타낸다. 후보 PESA 및 DF 구조체에 관한 개략도 아래에는 실시예 5에 기술된 바와 같은, 상기 올리고뉴클레오티드를 Mnl I와 인큐베이션시킨 동안의 시간 경과에 따른 형광 수준 플롯이 제시되어 있다. 2중으로 실시된 반응으로부터 얻은 값의 평균값이 제시되어 있다.
패널 1(실시예 5의 반응 1)에서, 5'GAGG3' 부분 Mnl I 인식 부위 바로 앞의 3' 서열(GAGG∧)로서 DF를 디자인하였다. DF 부재하의 형광 증가(ii)와 비교하였을 때, DF 존재하에서의 형광 증가(i) 속도가 더 빠른 것으로 관찰되었다. 본 반응의 PESA는 전체 RER 서열을 포함하였지만, (DF에 의해 제공되는) RERS 측면에 위치하는 가외 서열을 첨가함에 따라 절단은 더 빠르게 일어났다.
패널 2(실시예 5의 반응 2)에서, 3' 말단으로부터 하나의 뉴클레오티드에 의해(GAG∧G) 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는, DF가 3' 말단으로부터 하나의 뉴클레오티드(G)에 의해 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
패널 3(실시예 5의 반응 3)에서, 3' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드에 의해(GA∧GG) 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는, DF가 3' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드(GG)에 의해 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
패널 4(실시예 5의 반응 4)에서, 3' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드에 의해(여기서, 2번째 염기는 리보뉴클레오티드이다)(GA∧gG) 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는, 심지어 제2 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드(Gg)인 경우에도, DF가 3' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드(GG)에 의해 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
패널 5(실시예 5의 반응 5)에서, 3' 말단으로부터 3개의 뉴클레오티드에 의해(G∧AGG) 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는, DF가 3' 말단으로부터 3개의 뉴클레오티드(GGA)에 의해 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
패널 6(실시예 5의 반응 6)에서, 5'GAGG3'의 Mnl I 인식 서열로부터 상류쪽으로 바로 옆에 5' 서열(∧GAGG)로서 결합하도록 DF를 디자인하였다. DF의 존재(i) 또는 부재(ii)하에서, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 DF가 5'GAGG3'의 Mnl I 인식 서열로부터 상류쪽으로 바로 옆 5' 말단에 결합할 때, 어떤 절단가능한 CESA도 형성되지 않았다는 것을 나타낸다.
패널 7(실시예 5의 반응 7)에서, 5'GAGG3'의 Mnl I 인식 서열로부터 상류쪽으로 2개의 뉴클레오티드인 5' 서열(∧NNGAGG)로서 결합하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는 DF가 Mnl I RERS로부터 상류쪽 2개의 뉴클레오티드에 결합하여 RE 절단 부위를 완성할 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
패널 8(실시예 5의 반응 8)에서, 5' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드에 의해(CC∧TC) 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하도록 DF를 디자인하였다. DF 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 존재하지 않을 때에는, 시간 경과에 따른 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이러한 결과는 DF가 5' 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드(CC)에 의해 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 16은 은 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이, RE StyD 4I(패널 I), Rsa I(패널 II), Msp I(패널 III) 및 BssK I(패널 IV)에 의해 예시되는 다양한 구조체에 대한 절단 패턴을 보여주는 것이다. 반응은 하기와 열거된 구조체를 포함하였다: 반응 A: CESA; 반응 B: PESA + InF; 반응 C: PESA; 반응 D: 표지된 EAS 1 올리고; 반응 E(양성 대조군) 및 F(음성 대조군): 이중 가닥 연속된 RE 기질. 반응 A 내지 E는 RE를 포함한 반면, 음성 대조군 반응 F는 RE를 포함하지 않았다. 2중으로 실시된 반응으로부터 얻은 값의 평균값이 제시되어 있다.
양성 대조군(반응 E)의 경우, 상기 효소, 및 본 실험에서 분석된 다른 모든 효소(데이터는 나타내지 않음)는 시간 경과에 따른 형광 증가를 보였다. 이러한 관찰 결과는, 전체 RERS를 포함하는 연속된 이중 가닥 복합체를 인식하고 절단할 수 있는 RE의 능력과 일관된다. 모든 음성 대조군 반응(반응 F)은 시간 경과에 따른 형광 증가를 보이지 않았다.
패널 I는 하기 표 13의 I행에 기술되어 있는 바와 같이, RE StyD4 I에 대해 얻은 데이터를 나타낸다. 상기 RE의 경우, 반응 A 내지 D에서 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았다. 이는 상기 RE가 테스트된 조건하에서 RE에 의한 인식 및 절단에 필요한 영역 내에 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 복합체를 절단할 수 있는 능력이 없다는 것을 나타낸다. 추가로, 상기 RE는 반응이 오직 부분적으로 형성된 RERS만을 포함하는 경우에는 절단이 불가능하였다.
패널 II는 하기 표 13의 II행에 기술되어 있는 바와 같이, RE Rsa I에 대해 얻은 데이터를 나타낸다. 2개의 다른 RE인 Pme I 및 Hpy 8I 또한 Rsa I와 유사한 패턴을 보였다. 반응 A에서, 관찰 결과, 시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이, EAS1, EAS2 및 DF의 존재를 통해 절단가능한 CESA가 형성되었다. 이러한 관찰 결과는 테스트된 반응 조건하에서 RERS 중 닉을 포함하는 이중 가닥 복합체를 인식하고 절단할 수 있는 상기 RE들의 능력을 나타내는 것이다. 대조적으로, DF는 포함하지 않고, InF를 포함하는 반응 B에서, 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 형성된 이중 가닥 복합체가 절단되지 않았다는 것을 나타낸다. 이러한 반응 조건하에서는, EIC가 형성되었다. 상기 RE의 경우, 반응 C 및 D에서, 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 RE가 불완전 RERS를 포함하는 구조체는 절단할 수 없다는 것을 나타내는 것이다.
패널 III는 하기 표 13의 III행에 기술되어 있는 바와 같이, RE Msp I에 대해 얻은 데이터를 나타낸다. RE Ear I 또한 Msp I에 대해 보고된 것과 유사한 패턴의 결과를 보였다. 반응 A 및 반응 B의 경우, 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다. 반응 A에서, 시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이, EAS1, EAS2 및 DF의 존재를 통해 절단가능한 CESA가 형성되었다. 이러한 관찰 결과는 RERS 중 닉을 포함하는 이중 가닥 복합체를 인식하고 절단할 수 있는 RE의 능력을 나타내는 것이다. 그러나, DF는 포함하지 않고, InF를 포함하는 반응 B에서, RE는 또한 형광 증가를 보였다. 이러한 관찰 결과는 InF가 반응 조건하에서 EIC를 형성하지 않는다는 것을 나타낸다. 상기 RE의 경우, 반응 C 및 D에서, 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 상기 RE가 불완전 RERS를 포함하는 구조체는 절단할 수 없다는 것을 나타내는 것이다.
도 16의 패널 IV는 하기 표 13의 IV행에 기술되어 있는 바와 같이, RE, BssK I에 대해 얻은 데이터를 나타낸다. RE Alw I 또한 BssK I에 대해 보고된 것과 유사한 패턴의 결과를 보였다. A 내지 D에서, 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다. 상기 반응에서, 복합체는 전체 또는 부분 RERS를 포함하였다. 이는 상기 RE가 테스트된 조건하에서 전체 및 부분 RERS, 둘 모두를 인식 및 절단할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 17 패널 A는 EzyAmp 피드백 캐스케이드 반응에 대한 전략법을 도시한 것이다. 본 일례에서, 2개의 PESA(PESA A 및 PESA B)가 존재한다. PESA A(검은색)는 ESA1A(상부 가닥) 및 EAS2A(하부 가닥)로 구성되고; PESA B(회색) EAS1B(상부 가닥) 및 EA2B(하부 가닥)로 구성된다. 두 PESA 모두 RE, 본 일례에서는, Mnl I에 대한 부분 인식 부위를 포함한다. PESA A(상부 구조체; 좌측)는 DF-a(흰색 선, 회색 테두리)와 하이브리드화하였을 때, Mnl I에 대한 완전 인식 부위(점선으로 된 검은색 박스 표시)를 포함하는 절단가능한 CESA A 복합체(중간 구조체, 좌측)가 형성된다. CESA A(하부 단편, 좌측)가 절단되면, 형광단, 예를 들어, JOE(J), 및 소광제(Q)가 분리됨에 따라 형광이 증가하게 된다. 추가로, 추가로, CESA A가 절단되면, 다중 절단 단편이 유리되는데, 이중 하나는 새로운 DF-b(줄무늬 선)로서 작용할 수 있다. PESA B(상부 구조체; 우측)는 DF-b와 하이브리드화하면, Mnl I에 대한 완전 인식 부위(점선으로 된 회색 박스 표시)를 포함하는 CESA B(중간 구조체, 우측)가 형성된다. CESA B가 절단되면, 형광단, 예를 들어 FAM(F), 및 소광제(Q)(하부 단편, 우측)가 분리됨에 따라 형광이 증가하게 된다. 추가로, CESA B가 절단되면, 다중 절단 단편이 유리되는데, 이중 하나는 새로운 DF-a로서 작용할 수 있다. 각 CESA A의 절단을 통해 새로운 DF가 생성되고, 이를 통해 새로운 CESA B가 형성될 수 있고, 각 CESA B의 절단을 통해 새로운 DF가 생성되고, 이를 통해 새로운 CESA A가 형성될 수 있으며, 이를 통해 피드백 캐스케이드가 형성된다. 각 단계에서 새로운 DF가 생성되는 것 이외에도, 이미 믹스 중에 존재하고 있는 DF는 재순환됨으로써 추가 CESA를 형성할 수 있다. 이러한 전략법은 DF-a 또는 DF-b의 표적 의존 생성에 대한 반응으로 신호를 증폭시키는 데 사용될 수 있다.
패널 B 및 C는 패널 A에 기술된 캐스케이드의 예로부터 얻은 형광 결과를 보여주는 것이다. 데이터는 2중으로 실시된 것으로부터 얻은 값의 평균값을 나타낸다. 패널 B(반응 A)는 DF-a를 PESA A 및 B에 첨가하였을 때, JOE 및 FAM 채널, 둘 모두에서 형광이 증가하였다는 것으로 보여주는 것이다. JOE 채널의 신호 증가("(ii) JOE: CESA A + DF-a"로 표지된 트레이스)는 DF-a가 PESA A와 하이브리드화하여 CESA A를 형성한 것을 나타내는 것이다. CESA A가 Mnl I로 절단됨으로써 EAS1A 및 EAS2A의 올리고뉴클레오티드 단편이 해리되었고, 이로써 두 소광제 모이어티로부터 JOE 형광단이 분리되었다. FAM 채널의 신호 증가("(i) FAM: CESA B + DF-a"로 표지된 트레이스)는 EASA2의 절단 단편인 DF-b가 절단된 CESA A로부터 해리되었고, 이는 PESA B와 하이브리드화하여 CESA B를 생성한다는 것을 보여주는 것이다. CESA B가 Mnl I로 절단됨으로써 EAS1B 및 EAS2B의 올리고뉴클레오티드 단편이 해리되었고, 이로써 소광제 모이어티로부터 FAM 형광단이 분리되었다. EAS2B의 절단 단편 중 하나는 새로운 DF-a 분자인데, 이는 PESA A에 하이브리드화하여 추가 CESA A를 생성한다. 이를 통해 PESA A, PESA B, CESA A 및 CESA B 사이의 피드백 캐스케이드가 완성되었다. FAM 채널에서의 형광 증가 지연은 상기 반응이 CESA A의 절단으로부터의 DF-b 생성에 의존한다는 것을 나타낸다. DF-a를 포함하지 않는 반응("(II) DF-a 부재 대조군"으로 표지된 트레이스)에서는 JOE 또는 FAM 형광 증가는 없었다.
패널 B(반응 B)는 PESA A 및 PESA B, 둘 모두를 포함하는 반응에 DF-b를 첨가하였을 때, FAM 및 JOE 채널, 둘 모두에서의 형광 증가를 보여주는 것이다. FAM 채널의 신호 증가("(v) FAM: CESA B + DF-b"로 표지된 트레이스)는 DF-b가 PESA B와 하이브리드화하여 CESA B를 형성한다는 것을 나타낸다. CESA B가 Mnl I로 절단됨으로써 EAS1B 및 EAS2B의 올리고뉴클레오티드 단편이 해리되었고, 이로써 FAM 형광단 및 소광제 모이어티가 분리되었다. JOE 채널의 신호 증가("(vi) JOE: CESA A + DF-b"로 표지된 트레이스)는 EAS2B의 절단 단편인 DF-a가 절단된 CESA B로부터 해리되었고, 이는 PESA A와 하이브리드화하여 CESA A를 형성한다는 것을 보여주는 것이다. CESA A가 Mnl I로 절단됨으로써 EAS1A 및 EAS2A의 올리고뉴클레오티드 단편이 해리되었고, 이로써 JOE 형광단 및 두 소광제 모이어티가 분리되었다. EAS2A의 절단 단편 중 하나는 새로운 DF-b 분자인데, 이는 PESA B에 하이브리드화하여 추가 CESA B를 생성한다. 이를 통해 PESA A, PESA B, CESA A 및 CESA B 사이의 피드백 캐스케이드가 완성되었다. JOE 채널에서의 형광 증가 지연은 상기 반응이 CESA B의 절단으로부터의 DF-a 생성에 의존한다는 것을 나타낸다. DF-b를 포함하지 않는 반응("(IV) DF-b 부재 대조군"으로 표지된 트레이스)에서는 JOE 또는 FAM 형광 증가는 없었다.
상기 실험에서는 두 CESA 복합체 간의 캐스케이드 반응을 보여주기 위하여, 상이한 형광단, FAM 및 JOE로 PESA A 및 PESA B를 표지하였다. 다른 포맷에서는, CESA A 및 CESA B의 절단으로부터 발생된 신호가 상가 효과를 띠도록(additive) PESA A 및 PESA B, 둘 모두를 같은 형광단으로 표지할 수 있다.
도 18 패널 A는 헤어핀 PESA를 형성하는 ESA 올리고뉴클레오티드를 사용하는 EzyAmp 피드백 캐스케이드 반응에 대한 전략법을 도시한 것이다. 상기 캐스케이드 반응에는 이중 표지된(형광단-소광제) PESA 헤어핀 올리고뉴클레오티드 2개가 존재한다. 상기 둘 모두 RE, 본 일례에서는 Mnl I에 대한 부분 부위를 포함한다. PESA A(상부 구조체; 좌측)는 DF-a(흰색 선)와 하이브리드화하면, 이제 Mnl I에 대한 완전 인식 부위(점선으로 된 박스 표시)를 포함하는 CESA A(중간 구조체, 좌측)가 형성된다. CESA A(하부 단편, 좌측)가 절단되면, PESA A 상의 형광단(F) 및 소광제(Q) 모이어티가 분리됨에 따라 형광이 증가하게 된다. 추가로, CESA A가 절단되면, 다중 절단 단편이 유리되는데, 이중 하나는 새로운 DF-b(줄무늬 선)로서 작용할 수 있다. PESA B(상부 구조체; 우측)는 DF-b(흰색 선)와 하이브리드화하면, 이제 Mnl I에 대한 완전 인식 부위(점선으로 된 박스 표시)를 포함하는 CESA B(중간 구조체, 우측)가 형성된다. CESA B가 절단되면, PESA B(하부 단편, 우측) 상의 형광단(F) 및 소광제(Q) 모이어티가 분리됨에 따라 형광이 증가하게 된다. 추가로, CESA B가 절단되면, 다중 절단 단편이 유리되는데, 이중 하나는 새로운 DF-a로서 작용할 수 있다. 각 CESA A 복합체의 절단을 통해 새로운 DF-b가 생성되고, 이를 통해 새로운 CESA B가 형성될 수 있고, 각 CESA B 복합체의 절단을 통해 새로운 DF-a가 생성되고, 이를 통해 새로운 CESA A가 형성될 수 있으며, 이를 통해 피드백 캐스케이드가 형성된다. 각 단계에서 새로운 DF가 생성되는 것 이외에도, 이미 믹스 중에 존재하고 있는 DF는 재순환됨으로써 추가 CESA를 형성할 수 있다. 이러한 전략법은 DF-a 또는 DF-b의 표적 의존 생성에 대한 반응으로 신호를 증폭시키는 데 사용될 수 있다.
패널 B는 패널 A의 전략법을 사용한 실시예 7에서 수득한 결과는 보여주는 것이다. 본 실험에서, CESA A는 PESA A 및 DF-a로 구성되었고, CESA B는 PESA B 및 DF-b로 구성되었다. PESA A는 그 안에 DF-b로서 작용할 수 있는 영역을 포함하였고, PESA B는 그 안에 DF-a로서 작용할 수 있는 영역을 포함하였다. 각 반응에서, 모든 반응 성분은 하나의 반응 챔버에 존재하였다. 이중 표지된 PESA의 절단과 관련된 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 2중으로 실시된 반응으로부터 얻은 값의 정규화된 평균값으로 형광을 나타내었다.
시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이, DF-a 및 헤어핀 PESA A의 존재로 절단가능한 CESA A가 형성되었다는 것(반응(i))이 패널 B의 결과를 통해 입증되었다. 대조적으로, DF 부재하에서 PESA A를 포함하는 반응(반응(ii))의 경우, 시간 경과에 따른 형광 변화는 나타나지 않았는데, 이는 PESA A 단독으로는 절단가능한 올리고뉴클레오티드가 아니라는 것을 나타낸다. 반응(iii)에서, 헤어핀 PESA B와 함께 DF-b가 존재하는 경우, 시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이, 절단가능한 CESA B가 형성되었다. 대조적으로, DF 부재하에서 PESA B를 포함하는 반응(반응(iv))의 경우, 시간 경과에 따른 형광 변화는 나타나지 않았는데, 이는 PESA B 단독으로는 절단가능한 올리고뉴클레오티드가 아니라는 것을 나타낸다. 반응(v)에서, PESA A 및 PESA B, 둘 모두가 함께 DF-a가 존재하는 경우, 반응(i)와 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 형광 증가는 거의 배가된 결과를 얻었다. 이는 CESA A 절단으로부터 DF-b가 유리되고, 이어서, CESA B가 형성되고, 결국에는 절단됨으로써 추가의 DF-a가 유리될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 상기 반응은 DF-a의 존재에 의해 개시되는 신호 증폭 피드백 캐스케이드를 나타낸다. 반응(vi)에서, PESA A 및 PESA B, 둘 모두가 함께 DF-b가 존재하는 경우, 반응(iii)와 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 형광 증가는 거의 배가된 결과를 얻었다. 이는 CESA B 절단으로부터 DF-a가 유리되고, 이어서, 절단가능한 CESA A가 형성되고, 결국에는 추가의 DF-b가 유리될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 상기 반응은 DF-b의 존재에 의해 개시되는 신호 증폭 피드백 캐스케이드를 나타낸다. 반응(vii)은 PESA A 및 PESA B는 포함하지만, DF는 존재하지 않는 것인, 음성 대조군 반응이다. 상기 반응에서 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았고, 이는 DF 부재하에서는 PESA A 및 PESA B 사이에서 어떤 절단가능한 CESA 구조체도 형성되지 않았다는 것을 나타낸다. 반응(viii)은 동일 농도로 DF-a, DF-b, PESA A 및 PESA B를 포함하는 양성 대조군 반응으로서, 이에 존재하는 PESA 모두 CESA를 형성할 수 있고, 절단될 수 있으며, 이로써 상기 시스템에서 수득될 수 있는 최대 형광을 나타낼 수 있게 된다. 반응(viii), (vi) & (v)에서 70분째의 최종 형광 수준은 유사하였는데, 이는 반응(v) 및 (vi)에서의 피드백 캐스케이드가 완료에 도달하였다는 것을 나타내는 것이다.
도 19 패널 A는 개시 DF 서열이 MNA자임 기질 서열의 일부가 아닌, EzyAmp 캐스케이드 시스템에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 상기 시스템의 성분은 패널 A의 좌측 표에 도시되어 있다. 이들 구조체에서 필링형(filled) 원이 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 나타내고; RE 인식 부위가 점선으로 된 박스로 표시되어 있고; 제한 효소 절단 부위가 실선으로 그려진 화살촉으로 표지되어 있고; 형광단 및 소광제 모이어티의 존재는 각각 F 및 Q로 표시되어 있다. 구조체(i)은 표적의 존재하에서 회합하여 MNA자임을 형성하는 표적 특이 파트자임을 도시한 것이다. 복합체(ii)는 부분적으로 DF-a((v)에서와 같음)로 구성된 올리고뉴클레오티드, 및 DF 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열 측면에 위치하는 기질 서열을 포함하는, 기질-차단제 올리고뉴클레오티드로서 지칭되는 제2 올리고로 이루어진 기질-차단제-DF-a 복합체를 도시한 것이다. 상기 올리고는 하이브리드화에 의해 차단됨으로써 MNA자임에 대한 기질인, 바깥쪽으로 루프가 형성된 영역(기질 루프는 원형으로 영역으로 표시되어 있고, 여기서, 회색 크로스(X) 표시는 NA자임에 의한 절단 부위를 나타낸다)을 포함하는 이중 가닥 올리고 복합체를 형성한다. 복합체(ii)는, MNA자임에 의한 기질 루프의 절단에 의해 DF-a에 결합되어 있는 절단된 단편이 해리되고, 이로써, 보다 긴 장쇄의 중 가닥 올리고 복합체의 단일 가닥 신장부로서 DF-a가 유리될 수 있도록 디자인된 것이다. 구조체(iii)은 CESA A가 형성되도록 하기 위해서는 DF-a 서열을 필요로 하는 제1 PESA(PESA A)를 도시한 것이다. 상기 PESA A는 그의 서열 내에, RE에 의한 CESA A의 절단 후에 유리되도록 디자인된 DF-b(올리고 vi)를 구성하는 영역을 포함한다. 구조체(iv)는 CESA B가 형성되도록 하기 위해서는 DF-b를 필요로 하는 제2 PESA(PESA B)를 도시한 것이다. 상기 PESA B는 그의 서열 내에, RE에 의한 CESA B의 절단 후에 유리되도록 디자인된 DF-a로서 작용할 수 있는 영역을 포함한다. 구조체(v)는 PESA A로부터 CESA A를 형성하기 위해서 요구되는 DF-a를 보여준다. 구조체(vi)은 PESA B로부터 CESA B를 형성하기 위해서 요구되는 DF-b를 보여준다.
패널 A의 우측상의 도식은 이러한 디자인을 가지는 검정법에서의 단계를 도시한 것이다. 1단계에서, 파트자임이 표적 상에 조립하게 되고, 구조체(ii)의 기질 루프를 절단하도록 디자인된 MNA자임이 형성된다. 2단계에서, MNA자임에 의해 절단됨으로써 DF-a에 상보적인 서열이 해리되고, 이로써 DF-a는 PESA A와 하이브리드화하여 CESA A를 형성할 수 있게 된다(3단계에서 도시된 바와 같음). 4단계에서, CESA A의 절단으로 DF-b가 유리된다. CESA A의 절단으로 형광단 및 소광제 모이어티가 분리되었다면, 상기 단계를 통해서는 또한 형광도 함께 동시에 증가할 수 있다. 4단계에서, 유리된 DF-b는 PESA B와 회합하여 CESA B를 형성할 수 있고, 이어서, CESA B는 RE에 의해 절단될 수 있다. CESA B의 절단으로 DF-a가 유리되고, 상기 절단으로 형광단 및 소광제 모이어티가 분리되었다면, 형광도 함께 동시에 증가할 수 있다. 단계 5 및 6에서, CESA A 및 CESA B가 연속하여 형성되고, 절단됨으로써 추가의 DF-a 및 DF-b를 유리시키고, 이를 통해 추가의 CESA A 및 CESA B가 형성됨으로써 시스템은 피드백 캐스케이드를 형성한다. 추가의 복합 반응에서는 각각이, (독특한 표적을 나타내는) 독특한 MNA자임에 의해 유리되도록 디자인된 독특한 DF를 포함하는 다중 기질-차단제-DF 복합체가 존재할 수 있다.
패널 B는 패널 A에 기술된 것과 유사한 도식을 사용하여 MNA자임에 의해 개시되는 EzyAmp 반응을 보여주는 실시예 9에 기술된 데이터를 나타낸 것이다. EzyAmp 반응에서 성분은 기질-차단제 올리고뉴클레오티드; DF-a 올리고뉴클레오티드(이는 함께 기질-차단제-DF-a 복합체를 형성한다); 표적에 하이브리드화하여, 루프형 기질을 절단할 수 있는 MNA자임을 형성할 수 있는 파트자임; PESA A 및 PESA B를 포함하였다. PESA A는 EAS1A 및 EAS2A로 구성되었는데, 여기서, ESA2A는 DF-b로서 작용할 수 있는 서열을 포함하였다. PESA B는 EAS1B 및 EAS2B로 구성되었는데, 여기서, ESA2B는 DF-a로서 작용할 수 있는 서열을 포함하였다. 상기 반응의 성분들은 모두 단일 반응 챔버 중에 존재하였고, 표적을 포함하거나(표적), 또는 표적을 포함하지 않았다(표적 부재 대조군). EAS1A 및 EAS1B 절단으로 FAM 및 소광제 모이어티가 분리된 이후의 FAM 형광 증가에 의해 신호 증폭을 모니터링하였다. 표적의 존재하에서 루프형 기질의 MNA자임 절단으로 이중 가닥 기질-차단제-DF-b 올리고뉴클레오티드 복합체가 부분적으로 해리되었다. 해리된 복합체의 DF-a 부분은 PESA A와 하이브리드화하여 CESA A를 형성하였고, 이어서, CESA A는 Mnl I에 의해 절단되었다. 결국, 이를 통해 DF-b가 유리되었고, 이로써 CESA B가 형성될 수 있었으며, Mnl I에 의한 CESA B의 절단으로 추가의 DF-a가 유리되고, CESA A 및 CESA B 사이에 피드백 캐스케이드가 완성되었다.
대조적으로, 표적을 포함하지 않는 반응(표적 부재 대조군)에서는 시간 경광에 따른 형광의 지수적 증가는 없었다(단지 80분 경과 후에는 낮은 수준의 형광 이동이 관찰되었다). 이는 DF-a를 유리시키고, 결국에는 후속 EzyAmp 캐스케이드 반응을 개시시키기 위한 목적으로 루프형 기질의 MNA자임 절단을 개시시키기 위해서는 표적이 요구된다는 것을 나타낸다.
도 20은 고체 지지체에 테더링된 다중 CESA 복합체을 포함하는 EzyAmp 시스템에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 상기 시스템의 성분은 하기와 같이 도시되어 있다: 필링형 원이 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 나타내고; RERS가 점선으로 된 박스로 표시되어 있고; 절단 부위가 실선으로 그려진 화살표로 표지되어 있다. 스테이션 1은, 표적에 의존하는 방식으로 절단되었을 때(1단계-예를 들어, MNA자임을 사용하여 MNA자임 기질 절단), 제1 DF(줄무늬 선)를 유리시키는 테더링된 올리고뉴클레오티드(MNA자임 기질 또는 SIO)를 도시한 것이다. 이어서, 상기 DF는 스테이션 2의 테더링된 PESA A로 이동하여, 그와 하이브리드화함으로써 CESA A를 형성할 수 있다(2단계). RE에 의한 CESA A의 절단으로(3단계) 제2 DF(검은색 실선)는 유리되고, 이는 스테이션 3의 PESA B로 이동할 수 있다. 제2 DF가 PESA B와 하이브리드화하게 되면, CESA B가 형성될 것이다(4단계). RE에 의해 CESA B가 절단되면, 제1 DF(줄무늬 선)와 같이 작용할 수 있는 서열이 유리될 것이다. 이어서, 상기 제1 DF는 스테이션 2로 이동하여(5단계), 추가의 CESA A를 형성할 수 있으며, 그의 절단으로 추가의 제2 DF가 유리될 수 있다. 이러한 방식으로 캐스케이드 반응이 개시될 수 있고, 이를 통해 CESA A 및 CESA B가 연속하여 형성되고 절단될 수 있다(3, 4, 및 5단계). PESA가 형광단(F) 및 소광제(Q) 모이어티로 표지되었다면, 상기 모이어티 사이의 EAS의 절단을 통해 형광 신호가 발생될 수 있다. 상기 신호는 (상기 도면에 도시되어 있는 바와 같이) 스테이션 2 또는 3의 고체 지지체 상에 유지될 수 있거나, 또는 예를 들어, 형광단 및 소광제 모이어티의 위치가 역전된 경우라면, 용액에서 방출될 수 있다.
도 21은 실시예 11에 기술된 EzyAmp 표적 적정 결과를 보여주는 것이다. 상기 반응은 MNA자임에 의한 기질의 표적 의존 절단에 의해 개시되었고, 이를 통해 DF가 생성되었고, 이어서, 각각은 서로에 대한 DF를 생성한 것인 두 PESA 복합체를 포함하는 EzyAmp 피드백 캐스케이드를 사용한 신호 증폭으로 이어졌다. 모든 단계는 단일 튜브에서 수행되었다. 패널 A 및 B는 감소되는 농도로 표적을 포함하는 MNA자임에 의해 개시되는 EzyAmp 반응(i 내지 vii)에서 시간 경과에 따른 형광 변화(각각 로그 및 선형 플롯)을 보여준다. 표적을 포함하는 반응에서는 시간 경과에 따른 형광 변화가 지수적으로 증가하였다. 반응(viii)은 표적 부재 대조군(NTC: no target control)이다. 패널 C는 Ct에 대해 표적 농도를 플롯팅함으로써 작성된 표준 곡선을 보여주는 것으로서, 여기서, Ct는 농도가 검출 역치에 도달한 시점이다. Ct와 표적 농도의 로그값 사이의 상관관계는 선형을 보이며, 여기서, 회귀값은 0.99이다.
도 22는 PESA 복합체를 분지형 구조체에 포함시킴으로써 EzyAmp 성분을 국소화시키는 방법의 일례를 도시한 것이다. 패널 A는, (i) (5'→ 3' 방향으로) EAS1B, 골격 1 및 EAS2A를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드(빌딩 블록 1); (ii) EAS2A에 상보적일 수 있는 제2 올리고 EAS1A(그리고, 여기서, (i) 및 (ii)는 하이브리드화하여 PESA A를 형성할 수 있다); 및 (iii) ESA1B에 상보적일 수 있는 제3 올리고 EAS2B(그리고, 여기서, (i) 및 (iii)은 하이브리드화하여 PESA B를 형성할 수 있다)로 구성될 수 있는 분지형 구조체를 형성하는 데 필요한 제1 기본 빌딩 블록을 도시한 것이다. 패널 B는 (5'→ 3' 방향으로) EAS1B, 골격 2 및 EAS2A로 구성된 빌딩 블록 2(iv)를 구성할 수 있는 제4 올리고; (ii) EAS2A에 상보적일 수 있는 제2 올리고 EAS1A(그리고, 여기서, (i) 및 (ii)는 하이브리드화하여 PESA A를 형성할 수 있다); 및 (iii) ESA1B에 상보적일 수 있는 제3 올리고 EAS2B(그리고, 여기서, (i) 및 (iii)은 하이브리드화하여 PESA B를 형성할 수 있다)를 도시한 것이다. 골격 1은 골격 2에 상보적일 수 있다. 이를 통해 빌딩 블록 1 및 2를 포함하는 분지형 복합체가 형성될 것이다. 각각의 빌딩 블록에서 EAS1A 및 EAS2B는 결합되어 있으며, 이로써 복합체는 2개의 PESA A 및 2개의 PESA B를 포함하게 될 것이다. 빌딩 블록 1 및 2는 형광단(F)으로 표지될 수 있고, 각 빌딩 블록의 제2 및 제3 올리고는, 빌딩 블록 1 & 2로 구축될 때, 상기 올리고 상의 표지로부터 발생되는 형광이 소광될 수 있게 하는 위치에 배치된 소광제(Q)로 표지될 수 있다.
패널 C는 표적에 특이적인 방식으로 DF-a가 생성된 후, 패널 B에 도시된 바와 같은 분지형 복합체를 사용할 수 있는 EzyAmp 캐스케이드에서의 단계를 도시한다. 1단계에서, DF-a가 (예컨대, 빌딩 블록 1 상의) PESA A에 하이브리드화하게 되면, 상기 위치에서 CESA A가 형성될 것이다. 2단계에서, 제한 효소(예컨대, Mnl I)에 의한 CESA A의 절단으로 EAS1A 절단 단편이 해리되고, 형광단 및 소광제의 분리로 형광은 증가하게 되며, DF-b가 생성될 것이다. 2단계에서, DF-b가 빌딩 블록 1 또는 2의 EAS1B의 영역에 하이브리드화하게 되면, CESA B가 형성될 것이다. 3단계에서, 제한 효소(예컨대, Mnl I)에 의한 CESA B의 절단으로 EAS2B 절단 단편이 해리되고, 이로써, 형광은 증가하게 되고, DF-a가 생성될 것이다. 이어서, 상기 단계는 같은 복합체 상에서, 또는 또 다른 유사 복합체 상에서 반복될 수 있다. 상기 과정은 빌딩 블록 모두가 절단될 때까지 계속 진행될 수 있다. 별법으로, 표적 특이 방식으로 DF-b 생서을 통해, 유사한 캐스케이드가 개시될 수 있다.
분지형 구조체의 복합성은 여러 전략법에 의해 증가될 수 있다. 일례로, EAS1A의 5' 말단을 비오티닐화할 경우, 이때, 패널 D에 제시된 구조체는 빌딩 블록을 아비딘과 함께 인큐베이션시킴으로써 형성될 수 있다. 이로써 아비딘 분자를 통해 함께 테더링된 빌딩 블록 복합체를 얻을 수 있다. 상기 분지형 구조체 및 (임의의 올리고 성분 상에 비오틴 또는 다른 테더링 분자를 첨가함으로써 얻게 되는) 그의 변형체를 통해 PESA 복합체와 함께 유리된 DF를 국소화시킬 수 있다.
도 23은 신호 증폭이 엑소뉴클레아제 III(Exo III)에 의해 개시되고 매개될 수 있는, EzyAmp 반응에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 상기 효소는 3' 말단이 블런트 또는 오목형일 때, DNA 이중체의 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거하는 것으로 알려져 있다. 효소는 5개 이상의 염기를 포함하는 3' 오버행을 포함하는 이중체를 비롯한, 단일 가닥 올리고는 분해하지 않는다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드(올리고 상의 속이 빈 사각형 표시) 존재가 엑소뉴클레아제 활성을 차단시키는 것으로 알려져 있다. 줄무늬 회색 선은 DNA 표적(T)을 나타내고, 검은색 실선은, DF의 생성을 촉진시키기 위해 믹스에 첨가되는 합성 개시제 올리고(SIO)를 나타낸다. 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지될 수 있는 SIO는 오버행잉형 3' 말단을 포함하는 헤어핀 입체구조로 나타나 있다. SIO이 5개 초과의 염기로 이루어진 3' 오버행을 포함하는 바, Exo III은 표적 결합 이전에는 SIO를 분해할 수 없다. SIO에서 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 상기 지점 너머의 가수분해를 방해하고, 이로써, DF는 온전한 상태 그대로 유지된다. 폐쇄형 원이 SIO, PESA 및 CESA 올리고의 5' 말단을 나타낸다. 회색 실선은 5개 이상의 염기를 포함하는 2개의 3' 오버행잉형 말단을 포함하는 PESA를 나타낸다. PESA는, EAS1가 형광단 및 소광제로 표지되어 있는 것인 2개의 올리고(EAS1 및 EAS2)로서 제시되어 있다. PESA의 3' 말단이 5개 초과의 염기로 이루어진 3' 오버행을 포함하는 바, Exo III은 DF 결합 이전에는 PESA를 분해할 수 없다.
EzyAmp 반응은 하기 단계를 가지게 될 것이다: 1단계에서, SIO는 표적의 상보적인 영역에 결합할 수 있고, 2단계에서, SIO의 현재 오목한 3' 말단은 Exo III에 의해 포스포로티오에이트 염기까지 가수분해됨으로써 온전한 DF는 유리되고, 형광은 증가하게 될 것이다. DF는 표적에 상보적이지 않은 SIO의 5' 부분에 상응할 것이다. 이어서, 더 이상 SIO에 결합하지 못하는 표적은 자유롭게 재순환됨으로써 또 다른 SIO에 결합하고, 이를 통해 또 다른 DF가 생성될 것이다(3단계). 이어서, DF는 PESA의 EAS1에 결합할 수 있고 (4단계), 이제 EAS1의 3' 말단이 오목한 것인 CESA를 형성할 수 있다. 이어서, Exo III은 CESA의 EAS1 가닥을 가수분해함으로써(5단계), 형광은 증가하게 되고, DF는 유리될 것이다. 이에 DF는 자유롭게 재순환됨으로써(단계 6) 추가의 PESA를 CESA로 전환시킬 것이다.
도 24는 표적 의존 MNA자임을 사용하여 구동자 단편(DF)을 생성하는 다양한 방법을 도시한 예시적인 도식이다. DF는 검은색 윤곽선을 가지는 흰색 선으로 표시되어 있고; MNA자임 기질 절단 부위는 X로 표시되어 있고; 기질 서열을 포함하는 올리고는 회색 선으로 표시되어 있고; RE 절단 부위는 화살촉으로 표시되어 있고; RERS는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고; 표적은 검은색 및 흰색 줄무늬 선으로 표시되어 있고; DF와 결합하여 CESA를 형성할 수 있는 PESA 올리고뉴클레오티드는 줄무늬 회색 선으로 표시되어 있고; MNA자임은 검은색 실선으로 표시되어 있다.
패널 A는 MNA자임 기질의 직접적인 절단을 통해 DF가 생성되는 것을 도시한 것인데, 여기서, DF 서열은 기질 서열의 일부이다. 표적의 존재하에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 조립되고, 그의 기질을 절단한다. DF로서 작용하는, 절단된 기질의 한 단편은 PESA와 결합하고, 이를 통해 CESA가 형성된다. 이어서, 완전하게 조립된 CESA는 RE에 의해 절단될 수 있다. 실시예 2, 4 및 11이 DF를 생성하기 위한 상기 전략법의 용도를 입증한다.
패널 B는 MNA자임 기질의 절단을 통해 DF를 생성할 수 있는 방법을 도시한 것인데, 여기서, DF 서열은 MNA자임에 의해 인식되는 기질 서열의 일부분 내에 존재하지는 않지만, 이는 여전히 기질과 동일한 올리고뉴클레오티드 내에 포함되어 있었다. 기질 함유 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 이로써 MNA자임에 의해 인식되는 기질 영역은 헤어핀의 루프를 형성하게 되고, DF는 헤어핀의 줄기 내의 하이브리드화에 의해 갇히게 될 것이다. 표적의 존재하에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 조립되고, 그의 기질을 절단할 것이다. 기질 절단은 헤어핀을 파괴시키고, 이로써 줄기는 해리되고, 따라서 절단된 단편이 분리된다. DF로서 작용할 수 있는 것인, 절단된 단편 중 하나는 PESA와 결합하여 CESA를 형성하게 될 것이다. 이어서, 완전하게 조립된 CESA는 RE에 의해 절단될 수 있다.
패널 C는 이중 가닥 기질-차단제-DF 복합체의 MNA자임 절단을 통해 DF를 생성하는 것을 도시한 것이다. 상기 복합체에서, DF 서열은 MNA자임에 의해 인식되는 기질 서열의 일부가 아니며, 기질과 동일한 올리고뉴클레오티드 내에 포함되어 있는 것도 아니다. DF는 기질 올리고와 하이브리드화하는 제2 올리고 내에 포함되어 있다. 기질 올리고에서, MNA자임 기질로서 인식될 수 있는 서열은 DF 올리고에 상보적인 추가 서열 측면에 위치한다. 기질로서 작용할 수 있고, 동시에 DF에 결합하는 것인(따라서, DF를 차단하는 것인) 역할을 하는 상기 올리고는 기질-차단제 올리고로서 명명된다. MNA자임에 의해 인식되는, 기질-차단제 올리고 내의 서열은 DF 올리고뉴클레오티드에 상보적이지 않고, 따라서, 상기 기질 서열은 바깥쪽으로 루프를 형성한다. 표적의 부재하에서는, 이중 가닥 기질-차단제-DF 복합체 형성이 선호되는데, 이를 통해 DF는 PESA와 상호작용하지 못하게 된다. 표적의 존재하에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 조립되고, 기질 루프를 절단한다. 기질 루프의 절단으로 DF에 결합한 기질-차단제 올리고의 일부는 해리되고, 이로써 DF는 유리됨으로써, 상기 DF는 PESA와 결합하여 CESA를 형성할 수 있다. 이어서, 완전하게 조립된 CESA는 RE에 의해 절단될 수 있다. 실시예 9가 DF를 생성하기 위한 상기 전략법의 용도를 입증한다.
패널 D는 헤어핀 구조의 기질-차단제-DF 복합체의 MNA자임 절단을 통해 DF를 생성하는 것을 도시한 것이다. 상기 복합체에서, DF 서열은 비록 기질과 동일한 올리고뉴클레오티드 내에 포함되어 있기는 하지만, MNA자임에 의해 인식되는 기질 서열의 일부는 아니다. 헤어핀 구조의 기질-차단제-DF 복합체는 패널 C에 기술되어 있는 이중 가닥 기질-차단제-DF 복합체와 유사하지만, 단, 예외적으로, 기질-차단제 올리고와 DF 올리고 사이에 연결 서열이 존재하고, 이로써, 헤어핀이 형성된다. 표적의 부재하에서는, 기질-차단제-DF 헤어핀 구조체 형성이 선호되는데, 이를 통해 DF는 PESA와 상호작용하지 못하게 된다. 표적의 존재하에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 조립되고, 루프형 기질부를 절단한다. 기질 루프의 절단으로 DF에 결합한 줄기부가 해리된다. 이제 단일 가닥 DF 서열이 PESA에 결합하여 CESA를 형성할 수 있게 된다. 이어서, 완전하게 조립된 CESA는 RE에 의해 절단될 수 있다. 실시예 14가 DF를 생성하기 위한 상기 전략법의 용도를 입증한다.
도 25는 두 EzyAmp 반응이 단일 튜브에서 동시에 일어나고, 독립적으로 모니터링되는 다중화 분석법을 입증하는 것이다. PESA A 및 PESA B, 둘 모두의 존재하에서 DF-a 및/또는 DF-b를 이용하여 반응을 개시시켰다. DF-a가 PESA A에 결합함에 따라 CESA A가 형성되었고, 이것이 절단되었을 때, JOE 형광이 증가하였다(검은색 굵은 실선). DF-b가 PESA B에 결합함에 따라 CESA B가 형성되었고, 이것이 절단되었을 때, FAM 형광이 증가하였다(검은색 굵은 실선). 테스트 반응은 100 nM의 각 PESA 및 (i) 100 nM DF-a, (ii) 90 nM DF-a 및 10 nM DF-b, (iii) 100 nM의 DF-a 및 100 nM의 DF-b, (iv) 100 nM의 DF-a 및 90 nM DF-b 또는 (v) 100 nM DF-b를 함유하였다. 대조군 반응은 DF는 함유하지 않았고, 가는 실선(JOE) 또는 가는 점선(FAM)으로 표시되어 있다. FAM 및/또는 JOE에 대한 형광 증가를 시간에 대하여 플롯팅하였다. 반응(i)에서, JOE 형광은 증가하였지만, FAM 형광은 증가하지 않았는데, 이는 DF-a를 통해서는 오직 PESA A만이 형성될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 반응(v)에서, FAM 형광은 증가하였지만, JOE 형광은 증가하지 않았는데, 이는 DF-b를 통해서는 오직 PESA B만이 형성될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 반응(ii), (iii) (iv) & (v)에서는 FAM 및 JOE 형광, 둘 모두가 증가하였는데, 이는 DF-a 및 DF-b, 둘 모두가 존재할 때, CESA A 및 CESA B, 둘 모두가 절단되었으며, 형광 신호의 강도는 사용된 DF의 농도와 관련이 있었다는 것을 나타내는 것이다.
도 26은 인간 cDNA 표적(PPIA cDNA)이 검출될 수 있었던, MNA자임에 의해 개시되는 EzyAmp 반응을 도시한 것이다. EzyAmp 신호 증폭은 피드백 루프를 형성한 다중 CESA의 Mnl I 절단으로부터 일어났다. 본 일례에서는, (i) 리포터 MNA자임 기질의 표적 의존 MNA자임 절단에 의해, 및 (ii) MNA자임 기질의 절단으로 DF-a가 생성된 후의 CESA A 및 CESA B의 절단에 의해 발생된 형광의 누적 변화를 관찰함으로써 개시 및 신호 증폭, 둘 모두를 모니터링하였다. 본 도면에는 시간 경과에 따라 플롯팅된 정규화된 형광이 제시되어 있다. 150분째, cDNA 부재하의 아주 낮은 수준의 형광과 비교하였을 때(가는 선), 115 pg(검은색 굵은 실선) 및 23 pg(점선)의 cDNA를 포함하는 반응에서는 강한 형광 신호가 관찰되었다.
도 27은 RE인 Mnl I에 의한 CESA 절단에 관한 예시적인 전략법을 도시한 것이다. PESA에 결합하여 같은 CESA를 형성할 수 있는 DF를 생성할 수 있도록 CESA를 디자인하였다(패널 A). CESA(상부 복합체, 패널 A)는 PESA(하부 복합체, 패널 A) 및 DF(검은색 줄무늬 선 표시)로 구성되었다. 각 선상의 원은 각 올리고의 5' 말단을 나타낸다. RERS는 점선으로 된 박스로 표시되어 있고, RE 절단 부위는 실선으로 그려진 수직 화살표로 표시되어 있다. 형광단 및 소광제 모이어티 존재는 각각 F 및 Q로 표시되어 있다.
패널 A에는 CESA의 절단으로 그의 상응하는 PESA에 대한 DF가 생성될 수 있는 것인 전략법이 도시되어 있다. PESA는 EAS1 및 EAS2로 구성되는데, 여기서, EAS2는 그 안에, 일단 EAS2로부터 절단되고 나면 DF로서 작용할 수 있는 것인 서열을 포함한다. 개시 DF의 표적 의존 생성, 및 이어서, PESA에 결합을 통해 CESA가 형성될 것이다(1단계). 이어서, CESA는 RE에 의해 절단되고, 이로써, DF로서 작용할 수 있는 단편을 포함하는 절단된 단편이 해리될 수 있다(2단계). 이어서, 상기 단편은 또 다른 PESA에 결합함으로써 DF로서의 역할을 함에 따라 추가의 CESA를 형성할 수 있게 된다(3단계).
패널 B는 패널 A에 도시된 CESA의 Mnl I 절단에 상응하는 형광 증가를 보여주는 것이다. DF의 존재하에서 시간 경과에 따른 형광 증가가 관찰되었다(i). 대조적으로, DF가 첨가되지 않은 대조군 반응에서는 어떤 형광 증가도 관찰되지 않았다(ii). 이는 RE에 의해 절단되는 CESA가 형성되기 위해서는 DF가 필요하다는 것을 나타낸다. CESA의 절단을 통해 단편이 해리되는데, 이중 하나는 원래의 DF의 단축 버전을 포함한다.
정의
본원에서는 하기 기술되는 바와 같은 의미를 가지는 것으로 하는 특정 용어 및 어구가 사용된다.
본 출원에서 사용되는 바, 단수형인 "하나"("a," "an") 및 "그"("the")라는 것은 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "MNA자임" 또는 "완전 효소 신호 증폭제 복합체" 또는 "부분 효소 신호 증폭제 복합체"라는 용어는 또한 각각 복수 개의 MNA자임들 또는 완전 부분 효소 신호 증폭제 복합체들 또는 부분 효소 신호 증폭제 복합체들을 포함한다. 문맥상 달리 요구되거나, 구체적으로 상반되게 언급되지 않는 한, 본원에서 단수 형태의 정수들, 단계들, 또는 요소들로서 열거된 본 발명의 정수, 단계, 또는 요소는 단수 및 복수 형태, 둘 모두의 열거된 정수들, 단계들, 또는 요소들을 분명하게 포함한다.
"포함하는"이라는 용어는 "반드시 ~만을 단독으로 포함하는 것이 아니라, 주로, ~을 포함한다"는 것을 의미한다. 추가로, "포함하는"이라는 단어의 변형, 예컨대, "포함한다"("comprise" 및 "comprises")는 그에 맞게 변형된 의미를 가진다. 따라서, 예를 들어, 주어진 단계를 "포함하는" 방법은 배타적으로 오로지 그 단계로 구성될 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다.
"완전 효소 신호 증폭제 복합체," "CESA 복합체," 및 "CESA"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 같은 의미를 가진다. 본원에서 언급되는 바, CESA 복합체란 효소(예컨대, 뉴클레아제)에 의해 인식 및 절단될 수 있는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체이며, 이는 효소 인식 서열/부위 및 효소 절단 서열 부위를 포함한다. 효소는 예를 들어, 뉴클레아제(예컨대, 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 효소 절단 서열/부위는 효소 인식 서열/부위 내부에, 외부에, 또는 그와 중첩되어 있을 수 있다. 본원에서 언급되는 CESA 복합체는 각각 하기에서 정의되는 바와 같은, 2 이상의 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드 및 1 이상의 구동자 단편(DF)을 포함한다. CESA 복합체의 한 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 복합체 중 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 추가로, 상기 EAS 올리고뉴클레오티드 중 하나의 적어도 일부는 또한 1 이상의 DF의 적어도 일부에 상보적이다. DF는 비록 반드시 그러할 필요는 없지만, 하나 이상의 염기를 효소 인식 서열/부위 및/또는 효소 절단 서열/부위에 제공할 수 있다. 본원의 CESA 복합체는 상기 기술된 의미로부터 벗어나지 않으면서, 수치로, 예컨대, "제1" CESA 복합체, "제2" CESA 복합체, "제3" CESA 복합체 등으로 언급될 수 있다는 것에 주의해야 할 것이다.
"효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드," "효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드," "EAS 올리고뉴클레오티드," "EAS 올리고," 및 "EAS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 같은 의미를 가진다. 본원에서 언급되는 EAS 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적임으로써 적절한 조건하에서 둘 사이에 하이브리드화가 일어나는 것인 올리고뉴클레오티드이다. EAS 올리고뉴클레오티드는 임의적으로 하기 정의되는 바와 같은 구동자 단편(DF)의 적어도 일부에 상보적인 1 이상의 부분을 포함할 수 있다. EAS 올리고뉴클레오티드는 (하기 정의되는 바와 같은) 복합체, 예를 들어, CESA 복합체 및 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체의 성분일 수 있다. 본원의 EAS 올리고뉴클레오티드는 상기 기술된 의미로부터 벗어나지 않으면서, 수치로, 예컨대, "제1" 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1), "제2" 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2), "제3" 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3) 등으로 언급될 수 있다는 것에 주의해야 할 것이다. 일부 실시양태에서, EAS 올리고뉴클레오티드는 링커에 의해 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 예를 들어, EAS1 및 EAS2는 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 할 수 있는 연결 핵산 서열에 의해 그가 결합되어 있는 것인, 같은 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드 내에 존재할 수 있다.
"부분 효소 신호 증폭제 복합체," "부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체," "PESA 복합체" 및 "PESA"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 같은 의미를 가진다. 본원에서 언급되는 PESA 복합체는 한 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 복합체 중 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 것인, 2 이상의 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체이다. 추가로, 상기 EAS 올리고뉴클레오티드 중 하나의 적어도 일부는 또한 (하기 정의되는 바와 같은) 1 이상의 DF의 적어도 일부에 상보적이다. DF에 하이브리드화할 수 있는 능력을 가짐에도 불구하고, DF는 PESA 복합체에 하이브리드화되지 않고, 따라서, PESA 복합체의 성분이 아니다. PESA 복합체는 효소에 대한 적어도 부분 인식 서열/부위 및 또는 적어도 부분 절단 서열/부위를 포함하고, 효소에 대한 전체 인식 서열/부위 및/또는 전체 절단 서열/부위를 포함할 수 있다. 효소는 예를 들어, 뉴클레아제(예컨대, 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 일부 실시양태에서, PESA 복합체의 두 EAS 올리고뉴클레오티드는 링커에 의해 결합될 수 있고, 예를 들어, 두 EAS 올리고뉴클레오티드는 그가 연결 핵산 서열에 의해 헤어핀 구조 형태로 결합되어 있는 것인, 같은 올리고뉴클레오티드 내에 존재할 수 있다. 본원의 PESA 복합체는 상기 기술된 의미로부터 벗어나지 않으면서, 수치로, 예컨대, "제1" PESA 복합체, "제2" PESA 복합체, "제3" PESA 복합체 등으로 언급될 수 있다는 것에 주의해야 할 것이다.
"구동자 단편 올리고뉴클레오티드," "구동자 단편(DF) 올리고뉴클레오티드," "구동자 단편 올리고," "DF 올리고뉴클레오티드," "DF 올리고," 및 "DF"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 같은 의미를 가진다. 본원에서 언급되는 DF 올리고뉴클레오티드는 적절한 조건하에서 둘 사이에 하이브리드화가 일어날 수 있도록 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 1 이상의 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 것인 올리고뉴클레오티드이다. DF 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법에 의해 검출하고자 하는 표적 분자(예컨대, 핵산)일 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. DF 올리고뉴클레오티드는 복합체, 예를 들어, CESA 복합체의 성분일 수 있다. 이러한 경우, DF 올리고뉴클레오티드는 비록 반드시 그러할 필요는 없지만, 하나 이상의 뉴클레오티드를, 복합체 중에 존재할 수 있는 효소 인식 서열/부위 및/또는 효소 절단 서열/부위에 제공할 수 있다. 효소는 예를 들어, 뉴클레아제(예컨대, 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 본원의 DF 올리고뉴클레오티드는 상기 기술된 의미로부터 벗어나지 않으면서, 수치로, 예컨대, "제1" DF, "제2" DF, "제3" DF 등으로 언급될 수 있다는 것에 주의해야 할 것이다.
"합성 개시제 올리고" 또는 "SIO"는 시료 중의 표적 핵산에 하이브리드화함으로써 뉴클레아제에 의해 쉽게 절단될 수 있는 기질을 형성하고, 이로써 상기 절단을 통해 구동자 단편(DF)으로서 작용할 수 있는 더 짧은 단쇄의 올리고를 생성할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. SIO는 뉴클레아제에 의한 그의 절단 이전에 억제 단편(Inf: Inhibitory Fragment)으로서 작용할 수 있다. SIO는 부분 또는 완전한 이중 가닥 입체구조의 하나 또는 다중 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 다중 올리고뉴클레오티드를 포함하는 SIO를 본원에서는 "SIO 복합체"로 지칭한다. 본원의 SIO는 상기 기술된 의미로부터 벗어나지 않으면서, 수치로, 예컨대, "제1" SIO, "제2" SIO, "제3" SIO 등으로 언급될 수 있다는 것에 주의해야 할 것이다.
"효소 억제 복합체" 또는 "EIC"는 당업계의 효소에 의해 쉽게 절단될 수 있는 이중체 구조체의 형성을 파괴하는 추가 서열이 존재함으로 인해 효소에 의해 쉽게 절단되지 못하는 이중체를 형성하는 2개 이상의 상보적인 핵산 단편 또는 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 복합체이다. 한 실시양태에서, EIC는 EAS1, EAS2 및 억제 단편(InF)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, EIC는 PESA 및 InF를 포함한다. 추가의 실시양태에서, InF는 DF로서 유용한 서열을 포함하지만, 쉽게 절단될 수 있는 이중체 CESA가 형성되지 못하도록 이를 막는 추가의 뉴클레오티드를 가진다. 추가의 실시양태에서, InF는 오직 표적 피분석물의 존재하에서만, CESA의 조립을 완성하는 DF로서 작용할 수 있는 더 작은 소형의 올리고뉴클레오티드 단편으로 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, InF는 오직 표적의 존재하에서만 뉴클레아제에 의해 절단되어 DF를 생성할 수 있는 "합성 개시제 올리고" 또는 "SIO"일 수 있다. 다른 실시양태에서, InF는 오직 표적의 존재하에서만 MNA자임에 의해 절단되어 DF가 될 수 있는 "MNA자임 기질"일 수 있다. 일부 실시양태에서, InF의 절단은 핵산 효소 또는 압타자임에 의존한다. 일부 실시양태에서, 핵산 효소 또는 압타자임은 MNA자임을 포함한다. 다른 실시양태에서, 절단은 단백질 효소에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 효소는 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 효소는 엑소뉴클레아제이다. 추가의 다른 실시양태에서, 절단은 화학적 수단에 의해 달성된다.
"Ezy-amp" 또는 "EzyAmp" 반응은 뉴클레아제에 의한 CESA의 표적 의존 절단이 신호의 발생 및/또는 증폭을 촉진시키고, 여기서, 신호는 표적이 존재함을 나타내는 것인 과정이다. EzyAmp 반응은 하나 이상의 PESA 및 CESA 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중 PESA 복합체로부터의 다중 CESA 형성은 (표적 의존 이벤트로부터 생성된) 제1 DF의 제1 PESA에의 결합이 제1 CESA를 형성하고, 제1 CESA의 절단을 통해, 제2 PESA에 결합함으로써 제2 CESA를 형성하는 것인 제2 DF가 유리되고, 제2 CESA의 절단을 통해, 제1 PESA에 결합함으로써 또 다른 제1 CESA를 형성할 수 있는 제1 DF가 유리되는 것인, 피드백 루프를 형성할 수 있다. 이어서, 제1 CESA는 절단됨으로써, 또 다른 제2 PESA에 결합함으로써 또 다른 제2 CESA를 형성할 수 있는 또 다른 제2 DF를 생성할 수 있는 것 등을 할 수 있다. 검출가능한 신호는 제1 및/또는 제2 CESA의 각각의 절단시에 발생될 수 있고, 이로써 단일 표적 의존 이벤트로부터 유도된 신호를 증폭시키는 수단을 제공할 수 있다. 본원에서 언급되는 EzyAmp 반응은 선형 및 피드백 신호 증폭 캐스케이드, 둘 모두를 포함한다는 것에 주의해야 할 것이다.
"효소"란 화학적 반응을 촉매화시킬 수 있는 임의의 분자를 의미한다. "촉매성 단백질," "촉매성 아미노산," 및 "단백질 효소"는 같은 의미를 가지고, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 기질을 인식하고, 화학적 변형을 촉매화시키는 아미노산 쇄로 이루어진 분자라는 것을 기술한다. 효소는 또 다른 효소, 압타머, 분자, 또는 핵산을 인식하여 결합을 절단, 부가, 또는 변형시킬 수 있다.
"촉매성 핵산 분자," "촉매성 핵산," "핵산 효소" 및 "촉매성 핵산 서열"은 같은 의미를 가지고, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 하기의 모두 기질을 인식하고, 기질의 화학적 변형을 촉매화시키는 DNA 분자 또는 DNA 함유 분자(이는 또한 당업계에서 "DNA 효소," "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로도 알려져 있음) 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자(이는 또한 당업계에서 "RNA 효소" 또는 "리보자임"으로도 알려져 있음) 또는 "MNA자임"이라는 것을 기술한다. MNA자임, 압타-MNA자임, DNA자임, 리보자임, 압타자임, EAS, CESA 복합체, PESA 복합체, SIO, 구동자 단편 또는 억제 단편 중의 뉴클레오티드 잔기는 염기 A, C, G, T, 및 U 뿐만 아니라, 그의 유도체 또는 유사체를 포함하며, 그의 예는 하기 표 1에 열거되어 있다. MNA자임, 압타-MNA자임, DNA자임, 리보자임, 압타자임, EAS, CESA 복합체, PESA 복합체, SIO, 구동자 단편 또는 억제 단편의 하나 이상의 성분은 비드, 칩, 어레이, 마이크로캐리어, 나노캐리어, 코딩된 마이크로캐리어, 코딩된 나노캐리어를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, "유도체"라는 용어는 (예컨대, 화학적 수단에 의해) 합성 후 부가된 또는 (예컨대, 재조합 수단에 의해) 통합적으로 제조된 임의의 융합 분자를 비롯한, 임의의 기능상 등가인 핵산 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 융합체는 RNA 또는 DNA가 그에 부가되어 있거나, 그가 폴리펩티드(예컨대, 퓨로마이신 또는 다른 폴리펩티드), 소형 분자(예컨대, 프소랄렌) 또는 항체에 컨쥬게이트되어 있는 것인 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, "유사체"라는 용어는 DNA 또는 RNA 분자 또는 잔기와 관련된 물리적 구조를 가지는 화합물을 포함하고, 이는 DNA 또는 RNA 잔기 또는 그의 유사체와 수소 결합을 형성할 수 있지만(즉, DNA 또는 RNA 잔기 또는 그의 유사체와 어닐링하여 염기쌍을 형성할 수 있지만), 상기 화합물을 "유사체"라는 용어의 범주내 포함시키는 데 그러한 결합이 반드시 요구되는 것은 아니다. 상기 유사체는 그와 구조상 관련이 있는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기와 상이한 화학적 및 생물학적 특성을 가질 수 있다. 메틸화된, 요오드화된, 브롬화된 또는 비오티닐화된 잔기가 유사체의 일례이다. 데옥시이노신, C-5-이미다졸 데옥시우리딘, 3-(아미노프로피닐)-7-데아자-dATP, 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-메틸 캡을 비롯한, 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 활성 DNA자임이 기술되었다. 다른 유사체 또한 DNA자임 및 MNA자임의 촉매 활성과 화합성일 수 있다. 예를 들어, 또 다른 염기 대신 한 염기로 치환함으로써, 염기 대신 유사체로 치환함으로써 촉매 활성을 가진 핵산을 변경시키거나, 또는 당 성분 또는 포스포디에스테르 골격을 변경시키는 것은 당업자에게 간단할 수 있다. 예를 들어, 합성 동안 또는 합성 후 특이 염기를 변형시킴으로써 변경시킬 수 있다. 예컨대, 염기 변이 또는 염기 유사체와 같은 변경을 포함한 촉매성 핵산에 관한 실증적 분석을 통해 변경된 서열, 또는 특이 유사체가 촉매 활성에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 염기 A, C, G, T 및 U의 유사체는 당업계에 공지되어 있으며, 서브세트는 표 1에 열거되어 있다. 뉴클레아제 분해를 억제시킬 수 있는 유사체의 예 또한 당업계에 주지되어 있다. 그러한 유사체는 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 막기 위해 전략상 올리고뉴클레오티드 내에 배치될 수 있다. 일례로, 포스포로티오에이트 연결부의 Sp 입체이성체는 람다 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III(E. 콜라이), 엑소뉴클레아제 I(E. 콜라이), 엑소뉴클레아제 T 및 RecJ를 비롯한, 다수의 뉴클레아제의 절단을 크게 억제시키는 것으로 알려져 있다. 다중 포스포로티오에이트 연결부를 포함하는 것이 뉴클레아제 활성을 차단함에 있어 고도로 효과적일 수 있다.
뉴클레오티드 유사체의 예
약어 명칭
ac4c 4-아세틸시티딘
chm5u 5-(카복시히드록실메틸)우리딘
Cm 2'-O-메틸시티딘
Cmnm5s2u 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘
D 디히드로우리딘
Fm 2'-O-메틸슈도우리딘
Galq 베타, D-갈락토실퀘오신
Gm 2'-O-메틸구아노신
l 이노신
i6a N6-이소펜테닐아데노신
mla 1-메틸아데노신
mlf 1-메틸슈도우리딘
mlg 1-메틸구아노신
mil 1-메틸이노신
m22g 2,2-디메틸구아노신
m2a 2-메틸아데노신
m2g 2-메틸구아노신
m3c 3-메틸시티딘
m5c 5-메틸시티딘
m6a N6-메틸아데노신
m7g 7-메틸구아노신
mam5u 5-메틸아미노메틸우리딘
mam5s2u 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
Manq 베타, D-만노실메틸우리딘
mcm5s2u 5-메톡시카르보닐메틸우리딘
mo5u 5-메톡시우리딘
ms2i6a 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
ms2t6a N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
mt6a N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌
Mv 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르
o5u 우리딘-5-옥시아세트산 (v)
Osyw 와이부톡소신
P 슈도우리딘
PS 포스포티오에이트
Q 퀘오신
s2c 2-티오시티딘
s2t 5-메틸-2-티오우리딘
s2u 2-티오우리딘
s4u 4-티오우리딘
T 5-메틸우리딘
t6a N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
tm 2'-O-메틸-5-메틸우리딘
Um 2'-O-메틸우리딘
Yw 와이부토신
X 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, (acp3)u
AraU 베타, D-아라비노실
AraT 베타, D-아라비노실
"조립 촉진제 분자", "조립 촉진제", "MNA자임 조립 촉진제 분자", "MNA자임 조립 촉진제"는 같은 의미를 가지고, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 성분 파트자임이 자기 조립하여 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임을 형성할 수 있도록 촉진시킬 수 있는 분자를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 조립 촉진제는 MNA자임의 자기 조립을 위해서 요구된다. 일부 실시양태에서, 조립 촉진제 분자는 "표적," "표적 피분석물" 또는 "피분석물"을 포함하는데, 본원에서 사용되는 바, 이는 각각 그의 존재가 특정 MNA자임에 의해 검출되거나 측정되는 것인 분자를 의미한다. 조립 촉진제 분자는, "MNA자임"의 성분 또는 일부를 구성하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 "파트자임"과 쌍을 형성하거나, 그에 결합하는 하나 이상의 영역을 포함한다. 단, 조립 촉진제가 MNA자임의 성분 파트자임 중 1 이상과 상호작용하거나, 쌍을 형성하거나, 그에 결합한다면, 이는 각 성분 파트자임 또는 올리고뉴클레오티드와 반드시 상호작용하거나, 쌍을 형성하거나, 그에 결합할 필요는 없다. 본원에서 사용되는 바, MNA자임 조립 촉진제 분자는 MNA자임의 자기 조립을 촉진시킬 수 있는 성분들로서, 이를 가장 광범위게 포함하는 것으로 한다. 표적 및 피분석물은 또한 그에 고감도 검출 방법이 바람직할 수 있는 것인 검출가능한 성분들로서, 이를 가장 광범위게 포함하는 것으로 한다. 일부 예시적인 표적으로는 핵산 서열, 바이러스, 박테리아, 프리온, 단백질, 항체, 및 소형 분자를 포함한다. 다른 표적 피분석물 또한 본원에서 사용하기 위한 것으로 고려된다.
"기질," "기질 분자," 및 "화학적 기질"은 같은 의미를 가지고, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 촉매성 분자에 의해 인식되고 화학적으로 변형되는 임의 분자를 의미한다. 특정 실시양태에서, 기질은 효소에 의해 인식되고 화학적으로 변형되고, 다른 실시양태에서, 기질은 촉매성 핵산 분자에 의해 인식되고 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 기질은 단백질 효소에 의해 인식되고 화학적으로 변형되고, 다른 실시양태에서, 기질은 핵산 효소에 의해 인식되고 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 기질은 단일 가닥 핵산 분자 또는 분자들을 포함할 수 있고, 다른 실시양태에서, 기질은 이중 가닥 핵산 분자 또는 분자들을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 기질은 헤어핀 분자를 형성할 수 있다. 기질의 화학적 변형은 반응 생성물의 출현 또는 증가에 의해, 또는 반응(들) 기질의 소실 또는 감소에 의해 측정될 수 있다. 단, 각각 기질 분자가 촉매성 분자에 의해 촉매 활성에 대하여 인식될 수 있는 적어도 최소의 구조를 가지는 한, 특정 촉매성 분자는 하나 이상의 상이한 기질 분자를 인식할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "파트자임" 및 "성분 파트자임"이라는 용어는 같은 의미를 가지고, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 오직 MNA자임 조립 촉진제 분자의 존재하에서만 2개 이상의 것이 함께 "MNA자임"을 형성할 수 있는 것인 DNA 함유 또는 RNA 함유 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 성분 파트자임, 바람직하게, 2 이상의 것은 3개의 영역 또는 도메인: 화학적 변형을 촉매화시키는 MNA자임의 촉매성 코어의 일부를 형성하는 "촉매성" 도메인; 표적 피분석물과 회합하고/거나, 그에 결합하는 "센서 아암" 도메인; 및 기질과 회합하고/거나, 그에 결합하는 "기질 아암" 도메인을 포함한다. 파트자임은 필연적으로 MNA자임 구조의 일부를 형성해야 하지만, MNA자임 조립 촉진제 분자를 특이적으로 인식하거나, 그와 직접 결합하거나, 또는 그와 쌍을 형성할 필요는 없다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 주어진 MNA자임에 대한 하나 이상의 파트자임에는 전체로든 부분으로든 상기 언급된 도메인 중 하나, 또는 그 이상, 또는 모두가 존재하지 않을 수 있다는 것은 분명하다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 파트자임이 다른 파트자임과 상호작용하지만, 조립 촉진제 분자와 반드시 상호작용할 필요는 없다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 특정 파트자임은 조립 촉진제 분자에 직접 결합하거나, 그와 쌍을 형성한다거나 하지 않고, 오직 간접적으로 상호작용만 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "MNA자임" 및 "다성분 핵산 효소"라는 용어는 기질 분자 또는 분자들을 촉매적으로 변형시킬 수 있는 활성 핵산 효소를 오직 MNA자임 조립 촉진제 분자(예를 들어, 표적 피분석물)의 존재하에서만 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(예컨대, 파트자임)을 의미한다. 한 실시양태에서, 파트자임 A 및 B는 각각 (예컨대, 핵산 표적과 ?슨 크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 형성함으로써) 표적 피분석물에 결합한다. MNA자임은 오직 파트자임 A 및 B의 센서 아암이 표적 상에서 서로 인접하게 하이브리드화하고 있을 때에만 형성된다. MNA자임의 기질 아암은 기질과 맞물림을 형성하고, 그의 절단은, 파트자임 A 및 B 상의 부분 촉매성 도메인의 상호작용에 의해 형성된 MNA자임의 촉매성 코어에 의해 촉매화된다. 일부 실시양태에서, MNA자임은 형광단과 소광제 염료 쌍 사이의 기질을 절단하여 신호를 발생시킨다. DNA/RNA 키메라(기질)의 절단은 도면(도 5A)에 예시되어 있다. 다른 실시양태에서, MNA자임은 파트자임에의 결합 후 기질을 결찰시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "MNA자임" 및 "다성분 핵산 효소"라는 용어는 PCT 특허 공보 번호 WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, 및 관련 미국 특허 공개 번호 2007-0231810, 2010-0136536, 및 2011-0143338(이들 특허 각각의 전문이 본원에서 상호 참조로 포함된다) 중 임의의 하나 이상에 개시된 것을 비롯한, 공지된 모든 MNA자임 및 변형된 MNA자임을 포함한다는 것을 이해할 것이다. "MNA자임" 및 "다성분 핵산 효소"라는 용어에 포함되는 MNA자임 및 변형된 MNA자임의 비제한적인 예로는 (본원에 예시된 것과 같은) 절단 촉매 활성을 가진 MNA자임, 하나 이상의 조립 억제제를 포함하는 분해된 또는 부분적으로 조립된 MNA자임, 하나 이상의 압타머를 포함하는 MNA자임("압타-MNA자임"), 하나 이상의 절두형 센서 아암 및 임의적으로 하나 이상의 안정화 올리고뉴클레오티드를 포함하는 MNA자임, 하나 이상의 활성 억제제를 포함하는 MNA자임, 다성분 핵산 불활성 전효소(MNAi: multi-component nucleic acid inactive proenzyme), 및 리가제 촉매 활성을 가진 MNA자임("MNA자임 리가제")을 포함하며, 이들은 각각 WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, US 2007-0231810, US 2010-0136536, 및/또는 US 2011-0143338 중 하나 이상에 상세하게 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "압타머"는 그의 보다 고차원의 구조, 예를 들어, 3D 결합 도메인 또는 포켓에 기인하여 큰 친화도 및 특이성으로 하나 이상의 리간드를 인식할 수 있는 능력을 가진 핵산 또는 펩티드 서열을 포함한다. 압타머는 핵산, 단백질, 프리온, 소형 유기 화합물 또는 전체 유기체에 결합할 수 있다. 본원에서 바람직한 압타머는 흡착, 회수, 및 재증폭으로 이루어진 반복 공정에 의해 합성 핵산으로 이루어진 복합체 라이브러리로부터 단리될 수 있는 단쇄의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 압타머는 소형 분자, 예컨대, 아미노산, 단백질에 대한 항생제 및 핵산 구조체 범위에 이르는 거의 모든 표적에 대하여 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고"는 DNA 또는 DNA 함유 핵산 분자, 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자의 세그먼트 또는 단편을 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 예로는 핵산 표적; 기질, 예를 들어, MNA자임에 의해 변형될 수 있는 것; 프라이머, 예컨대, 방법, 예컨대, PCR에 의해 시험관내 표적 증폭에 사용되는 것; 및 MNA자임의 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, MNA자임 조립 촉진제는 본원에서 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 파트자임은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는 EAS, InF, SIO 및 DF를 포함한다. 본원에서 언급되는 올리고뉴클레오티드는 또 다른 올리고뉴클레오티드에 "상보적"일 수 있다. 본원에서 제2 핵산 분자에 "상보적"인 것으로 언급된 임의의 핵산 분자는 적절한 조건하에서 ?슨 크릭 염기 쌍 형성을 통해 (전체적으로 또는 부분적으로) 상기 제2 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "염기"라는 용어는 그에 염기가 부착되는 전체 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바, "헤어핀 올리고뉴클레오티드," 또는 "헤어핀"은 그 자신 내부에 서열 상보성을 포함함으로써 분자내 하이브리드화 결합을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상보적인 부분은 "줄기"라고 불리는 반면, 줄기를 형성하는 것 사이의 영역은 "루프"라고 불린다. 헤어핀은 5' 또는 3' 말단에 줄기로부터 신장된 가외 서열을 가질 수 있다. 헤어핀은 또 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, DF에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
"형광 표지" 및 "형광단"은 형광을 보일 수 있는 물질 또는 모이어티를 의미한다. "소광제"는 두 모이어티가 아주 근접하게 위치해 있을 때 형광단의 발광 에너지를 흡수할 수 있는 모이어티이다. 형광단은 다양한 파장에서 에너지를 흡수하고 발광할 수 있고, 따라서, 상이한 파장에서 소광될 수 있다. 형광단 및 소광제는 아주 근접하게 위치해 있을 수 있도록 쉽게 조작될 수 있다. 예를 들어, 상기 둘은 같은 DNA 가닥 상에 0 내지 20개의 염기 단위만큼의 떨어진 거리 범위 안에 배치될 수 있거나, 또는 DNA 가닥의 반대쪽 말단에 배치될 수 있다. 이러한 공간상의 위치 결정을 통해 실질적으로 형광단은 발광 파장에서 어떤 신호도 발생하지 않을 수 있다. 예를 들어, DNA 가닥의 효소적 절단의 결과로서 물리적으로 분리되었을 때, 소광제 및 형광단은 소광제가 형광단으로부터 에너지를 효과적으로 흡수하기에는 너무 떨어져 있을 수 있고, 이로써 형광단은 발광 파장에서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "캐스케이드"라는 용어는 각 단계가 발생하는 것은 전형적으로 이전 단계가 발생하는 것에 따라 달라지는 것인, 연속 단계로 발생하는 임의의 일련의 과정 또는 작동을 의미한다. 따라서, 캐스케이드는 효소적 캐스케이드 또는 임의의 다른 신호 전달 캐스케이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 캐스케이드는 뉴클레아제의 촉매 활성으로부터 발생되는 신호 증폭을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 증폭 캐스케이드는 제1 분자 또는 분자들의, 또는 그에 의한 촉매성 변형을 통해 제2 분자 또는 분자들의, 또는 그에 의한 촉매성 변형에 필요한 분자가 이용될 수 있도록 만들고, 결국에는 제1 분자 또는 분자들의, 또는 그에 의한 촉매성 변형에 필요한 분자가 이용될 수 있도록 만드는, 신호의 반복형인, 따라서, 순환형인 증폭을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 필요한 분자는 구동자 단편, 파트자임, 효소, 조립 촉진제, 기질, 표적, 그의 일부 또는 단편 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 따라서, 캐스케이드는 누적 효과를 낳음으로써, 신호를 검출될 수 있는 수준으로 발생시켜 희소 표적을 검출하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2 초과의 촉매성 단계가 사용될 수 있다. 캐스케이드는 선형일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 캐스케이드는 지수적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "피드백 캐스케이드"이라는 용어는 다음 단계가 발생하는 것은 이전 단계가 발생하는 것에 따라 달라지고, 같은 이전 단계가 발생하는 것은 적어도 부분적으로는 후속 단계가 발생하는 것에 따라 달라지는 것인, 연속 단계로 발생하는 임의의 일련의 과정 또는 작동을 의미한다.
약어
하기 약어 본원 및 본 명세서 전역에서 사용된다:
RE: 제한 엔도뉴클레아제, 제한 효소
CESA: 완전 효소 신호 증폭제 복합체
PESA: 부분 효소 신호 증폭제 복합체
SIO: 합성 개시제 올리고
EIC: 효소 억제 복합체
RERS: 제한 효소 인식 부위/서열
RER: 제한 효소 인식
EAS: 효소 증폭제 기질 올리고
EAS1: 제1 효소 증폭제 기질 올리고
EAS2 : 제2 효소 증폭제 기질 올리고
EAS3: 제3 효소 증폭제 기질 올리고
EAS4 : 제4 효소 증폭제 기질 올리고
EAS5: 제5 효소 증폭제 기질 올리고
EAS6: 제6 효소 증폭제 기질 올리고
EAS7 제7 효소 증폭제 기질 올리고
EAS8: 제8 효소 증폭제 기질 올리고
InF: 억제 단편
DF: 구동자 단편
MNA 자임: 다성분 핵산 효소
DNA 자임: 데옥시리보핵산 효소;
PCR: 중합효소 연쇄 반응;
dH20: 탈이온 증류수;
LNA: 잠금 핵산;
PNA: 펩티드 핵산;
bDNA: 분지형 DNA 검정법;
FCS: 형광 상관 분광법(fluorescence correlation spectroscopy);
TSA: 티라미드 신호 증폭(tyramide signal amplification);
An: 피분석물 또는 표적;
F: 형광단 염료 분자;
Q: 소광제 분자;
N= A, C, T, G, 또는 그의 임의의 유사체;
N' = N에 상보적이거나, 또는 N과 염기쌍을 형성할 수 있는 임의의 뉴클레오티드;
(N) x : N의 임의 개수;
( N' ) x : N'의 임의 개수;
n = rN과 상호교환가능;
W: A 또는 T;
K: A, G, 또는 AA;
rN: 임의의 리보뉴클레오티드 염기;
( rN ) x : rN의 임의 개수;
rR: a 또는 g;
rY: c 또는 u;
M: A 또는 C;
H: A, C, 또는 T;
D: G, A, 또는 T;
JOE 또는 6- JOE: 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인;
FAM 또는 6- FAM: 6-카복시플루오레세인;
올리고: 올리고뉴클레오티드;
BHQ = 블랙 홀 소광제(black hole quencher);
BHQ1 = 블랙 홀 소광제 1;
BHQ2 = 블랙 홀 소광제 2;
TXR = 텍사스 레드(Texas Red) 또는 술포로다민;
IAbFQ 또는 IAbkFQ = 아이오와(Iowa) 블랙 형광 소광제.
상세한 설명
우선 처음에는 본원에서 제공하는 도면 및 실시예는 본 발명 및 그의 다양한 실시양태를 예시하고자 하는 것이지, 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
표적 검출용, 확인용 및/또는 정량화용의 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 방법은 일반적으로, 완전 효소 신호 증폭제 복합체 내로의 포함시 뉴클레아제에 의해 매개된 검출가능한 신호의 증폭을 촉진시키는 구동자 단편(DF)의 표적 의존 생성을 위한 성분을 포함하는 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 구동자 단편(DF)의 표적 의존 생성으로부터 발생된 초기 신호가 새로운 표적 분자의 제공 여부와는 상관없이 증폭될 수 있는 것인(즉, 초기 표적 인식 이벤트 이후의 신호 증폭은 표적 분자와는 상관없이 발생될 수 있는 것인) 피드백 캐스케이드를 제공한다. 표적 인식 이벤트로부터 DF가 생성될 수 있도록 하는 수단과 관련해서는 어떤 특정의 제한도 없지만, 일부 실시양태에서, DF는 다성분 핵산 효소(MNA자임)에 의한 기질 절단에 의해서 생성된다. MNA자임은 바람직하게는 조립 촉진제의 존재하에서 자기 조립하여 활성 핵산 효소를 형성하는 다중 핵산 파트자임에 의해 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 조립 촉진제는 표적이고, 따라서, MNA자임은 오직 표적의 존재하에서만 형성된다. 다른 실시양태에서, DF는 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)와 표적 서열 사이의 하이브리드화에 의해 형성된 이중체의 표적 의존 뉴클레아제 절단에 의해 생성된다.
1. 조성물 및 키트
본원에서는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 단지 비제한적인 일례로서, 조성물 및 키트는 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드, 구동자 단편(DF), 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체, 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체, 효소 억제 복합체(EIC), 억제 단편(InF), 합성 개시제 올리고(SIO), 촉매성 핵산, MNA자임, MNA자임 성분, 파트자임, 조립 촉진제, MNA자임 기질, 효소, 제한 효소, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 기질, 압타머, 및/또는 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
1.1 MNA 자임
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 MNA자임을 포함할 수 있다. MNA자임은, 본원에서는 또한 파트자임으로도 언급되는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분으로부터 자기 조립할 수 있는 촉매적으로 활성을 띠는 핵산 효소이다. 파트자임 올리고뉴클레오티드는 MNA자임 자기 조립 촉진제의 존재하에서 자기 조립하여 MNA자임을 형성한다. 일부 실시양태에서, MNA자임의 존재는 검출될 수 있으며, 오직 표적의 존재하에서만 MNA자임이 형성되기 때문에 MNA자임의 존재는 표적이 존재함을 나타내는데, 여기서, 표적은 조립 촉진제를 포함한다. MNA자임은 당업계에 주지되어 있고, PCT 특허 공보 번호 WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, 및 관련 미국 특허 공개 번호 2007-0231810, 2010-0136536, 및 2011-0143338 (이들 특허 각각의 전문이 본원에서 상호 참조로 포함된다) 중 임의의 하나 이상에서 상세하게 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, MNA자임 구조체는 하나 이상의 DNA자임 및/또는 리보자임에 기초한 것이다. 특정 DNA자임 구조체에 기초한 것인 상기 MNA자임 구조체가 더욱 바람직하다. 현재 바람직한 구조체는 10:23 및 8:17 DNA자임을 비롯한, DNA자임에 기초한 것이다. 다양한 실시양태에서, MNA자임은 리보뉴클레오티드 염기 및 데옥시리보뉴클레오티드 염기 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, MNA자임 구조체는 적어도 부분적으로 DNA자임의 구조체에 기초한 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, MNA자임은 적어도 일부 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 그의 유사체를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, MNA자임의 촉매성 코어는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 그의 유사체를 포함한다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 그의 유사체는 기질 촉매에 관여한다. 다른 실시양태에서, 촉매성 코어 중 1 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 또는 그의 유사체는 촉매 활성을 개선시킨다. 추가의 다른 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 존재하지 않는 비스한 MNA자임의 것에 비하여 측정가능한 속도로 촉매화가 발생할 수 있도록 하기 위해서는 MNA자임의 촉매성 코어 중 1 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 또는 그의 유사체에 대한 엄격한 요건이 존재한다.
MNA자임은 당업계에게 주지된, 하나 이상의 치환, 예컨대, 유사체, 유도체, 변형된 또는 변경된 염기, 리보뉴클레오티드, 당 또는 포스페이트 골격의 변경, 다양한 결실, 삽입, 치환, 중복 또는 다른 변형, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 변형, 치환, 결실, 삽입 등은 분자가 촉매 활성을 보유하도록 센서 및/또는 기질 아암에서 및/또는 촉매성 코어부에서 이루어질 수 있다. 기질 또는 조립 촉진제에 결합하는 아암에 대한 치환 및 변형은 내성이 우수할 수 있고, 그를 통해 분자는 상이한 기질/조립 촉진제에 맞게 조정될 수 있다. 예를 들어, 센서 아암의 변형을 통해서는 상이한 조립 촉진제에 맞게 조정될 수 있는 반면, 기질 아암의 변형을 통해서는 상이한 기질에 맞게 조정될 수 있다.
기질은 변화없이 그냥 그대로 유지시키면서, 오직 파트자임의 센서 아암만을 변경시킴으로써 각각의 복수 개의 표적에 대하여 특이적이며, 이 모두는 검출을 위해 범용 MNA자임 기질을 사용하는 것인, 매우 다양한 MNA자임을 디자인할 수 있다. 각 표적에 대하여 맞춤화되어야 한다거나, 또는 독특한 기질을 필요로 하는 요구 사항이 제거되었다는 점에서 그가 제공하는 이점을 당업자는 이해할 것이다. 각각의 새로운 표적은 오직 파트자임의 센서 아암부 중 하나 이상에 하나 이상의 변이만을 필요로 하며; 기질 아암부 및 촉매성 코어부는 그대로 유지될 수 있다. 따라서, MNA자임을 사용하는 단일 표적을 위해, 및 변경된 MNA자임을 사용하는 일련의 검정법에서의 다중 표적을 위해 단일 MNA자임 기질이 사용될 수 있다. 복수 개의 MNA자임 기질을 통해 다중화함으로써 각 표적에 대하여 하나씩인 다중 MNA자임을 사용하는 단일 검정법에서 다중 표적을 검출할 수 있다. MNA자임을 사용하는 상기의 다중화 방법은 용액 중에서 또는 지지체 시스템에의 부착을 이용하여 쉽게 달성될 수 있다. 따라서, 본원에서는 기질, 또는 MNA자임 파트자임 또는 조립 촉진제, 또는 추가 효소 활성 중 하나 이상을 본원에 기술되어 있는 것과 같은 지지체에 부착시킨 것을 포함하는 시스템에서 다중화 검정법이 달성될 수 있다는 점이 고려된다.
MNA자임은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그 둘 모두를 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 1 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 성분 올리고뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게는 데옥시리보뉴클레오티드 성분 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 상기 MNA자임이 본 발명에서는 바람직하다. MNA자임의 촉매성 코어 내에 1 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 또는 그의 유사체를 포함하는 상기 MNA자임 또한 바람직하다. 촉매 활성을 위해 상기 염기가 요구되는 것이 상기 실시양태의 것이 더욱더 바람직하다.
일부 실시양태에서, 파트자임, 조립 촉진제 또는 기질 중 1 이상은 또한 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함할 수 있다(include/comprise).
바람직한 압타머는 흡착, 회수, 및 재증폭으로 이루어진 반복 공정에 의해 합성 핵산 또는 펩티드로 이루어진 복합체 라이브러리로부터 단리될 수 있는 단쇄의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 올리고머 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 압타머는 소형 분자, 예컨대, 아미노산, 단백질에 대한 항생제 및 핵산 구조체 범위에 이르는 거의 모든 표적에 대하여 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 압타머는 예를 들어, 바람직하게는 진화 및 선별 기법에 의해 생성된 핵산 결합 분자를 포함한다. 바람직하게, 압타머는 예를 들어, 상기 표 1과 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 DNA 또는 RNA 분자, 또는 그 둘의 조합을 포함할 수 있다.
압타머 사용과 MNA자임을 조합하는 전략법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, MNA자임의 1 이상의 파트자임을 압타머에 포함(압타-파트자임)할 수 있을 뿐만 아니라, 헤어핀을 형성하여 MNA자임 조립을 억제시킬 수 있는 상보적인 서열에도 포함할 수 있다. 검출하고자 하는 피분석물 또는 표적은 압타-파트자임에 결합할 수 있고, 이로써 활성 MNA자임의 조립이 이루어질 수 있다. 표적 피분석물의 부재하에서, 압타-파트자임은 활성 MNA자임의 조립을 억제시키는 헤어핀 구조를 취한다. 표적 피분석물의 존재하에서 표적 피분석물은 압타-파트자임의 압타머 도메인에 결합하여 헤어핀 구조를 파괴하고, 압타-파트자임이 활성 MNA자임의 조립에 참여할 수 있도록 한다. 이어서, 활성 MNA자임이 MNA자임 기질을 변형시킴으로써 구동자 단편이 생성될 수 있다.
다른 실시양태에서, 압타머는 압타머 뿐만 아니라, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 상보적인 억제제 서열을 포함하는 조립 촉진제의 일부로서 존재할 수 있다. 표적 피분석물의 부재하에서, 조립 촉진제는 이 성분이 활성 MNA자임의 조립을 지시할 수 있는 능력을 억제시키는 헤어핀 구조를 취한다. 표적 피분석물의 존재하에, 표적 피분석물은 조립 촉진제의 압타머 도메인에 결합하여 헤어핀 구조를 파괴하고, 상기 성분이 활성 MNA자임의 조립을 지시할 수 있도록 한다. 이어서, 활성 MNA자임이 MNA자임 기질을 변형시킴으로써 구동자 단편이 생성될 수 있다.
압타머는 조립 촉진제 분자 또는 분자들의 어느 말단으로든 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 다중 압타머는 파트자임 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상의 것으로 포함될 수 있다는 것도 이해할 것이다.
추가의 실시양태에서, 압타머 서열은 입체 배치에서 파트자임(압타-파트자임)의 말단에 포함될 수 있고, 이로써 활성 MNA자임은 오직 표적 피분석물의 존재하에서만 형성이 된다. 이러한 경우, MNA자임 검출 전략법에 필요한 올리고뉴클레오티드 성분으로는 표준 파트자임; 파트자임의 말단 중 한쪽에 압타머가 포함되어 있는 파트자임인 압타-파트자임; (표적의 존재하에서) 활성 MNA자임을 조립할 수 있는 압타-파트자임 및 파트자임, 둘 모두에 결합하는 조립 촉진제; 기질; 및 압타머 서열의 적어도 일부, 및 파트자임 서열의 기질 결합 아암의 일부에 걸쳐져 있는 영역 중의 압타-파트자임에 하이브리드화하는 조립 억제제를 포함한다. 표적의 부재하에서, 조립 억제제는 압타-파트자임에 결합함으로써 MNA자임 기질의 결합(및 절단)을 차단시킨다. 표적의 존재하에서, 표적은 압타-파트자임의 압타머 서열에 결합하여 조립 억제제의 결합은 막고, MNA자임 기질의 결합 및 절단은 허용한다. 따라서, 활성 MNA자임은 오직 표적의 존재하에서 MNA자임 기질을 형성하고 변형시킴으로써 절단 단편, 예를 들어 구동자 단편을 생성할 수 있다.
추가로, 조립 억제제는 별개의 분자일 수 있거나, 또는 MNA자임 복합체에 참여하는 성분 중 하나로 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
하나 이상의 압타머가 파트자임, 조립 촉진제 또는 MNA자임 기질을 비롯한 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 것에 포함될 수 있다는 것 또한 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 압타머는 상기 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 어느 한쪽의 말단으로 포함될 수 있다.
1.2 MNA 자임 기질
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 MNA자임 기질을 포함할 수 있다. 기질은 주어진 MNA자임에 대하여 특이적인 것일 수 있거나, 또는 상이한 표적 특이성을 가진 MNA자임에 의해 변형이 가능한 범용/일반 기질일 수 있다. 특정 실시양태에서, MNA자임은 범용 또는 일반 기질을 사용할 수 있다는 유익한 특성을 가진다. 범용 MNA자임 기질을 통해 손쉽게 디자인을 변경함으로써 상이한 표적을 인식하는 새로운 MNA자임을 생성하여 신속하게 검정법을 개발할 수 있다. 파트자임의 기질 아암부 및 촉매성 코어부는 변함없이 그대로 유지될 수 있고, 새로운 표적에 대하여 필요한 하나 이상의 파트자임의 센서 아암부만이 오직 변경된다. 범용 기질 서열이 제공되고, 따라서, 다수의 상이한 표적에 대한 검정법에 같은 기질이 포함될 수 있다. 추가로, 다양한 실시양태에서, 같은 기질은, 용액 중에 기질이 없거나, 또는 지지체에 테더링되거나 부착되어 있는 검정법을 비롯한, 본원의 방법에 포함될 수 있다. 일련의 범용 기질이 다중화 반응에서 사용될 수 있고, 이를 통해 다중 표적이 동시에 검출될 수 있다.
범용 기질을 사용하는 MNA자임 전략법은 각각의 새로운 표적에 대하여 특이적인 프로브의 디자인 및 사용을 필요로 하는 검출 기술, 예컨대, 택맨(TaqMan)® 또는 몰레큘러 비콘스(Molecular Beacons) 또는 하이브리드화 프로브스(Hybridization probes)에 비하여 주된 이점을 제공한다.
특정 실시양태에서, MNA자임 기질은 부분 효소 기질 증폭제 복합체(PESA)에 결합하여, 뉴클레아제, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제에 의해 쉽게 절단되지 않는 효소 억제 복합체(EIC)를 형성하는 억제 단편으로서의 역할을 할 수 있다.
MNA자임에 의한 MNA자임 기질 변형을 통해 본 발명의 방법(예컨대, EzyAmp 반응)에서 사용하기 위한 하나 이상의 성분을 제공할 수 있다. 변형은 예를 들어, MNA자임 기질의 절단 또는 다중 MNA자임 기질의 결찰일 수 있다.
일부 실시양태에서, MNA자임 기질의 절단을 통해, 구동자 단편으로서의 기능을 하고, PESA와 조립됨으로써 제한 효소 또는 다른 뉴클레아제에 의해 쉽게 절단될 수 있는 CESA를 형성할 수 있는 더 작은 소형 단편이 생성될 수 있다. MNA자임 기질이 범용성이고, 임의 표적에 대하여 유용할 수 있는 바, 범용 MNA자임 기질의 절단을 통해서 범용 구동자 단편이 생성될 수 있다. 그 결과, 범용 DF는 범용 PESA에 결합할 수 있고, 그 결과로 생성된 범용 CESA는 절단됨으로써 임의 표적의 존재하에서 신호는 증폭될 수 있다.
다른 실시양태에서, MNA자임 기질의 결찰을 통해, 구동자 단편으로서의 기능을 하고, PESA와 조립됨으로써 제한 효소 또는 다른 뉴클레아제에 의해 쉽게 절단될 수 있는 CESA를 형성할 수 있는 더 큰 단편이 생성될 수 있다. MNA자임 기질이 범용성이고, 임의 표적에 대하여 유용할 수 있는 바, 범용 MNA자임 기질의 결찰을 통해서 범용 구동자 단편이 생성될 수 있다. 그 결과, 범용 DF는 범용 PESA에 결합할 수 있고, 그 결과로 생성된 범용 CESA는 절단됨으로써 임의 표적의 존재하에서 신호는 증폭될 수 있다.
1.3 구동자 단편
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 구동자 단편(DF)을 포함할 수 있다. 추가로, 또는 별법으로, DF는 본 발명의 방법에 따라 조성물 및 키트를 사용하는 동안에 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 구동자 단편은 올리고뉴클레오티드의 성분으로서 제공될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드, 합성 개시제 올리고뉴클레오티드, MNA자임 기질 올리고뉴클레오티드, 헤어핀 올리고뉴클레오티드(예컨대, 다중 EAS, 및 바람직하게, 2개의 EAS를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드), 테더링된 올리고뉴클레오티드, 또는 한 가닥에 내부 루프부를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이중 가닥 및/또는 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 한 가닥이 그의 상보적인 가닥보다 추가로 신장되어 있는 오버행잉형 부분(예컨대, 5' 또는 3' 오버행)를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 성분과 복합체(예컨대, PESA 또는 CESA) 형태로 복합체를 형성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 구동자 단편은 EAS 올리고뉴클레오티드의 성분으로서 제공되는데, 여기서, EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 또 다른 상이한 EAS 올리고뉴클레오티드에 상보적이고, 여기서, 상기의 상이한 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 구동자 단편의 적어도 일부에 상보적이다.
구동자 단편은 본원에 개시된 신호 증폭 방법(예컨대, EzyAmp 반응)을 개시시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 오직 표적 검출시에만 이용가능한 구동자 단편은 PESA 복합체에서 EAS에의 결합시 신호 증폭 캐스케이드를 개시시키는 데 사용될 수 있다. 상기 실시양태에서, 캐스케이드는 구동자 단편의 부재하에서는 시작될 수 있는 바, 비록 하기의 용어가 단지 암시적인 것일 뿐이지만, 상기 구동자 단편을 기술함에 있어 요건이 되는 것은 아니라는 것을 이해하기는 하지만, 이에 구동자는 "개시제" 구동자 단편으로서 언급될 수 있다.
예를 들어, 구동자 단편은 오직 표적 서열의 존재하에서만 조립되는 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단에 의해 생성될 수 있다. 구동자 단편은 오직 표적 서열의 존재하에서만 조립되는, 리가제 활성을 가진 MNA자임의 다중 기질의 결찰에 의해서 생성될 수 있다는 것 또한 고려한다. 구동자 단편은 단백질, 지질, 소형 분자, 바이러스 또는 압타머를 포함한 하기 유형의 촉매성 핵산에 의해 검출가능한 다른 리간드를 비롯한 표적 리간드의 존재하에서만 MNA자임 기질을 절단하는 압타-MNA자임 또는 압타자임(DNA, RNA 또는 키메라)의 촉매 활성에 의해 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 구동자 단편은 예를 들어, 도 19 및 24, 및 실시예 9 및 14에 기술되어 있는 바와 같이 표적 의존 MNA자임을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 실시양태는 기질로서도 작용하고, DF에 결합하여 그를 차단하는 작용도 하는, 이에 본원에서는 기질-차단제 올리고뉴클레오티드로서 언급되는 것인 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 복합체로부터 구동자 단편이 생성되는 것을 기술한다.
단지 비제한적인 일례로, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분일 수 있으며, 여기서, 제1 가닥은 MNA자임의 촉매 활성에 의해 변형(예컨대, 절단)될 수 있는 내부 루프부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 가닥은 헤어핀 루프부에 의해 연결될 수 있으며, 여기서, 한 가닥의 5' 말단은 나머지 다른 가닥의 3' 말단에 연결된다. 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화되지 않는다. 올리고뉴클레오티드 복합체는 루프부 외부에 있고, 반대쪽 가닥의 일부에 하이브리드화하는 1 이상의 구동자 단편을 포함한다. 예를 들어, 구동자 단편은 상기 복합체의 제2 가닥의 성분일 수 있다. 표적의 존재하에서, MNA자임은 조립될 수 있고, 루프부를 절단함으로써 또 다른 엔티티(예컨대, EAS)와 하이브리드화할 수 있는 단일 가닥 구동자 단편을 유리시키는 방식으로 상기 복합체를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 루프의 절단을 통해 복합체로부터 루프의 일부가 제거될 수 있고, 이로써 앞서 구동자 단편에 하이브리드화된 이중 가닥 복합체의 일부가 제거될 수 있다. 표적에 의존하는 방식으로 생성된 구동자 단편이 증폭 캐스케이드를 일으킬 수 있다.
별법으로, MNA자임 기질은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분일 수 있으며, 여기서, 제1 및 제2 가닥은 한 가닥의 5' 말단이 나머지 다른 가닥의 3' 말단에 결합함으로써 헤어핀 루프부에 의해 연결된다. 표적의 존재하에서 조립시에 MNA자임의 촉매 활성에 의해 헤어핀 루프부가 변형(예컨대, 절단)될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합체는 반대쪽 가닥의 일부에 하이브리드화하는, 헤어핀부 외에 있는 1 이상의 구동자 단편을 포함한다. 표적의 존재하에서, MNA자임은 조립될 수 있고, 헤어핀 루프부를 절단함으로써 또 다른 엔티티(예컨대, EAS)와 하이브리드화할 수 있는 단일 가닥 구동자 단편을 제공하는 방식으로 상기 복합체를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 헤어핀 루프의 절단을 통해 복합체로부터 루프의 일부가 유리될 수 있고, 이로써 앞서 구동자 단편에 하이브리드화된 이중 가닥 복합체의 일부가 제거될 수 있다. 표적에 의존하는 방식으로 생성된 구동자 단편이 증폭 캐스케이드를 일으킬 수 있다.
구동자 단편이 제한 효소 절단에 의해 생성될 수 있다는 것 또한 고려된다. 예를 들어, 이중 가닥 게놈 DNA 주형의 한 가닥 또는 양쪽 가닥 모두가 절단되면 특이 단편이 생성될 수 있는데, 이 단편은 해리될 수 있고, PESA에 결합하여 CESA를 형성하고, 이에 따라 EzyAmp 캐스케이드 반응을 일으킬 수 있는 개시 구동자 단편으로서의 역할을 하는데, 여기서, 상기 EzyAmp 캐스케이드 반응은 일단 개시되고 나면, 오직 게놈 DNA로부터 유도된 개시 구동자 단편의 존재 여부에만 의존한다기 보다는, CESA의 절단에 의해 생성된 새로운 구동자 단편에 따라 달라질 것이다. 메틸화에 감수성인 RE는 표적 DNA에서 시토신 잔기를 메틸화하는 데 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 구동자 단편은 미스매치 이종이중체 서열 또는 DNA/RNA 이중체 서열을 인식하고 절단하는 효소 또는 화학물질을 사용하여 생성될 수 있다는 것이 고려된다. 미스매치는 검사되는 서열과 관련된 천연 미스매치일 수 있고, 예를 들어, 후천성 돌연변이 또는 유전 SNP일 수 있다.
개시 구동자 단편은 또한 예를 들어, 불용성 지지체에 테더링된 SIO를 비롯한, 표적과 복합체를 형성하고 있는 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)의 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트에 포함된 구동자 단편은 CESA 복합체의 뉴클레아제 분해에 의해 생성될 수 있다. 뉴클레아제는 제한 효소, 엑소뉴클레아제, 또는 엔도뉴클레아제일 수 있다. 임의의 적합한 제한 효소, 엑소뉴클레아제, 또는 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 제한 효소이다. 제한 효소는 1 이상의 닉을 포함하는 이중체 올리고뉴클레오티드를 인식하고 절단할 수 있다. 닉 또는 닉들은 제한 효소의 인식 부위 내부에 또는 외부에 존재할 수 있다. 닉 또는 닉들은 제한 효소의 절단 부위 내부에 또는 외부에 존재할 수 있다. 비록 임의의 제한 효소가 잠재적으로 사용될 수 있지만, 적합한 제한 효소의 비제한적인 예로는 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I, 및 표 2 및 표 3에 제시되어 있는 제한 효소 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이다. 임의의 특정 유형의 엔도뉴클레아제로 제한하지 않으면서, 적합한 예로는 T7 엔도뉴클레아제 I, 멍빈 뉴클레아제, RN아제 H, 플랩 뉴클레아제, 및 MNA자임을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제이고, 그의 비제한적인 예로는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 T를 포함한다.
1.4 합성 개시제 올리고( SIO )
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 합성 개시제 올리고(SIO)를 포함할 수 있다. SIO는 시료에 첨가됨으로써 SIO와, 시료 중에 존재하는 표적 핵산 사이의 이중체 형성을 유도하는 올리고뉴클레오티드이다. SIO/표적 이중체의 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의, 뉴클레아제에 의한 절단을 사용하여 구동자 단편으로서 작용할 수 있는 핵산 단편을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 구동자 단편은 미스매치 이종이중체 서열 또는 DNA/RNA 이중체 서열을 인식하고 절단하는 효소 또는 화학물질을 사용하여 생성될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 실시양태에서, SIO는 요구되지 않을 것이다. 미스매치는 검사되는 서열과 관련된 천연 미스매치일 수 있고, 예를 들어, 후천성 돌연변이 또는 유전 SNP일 수 있다. 돌연변이 또는 SNP가 존재하는 곳 이외의 다른 지점에서 서열을 절단하는 것이 바람직하다면, 이때, 합성 개시제 올리고(SIO)는 시료에 첨가될 수 있고, 이로써 생물학적 시료 중에 존재하는 핵산의 특이 부위에서의 절단을 유도할 수 있다. SIO는 표적 생물학적 주형과 비교하여 하나 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 별법으로, SIO는 예를 들어, DNA 서열에 결합하는 RNA/DNA 키메라 올리고일 수 있으며, 이로써 상기 하이브리드 서열을 인식하는 효소를 사용하는 절단에 대한 부위를 제공할 수 있는 짧은 RNA/DNA 이중체가 형성된다.
추가의 실시양태에서, 구동자 단편은, 생물학적 표본을 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 가진 효소 및 SIO와 인큐베이션시켜 상기 효소가 더 큰 단편을 분해하여 구동자 단편을 형성하도록 함으로써 생성될 수 있다. 상기 방법에서 사용될 수 있는 효소에 관한 비제한적인 예는 (하기) 표 2에 열거되어 있다. 일부 효소는 2단계 프로토콜을 필요로 할 수 있지만, 다른 효소는 단일 단계 반응에 따라 쉽게 진행될 수 있다. 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 가진 효소 및 DNA 및/또는 RNA로 구성된 매치된 또는 미스매치된 SIO를 사용하여 구동자 단편을 생성시키는 데 다수의 다른 효소가 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
예시적인 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제의 사용 기전은 도 8-11을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 8은 E. 콜라이로부터 유래된 엑소뉴클레아제 I의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 구동자 단편을 생성하는 2가지 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체로부터 3' 단일 가닥 오버행을 가수분해한다. 표적 DNA를 함유하는 시료에 합성 개시제 올리고(SIO)를 첨가하여 구동자 단편 생성을 촉진시킨다. 우측 패널에서, DF는 SIO의 절단으로부터 유도되고, 부분 표적 단편은 온전하게 그대로 유지되고, 재순환을 통해 추가의 DF를 생성하는 데 이용될 수 있다. 좌측 패널에서, DF는 표적의 절단으로부터 유도된다. 엑소뉴클레아제 I에 의한 PESA 복합체의 절단을 막기 위해 상기 복합체의 3' 오버행 신장부 내로 포스포로티오에이트 염기가 포함될 수 있다. 일단 DF가 생성되고 나면, 이는 PESA에 하이브리드화하여 그를 CESA 복합체로 전환시킨다.
도 9는 멍빈 뉴클레아제의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 DF를 생성하는 2가지 기전을 도시한 것이다. 상기 엔도뉴클레아제는 블런트 말단은 남겨 두면서, DNA 이중체로부터 단일 가닥 오버행을 3' 또는 5' 방향으로부터 분해한다. 표적 DNA를 함유하는 시료에 합성 개시제 올리고(SIO)를 첨가하여 구동자 단편 생성을 촉진시킨다. 우측 패널에서, DF는 SIO의 절단으로부터 유도되는 반면, 좌측 패널에서, 구동자 단편은 표적으로부터 유도된다. 뉴클레아제에 의한 PESA 또는 CESA 분해를 막기 위해 좌측(L) 또는 우측(R)에 제시된 반응이 2단계(1 및 2)로 수행될 수 있다. 이는 물리적인 분리에 의해 달성될 수 있다. 일단 DF가 생성되고 나면, 이는 PESA에 하이브리드화하여 그를 CESA 복합체로 전환시킨다.
도 10은 엑소뉴클레아제 III의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 DF를 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체의 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거한다. 효소는 블런트 또는 오목형 3' 말단 상에서는 활성을 띠지만, 단일 가닥 DNA 상에서는 활성을 띠지 않는 바, 이에 3' 돌출 말단을 절단하지 않을 것이다. 효소는 또한 이중체 DNA 중 닉으로부터의 가수분해를 개시함으로써 단일 가닥 갭을 생성할 수 있다. 성분 올리고뉴클레오티드 상에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 존재하면, 상기 엑소뉴클레아제 활성은 차단된다. 표적 DNA를 함유하는 시료에 SIO를 첨가하여 DF 생성을 촉진시킨다. SIO 내로 포함된 포스포로티오에이트가, DF 단편이 PESA 또는 CESA와 하이브리드화하였을 때 형성된 닉에서의 절단을 막는다. DF는 SIO로부터 유도되고, 표적은 재순환되어 추가의 DF를 생성할 수 있다. 상기 실시양태에서, SIO는 표적과 이중체를 형성하는 표적 특이 영역 및 범용 비표적 결합 영역을 포함할 수 있다. 엑소뉴클레아제 III에 의한, 표적 특이 영역의 절단을 통해 범용 PESA에 결합하여 범용 CESA를 형성할 수 있는 (SIO의 비표적 결합 영역에 상응하는) 범용 구동자 단편이 생성될 수 있다.
도 11은 T7 엑소뉴클레아제의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 DF를 생성하는 기전을 도시한 것이다. 상기 효소는 DNA 이중체 또는 DNA/RNA 이중체으로부터 특히 인산화된 5' 말단에서 5' 방향으로 뉴클레오티드를 제거한다. 5' 포스페이트를 포함하지 않는 다른 5' 말단에 대한 활성은 인산화된 기질의 존재하에서 크게 감소된다. 표적 DNA 또는 RNA를 함유하는 시료에 SIO를 첨가하여 DF 생성을 촉진시킨다. DF는 합성 개시제 올리고(SIO)로부터 유도되고, RNA 또는 DNA 표적은 재순환되어 추가의 DF를 생성할 수 있다. PESA는 DNA로 구성되지만, T7 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위해 이중체의 5' 말단에 일부 이중체 RAN를 가질 수 있다(점선으로 된 박스 표시). 상기 실시양태에서, SIO는 표적과 이중체를 형성하는 표적 특이 영역 및 범용 비표적 결합 영역을 포함할 수 있다. T7 엑소뉴클레아제에 의한, 표적 특이 영역의 절단을 통해 범용 PESA에 결합하여 범용 CESA를 형성할 수 있는 (SIO의 비표적 결합 영역에 상응하는) 범용 구동자 단편이 생성될 수 있다.
추가로, SIO는 별법으로 또는 부가적으로, 엔티티, 예컨대, 표지된 핵산, 나노입자, 마이크로입자, 단백질, 항체, RNA, DNA, 핵산 유사체, 단백질, 당단백질, 지단백질, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 압타머, 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 금 나노입자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 키트는 불용성 지지체에 테더링된 SIO를 포함한다.
특정 실시양태에서, SIO는 헤어핀 입체구조로 제공될 수 있다. 비제한적인 일례로, SIO는 올리고의 부분들 간의 서열 상보성으로부터 발생되어 분자내 결합을 형성하는 이중 가닥 줄기부 및 그 내부의 염기는 상보적이지 않은 것인, 상기 줄기부의 한쪽 말단에 위치하는 헤어핀 루프부를 포함할 수 있다. 헤어핀 SIO는 5' 또는 3' 말단의 줄기부로부터 신장되어 단일 가닥 서열로 된 5' 또는 3' 오버행을 형성하는 가외 서열을 가질 수 있다. 헤어핀 SOI는 또 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, DF에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 도 23은 헤어핀 SIO의 비제한적인 예를 제공한다.
1.5 완전 효소 신호 증폭제 ( CESA ) 복합체 및 부분 효소 신호 증폭제 ( PESA ) 복합체
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체 및/또는 하나 이상의 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 포함할 수 있다.
완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체는 전형적으로 2개의 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드(예컨대, 제1 효소 증폭제 기질(EAS1) 올리고 및 제2 효소 증폭제 기질(EAS2) 올리고) 및 구동자 단편을 포함한다. EAS1은 전형적으로 이중체의 한 가닥을 포함하는데, 이중 가닥일 경우, 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함한다. 뉴클레아제는 예를 들어, 제한 효소, 엑소뉴클레아제, 또는 엔도뉴클레아제일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, EAS1은 이중체의 한 가닥을 포함하는데, 이중 가닥일 경우, 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위로 된 한 가닥을 포함한다.
예시적인 CESA 복합체가 도 14 및 15에 제공되어 있다. CESA 복합체의 한 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 상기 복합체의 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이고, 상기 EAS 올리고뉴클레오티드 중 하나의 적어도 일부 또한 1 이상의 DF의 적어도 일부에 상보적이다. 상기 언급된 바와 같이, CESA 복합체는 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함한다. DF는 비록 반드시 그러할 필요는 없지만, 하나 이상의 뉴클레오티드를 인식 서열 및/또는 뉴클레아제 절단 서열에 제공할 수 있다.
DF가 2개의 EAS 올리고에 의해 형성된 부분 인식 서열 및/또는 부분 효소 절단 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드를 제공하면, DF가 PESA 복합체에 결합하여 CESA 복합체를 형성하게 될 때, 뉴클레아제에 의해 매개되는 절단을 위한 촉발제를 제공한다. DF가 하나 이상의 뉴클레오티드를 인식 서열 및/또는 절단 서열에 제공하는 것인 실시양태에서, DF는 임의 개수의 뉴클레오티드, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 5개 초과의 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 별법으로, DF는 5개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만의 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. DF에 의해 제공된 뉴클레오티드는 예를 들어, 2개의 EAS 올리고에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 서열 또는 부분 뉴클레아제 절단 서열의 5' 바로 옆에 또는 3' 바로 옆에 위치할 수 있다. 별법으로, DF에 의해 제공된 뉴클레오티드는 2개의 EAS 올리고에 의해 형성된 완전 뉴클레아제 인식 서열 또는 완전 뉴클레아제 절단 서열로부터 5' 또는 3'쪽으로 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 5개 초과의 뉴클레오티드만큼의 거리에 위치할 수 있다.
대체 실시양태에서, DF는 어떤 뉴클레오티드도 CESA 복합체의 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서의 실시예 5에서 제공된 실험 데이터를 통해 확인되는 바와 같이, 이미 완전 뉴클레아제 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 PESA에의 DF 결합은 CESA 복합체 절단시에 발생되는 신호를 증진시킬 수 있다.
CESA 복합체의 절단은 전형적으로 특이 이벤트를 나타내는 검출가능한 신호를 발생시키는 데 사용된다. 도 3 및 5를 참조하면, 제1 효소 증폭제 기질 올리고(EAS1)는 검출가능한 부분(F) 및 소광제 부분(Q), 둘 모두를 포함한다. 제2 효소 증폭제 기질 올리고(EAS2) 또한 소광제 부분(Q)을 포함한다. 소광제 부분은, CESA가 제한 효소 또는 다른 뉴클레아제에 의해 절단될 때까지 제1 EAS1의 검출가능한 부분으로부터 발생되는 검출가능한 신호를 감소시키거나 제거하도록 적합화된다. 예를 들어, 소광제 부분은 "블랙 홀 소광제 1"(BHQ1) 또는 "블랙 홀 소광제 2"(BHQ2)를 포함할 수 있다. 상기 프로토콜에서 임의의 적합한 형광단-소광제 염료 쌍이 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가로, CESA 복합체의 하나 이상의 EAS 올리고(예컨대, EAS1)는 별법으로 또는 부가적으로, 엔티티, 예컨대, 표지된 핵산, 나노입자, 마이크로입자, 단백질, 항체, RNA, DNA, 핵산 유사체, 단백질, 당단백질, 지단백질, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 압타머 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 금 나노입자일 수 있다.
뉴클레아제에 의해 CESA가 절단되면, 그 결과로서 검출가능한 결과가 발생되며, 그러므로, 결과의 규모 및/또는 속도가 시료 중 표적의 양을 나타낼 수 있다. 검출가능한 결과는 형광 분광법, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법, 원편광 이색법, 면역검정법, 크로마토그래피, 방사선 측정법, 광도 측정법, 섬광조영술, 전자 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광법, 효소법 또는 그의 임의 조합을 비롯한, 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, CESA 복합체의 한 EAS 올리고는 제한 효소 인식 서열 부분 및/또는 제한 효소 절단 서열 부분을 포함하는, 이중체의 한 가닥을 포함한다. 도 1, 2, 및 3을 참조하면, 제1 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고 EAS1 및 EAS2는 그의 길이의 적어도 일부에 걸쳐 상보적이고, 이로써, 제1 및 제2 EAS 올리고의 상보적인 부분은 하이브리드화하여 부분적으로 이중 가닥 제한 효소 인식 서열 및/또는 제한 효소 절단 서열을 형성할 수 있다. 도 4 및 5를 참조하면, 제2 EAS(EAS2)는, EAS1에의 결합시에 EAS1에 위치하는 검출가능한 부분을 소광시킬 수 있는 소광제 부분을 포함할 수 있다. 별법으로, EAS2는 검출가능한 부분을 포함할 수 있는데, 그의 형광은 EAS1에 위치하는 소광제 부분에 의해 소광된다. EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 형성된 복합체를 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체로 지칭한다.
PESA 복합체는 한 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 복합체 중 또 다른 EAS 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 것인, 2 이상의 효소 증폭제 기질(EAS) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중 올리고뉴클레오티드 복합체이다. 추가로, 상기 EAS 올리고뉴클레오티드 중 하나의 적어도 일부는 또한 1 이상의 DF의 적어도 일부에 상보적이다. DF에 하이브리드화할 수 있는 능력을 가짐에도 불구하고, DF는 PESA 복합체에 하이브리드화되지 않고, 따라서, PESA 복합체의 성분이 아니다. PESA 복합체는 효소에 대한 적어도 부분 인식 서열/부위 및/또는 적어도 부분 절단 서열/부위를 포함하고, 효소에 대한 전체 인식 서열/부위 및/또는 전체 절단 서열/부위를 포함할 수 있다. 예시적인 PESA가 도 1C, 3C, 4, 5B, 7A, 7B, 8 (좌측 및 우측 패널, 둘 모두), 14C, 17A, 18A, 19A, 20 및 22에 도시되어 있다.
MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단에 의해, 또는 단백질 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제를 비롯한 다른 뉴클레아제에 의한 SIO/표적 이중체의 절단에 의해 생성된 구동자 단편(DF)은 제한 효소 인식 서열(도 2에서 해칭 박스로 표시)을 완성하는 데 요구될 수 있고/거나, 제한 효소에 의한 절단에 필요한 제한 효소 인식 서열에 인접한 위치에 추가 서열을 제공할 수 있다. 도 2를 참조하면, 절단 부위(들)는 실선으로 그려진 검은색 수직 화살표로 표시되어 있다. 구동자 단편의 적어도 일부는 제1 효소 증폭제 기질 올리고 EAS1의 적어도 일부에 상보적이다. 도 1, 2, 및 3을 참조하면, 구동자 단편 및 제1 EAS1은 그의 길이의 적어도 일부에 걸쳐 상보적이고, 이로써, 구동자 단편 및 제1 효소 증폭제 기질 올리고의 상보적인 부분은 예를 들어, 하이브리드화에 의해 조립됨으로써 완전 또는 부분 제한 효소 인식을 포함하는 이중 가닥 서열을 형성할 수 있다. CESA 내로 포함된 완전 또는 부분 이중 가닥 제한 효소 절단 서열 또한 상기 방식으로 형성될 수 있다. EAS1, EAS2 및 DF의 하이브리드화에 의해 조립된 CESA는 RE에 의한 인식 및 절단, 둘 모두에 필요한 모든 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 적절한 RE에 의한 CESA의 절단을 통해 검출가능한 부분 및 소광제 부분 사이의 제1 효소 증폭제 기질 올리고 EAS1이 절단되고, 이로써 상기 두 부분은 분리됨으로써, 소광제 부분이 검출가능한 부분의 국소 환경으로부터 원거리로 이격화되거나, 또는 그로부터 효과적으로 제거됨에 따라 검출가능한 신호가 나타나거나, 증가할 수 있다. 다른 실시양태에서, CESA가 절단되면 추가 PESA에 하이브리드화하여 추가 CESA를 형성할 수 있는 새로운 구동자 단편이 생성될 수 있다(예컨대, 도 7, 17A, 18A, 19A, 20, 및 22). 추가 CESA는 같은 RE 또는 상이한 RE를 사용함으로써 쉽게 절단될 수 있다.
도 2 및 15를 참조하면, 일부 실시양태에서, 전체적으로 조립된 CESA는 상이한 디자인을 가질 수 있다. DF(중심부가 흰색으로 된 검은색 선)는 제한 효소의 인식 서열을 완성하는 데 요구될 수 있고/거나, 제한 효소에 의한 절단에 필요한 제한 효소 인식 부위에 인접한 위치에 추가 서열을 제공할 수 있다. 제한 효소에 의한 절단을 통해 5' 오버행, 3' 오버행이 형성될 수 있거나, 또는 블런트 말단이 생성될 수 있다. 제한 효소는 EAS1, EAS2 및 DF의 이중 가닥 조립형 복합체의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단할 수 있다. EAS2 및 DF가 인접해 있는 위치는 RE가 일반적으로 연속 이중 가닥 이중체를 절단하는 곳인 위치할 수 있거나, 제한 효소에 의한 인식 및 절단에 필요한 서열이 있는 다른 위치일 수 있다. EAS2와 인접해 있는 DF의 말단은 이전 단계에서 보다 긴 장쇄의 분자의 절단으로부터 생성되어야 한다. 예를 들어, 구동자 단편이 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단에 의해 5' 및 3' 단편으로 생성된다면, 이때, 인접해 있는 말단은 절단된 MNA자임 기질의 3' 단편의 5' 말단 또는 5' 단편의 3' 말단이어야 한다. 또 다른 예에서, 구동자 단편이 엑소뉴클레아제 III(도 10)에 의한 SIO의 절단에 의해 5' 단편으로 생성된다면, 이때, 인접해 있는 말단은 상기 5' 단편이 3' 말단이어야 한다.
도 1B를 참조하면, "효소 억제 복합체" 또는 "EIC"는 EAS1, EAS2 및 억제 단편(InF)을 포함할 수 있는 다중 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 복합체이다. EIC는 다중 올리고 상에 존재하는 효소 인식 부위 및 절단 부위에 대한 서열을 포함할 뿐만 아니라, 제한 효소 또는 다른 뉴클레아제에 의한 절단을 유발하는 추가 서열도 포함한다.
EIC가 PESA 및 InF를 포함하는 실시양태에서, PESA가 CESA로 전환되기 위해서는 억제 단편(InF)가 절단되어야 하고, 이로써, CESA를 완성하는 구동자 단편(DF)으로서 작용할 수 있는 보다 소형의 단편이 생성되어야 한다. InF의 절단은 여러 가지 수단에 의해 달성될 수 있다. InF는, 표적 피분석물의 존재하에서 조립되고, InF/MNA자임 기질을 절단하여 DF를 생성하는 것인 MNA자임에 대한 기질일 수 있다. 별법으로, InF는, 표적 서열과 하이브리드화하여 단백질 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 이중체를 형성하는 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)일 수 있으며, 이로써 InF/표적 복합체의 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 염기의 절단을 통해 DF가 생성되고, 이는 CESA를 완성하게 된다.
특정 실시양태에서, PESA 복합체 및 CESA 복합체는 헤어핀 구조 형태로 제공된다. 비제한적일 일례로, PESA 복합체는 복합체 중 각 EAS 올리고의 적어도 일부들 간의 서열 상보성으로부터 발생되는 이중 가닥 줄기부 및 그 내부의 루프 염기는 상보적이지 않은 것인, 상기 줄기부의 한쪽 말단에 위치하는 헤어핀 루프부를 포함할 수 있다. 헤어핀 PESA 복합체는 5' 또는 3' 말단의 줄기부로부터 신장되어 단일 가닥 서열로 된 5' 또는 3' 오버행을 형성하는 가외 서열을 가질 수 있다. 헤어핀 PESA 복합체는 또 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, DF에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 헤어핀 CESA 복합체는 DF가 헤어핀 PESA 복합체에 결합할 때 형성될 수 있다. 도 18은 헤어핀 PESA 복합체 및 헤어핀 CESA 복합체의 비제한적인 예를 제공한다.
CESA 복합체를 형성할 수 있는 잠재능을 가지는 PESA 복합체는 다중 복합체 사이의 성분, 예컨대, 구동자 단편을 국소화하고, 그의 전달을 개선시키기 위해 합성 구조체로 포함될 수 있다. 도 22는 PESA 복합체를 분지형 구조체에 포함시킴으로써 EzyAmp 성분을 국소화시키는 방법의 일례를 도시한 것이다. 골격 올리고뉴클레오티드, EAS1, EAS2, EAS3, 및 EAS4를 포함하는 제1 복합체가 제공된다. 골격 올리고뉴클레오티드는 EAS1, EAS3, 및 EAS1 및 EAS3을 분리시키는 개재부를 포함한다. EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고(EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 하이브리드화), EAS2의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함한다. EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고(EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 하이브리드화), EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, EAS3 또는 EAS4의 일부는 제2 DF를 포함한다. 제1 복합체는 C 형상을 취하며, EAS1 및 EAS3을 분리시키는 개재부는 상보적인 서열을 포함하는 제2 복합체의 상응하는 부분과의 하이브리드화를 위해 위치한다. 도 22의 패널 B에 제시되어 있는 바와 같이, 이로써 4개의 별개의 PESA 복합체를 포함하는 이중 복합체가 형성될 수 있다. 도 22D에 도시되어 있는 바와 같이, 각각의 단일 또는 이중 복합체의 하나 이상의 아암은 임의의 적합한 시약(예컨대, 비오틴/아비딘, 화학적 시약, 항체, 펩티드 링커 등)을 사용하여 또 다른 단일 또는 이중 복합체의 하나 이상의 아암과 연결될 수 있다. 다양한 PESA 복합체가 서로 근접한 위치에 오도록 이동시키면, CESA 복합체의 형성 및 절단시, 다양한 PESA 복합체 간에 구동자 단편을 효율적으로 전달할 수 있게 된다.
1.6 올리고뉴클레오티드
구동자 단편, 억제제 단편, 합성 개시제 올리고뉴클레오티드 및 효소 증폭제 기질은 올리고뉴클레오티드이고, 이는 당업자에게 주지된, 하나 이상의 치환, 예컨대, 유사체(예컨대, 표 1에 열거되어 있는 것), 유도체, 변형된 또는 변경된 염기, 리보뉴클레오티드, 당 또는 포스페이트 골격의 변경, 다양한 결실, 삽입, 치환, 중복 또는 다른 변형, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 변형, 치환, 결실, 삽입 등은, 단, 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 그의 기능을 보유하는 한, 올리고뉴클레오티드 중의 임의 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 치환 및 변형은 내성이 우수할 수 있고, 그를 통해 분자는 특정 조건하에서 작용할 수 있도록, 또는 완전 효소 신호 증폭제 복합체를 포함하는 반응의 효율을 개선시킬 수 있도록 그에 맞게 조정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함함으로써 효소 증폭제 기질 또는 구동자 단편을 변형시키면, 불안정성이 보다 큰 완전 효소 신호 증폭제 복합체의 조립이 촉진될 수 있고, 이로써, 예를 들어, 뉴클레아제에 의한 완전 효소 신호 증폭제 복합체의 절단 효율은 개선될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 구동자 단편, 합성 개시제 올리고뉴클레오티드, 억제 단편, 기질, 압타머, 및 효소 증폭제 기질 올리고는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 주로 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하고, 더욱더 바람직하게는, 오직 데옥시리보뉴클레오티드만을 포함한다.
1.7 제한 효소
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 제한 효소, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물, 방법 및 키트에 유용한 제한 효소는 I형, II형, III형 또는 IV형 제한 효소일 수 있다. 제한 효소는 일반적으로 서브유니트 조성, 절단 위치, 서열 특이성 및 보조인자 요건에 기초하여 상기 유형으로 분류된다(표 2 참조).
제한 효소 유형
유형 특성
I형 · 복합 다중 서브유니트 효소.
· 그의 인식 서열로부터 원거리에 있는 위치에서 무작위로 DNA를 절단한다.
。예컨대, Eco606ORF4215P (TGANNNNNNNNTGCT).
II형 · 그의 인식 서열로부터 가까운 거리의 또는 그 안에 있는 정의된 위치에서 DNA 절단함으로써 별개의 제한 단편, 예컨대, HhaI , HindIII , NotI를 생성한다.
· 절단을 통해 3'-히드록실 및 5'-포스페이트를 생성한다.
· 활성을 위해서는 오직 마그네슘만이 요구된다.
· 구조 & 인식 서열.
。 다수는 앞뒤역순상동 서열을 인식하는 동종이량체이다.
。 일부는 비대칭 DNA 서열을 인식하는 이종이량체이다
(예컨대, Bbv CI: CCTCAGC).
。 일부는 연속 서열을 인식한다(예컨대, EcoR I: GAATTC).
。 다른 나머지는, 절반부가 분리되어 있는 것인 불연속 서열을 인식한다(예컨대, Bgl I: GCCNNNNNGGC).
IIS형 · 그의 인식 서열로부터 가까운 거리에 있는 정의된 위치에서 절단함으로써 별개의 제한 단편을 생성한다.
。연속이고 비대칭인 서열을 인식하고, 그의 인식 서열 바깥쪽을 절단한다(예컨대, Fok I 및 Alw I).
。 DNA 결합 및 DNA 절단을 위한 2개의 별개의 도메인을 포함한다.
。 일반적으로, 단량체로서 결합하지만, 이량체화를 통해 협력하여 절단하는 것으로 간주된다.
IIG형 · 두 효소 활성이 같은 단백질 쇄에 있는 것인, 대형 조합 제한-및-변형 효소.
· 그의 인식 서열 바깥쪽을 절단하다.
。 일부는 연속 서열을 인식하고(예컨대, Acu I: CTGAAG), 오직 한쪽에서만 절단한다(닉 형성).
。 일부는 불연속 서열을 인식하고예컨대, Beg I: CGANNNNNNTGC), 양측 모두를 절단한다(이로써, 인식 부위를 포함하는 소형 단편이 유리된다).
· 그의 기질에 결합하였을 때, DNA를 절단하는 제한 모드로 전환되거나, DNA를 메틸화시키는 변형 모드로 전환된다.
III형 · 대형 조합 제한-및-변형 효소.
。 그의 인식 서열의 바깥쪽을 절단하고, 그의 인식 서열의 바깥쪽을 절단하기 위해 같은 DNA 분자 내에 반대 배향으로 2개의 상기 서열을 필요로 한다.
IV형 · 효소가 변형된, 전형적으로는 메탈화된 DNA를 인식하고, 그의 예로는 E. 콜라이의 McrBC 및 Mrr 시스템이 있다.
표 2에 열거된 제한 효소는 단지 예시 목적으로 제공된 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제공하는 것은 아니다. 매우 광범위한 제한 효소가 CESA 및 EzyAmp 반응 개발에 화합성일 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 제한 효소 데이터베이스인 REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)에 열거되어 있는 다수의 제한 효소가 CESA 및 EzyAmp 반응 개발에 화합성일 것이다. 하기 표 3은 본 발명에서 특이성 및 특징이 다양화된 제한 효소의 예를 제공한다.
[표 3]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

추가로, 단지 일례로서, Mnl I는 EzyAmp 반응에 사용하는 데 특히 유용한 효소이다. Mnl I는 4개의 뉴클레오티드 이중 가닥 인식 서열을 필요로 한다. 절단 부위는 RERS로부터 원거리에 위치하고, 효소는 개입 공간에 어떤 특이 서열도 필요로 하지 않는다. DNA의 각 가닥은 부분 인식 서열을 제공하며, 이는 그의 보체와의 하이브리드화를 통해 완전 이중 가닥 인식 서열을 제공하여야 한다. 인식 서열, 개입 서열 및 절단 부위는 하기와 같이 도시될 수 있다(여기서, N은 임의의 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있고, "/"는 절단 부위를 나타낸다:
Figure pct00004
이중 가닥 서열의 한 가닥이 비연속인 경우(즉, 인접한 데옥시리보뉴클레오티드가 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있지 않은 경우), DNA 이중체는 "닉"을 포함한다고 말할 수 있다. Mnl I의 정규 인식 서열은 어떤 닉도 포함하지 않는 연속된 이중 가닥 DNA로 되어 있다.
RERS 내의 상이한 위치에 닉을 포함하는 구조체, 및 미스매치된 뉴클레오티드, 티오기 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 구조체를 비롯한, 다양한 이중체 구조체를 절단할 수 있는 Mnl I의 능력에 관한 특징을 규명하기 위하여 광범위한 연구에 착수하였다. 상기 연구의 목적은 부분 Mnl I 인식 부위를 포함하는 다양한 PESA 및 DF를 디자인할 수 있도록 허용하는 유연성 수준을 측정하고자 하는 것이었다(하기 표 4). 다른 RE에서 수행된 상기와 같은 광범위한 특징 규명을 통해 EzyAmp 반응에서 다른 RE를 사용하는 것에 관한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
[표 4]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007

1.8. 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 효소
본 발명의 조성물 및 키트는 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 효소를 하나 이상 포함할 수 있다.
제한 효소 및 촉매성 핵산 효소 이외의, 핵산 서열을 절단할 수 있는 능력이 있는 다른 단백질 효소가 본원에 기술된 조성물, 방법 및 키트에 유용하다. 이들 효소 중 일부는 엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 이를 통해 단일 또는 이중 가닥 핵산의 말단으로부터 뉴클레오티드가 제거된다. 나머지 다른 효소는 엔도뉴클레아제 활성을 가지고, 이는 내부 결합에서 서열을 절단하고 이를 통해 보다 작은 소형 단편이 생성된다.
적합한 엑소뉴클레아제의 비제한적인 예로는 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I(E. 콜라이), 엑소뉴클레아제 III(E. 콜라이), T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 T, 및 뉴클레아제 BAL-31을 포함한다. 적합한 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예로는 T7 엔도뉴클레아제 I, RN아제 H, 플랩 뉴클레아제, 멍빈 뉴클레아제, 및 MNA자임을 포함한다.
적합한 뉴클레아제의 서브세트의 특성은 하기 표 5에 열거한다.
뉴클레아제 특성
효소 본 발멸에서 사용될 수 있는 잠재적인 활성의 예
ss - 단일 가닥; ds - 이중 가닥
뉴클레아제 BAL-31 본 엑소뉴클레아제는 이중체 DNA의 3' 및 5' 말단, 둘 모두를 분해한다. 이는 이중체 DNA 및 RNA의 닉, 갭 및 ss 영역에서 절단하는, 고도로 특이적인 ss 엔도뉴클레아제이다.
엑소뉴클레아제 I
(E. 콜라이)		 본 3'→5'엑소뉴클레아제는 ss DNA로부터 뉴클레오티드를 제거하고, 이로써, ds DNA로부터 ss 오버행을 절단하게 될 것이다.
멍빈 뉴클레아제 본 엔도뉴클레아제는 ds DNA 또는 ds RNA의 말단으로부터 ss 신장부(3'및 5')를 제거하고, 이로써, 블런트 말단이 남게 된다.
엑소뉴클레아제 III
(E. 콜라이) 		본 엑소뉴클레아제는 블런트 또는 오목형 3'-말단을 가지는 이중체 DNA의 3' 말단으로부터, 및 또는 이중체 DNA 중 닉에서 뉴클레오티드를 제거함으로써 ss 갭을 형성한다.
T7 엔도뉴클레아제 I 본 엔도뉴클레아제는 비완전하게 매칭된 DNA, 십자형 DNA 구조체, 홀리데이(Holliday) 구조 또는 접합부, 이종이중체 DNA를 절단하고, 닉이 있는 ds DNA는 보다 느리게 절단한다.
T7 엑소뉴클레아제 본 엑소뉴클레아제는 5'→ 3' 방향으로 이중체 DNA로부터 5' 뉴클레오티드를 제거한다. 이는 ds DNA의 갭 및 닉에서 5' 말단으로부터의 뉴클레오티드 제거를 개시할 수 있다. 이는 또한 5'→ 3' 방향으로 RNA/DNA 하이브리드로부터 RNA 및 DNA를 분해하는 것으로 보고된 바 있지만, 이는 ds 또는 ss RNA는 분해할 수 없다.
엑소뉴클레아제 T 본 엑소뉴클레아제는, 유리 3' 말단을 필요로 하고, 3'→5' 방향으로 뉴클레오티드를 제거하는 ss RNA 또는 ss DNA 특이 뉴클레아제이다. 이는 3' 신장부를 가지는 dsRNA 또는 ds DNA 분자로부터 블런트 말단을 형성할 수 있다.
플랩 엔도뉴클레아제 이는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 분기된 말단을 인식하고, 제1 중첩 염기 다음의 단일 가닥 5' 아암을 제거하고, 이로써, 두 올리고뉴클레오티드 사이에 3' 히드록실 닉이 남게 되는 것인, 구조 특이 5' 엔도뉴클레아제이다.
1.9 압타머
본 발명의 조성물 및 키트는 하나 이상의 압타머를 포함할 수 있다. 압타머는 그의 보다 고차원의 구조, 예를 들어, 3D 결합 도메인 또는 포켓에 기인하여 큰 친화도 및 특이성으로 하나 이상의 리간드를 인식할 수 있는 능력을 가진 핵산 또는 펩티드 서열이다. 예를 들어, 압타머는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소형 분자, 중합체, 금속 이온, 금속 염, 프리온 또는 그의 임의의 유도체, 일부 또는 조합, 또는 임의의 다른 엔티티에 결합할 수 있다
일부 실시양태에서, 압타머는 하나 이상의 리간드를 인식할 수 있는 능력을 가진 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 본원에서 바람직한 압타머는 단쇄의 단일 가닥 DNA, RNA 올리고머, 또는 펩티드일 수 있다. 이는 흡착, 회수, 및 재증폭으로 이루어진 반복 공정에 의해 합성 핵산으로 이루어진 복합체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 압타머는 소형 분자, 예컨대, 아미노산, 단백질에 대한 항생제 및 핵산 구조체 범위에 이르는 거의 모든 표적에 대하여 생성될 수 있다. 바람직하게, 압타머는 예를 들어, 상기 표 1과 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 DNA 또는 RNA 분자, 또는 그 둘의 조합을 포함할 수 있다.
압타머는 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 다른 성분(예컨대, MNA자임 성분)에 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
1.10 키트
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트는 본 발명을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 포함한다.
키트는 본 발명의 임의의 하나 이상의 조성물, 및/또는 본 발명의 조성물의 임의의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 키트는 MNA자임 성분을 포함하는 제1 용기, MNA자임 기질을 포함하는 제2 용기 및 PESA 성분을 포함하는 제3 용기 및 제한 효소를 포함하는 제4 용기를 포함할 수 있다. MNA자임의 자기 조립을 위해서는 테스트 시료 중에 존재하는 조립 촉진제 또는 표적이 회합되어야 한다. 따라서, 상기 실시양태에서, 키트 성분의 조합시, MNA자임은 테스트 시료 중에 존재하는 조립 촉진제 또는 표적의 존재하에서 조립되고, 기질을 절단하여 DF를 형성한다. 이어서, DF는 PESA 성분과 조립됨으로써 제한 효소에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 CESA를 생성한다.
다른 실시양태에서, 키트는 SIO를 포함하는 제1 용기, PESA 성분을 포함하는 제2 용기, 및 SIO와 표적 사이에 이중체가 형성될 때, 절단을 할 수 있는 뉴클레아제를 포함하는 제3 용기 및 제한 효소를 포함하는 제4 용기를 포함할 수 있다. 사용하는 동안, 테스트 시료 중에 존재하는 SIO 및 표적의 회합에 의해 이중체가 형성된다. 따라서, 상기 실시양태에서, 키트 성분의 조합시, SIO는 테스트 시료 중에 존재하는 표적의 존재하에서 이중체를 형성하고, 이중체가 형성되었을 때, 뉴클레아제는 절단함으로써 DF가 형성된다. 이어서, DF는 PESA 성분과 조립됨으로써 제한 효소에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 CESA를 생성한다.
전형적으로, 본 발명의 키트는 또한 예를 들어, 세척용 시약, 및/또는 본 발명의 방법을 수행하는 데 필요한 다른 시약을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
본 발명과 관련하여, 키트는 시약이 별도의 용기에 포함되어 있는 임의의 키트를 포함할 수 있고, 이는 소형 유리 용기, 플라스틱 용기, 또는 플라스틱 또는 종이 스트립을 포함할 수 있다. 상기 용기를 통해 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 시약을 효율적으로 전달할 수 있으며, 동시에 시료 및 시약의 상호 오염을 피할 수 있고, 각 용기의 시약 또는 용액을 정량적 방식으로 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 첨가할 필요도 없게 된다. 상기 키트는 또한 테스트 시료를 수용하는 용기, 검정에 사용되는 시약을 포함하는 용기, 세척용 시약을 포함하는 용기, 및 검출용 시약을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 또한 적절한 방법을 수행하기 위한 키트 성분의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 및 방법은 예를 들어, 실시간 PCR 기기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 자동 분석 장치 및 시스템과 함께 사용될 수 있다.
상이한 표적의 검출, 확인, 또는 정량화에 적용하기 위해, 본 발명의 단일 키트가 적용될 수 있거나, 또는 별법으로, 예를 들어, 각 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트가 필요할 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 임의의 엔티티를 검출, 확인 또는 정량화하는 것이 바람직한 상황하에서는 어느 경우에나 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
2. 검출 및 신호 증폭
본 발명은 1 이상의 표적을 검출, 확인, 및/또는 정량화하는 다양한 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 표적 검출로부터 발생되는 신호를 증폭시키는 다양한 방법을 제공한다.
본 방법은 상기 섹션 1에 기술되어 있는 것을 비롯한, 본 발명의 조성물 및 키트, 및 그의 성분을 사용함으로써 수행될 수 있다.
2.1 개시제 구동자 단편
본 발명의 방법에 따라 표적을 검출, 정량화 및/또는 증폭시키는 것은 전형적으로 하나 이상의 구동자 단편(DF)의 용도에 의존한다. 특히, 본 방법은 전형적으로 표적 분자 검출시에 생기는 개시 DF(이는 또한 본원에서 "개시제 DF"로서도 언급된다)의 생성에 의존한다. 일단 생성되고 나면, 개시제 DF는 예를 들어, PESA 복합체와 하이브리드화하여, 효소에 의해 인식 및 변형될 수 있는 CESA 복합체를 형성함으로써 신호 발생을 개시시킬 수 있다. 효소(예컨대, 뉴클레아제)에 의한 CESA 복합체의 변형(예컨대, 절단)을 통해 검출가능한 결과를 얻게 되고, 추가 PESA 복합체에 결합하여 신호 증폭을 촉진시킬 수 있는 추가의 DF가 유리될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 비록 일부 실시양태에서는 개시제 DF가 표적의 일부를 포함할 수 있고, 다른 실시양태에서는 개시제 DF가 표적일 수 있지만, 개시제 DF는 표적과는 별개의 것이다.
바람직한 실시양태에서, 비록 개시제 DF 생성이 제한 효소에 의한 표적의 효소적 절단을 포함할 수 있다는 가능성이 반드시 배제되는 것은 아니지만, 개시제 DF 생성이 제한 효소에 의한 표적의 효소적 절단을 포함하지는 않는다. 개시제 DF는 표적 특이 이벤트에 의해 생성될 수 있고, 이는 본 발명의 신호 검출 및 신호 증폭을 활성화시키는 촉발제로서의 역할을 한다. 일반적으로, 개시제 DF를 생성하는 것은 표적 분자를 본 발명의 올리고뉴클레오티드(예컨대, SIO, MNA자임 또는 PESA 복합체)에 결합시켜, 효소, 예컨대, 뉴클레아제에 의해 변형될 수 있는 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 예를 들어, 표적이 올리고뉴클레오티드에 결합함으로써 부분 효소 인식 및/또는 절단 부위가 완성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적이 결합하는 올리고뉴클레오티드는 DF를 포함하고, 그렇게 형성된 복합체의 효소적 변형은 올리고뉴클레오티드로부터 개시제 DF를 유리시키는 역할을 한다(예를 들어, 도 8B, 9B, 10, 11 및 23 참조). 다른 실시양태에서, 표적이 올리고뉴클레오티드에 결합함으로써 표적의 효소적 변형은 촉진되고, 이로써 표적으로부터 직접 개시제 DF가 형성된다(예를 들어, 도 8A 및 9A 참조). 추가의 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적에의 결합시, 촉매적으로 활성을 띠게 되고, 하나 이상의 기질을 변형시켜 DF를 형성한다(예를 들어, 도 5, 13, 19 및 24 참조).
단지 비제한적인 일례로, 개시제 DF는 상기 서브섹션 1.3에 기술되어 있는 바와 같이, MNA자임에 의한 기질의 절단 또는 결찰에 의해 생성될 수 있다. 기질은 기질-차단제 올리고뉴클레오티드일 수 있다(서브섹션 1.3, 도 19 및 24B, 24C, 24D 및 실시예 9 및 14 참조).
다른 실시양태에서, 개시제 DF는 표적(예컨대, 게놈 DNA)의 제한 효소 절단에 의해, 표적과 복합체를 형성하고 있는 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)의 절단에 의해(예를 들어, 상기 서브섹션 1.4, 도 8-11 및 도 23 참조), 또는 미스매치 이종이중체 서열 또는 DNA/RNA 이중체 서열을 인식하고 절단하는 효소 또는 화학물질을 사용함으로써 생성될 수 있다. 미스매치는 검사되는 서열과 관련된 천연 미스매치일 수 있고, 이는 예를 들어, 후천성 돌연변이 또는 유전 SNP일 수 있다.
상기 언급된 개시제 구동자 단편을 생성하는 방법은 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 다른 적합한 방법 또한 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
2.2 표적 검출
본 발명의 방법은 표적의 존재를 나타내는 신호를 제공하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 개시제 DF의 생성을 통해 검출가능한 결과를 얻을 수 있다. 상기 서브섹션 2.1에서 언급된 바와 같이, 개시제 DF는 표적이 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 결합됨으로써 형성된 복합체의 효소적 변형(예컨대, 절단)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 형광단 및 소광제 모이어티로 표지된 SIO에 표적이 결합하게 되면, 상기 모이어티를 분리시키는 방식으로 SIO의 효소적 변형은 촉진되고, 이로써, 개시제 DF가 유리되는 동안 검출가능한 결과를 얻을 수 있다(예를 들어, 도 23 참조). 추가로 또는 별법으로, 올리고뉴클레오티드/표적 복합체의 효소적 변형으로부터 생성되는 생성물의 크기 및 서열에 기초하여 검출되고, 잠재적으로 정량화될 수 있다.
2.2.1 선형 캐스케이드
바람직한 실시양태에서, 표적 인식 이벤트시에 생성된 개시제 DF는 PESA 복합체의 완성을 통해 CESA 복합체를 형성함으로써 신호를 발생시키는 데 사용된다. CESA 복합체의 효소적 절단은 검출가능한 결과를 발생시키는 데 사용될 수 있고/거나, 또 다른 PESA 복합체에의 결합이 가능한 하나 이상의 추가의 DF를 제공하여 상기 결합을 통해 효소적 절단 및 신호 발생이 가능한 추가의 CESA 복합체를 형성함으로써 선형 캐스케이드를 제공하는 데 사용될 수 있다.
상기 과정은 도 4에 도시되어 있는데, 여기서, 이전 단계에서 생성된 구동자 단편(예컨대, 개시제 DF)은, 제1 효소 증폭제 기질(EAS1) 올리고 및 제2 효소 증폭제 기질(EAS2) 올리고를 포함하는 PESA 복합체와 조립된다. DF가 PESA 복합체와 조립되었을 때, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(도 4에서 점선으로 된 박스 표시) 및 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(들)(도 4에서 필링형 수직 화살표 표시)를 포함하는 CESA가 생성된다. 한 실시양태에서, 제1 EAS1은 소광제(Q)로 표지되고, 제2 EAS2는 형광단(F)을 표지된다. 조립된 CESA의 절단 후, 이어지는 상기 성분의 해리를 통해 형광단 및 소광제는 분리되고, 동시에 형광 신호가 발생되고, 온전한 DF가 유리된다(도 4). 이어서, DF는 자유롭게 또 다른 PESA와 회합하여 또 다른 CESA를 형성할 수 있고, 이를 통해 제한 엔도뉴클레아제 절단이 일어나고, 형광이 증가하게 된다. 따라서, 도 4에 도시되어 있는 바와 같이, 상기 과정은 계속 진행되고, 이를 통해 추가 EAS1의 제한 효소 매개 절단에 의해서 형광 신호가 발생됨으로써 신호가 증폭된다. 추가의 다른 실시양태에서, CESA를 절단하는 효소는 제한 엔도뉴클레아제가 아닌 뉴클레아제이다.
또 다른 실시양태에서, 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 제1 및 제2 파트자임은 조립 촉진제를 함유하는 시료와의 접촉시에 조립됨으로써 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임이 된다. MNA자임은 MNA자임 기질에 결합하여 MNA자임 기질의 변형을 촉진시키는데, 상기 변형은 조립 촉진제가 존재함을 나타내는 것으로서, 여기서, 조립 촉진제는 표적이 된다(도 5A). 다른 실시양태에서, 예컨대, 압타머를 포함하는 것의 경우, 조립 촉진제는 표적이 될 수 있고, 따라서, 오직 MNA자임의 자기 조립에 필요한 요소만을 포함할 수 있다.
촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단을 통해 구동자 단편(DF)이 생성되고, 이는 PESA와 조립됨으로써(도 5B)(도 5, 2단계), 제한 효소 인식 부위(점선으로 된 박스 표시) 및 제한 효소 절단 부위(검은색 수직 화살표 표시)를 형성하는, 제1 EAS(EAS1) 및 제2 EAS(EAS2) 및 DF를 포함하는 CESA(도 5C)를 생성한다. 한 실시양태에서, 제1 효소 증폭제 기질 올리고는 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지되고, EAS2는 소광제(Q)로 표지된다. 상기 조립된 구조체가 제한 효소에 의해 절단(도 5, 3단계), 이어서, 상기 성분이 해리되면(도 5, 4단계) 형광 신호가 발생되고, DF가 유리된다. 이어서, DF는 자유롭게 또 다른 PESA와 회합하여 또 다른 CESA를 형성할 수 있고(도 5, 5단계), 이를 통해 추가의 제한 효소 절단이 일어난다(도 5, 3단계에서의 것과 같은 6단계). 따라서, 도 5의 4, 5, 및 6단계에 도시되어 있는 바와 같이, 상기 과정은 계속 진행되고, 이를 통해 추가 EAS1의 제한 효소 매개 절단에 의해서 형광 신호가 발생됨으로써 신호가 증폭된다.
MNA자임의 성질, 및 RE를 비롯한 뉴클레아제의 다양한 특성에 기인하여, 반응은 단지 MNA자임의 조립 요건, MNA자임 기질의 촉매성 변형(예컨대, 절단), 및 PESA 및 DF로부터의 CESA의 조립 요건, 및 뉴클레아제의 활성에 따라 매우 광범위한 온도 범위에서 수행될 수 있다. 방법의 각 단계는 상이한 온도에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 표적 존재하의 MNA자임 형성, 및 이어서 MNA자임 기질의 절단은 한 온도에서 달성될 수 있고, DF를 포함하는 CESA의 형성, 및 이어서, 제한 효소에 의한 절단을 통해 신호를 증폭시키는 것은 다른 온도에서 이루어질 수 있다. 별법으로, 모든 단계는 MNA자임 및 제한 효소를 비롯한 뉴클레아제, 둘 모두의 촉매 활성을 지원하는 환경하의 단일의 온도에서 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 구동자 단편이 단백질 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하는 표적 지정 절단에 의해 생성되는 경우, 이때, EzyAmp에 필요한 모든 단백질 효소와 화합성인 반응 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본원에서 추가로 제공되는 바와 같이, 제한 효소를 비롯한 뉴클레아제를 단독으로 또는 MNA자임과 함께 조합하여 사용하여 표적을 검출하는 일부 방법에서는 열순환 및/또는 표적의 변성이 요구되지 않는다. 등온 방법이 열순환을 필요로 하는 방법보다 유연성이 더 크고, 그러한 방법을 통해 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산을 포함하는 표적들 간의 차별화 또한 가능하다. 추가로, 열순환이 요구되지 않음으로써 상기 방법은 더 용이해지고, 비용은 절감될 수 있다. 본원의 방법에 따라, 합성 또는 천연의 표적일 수 있는, 시료 중 관심의 대상이 되는 표적을 검출하는 방법으로서 간단하고, 신속하며, 비용면에서 효율적이고, 등온성인, 절차상 유연적인 방법을 제공한다.
2.2.2 피드백 캐스케이드
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 표적 인식 이벤트시에 생성된 개시제 DF는 다중 PESA 및 CESA 복합체를 포함하는 피드백 캐스케이드에서 신호를 발생시키는 데 사용된다.
단지 비제한적인 일례로, 및 도 17A 및 18A를 참조하면, 개시제 DF(DF-a)는 제1 PESA 복합체(PESA A)에 결합하여 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 가지는 제1 CESA 복합체(CESA A)를 형성할 수 있다. PESA A는, EAS1의 일부는 EAS2에 상보적이고, EAS1의 DF-a에 상보적인, 제1 및 제2 EAS 올리고(EAS1 및 EAS2)를 포함할 수 있다. EAS1은 또한, EAS1이 온전한 상태로 있는 동안, 어떤 신호도 발생되지 못하도록 이를 함께 막거나 또는 실질적으로 막을 수 있을 정도로 충분히 가까운 위치에 배치된 형광단 및 소광제 모이어티로 표지될 수 있다. EAS2는 DF-a와는 별개의 것인 제2 DF(DF-b)를 포함할 수 있다. 뉴클레아제에 의한 PESA A의 절단으로 EAS1이 절단되고, 이를 통해 형광단 및 소광제 모이어티가 분리됨으로써 검출가능한 신호가 발생되고, 또한 EAS2도 절단되어 DF-b가 유리되고, 이로써 PESA B와 복합체를 형성하여 CESA B를 형성할 수 있다. CESA B는, EAS3의 일부는 EAS4에 상보적이고, EAS3의 DF-b에 상보적인, 제3 및 제4 EAS 올리고(EAS3 및 EAS4)를 포함할 수 있다. EAS3은 또한, EAS3이 온전한 상태로 있는 동안, 어떤 신호도 발생되지 못하도록 이를 함께 막거나 또는 실질적으로 막을 수 있을 정도로 충분히 가까운 위치에 배치된 형광단 및 소광제 모이어티로 표지될 수 있다. EAS4는 DF-a를 포함할 수 있다. 뉴클레아제에 의한 PESA B의 절단으로 EAS3이 절단되고, 이를 통해 형광단 및 소광제 모이어티가 분리됨으로써 검출가능한 신호가 발생되고, 또한 EAS4도 절단되어 DF-a가 유리되고, 이로써 새로운 PESA A와 복합체를 형성하여 새로운 CESA A를 형성할 수 있으며, 이로써 피드백 신호 증폭 루프가 형성된다. 계속 진행되는 새로운 DF-a 및 DF-b의 생성에 의해 야기된 다음 회차의 CESA A 및 CESA B 절단이 개시제 DF(DF-a)의 PESA A에의 개시 결합으로부터 발생된 신호를 증폭시키는 역할을 하고, 이는 추가 표적 분자의 존재와는 상관없이 진행된다. 그럼에도 불구하고, 새로운 개시제 DF 올리고(즉, DF-a)는 또한 추가 표적 분자 인식시에 시스템 내로 진입할 수 있다. 따라서, 본 방법은 최소 개수의 표적 분자로부터 발생되는 신호를 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 표적 분자를 검출하고, 그의 존재량을 정량화하는 데, 그 둘 모두를 위한 수단으로서의 역할을 할 수 있다. 특정 실시양태에서, PESA A 및/또는 PESA B는 헤어핀 올리고뉴클레오티드이다(도 18A 참조).
도 19는 MNA자임을 포함하는 피드백 신호 증폭 캐스케이드의 또 다른 예를 제공한다. 이러한 예에서, 개시 DF 서열은 MNA자임 기질 서열의 일부가 아니다. 올리고뉴클레오티드 파트자임은, 기질-차단제 DF-a 올리고뉴클레오티드의 루프부 내에 존재하는 표적 인식시에 조립되어 루프를 절단할 수 있는 MNA자임을 형성한다. 이러한 실시양태에서, 개시 DF(DF-a)는 (루프에 대하여) 기질-차단제 올리고의 반대쪽 가닥에 존재한다. MNA자임에 의해 루프가 절단되면, DF-a에 상보적인 기질-차단제 올리고의 일부가 해리되고, 이로써, DF-a는 PESA에 하이브리드화함으로써 CESA A를 형성할 수 있다. 이어지는 CESA A의 절단을 통해 (예컨대, 형광단 및 소광제 모이어티의 분비에 의해) 검출가능한 신호가 발생될 수 있고, DF-b가 유리될 수 있다. 유리된 DF-b는 PESA B와 회합하여, RE에 의해 절단될 수 있는 CESA B를 형성할 수 있다. CESA B의 절단을 통해 (예컨대, 형광단 및 소광제 모이어티의 분비에 의해) 검출가능한 신호가 발생될 수 있고, DF-a로서 작용할 수 있는 올리고가 유리될 수 있다. 따라서, CESA A 및 CESA B가 연속하여 형성되고, 절단됨으로써 추가의 DF-a 및 DF-b를 유리시키고, 이를 통해 추가의 CESA A 및 CESA B가 형성됨으로써 피드백 캐스케이드가 형성된다. 추가의 복합 반응에는 각각 독특한 MNA자임에 의해 유리되도록 디자인된 독특한 개시 DF를 포함하는 다중 이중 가닥 올리고 복합체가 존재할 수 있다.
피드백 신호 증폭 캐스케이드에 관한 추가의 비제한적인 예는 도 22에 제공되어 있다. 상기 도 22에 관한 다양한 설명에 기술되어 있는 바와 같이(서브섹션 1.5 및 "도면의 간단한 설명"부 참조), PESA 복합체를 분지형 구조체에 포함시킴으로써 EzyAmp 성분을 국소화시키는 것이 피드백 캐스케이드 시스템의 효율을 증진시킬 수 있다. 상기 구조체를 통해 다양한 PESA 복합체는 서로 근접한 위치에 오도록 이동되면, CESA 복합체의 형성 및 절단시, 다양한 PESA 복합체 간의 구동자 단편 전달은 더 효율적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 도 22A에 제시된 실시양태에서 나타난 바와 같이, 단일 분지형 구조체는 2 이상의 PESA 복합체(PESA A 및 PESA B)를 포함할 수 있는데, 각각의 복합체는 별개의 DF(DF-a 또는 DF-b)와의 결합시 뉴클레아제 절단이 가능한 것이다. DF-a가 PESA A에 결합하였을 때 형성된 CESA 복합체(CESA A)의 뉴클레아제 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻을 수 있고, DF-b가 유리될 수 있다. DF-b는 PESA B에 결합하여 CESA B를 형성할 수 있고, 이는 뉴클레아제에 의해 절단됨으로써 추가의 검출가능한 결과를 얻을 수 있고, 추가의 DF-a가 유리될 수 있으며, 이는 추가의 PESA A에 결합함으로써, 이를 통해 피드백 루프가 형성될 수 있다. 도 22B에 제시된 실시양태에서 나타난 바와 같이, 단일 분지형 구조체는 그의 각각의 골격부를 통해 하이브리드화함으로써 이중 분지형 구조체를 형성할 수 있고, 이로써, 구조체 중에 존재하는 PESA A 및 PESA B 복합체의 개수는 효과적으로 배가될 수 있다. 단일 분지형 구조체 및 이중 분지형 구조체는 하나 이상의 연결 시약을 사용하여 다른 단일 분지형 구조체 및/또는 다른 이중 분지형 구조체에 연결될 수 있으며, 이를 통해 분지형 구조체 네트워크가 형성된다. 예를 들어, 도 22D에 제시된 실시양태에서 나타난 바와 같이, 단일 분지형 구조체 및/또는 이중 분지형 구조체의 하나 이상의 아암은 임의의 적합한 시약/시약들(예컨대, 비오틴/아비딘, 화학적 시약, 항체, 펩티드 링커 등)을 사용하여 다른 단일 분지형 구조체 및/또는 이중 분지형 구조체의 하나 이상의 아암과 연결될 수 있다.
도 23은 피드백 캐스케이드가 단일 PESA 구조체 및 SIO를 사용하여 형성된 것인, 또 다른 실시양태를 도시한 것이다. 이러한 예에서, 신호 증폭은 적합한 엑소뉴클레아제, 예컨대, 엑소뉴클레아제 III(Exo III)에 의해 개시되고 매개된다. Exo III은, DNA 이중체의 3' 히드록실 말단이 블런트 또는 오목형일 때, 상기 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거할 수 있고, 5개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 4' 오버행을 포함하는 이중체를 비롯한 단일 가닥 올리고는 분해하지 못한다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드는 또한 엑소뉴클레아제 활성을 차단하는 것으로 알려져 있다. 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지될 수 있는 SIO는 오버행잉형 3' 말단을 가진 헤어핀 입체구조로 제시된다. SIO이 5개 초과의 뉴클레오티드로 이루어진 3' 오버행을 포함하는 바, Exo III은 표적 결합 이전에는 SIO를 분해할 수 없다. SIO에서 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 상기 지점 너머의 가수분해를 막고, 이로써, DF는 온전한 상태 그대로 유지된다. SIO는 포스포로티오에이트 염기에 따라 Exo III에 의해 가수분해될 수 있는 SIO 중의 오목형 3' 말단을 형성하는 표적의 상보적인 영역에 결합할 수 있고, 이를 통해 온전한 DF가 유리되고, 형광이 증가하게 된다. 이러한 예에서, DF는, 표적에 상보적이지 않은 SIO의 5' 부분(즉, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드에 대해 5'쪽 서열)에 상응한다. 이어서, 더 이상 SIO에 결합하지 않는 표적은 자유롭게 재순환하여 또 다른 SIO와 결합함으로써 또 다른 DF를 생성하게 된다. 그렇게 생성된 DF는 PESA의 EAS1에 결합하여 CESA를 형성하는데, 여기서, EAS1의 3' 말단은 오목형이다. 이어서, Exo III은 CESA의 EAS1 가닥을 가수분해시킴으로써, 이를 통해 형광은 증가하고, DF는 유리되고, 이는 재순환하여 추가의 PESA를 CESA로 전환시킬 수 있다.
2.2.3 다중화
본 발명의 방법은 단일 EzyAmp 반응에서 다중 표적을 검출하는 데 사용될 수 있고, 별개의 표적의 검출로부터 발생된 개별 신호는 동시에 증폭될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 방법을 사용하는 상이한 표적의 다중화 검출/신호 증폭은, 각각이 특이 표적으로부터 유도된 것인 일련의 상이한 개시제 구동자 단편을 생성함으로써 달성될 수 있다. 각각의 PESA 복합체는 다른 PESA 복합체의 것과 구별이 될 수 있는 별개의 검출가능한 요소(예컨대, 독특한 형광단)를 포함하는 것인, 상응하는 PESA 복합체는 각각 특이적인 유형의 개시제 DF에 대하여 제공될 수 있다. 상기 반응에 대한 개시제 구동자 단편은 상기 서브섹션 2.1에서 참조되는 방법들 중 임의의 하나 이상을 비롯한, 임의의 적합한 방법으로 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 각각은 상이한 표적으로부터 유도된 것인, 다중 별개의 개시제 구동자 단편은, 상이한 표적 특이성을 가지며, 별개의 구동자 단편을 포함하는 것인 2개 이상의 합성 개시제 올리고뉴클레오티드, 별개의 표적 특이성을 가지며, 하나 이상의 MNA자임 기질의 촉매성 변형에 의해 별개의 구동자 단편을 생성할 수 있는 것인 2개 이상의 MNA자임, 또는 각각 상이한 표적 특이성을 가지며, 각각 별개의 DF를 생성할 수 있는 것인, 하나 이상의 합성 개시제 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 MNA자임의 조합을 사용함으로써 생성될 수 있다.
따라서, 당업자는 본원에서 제공되는 조성물 및 방법이 반응당 단일 표적을 검출하는 데, 또는 단일 반응에서 다중 표적을 검출하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다중 표적을 검출할 때, 검정법 및 검출하고자 하는 대상에 따라 하나 이상의 MNA자임이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 관련 구조체, 예를 들어, (MNA자임에 의해 인식되는) 중요한 서열은 공유하며, 예를 들어, 단지 중요 서열 바깥쪽 서열 또는 길이만을 달리하는 서열로 이루어진 군을 검출하는 경우에는 단일 MNA자임이 충분할 수 있다. 중요 서열을 포함하는 임의 서열이 검출될 수 있다. 단지 단일 뉴클레오티드만큼 적은 정도로 차이를 보이는 관련 서열을 검출할 경우, 또는 심지어는 매우 상이한 표적을 검출하고자 하는 경우에도 다중 MNA자임은 유용할 것으로 간주되며, 각각의 존재 또는 부재를 아는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 다른 경우에 있어서, 독특한 DF를 형성하여 여러 표적들 각각을 표적할 수 있도록 하기 위해 독특한 MNA자임 기질을 필요로 하는 경우에는 단일 MNA자임 기질이 충분할 것이다.
일부 경우에, 방법을 다중화하는 것은 방법의 디자인을 촉진시키기 위해 별개의 또는 독특한 MNA자임 형성을 필요로 한다. 기질이 지지체 또는 지지체들에 부착되어 있고, 지지체 또는 지지체들 상에서 그의 국소화에 의해 구별될 수 있는 경우에는, 별개의 또는 독특한 DF가 필요하지 않을 수 있다. 당업자는 이러한 디자인의 특징을 쉽게 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 방법을 통해 한 반응에서 각종의 상이한 유형의 표적, 예컨대, 핵산 표적 및 단백질을 검출할 수 있다.
유사하게, 다중 표적에 대한 다중 SIO를 사용하는 반응을 통해 동시에 다중 표적을 분석하는 다중 검정법을 개발할 수 있게 될 것이다. 이러한 계획안 또는 다른 것에서, CESA는 제한 효소 또는 또 다른 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 이로써, 신호 증폭을 촉진시킬 수 있다.
단지 비제한적인 일례로, 다중 표적은 일련의 범용 기질을 변형시키는 다중 MNA자임을 사용하여 검출될 수 있으며, 각 기질의 변형을 통해 별개의 DF가 생성되는데, 이 DF는 별개의 PESA와 조립함으로써 별개의 제한 효소에 대한 CESA를 형성하고, 이로써 뚜렷하게 검출가능한 신호(예컨대, 상이한 형광)를 얻게 될 것이다.
다중화 EzyAmp 시스템에 대한 예시적인 전략법이 도 13에 도시되어 있는데, 여기서, 다양한 별개의 개시제 구동자 단편은 상이한 표적 특이성을 가지는 일련의 3개의 MNA자임을 이용하여 표적에 특이적인 방식으로 생성된다. 생성된 각각의 상이한 DF는 별개의 PESA 복합체에 결합하는데, 여기서, 별개의 PESA 복합체는 각각 별개의 형광단을 포함한다. 상기와 같이 형성된 3개의 CESA 복합체는 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 각각의 경우에, 3개의 상이한 형광단에 의해 별개의 신호가 발생된다. 도 25는 2개의 EzyAmp 반응이 단일 튜브에서 동시에 일어나고, 이러한 방식으로 독립적으로 모니터링되는 다중화 분석법의 결과를 보여주는 것이다.
상기 기술된 바와 같이, 상이한 표적의 인식으로부터 발생된 별개의 신호는 동시에 또는 실질적으로 동시에 진행되는 방식으로 독립적으로 증폭될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 상기 서브섹션 2.2.2 및/또는 2.2.3에 기술된 방법을 사용함으로써, 별개의 표적의 검출로부터 생성되고, 별개의 개시제 구동자 단편과 함께 형성된 CESA 복합체는 각각 분리형 선형 및/또는 피드백 캐스케이드로 포함됨으로써 각각의 별개의 신호를 증폭시킬 수 있다. 선형 및/또는 피드백 캐스케이드는 상이한 신호의 독립된 증폭을 위해 함께 진행될 수 있다.
단일 표적 내의 다중 영역 또한 본 발명의 방법을 사용함으로써 동시에 또는 실질적으로 동시에 검출될 수 있다. 상기와 같은 경우에, 일련의, 별개의 또는 동일한 개시 구동자 단편이 주어진 표적 내의 상이한 영역에 기초하여 일련의 표적 인식 이벤트로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 목적을 위해서는 표적 내의 상이한 영역에 대한 특이성을 가지는 다중의 상이한 MNA자임이 사용될 수 있다. MNA자임은 단일 범용 기질을 사용하여 단일 유형의 DF의 다중 카피를 생성할 수 있는데, 이들은 각각 단일 유형의 PESA에 결합함으로써 일련의 동일한 CESA를 형성할 수 있고, 이로써, 동일한 검출가능한 결과를 가져올 수 있다. 별법으로, MNA자임은 일련의 상이한 범용 기질을 촉매적으로 변형시킬 수 있는데, 각 기질의 변형을 통해 별개의 DF가 생성되고, 이는 별개의 PESA와 조립됨으로써 별개의 CESA를 형성함에 별개의 검출가능한 신호를 얻을 수 있을 것이다.
2.2.4 불용성 및 고체 지지체를 사용하는 방법
일반적으로 본 발명의 방법은 다중화 여부와 상관없이, 용액에 적용될 수 있거나, 예를 들어, MNA자임 기질, 파트자임, PESA, CESA, EAS, DF, EIC, InF, SIO, 제한 효소, 뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 압타머, 헤어핀 올리고뉴클레오티드, MNA자임 조립 촉진제, 및/또는 표적을 비롯한, 하나 이상의 검정 성분이 그 위에 결합, 부착, 또는 테더링되어 있는 것인 불용성 지지체 또는 고체 지지체와 와 조합될 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다. 일반적으로, 본원에서 논의되는 방법 및 변형법과 함께 제깅되는 상기 시스템의 특징을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 발명이 본원에서 기술하는 문자 그대로의 교시로 제한되는 것으로 간주되지 않아야 하며, 본원에서 제공하는 교시의 원리 및 범주 및 당업계의 지식과 일관되게 변형되고, 수정될 수 있다.
바람직하게, 지지체는 기질을 보유하며, 그가 대량의 반응 혼합물 중에서 자유롭게 이동하지 못하도록 차단하는 매트릭스, 또는 불용성 물질이다. 상기 지지체는 핵산 올리고뉴클레오티드를 비롯한 기질을 고정화시키거나, 국소화시키는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 지지체는 마이크로어레이에서 사용하기에 편리한, 비드를 비롯한 다양한 형태의 매우 다양한 매트릭스, 중합체 등으로부터, 그리고 그 뿐만 아니라, 반응 조건과 화합성인 다른 물질로부터 선택될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 지지체는 플라스틱 물질, 예컨대, 플라스틱 비드 또는 웨이퍼, 또는 특정 검정법이 수행되는 웰 또는 튜브의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 지지체는 마이크로캐리어 또는 나노캐리어일 수 있다. 특정 실시양태에서, 지지체는 코딩될 수 있다.
예를 들어, 지지체에 부착된 MNA자임, MNA자임 기질, CESA, 및/또는 PESA를 사용하여 표적을 검출하는 방법이 고려된다. 바람직한 실시양태에서, PESA가 바람직하게 지지체에 부착된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, SIO가 지지체에 부착된다. PESA 또는 그의 성분을 지지체에 부착시키는 것은, 구동자 단편이 PESA와 조립된 후, 이어서, 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지된 CESA가 제한 효소에 의해 절단될 때, 형광단이, 지지체에 그대로 부착되어 있는 소광제로부터 멀리 떨어져 대량의 반응 혼합물 내로 유리되도록 디자인된다. 따라서, 절단시 소광제 부분 및 검출가능한 부분이 분리됨에 따라, 검출가능한 신호는 크게 증가하게 된다. 대체 실시양태에서, 형광단 함유 검출가능한 부분은 절단 후에도 그대로 부착되어 있을 수 있다. 이를 통해 지지체 상의 신호가 국소화될 수 있다. 특정 경우에, 형광단은 용액 중에 존재하지 않을 수 있다는 것도 고려된다.
특정 실시양태에서, 반응은 용액 중에서 이루어질 수 있도록 설정될 수 있고/거나, 반응은 고체 지지체 부착된 성분/성분들을 포함할 수 있다. 도 20에 도시된 반응은 테더링된 성분을 사용하는 검정법에 관한 예시적인 도식을 보여주는 것이다. 상기 도면에서, 스테이션 1은, 표적에 의존하는 방식으로 절단되었을 때(1단계), 제1 DF(줄무늬 선)를 유리시키는 테더링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 도시된 것이다. 이어서, 상기 DF는 스테이션 2의 테더링된 PESA A로 이동하여, 그와 하이브리드화함으로써 CESA A를 형성할 수 있다(2단계). CESA A의 절단으로(3단계) 제2 구동자 단편(검은색 실선)은 유리되고, 이는 스테이션 3의 PESA B로 이동하게 될 것이다. 제2 DF가 PESA B와 하이브리드화하게 되면, CESA B가 형성될 수 있다(4단계). CESA B가 절단되면, 제1 DF(줄무늬 선)와 등가인 서열이 유리될 것이다. 이어서, 상기 제1 DF는 스테이션 2로 이동하여(5단계), 추가의 CESA A를 형성할 수 있으며, 그의 절단으로 추가의 제2 DF가 유리될 수 있다. 이러한 방식으로 캐스케이드 반응이 개시될 수 있고, 이를 통해 CESA가 연속하여 형성되고 절단될 수 있다(3, 4, 및 5단계). 각각의 PESA가 형광단(F) 및 소광제(Q)로 표지된 검정법에서, 상기 모이어티 간의 절단을 통해 형광 신호가 발생될 수 있다. 예를 들어, 상기 신호는 (도시된 바와 같이) 고체 표면 2 또는 3 상에서 유지될 수 있거나, 또는 형광단 및 소광제의 위치가 역전된 경우라면, 용액에서 방출될 수 있다.
스테이션은 분리형 챔버일 수 있거나, 또는 예를 들어, 분비형 고체 표면 상에, 예컨대, 칩 또는 마이크로캐리어 상에 존재할 수 있다. 이러한 전략법이 EzyAmp 캐스케이드 개발에 유용한 제한 효소의 개수를 증가시킬 것이다. 상기 시나리오에서, 유일하게 필요한 요건은 표적 의존 절단에 의해 생성된 구동자 단편이 RE에 의한 인식 및 절단에 필요한 서열을 완성하여야 한다는 것이 될 것이다. 상기 시나리오에서는 그의 표적 의존 절단 이전에 구동자 단편을 포함하는 전장의 올리고뉴클레오티드에 의해 RE가 억제되어야 한다는 요건은 더 이상이 필요하지 않을 것이다. 이제, 절단되지 않은 보다 긴 장쇄의 단편은 PESA로부터 물리적으로 분리될 것이며, 오직 표적에 의존하는 방식으로 절단 후, PESA와 접촉할 수 있게 된다. 그러므로, PESA 단편 및 표적 특이 단편의 접합부에 위치하는 추가 서열의 존재에 의해 억제되지 않는 RE가 EzyAmp 검정법에 사용될 수 있으며, 이로써 캐스케이드 반응이 형성된다.
2.2.5. 압타머
본 방법은 압타머를 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서, 상기 압타머가 핵산 이외의 표적을 비롯한, 표적의 검출, 확인 및/또는 정량화를 촉진시킬 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 압타머의 비제한적인 예로는 상기 서브섹션 1.8에 기술된 것을 포함한다.
예를 들어, 비핵산 엔티티를 비롯한 표적을 검출하기 위해 MNA자임 및 제한 효소를 사용하는 방법이 고려된다. 압타머를 MNA자임 성분 중 임의의 것에 포함시킬 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 다중 압타머를 파트자임 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상에 포함시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
MNA자임의 조립에 표적이 요구되지 않는 것인 실시양태에서, 압타머가 조립 촉진제에 포함될 수 있다. 압타머 서열이 입체 배치에서 파트자임(압타-파트자임)의 말단에 포함되고, 이로써 활성 MNA자임은 오직 표적 피분석물의 존재하에서만 형성이 되는 것인 관련 전략법 또한 예상된다. 상기와 같은 검출 전략법에 필요한 올리고뉴클레오티드 성분으로는 표준 파트자임; 파트자임의 말단 중 한쪽에 압타머가 포함되어 있는 파트자임인 압타-파트자임; (표적의 존재하에서) 활성 MNA자임을 조립할 수 있는 압타-파트자임 및 파트자임, 둘 모두에 결합하는 조립 촉진제; MNA자임 기질; 및 압타머 서열의 적어도 일부, 및 파트자임 서열의 기질 결합 아암의 일부에 걸쳐져 있는 영역 중의 압타-파트자임에 하이브리드화하는 조립 억제제를 포함한다. 표적의 부재하에서, 조립 억제제는 압타-파트자임에 결합함으로써 MNA자임 기질의 결합(및 절단)을 차단시킨다. 표적의 존재하에서, 표적은 압타-파트자임의 압타머 서열에 결합하여 조립 억제제의 결합은 막고, MNA자임 기질의 결합 및 절단은 허용한다. 따라서, 활성 MNA자임은 오직 표적의 존재하에서 형광 신호 발생을 형성하고 생성할 수 있다.
상기 전략법에서 억제제 서열은 별개의 분자일 수 있거나, 또는 MNA자임 복합체에 참여하는 성분 중 하나로 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 하나 이상의 압타머가 파트자임, 조립 촉진제 또는 기질을 비롯한 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 것에 포함될 수 있다는 것 또한 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 압타머는 상기 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 어느 한쪽의 말단으로 포함될 수 있다.
2.2.6. 방법의 최적화
표적의 검출, 확인 및/또는 정량화를 최적화시키기 위한 목적으로 다양한 실험 파라미터를 이용함으로써 본원에 기술된 방법은 최적화될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 최적화되는 특정의 실험 파라미터, 및 그러한 최적화 수준은 사용되는 특정 방법, 및 검출, 확인 및/또는 정량화하고자 하는 특정 표적에 따라 달라질 것이다. 그러한 파라미터로는 온도, pH, 염의 농도, 올리고뉴클레오티드의 농도, 완충제의 유형 및 농도, 제한 효소 보조인자, 계면활성제, 양이온 및 다른 시약(디메틸술폭시드(DMSO), EDTA, ATP, 글리세롤을 포함하나, 이에 한정되지 않음)의 농도, MNA자임 및/또는 CESA의 핵산 성분의 상보성 길이, GC 함량 및 융점(Tm)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 특이 핵산 서열을 검출하는 것을 포함하는 방법의 경우, 바람직하게는, 상기 방법이 수행되는 온도를 비롯한, 실험 파라미터는 서열 변이를 포함하는 표적 핵산, 또는 그를 포함하지 않는 표적 핵산에의 MNA자임 성분의 결합을 구별 짓기 위해 최적화될 수 있다. 상기 방법이 수행될 수 있는 온도는 약 20℃ 내지 약 96℃, 약 20℃ 내지 약 75℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 또는 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위일 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 수행하는 데 최적화된 반응을 제공한다. 상기 최적화된 반응에서, 검출되는 반응은 최적화되지 않은 반응에 비하여 최대 10%, 20%, 또는 30%만큼 증가한다. 더욱 바람직한 반응 조건은 검출되는 반응을 35%, 또는 40% 이상만큼, 및 바람직하게는 최대 50% 이상까지 개선시킨다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 최적화된 반응은 50% 초과, 및 최대 66%, 75% 또는 심지어 100%까지 증가된 촉매 활성을 가진다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 완전하게 최적화된 반응 방법은 신호 검출을 100%, 200% 또는 심지어 300% 초과로 증가시킬 것이다. 더욱 바람직한 반응 조건은 촉매 활성을 최적화되지 않은 반응 조건으로 수행된 방법에 비하여 최대 1,000%까지 또는 그 이상만큼 개선시킬 수 있다. 본원에서 제공되는 방법을 최적화시키는 데 고도로 바람직한 반응 조건은 특정의 2가 양이온을 포함하는 것이다. 대부분의 핵산 효소 및 단백질 효소의 촉매 활성은 농도에 의존하는 방식으로 2가 양이온의 농도에 영향을 받을 수 있다. 바람직한 최적화된 반응은 Ba2 +, Sr2 +, Mg2 +, Ca2 +, Ni2 +, Co2 +, Mn2 +, Zn2 +, 및 Pb2 + 중 하나 이상에 대하여 최적화된다.
2.2.7 방법의 적용
매우 광범위한 적용 영역에서 MNA자임, CESA 및 제한 효소가 표적의 검출, 확인 또는 정량화를 위한 전략법에서 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 영역으로는 의학, 수의학, 농업, 식품 기술, 품질 관리, 환경 검사, 생명 과학 연구, 법의학, 신분 검사, 영상화, 및 생물테러 적용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
의학적 적용의 비제한적인 예로는 특정 질환 또는 병증, 또는 그러한 질환 또는 병증이 발병될 위험을 진단하는 것 및/또는 질환 또는 병증에 대한 예후를 수득하는 것이 있다.
생물학적 적용의 경우, 비록 하기의 가능성이 반드시 배제되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법을 살아있는 동물 또는 인간의 신체에 대하여 수행해야 한다는 특별한 제한은 없으며, 본 방법은 시험관내/생체외에서 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 방법은 생물학적 시료(예컨대, 혈액 또는 조직 시료)에서, 앞서 피험체로부터 단리된 세포 또는 핵산(상기 세포 및 핵산의 냉동 시료, 파라핀에 포매된 시료 포함)에서, 및 배양 세포에서 수행된다.
본원에 기술된 방법은 용액 중의 표적을 검출, 확인 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다는 것 또한 쉽게 자명해질 것이다. 예를 들어, 단일 기질을 사용하여 단일 표적을 검출, 확인 및/또는 정량화하는 것을 포함하는 전략법이 상기 검출에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 범용 기질을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
이제, 본 발명은 하기의 구체적인 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 기술될 것이나, 이것이 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
하기 실시예는 뉴클레아제에 의해 절단가능하거나, 절단불가능한 다양한 이중체 구조체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증한다. 뉴클레아제에 의해 절단가능한 구조체는 이중체 기질, 예컨대, CESA 복합체이고, 본 실시예에서, 뉴클레아제는 제한 효소(RE)이다.
1.1. 올리고뉴클레오티드
하기 반응을 위해, 올리고뉴클레오티드 단편을 조합하고, 절단가능한 이중체 기질을 형성할 수 있는 그의 능력에 대하여 테스트하였다. 예시적인 구조체는 도 3에 도시되어 있다. 본 실시예에서, 이중체는 효소 Mnl I에 대한 이중 가닥 제한 효소 인식 부위(RERS)의 한 가닥을 형성하는 데 필요한 뉴클레오티드 모두를 포함하는 한 가닥을 포함한다.
이중 표지된 DNA 복합체의 절단에 의해 RE 절단 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, 효소 증폭제 기질 올리고 1(EAS1)의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하고, 이를 EAS1-5(23)-BF로 지정하였다. EAS2-5(16)-B로 지정된 제2 효소 증폭제 기질 올리고 EAS2 또한 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, EAS1-5(23)-BF에 어닐링시켜 PESA를 생성하였다. 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체로 명명되는, 완전하게 조립된 절단가능한 이중체 기질의 RE에 의한 절단을 485 nm(FAM 여기 파장)에서의 여기와 함께 530 nm (FAM 방출 파장)에서 모니터링하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 굵은 밑줄체 로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. 상기 효소에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 밑줄체로 표시되어 있고, 상부 가닥 5' NNCCTCN7/3' 및 하부 가닥 3'NNGGAGN6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다). 억제 단편(Sub1(8:9)-TRB2)과 DF에 공통된 영역은 밑줄체의 이탤릭체 로 표시된 것이다. 대문자는 DNA를 나타내고, 소문자는 RNA를 나타낸다.
Figure pct00008
1.4. 반응 성분
도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드 및 구조체를 참고하여, 하기 표 6에 열거된 하기 올리고뉴클레오티드 단편을 포함하도록 반응 A, B, C 및 D를 설정하였다.
Figure pct00009
RE(10 U Mnl I)에 의한 형광 표지된 EAS1(EAS1-5(23)-BF)의 절단에 의해 발생되는 형광 신호 증가에 의해 EAS1, EAS2 및 DF에 의한 CESA의 형성을 측정하였다. 반응 A, B, C 및 D 모두 37℃하에 스마트사이클러® 시스템 열순환 반응기(SmartCycler® System thermocycler)(세피이드(Cepheid))에서 수행하였고, 모든 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 총 60분 동안 매 36초마다 각 반응에 대한 형광을 판독하였다. 모든 반응은 1 X BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 중 100 nM의 EAS1-5(23)-BF, 1.25 x NE버퍼(NEBuffer) 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 10 유니트의 Mnl I를 함유하였다. 추가로, 반응 A는 100 nM의 EAS2-5(16)-B 및 100 nM DF1을 함유하였고, 반응 B는 100 nM의 EAS2-5(16)-B 및 100 nM Sub1(8:9)-TRB2를 함유하였고, 반응 C는 100 nM의 EAS2-5(16)-B를 함유한 반면, 반응 D는 오직 EAS1만을 함유하였다.
7.5. 결과: RE 에 의한 절단 검출
반응 A에서, EAS1(EAS1-5(23)-BF), EAS2-5(16)-B 및 DF1을 첨가한 결과, 시간 경과에 따라 FAM 형광이 증가된 것으로 나타난 바와 같이(도 14A; +RE), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA 이중체 기질이 형성되었다. 이러한 관찰 결과는, RE에 의한 인식 및 절단을 위해 필요한 영역내, 두 가닥 중 1 이상에 절단부 또는 닉을 포함하는 이중 가닥 복합체를 인식하고 절단할 수 있는 제한 효소의 능력과 일관된다. 다시 말해, 절단가능한 이중체 기질은 2개의 절단되지 않은 연속 상보적인 가닥으로부터 형성되어야 한다기보다는, 상보적인 이중체를 형성하는 다중 올리고로부터 구성될 수 있다.
대조적으로, DF1 단편을 포함하지 않는 대신, Sub1(8:9)-TRB2를 포함하는 반응 B에서는 Sub-1(8:9)-TRB2가 Inf로서 작용하였기 때문에 형성된 이중체는 절단되지 않았고, 이에, 시간이 경과함에 따라 형광은 증가하지 않았다(도 14B; +RE). Sub1(8:9)-TRB2가 DF1의 전체 서열을 포함하였다는 사실에도 불구하고, 상기와 같은 반응이 일어났다. 이 역시 DF에 존재하는 것인 상기 특이 서열 이외의 것인, Inf Sub1(8:9)-TRB2에 존재하는 서열이 절단가능한 이중체 기질의 형성을 억제하였다. 실제로, 추가 서열을 통해 효소 억제 복합체(EIC)라고 명명되는 절단불가능한 복합체가 형성되었다.
EAS1-5(23)-BF 및 EAS2-5(16)-B만을 함유하고, DF1 및 Sub 1(8:9)-TRB2, 둘 모두는 함유하지 않는 것인 반응 C에서는 형광 증가가 관찰되지 않았는데, 이는 RE에 의한 이중체의 인식 및 절단을 위해서는 상기 두 올리고(EAS1 및 EAS2)만으로는 충분하지 못하다는 것을 나타내는 것이었다(도 14C; +RE). 올리고 EAS1 및 EAS2가 하이브리드화하여 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 형성하지만, 절단불가능한 PESA를 절단가능한 CESA로 전환시키기 위해서는 추가 올리고, 즉, DF가 필요한 것이었다.
마지막으로, 오직 EAS1만을 함유하는 대조군 반응 D에서는 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 상기 구조체가 Mnl I에 대한 인식 서열 중 한 가닥을 포함한다는 사실에도 불구하고 상기 구조체는 쉽게 절단되지 않는다는 것을 나타낸다. EAS1을 포함하는 절단가능한 이중체를 형성하기 위해서는 상보적인 서열이 필요하기 때문에 절단이 일어날 수 없었다.
실시예 2
하기 실시예는 CESA 중 제한 효소 인식 부위를 형성하여 형광 표지된 올리고를 절단하고, 이로써 뉴클레아제(제한 효소) 매개 신호 증폭을 일으키는 다중 올리고뉴클레오티드 단편을 사용하는 것에 기반을 두었다. 뉴클레아제 절단을 통해 신호 증폭이 일어나는 반응을 EzyAmp 반응이라고 명명하였다.
2.1. EzyAmp 올리고뉴클레오티드
상기 EzyAmp 반응을 위해서는 구동자 단편과 함께 조합하여 제한 효소 인식 부위를 형성하는 데에는 두 올리고뉴클레오티드 EAS1 및 EAS2가 필요하였다. 본 실시예에서는, EzyAmp 시스템 1을 사용하여 효소 Mnl I에 대한 제한 효소 인식 부위(RERS)를 형성하였다. EzyAmp 시스템 1(EzyAmp 1)은 효소 증폭제 기질 올리고 1(EAS1-1(20)-JB), 효소 증폭제 기질 올리고 2(EAS2-1(13)), 및 MNA자임 기질 Sub1(Sub1(8:9)-FB)의 절단에 의해 생성된 구동자 단편 1(DF1)로 구성되었다. 본 전략법은 도 5에 도시되어 있다.
이중 표지된 단편의 절단에 의해 EzyAmp 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1(EAS1-1(20)-JB)의 말단을 5' 말단은 JOE 모이어티로, 및 3' 말단은 블랙 홀 소광제 1("BHQ1") 모이어티로 표지하였다. EAS2 EAS2-1(13))를 EAS1-1(20)-JB에 어닐링하였다. 완전하게 조립된 CESA의 RE에 의한 절단을 520 nm (JOE 여기 파장)에서의 여기와 함께 548 nm (JOE 방출 파장)에서 모니터링하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다(상부 가닥 5' NNCCTCN7/3' 및 하부 가닥 3'NNGGAGN6/5'이다.
Figure pct00010
.
2.2. 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 조립 촉진제
구동자 단편 1(DF1)을 생성하기 위해, MNA자임 기질인 Sub1(8:9)-FB를, 합성 표적, 즉, 조립 촉진제, AF-PD1의 존재하에서 형성된 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의해 절단하였다. 조립 촉진제, 및 파트자임 A 및 B의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적 조립 촉진제와 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00011
.
2.3. MNA 자임 기질
이중 표지된 핵산 리포터 MNA자임 기질(Sub1(8:9)-FB)의 절단에 의해 MNA자임 활성을 모니터링하였다. MNA자임 기질 서열은 RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열로서, 이보다 더 긴 장쇄 버전은 앞서 8:17 DNA자임 기질로서 사용된 바 있다(문헌 [Li et al., 2000]). 본 실시예에서, 리포터 MNA자임 기질을 Sub1(8:9)-FB로 지정하고, 그의 말단을 5' 말단은 6-카복시플루오레세인("6-FAM") 모이어티로, 및 3' 말단은 블랙 홀 소광제 1("BHQ1") 모이어티로 표지하였다. Sub1(8:9)-FB의 MNA자임에 의한 절단을 485 nm(FAM 여기 파장)에서의 여기와 함께 530 nm (FAM 방출 파장)에서 모니터링하였다. Sub1(8:9)-FB의 표지된 서열은 하기와 같았다(5'→3' 방향). 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 이탤릭체로 표시된 염기는 절단 후 DF로서의 역할을 하는 단백질에 상응하는 것이다.
Figure pct00012
.
2.4. 반응 성분
형광 표지된 EAS1-1(20)-JB의 RE(20 U Mnl I; 뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의한 절단에 의해 발생되는 형광 신호 증가에 의해 EAS1, EAS2 및 구동자 단편에 의한 CESA의 형성을 측정하였다. 20 nM 표적 조립 촉진제 AF-PD1을 첨가함으로써 테스트 반응을 개시시키고, 대조군 반응은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응은 스마트사이클러® 시스템 열순환 반응기(세피이드)에서 35℃에서 수행하였고, 모든 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 채널 1(FAM) 및 채널 2(Cy3)에서 총 120분 동안 매 72초마다 각 반응에 대한 형광을 판독하여 각각 FAM 및 JOE를 모니터링하였다. 모든 반응은 50 nM의 파트자임 A(PD1A2/1(8)), 50 nM 파트자임 B(PD1B3/1(9)), 50 nM Sub1(8:9)-FB, 50 mM MgCl2 중 100 nM EAS1-1(20)-JB 및 100 nM EAS2-1(13)(앰비온(Ambion)), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다.
2.5. 결과: EAS1 의 절단 검출
표적 조립 촉진제를 테스트 반응에 첨가하자, 파트자임 A 및 B는 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임으로 조립되고, 이는 리포터 MNA자임 기질 Sub1(8:9)-FB를 절단함으로써 (i) 구동자 단편, DF1(DF1 : GGAAGAGAT)이 생성되고, (ii) 시간이 경과함에 따라 검출가능한 신호가 증가하였으며, 상기 신호는 FAM 채널에서 실시간으로 모니터링될 수 있는데, 이는 Sub1(8:9)-FB의 MNA자임 절단을 나타내는 것이다(도 6 (i) 표적 AF-PD1). 이어서, DF는 (EAS1 및 EAS2에 의해 형성된) PESA 복합체에 결합하여 CESA 복합체를 형성할 수 있었는데, 이 복합체는 이중체 기질로서 작용하였고, Mnl I에 의해 절단되었다. 이를 통해 시간이 경과함에 따라 JOE가 증가하는 검출가능한 신호를 얻었으며, 이는 CESA 복합체 내에 존재하는 EAS1이 RE에 의해 절단되었음을 나타내는 것이며, 결국은 표적 AF-PD1이 존재함을 나타내는 것이다(도 6 (iii) 표적 AF-PD1).
어떤 표적 조립 촉진제도 믹스에 첨가되지 않은 것인 대조군 반응에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 형성되지 않았고, 이로써, 리포터 MNA자임 기질 Sub1(8:9)-FB도 절단되지 않고, 어떤 DF도 생성되지 않았고, CESA도 형성되지 않았다. 이에, 시간 경과에 따른 FAM 또는 JOE 신호에서 증가하는 신호는 없었다(도 6 (ii) 및 (iv) 표적 부재 대조군). 이는 MNA자임에 의한 Sub1(8:9)-FB의 절단을 위해서는 CESA가 형성될 수 있도록 DF가 공급되어야 한다는 것을 시사한다. 대조적으로, 상기 표적 부재 반응에서, 그가 절단되지 않은 상태에서는 InF로서의 작용을 하는 Sub1(8:9)-FB와 PESA 사이의 하이브리드화에 의해 EIC가 형성되었다.
실시예 3
본 실시예는 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체 및 관련 올리고뉴클레오티드의 디자인에 관한 전략법을 제공한다.
일례로, 8-17 DNA자임에 기초한 MNA자임에 의한 절단에 적합한 MNA자임 기질은 하기 서열: 5' CTCACTATaGGAAGAGAT 3' (여기서, 대문자는 DNA를 나타내고, 소문자는 RNA를 나타낸다)을 가질 수 있었다. 일단 적절한 조립 촉진제의 존재하에서 MNA자임에 의해 절단되고 나면, 상기 MNA자임 기질은 2개의 단편, 즉, CTCACTATa 및 GGAAGAGAT를 생성하였다. 구동자 단편으로서 3' 올리고뉴클레오티드 단편 5' GGAAGAGAT 3'(3' TAGAGAAGG 5')을 사용하여 CESA 복합체를 생성하는 방법의 예는 하기 표에서 입증된다. 하기 예에서, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N'은 그의 보체이다. EAS1의 서열 및 Sub1(8:9)의 3' 절단 단편(하기 참조)을 약간 수정하면, 상이한 인식 서열을 가진 다양한 다른 제한 효소와 함께 사용되도록 디자인된, 다수의 상이한 PESA와, 이어서, CESA가 생성될 수 있다.
Figure pct00013
.
올리고뉴클레오티드 EAS1은, 제한 효소에 대한 제한 인식 부위가 예를 들어, 상기 제시된 범용 또는 일반 ESA1 서열을 따라 다양한 위치에서 시작되는 서열을 포함할 수 있다.
일례로, RE 부위가 6번 위치에서 시작될 경우, BsaW1에 대한 인식 서열(TCCGGA)은 하기 도시되는 바와 같이 EAS1, EAS2 및 구동자 단편으로 포함될 수 있다(여기서, RER 부위는 밑줄체로 표시).
Figure pct00014
.
별법으로, RE 부위가 7번 위치에서 시작될 경우, Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC)은 하기 도시되는 바와 같이 EAS1, EAS2 및 구동자 단편으로 포함될 수 있다(여기서, RER 부위는 밑줄체로 표시).
Figure pct00015
.
추가 예에서, RE 부위가 8번 위치에서 시작될 경우, Ear1에 대한 인식 서열(CTCTTC)은 하기 도시되는 바와 같이 EAS1, EAS2 및 구동자 단편으로 포함될 수 있다(여기서, RER 부위는 밑줄체로 표시).
Figure pct00016
.
상기와 같은 일반 전략법을 사용할 경우, 상기 DF와 사용하기 위한 후보 RE로는 그의 5' 말단에 C 또는 CC 또는 TCC를 가지는 인식 서열을 포함하는 RE를 포함할 것이다. 따라서, 상기 구동장 단편과 사용하기 위한 것으로서 하기 표에 기재되어 있는 RE(다수의 다른 것도 포함)를 테스트할 수 있다.
Figure pct00017
제시되는 다른 예는 상기 제시된 예에 대해 반대 배향의 것인 같은 구동자 단편을 사용하는 것을 보여주는 것이다. 이러한 경우, 후보 RE는 그 말단에 G 또는 GG 또는 GGA를 가지는 RERS을 포함할 수 있다. 상기 시스템에서 사용하기 위한 EAS1, EAS2 및 DF의 일반 서열은 하기와 같다.
Figure pct00018
일례로, RE 부위가 4번 위치에서 시작될 경우, BstU1에 대한 인식 서열(CGCG)은 하기 도시되는 바와 같이 EAS1, EAS2 및 구동자 단편으로 포함될 수 있다(여기서, 상기 부위는 밑줄체로 표시).
Figure pct00019
임의의 특이 DF와 함께 사용될 수 있는 유용한 제한 효소의 범위는, 절단될 수 있도록 하기 위해서는 인식 서열의 5' 또는 3'에 추가 서열이 존재하여야 한다는 일부 RE의 요건을 이용함으로써 확장될 수 있다.
실시예 4
하기 실시예는 CESA 중 제한 효소 인식 부위를 형성하여 형광 표지된 올리고를 절단하고, 이로써 뉴클레아제(제한 효소) 매개 신호 증폭을 일으키는 다중 올리고뉴클레오티드 단편을 사용하는 것에 기반을 두었다. 뉴클레아제 절단을 통해 신호 증폭이 일어나는 반응을 EzyAmp 반응이라고 명명하였다.
4.1. EzyAmp 올리고뉴 클레오티드
상기 EzyAmp 반응을 위해서는 구동자 단편과 함께 조합하여 제한 효소 인식 부위를 형성하는 데에는 두 올리고뉴클레오티드 EAS1 및 EAS2가 필요하였다. 본 실시예에서는, EzyAmp 시스템 1을 사용하여 효소 Mnl I에 대한 제한 효소 인식 부위(RERS)를 형성하였다. EzyAmp 시스템 1(EzyAmp 1)은 효소 증폭제 기질 올리고 1(EAS1-1(20)), 효소 증폭제 기질 올리고 2(EAS2-1(13)), 및 MNA자임 기질 Sub1의 절단에 의해 생성된 구동자 단편 1(DF1)로 구성되었다. 본 전략법은 도 5에 도시되어 있다.
이중 표지된 단편의 절단에 의해 EzyAmp 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1(EAS1-1(20)-BJ)의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 JOE 모이어티로 표지하였다. EAS2(EAS2-1(13))의 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ")로 표지하고, EAS1-1(20)-BJ에 어닐링하였다. 완전하게 조립된 CESA의 RE에 의한 절단을 520 nm(JOE 여기 파장)에서의 여기와 함께 548 nm (JOE 방출 파장)에서 모니터링하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부(CCTC)를 형성한다.
Figure pct00020
.
4 .2. 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 조립 촉진제
구동자 단편 1(DF1)을 생성하기 위해, MNA자임 기질인 Sub1(8:9)-TRB2를, 합성 표적, 즉, 조립 촉진제(촉진 인자), AF-PD1의 존재하에서 형성된 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의해 절단하였다. 조립 촉진제, 및 파트자임 A 및 B의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적과 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00021
.
4.3. MNA 자임 기질
이중 표지된 핵산 리포터 MNA자임 기질(Sub1(8:9)-TRB2)의 절단에 의해 MNA자임 활성을 모니터링하였다. MNA자임 기질 서열은 RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열로서, 이보다 더 긴 장쇄 버전은 앞서 8:17 DNA자임 기질로서 사용된 바 있다(문헌 [Li et al., 2000]). 본 실시예에서, 리포터 MNA자임 기질을 Sub1(8:9)-TRB2로 지정하고, 그의 말단을 5' 말단은 술포로다민("TXR") 모이어티로, 및 3' 말단은 블랙 홀 소광제 2("BHQ2") 모이어티로 표지하였다. Sub1(8:9)-TRB2의 MNA자임에 의한 절단을 598 nm (TXR 여기 파장)에서의 여기와 함께 617 nm (TXR 방출 파장)에서 모니터링하였다. Sub1(8:9)-TRB2의 표지된 서열은 하기와 같았다(5'→3' 방향). 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 이탤릭체로 표시된 염기는 DF로서의 역할을 할 수 있는 부분에 상응하는 것이다.
Figure pct00022
.
4.4. 반응 성분
형광 표지된 EAS1-1(20)-BJ의 RE(Mnl I)에 의한 절단에 의해 발생되는 형광 신호 증가에 의해 EAS1, EAS2 및 구동자 단편에 의한 CESA의 형성을 측정하였다. 10 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 모든 반응은 스마트사이클러® 시스템 열순환 반응기(세피이드)에서 35℃에서 수행하였고, 모든 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 총 120분 동안 매 72초마다 각 반응에 대한 형광을 판독하여 각각 FAM 및 JOE를 모니터링하였다. 모든 반응은 50 nM 파트자임 A(PD1A2/1(8)), 50 nM 파트자임 B(PD1B3/1(9)),100 nM의 Sub1(8:9)-TRB2, 50 mM MgCl2 중 100 nM EAS1-1(20)-BJ 및 100 nM EAS2-1(13)-B(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 1.2 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 추가로, 테스트 반응은 20 nM 표적 조립 촉진제(AF-PD1)를 함유하였고, 대조군 반응은 H2O를 함유하였다.
4.5. 결과: EAS1 의 절단 검출
표적 조립 촉진제를 테스트 반응에 첨가하자, 파트자임 A 및 B는 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임으로 조립되고, 이는 리포터 MNA자임 기질 Sub1(8:9)-TRB2를 절단함으로써 (i) 구동자 단편, DF1(DF1: GGAAGAGAT)이 생성되고, (ii) 시간이 경과함에 따라 검출가능한 신호가 증가하였으며, 상기 신호는 TXR 채널에서 실시간으로 모니터링될 수 있는데, 이는 Sub1(8:9)-TRB2의 MNA자임 절단을 나타내는 것이다. 이어서, DF는 (EAS1 및 EAS2에 의해 형성된) PESA 복합체에 결합하여 CESA 복합체를 형성할 수 있었는데, 이 복합체는 이중체 기질로서 작용하였고, Mnl I에 의해 절단되었다. 이를 통해 시간이 경과함에 따라 JOE 채널에서 증가하는 검출가능한 신호를 얻었으며, 이는 CESA 복합체 내에 존재하는 EAS1이 RE에 의해 절단되었음을 나타내는 것이며, 결국은 표적 AF-PD1이 존재함을 나타내는 것이다(도 12).
어떤 표적 조립 촉진제도 믹스에 첨가되지 않은 것인 대조군 반응에서, 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임은 형성되지 않았고, 이로써, 리포터 MNA자임 기질 Sub1(8:9)-TRB2도 절단되지 않고, 어떤 DF도 생성되지 않았고, CESA도 형성되지 않았다. 이에, TXR 또는 JOE 채널에서 시간 경과에 따른 신호 증가는 없었다(도 12). 이는 MNA자임에 의한 Sub1(8:9)-TRB2의 절단을 위해서는 CESA가 형성될 수 있도록 DF가 공급되어야 한다는 것을 시사한다. 대조적으로, 상기 반응에서, 그가 절단되지 않은 상태에서는 InF로서의 작용을 하는 Sub1(8:9)-TRB2와 PESA 사이의 하이브리드화에 의해 EIC가 형성되었다.
실시예 5
하기 실시예는 (i) 인식 서열의 특이 염기에 인접한, 그리고, 그 내부에 있는 다양한 지점의 닉에 대해 내성을 띨 수 있고, (ii) 인식 서열의 특이 염기에 인접한 비상보적인 염기에 대해 내성을 띨 수 있고, (iii) 인식 서열과 절단 부위 사이의 비상보적인 염기에 대해 내성을 띨 수 있고, (iv) 인식 서열에 인접하거나, 또는, 그 내부에 있는 리보뉴클레오티드의 존재에 대해 내성을 띨 수 있는 Mnl I의 능력을 입증한다.
5.1. 올리고뉴클레오티드
5.1.1 반응 1: DF 가 결합하면 RERS " GAGG "의 3' 말단 바로 옆 인접한 위치에 닉이 형성된다
하기 반응에서, PESA는 EAS1(EAS1_10_2) 및 EAS2(EAS2_11_2(16))로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하고, 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 그의 3' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2에서 5'GAGG3' 부분 Mnl I 인식 서열 바로 앞의 3' 서열로서 EAS1에 하이브리드화하도록 DF(DF1(8))를 디자인하였다(표 4B). DF는 Mnl I 인식 서열의 일부도 포함하지 않았다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00023
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5.1.2 반응 2: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 3' 말단 내에 1개의 염기로 된 닉이 형성된다
하기 반응에서, PESA는 EAS1(EAS1_10_2) 및 EAS2(EAS2_11_2(15))로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하고, 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 그의 3' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GAG3')을 포함하였다. EAS2에 인접한 EAS1에 하이브리드화하도록 DF(DF1(9))를 디자인하였다. DF는 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(3' G)을 포함하였고, 이는 EAS2로부터 누락된 1개의 염기를 부가함으로써 그를 완성시켰다(표 4C). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00024
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5.1.3 반응 3: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 3' 말단 내에 2개의 염기로 된 닉이 형성된다
하기 반응에서, PESA는 EAS1(EAS1_10) 및 EAS2(EAS2_11)로 구성되었다.
EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하고, 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 그의 3' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GA3')을 포함하였다. EAS2에 인접한 EAS1에서 하이브리드화하도록 DF(DF1)를 디자인하였고, 이는 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GG3')을 포함하였고, 이는 EAS2로부터 누락된 2개의 염기(GG)를 부가함으로써 그를 완성시켰다(표 4D). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00025
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5.1.4 반응 4: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 에 1개의 닉과 1개의 리보뉴클레오티드 염기인 2개의 염기가 형성된다
하기 반응에서, EAS1(Re1F1(20T)(20)-BJ) 및 EAS2(Re1S1(1A)(13)-5-B)로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 Joe_N("JOE") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하고, 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GA3')을 포함하였다. EAS2에 인접한 EAS1에 어닐링되도록 DF(rRe1S1(9)-3)를 디자인하였다. DF는 그의 5' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GG3')을 포함하였고, 이는 EAS2로부터 누락된 2개의 염기를 부가함으로써 그를 완성시켰다. DF는 또한 리보뉴클레오티드를 인식 서열 내로 도입하기 위해 리보뉴클레오티드(Gg)를 포함하였다(표 4E). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성하고, 리보뉴클레오티드 염기는 소문자 g로 표시되어 있다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00026
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5.1.5 반응 5: DF 가 결합하면 부분 RERS GAGG 의 3' 말단 내에 3개의 염기로 된 닉이 형성된다
하기 반응에서, EAS1(EAS1_10_2) 및 EAS2(EAS2_11_2(13))로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하고, 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 그의 3' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'G3')을 포함하였다. EAS2에 인접한 EAS1에 하이브리드화하도록 DF(DF1(11))를 디자인하였고, 이는 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'GGA3')을 포함하였고, 이는 EAS2로부터 누락된 3개의 염기를 부가함으로써 그를 완성시켰다(표 4F). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00027
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5.1.6 반응 6: DF 가 결합하면 RERS " GAGG "의 5' 말단 바로 옆 인접한 위치에 닉이 형성된다
DF가 인식 서열 및 절단 서열의 일부를 형성하였다. 하기 반응에서, PESA는 EAS1(Mnl I/DFS_F1-BF) 및 EAS2(Mnl I/DFS_F2)로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 어닐링되도록 디자인하였다. EAS2는 그의 5' 말단에 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2에서 5'-GAGG3' Mnl I 인식 부위의 상류쪽으로 바로 옆에 5' 서열로서 EAS1에 하이브리드화하도록 DF(Mnl I/DFS_DF)를 디자인하였다. DF는 Mnl I 인식 서열의 일부도 포함하지 않았지만, 절단 부위는 포함하였다(표 4G). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00028
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5.1.7 반응 7: DF 가 결합하면 부분 RERS GAGG 의 5' 말단으로부터 상류쪽으로 2개의 염기로 된 닉이 형성된다. DF 가 절단 부위의 일부를 형성하였다 .
하기 반응에서, PESA는 EAS1(Mnl IDFS_F1-BF) 및 EAS2(Mnl I/DFS_F2(13))로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 하이브리드화하도록 디자인하였고, 이는 5GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열과, 상기 서열에 대하여 5' 방향에 2개의 가외 염기를 포함하였다. EAS2의 5' 말단으로부터 상류쪽으로 2개의 염기만큼 떨어진 위치의 EAS1에 하이브리드화하도록 DF(Mnl I/DFS_DF(8))를 디자인하였다. 상기 DF는 Mnl I 인식 서열의 일부도 포함하지 않았지만, 절단 부위는 포함하였다(표 4H). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00029
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5.1.8 반응 8: DF 가 결합하면 부분 RERS " CCTC "의 5' 말단 내에 2개의 염기로 된 닉이 형성된다
하기 반응에서, PESA는 EAS1(EAS1_28) 및 EAS2(EAS2_27)로 구성되었다. EAS1은 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였고, 이는 5'GAGG3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 포함하였다. EAS2를 EAS1에 하이브리드화하도록 디자인하고, 3' 말단을 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2는 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'TC3)을 포함하였다. 인식 서열과 절단 부위 사이에 단일의 비상보적인 염기 쌍이 생성되도록 EAS2를 디자인하였다. EAS1에 하이브리드화하도록 DF(DF-3EAS2_26)를 디자인하였고, 이는 5'CCTC3인 부분 Mnl I 인식 서열의 단편(5'CC3')을 포함하였고, 이는 EAS2로부터 누락된 2개의 염기를 부가함으로써 그를 완성시켰다(표 4I). 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열의 적어도 일부를 형성한다. Mnl I에 대한 인식 서열에 기여하는 염기는 5' CCTC(N)7/3' 및 3' GAGG(N)6/5'이다(여기서, /는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00030
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5.2 반응 성분
형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 대한 반응으로 발생되는 형광 신호 변화를 측정함으로써 EAS1, EAS2 및 DF로 구성된 후보 CESA의 RE Mnl I에 의한 절단을 모니터링하였다. 100 nM의 the DF를 첨가함으로써 테스트 반응을 개시시키고, 대조군 반응은 물을 첨가함으로써 개시시켰다(대조군 반응은 어떤 DF도 포함하지 않았다). 반응을 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(CFX96™ Real-Time PCR Detection System)(바이오래드(Bio-Rad))에서 수행하였고, 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 반응을 2중으로 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies: IDT)로부터 구입하였다. 반응은 각각 100 nM의 EAS1, 100 nM의 EAS2, 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 뉴클레아제 무함유 물(앰비온)을 함유하였다. 각 반응에 대한 변형은 하기 표 7에 열거되어 있다.
Figure pct00031
5.3 결과: CESA 의 절단 검출
DF를 테스트 반응에 첨가하자, DF는 (EAS1 및 EAS2에 의해 형성된) PESA 복합체에 결합할 수 있었다. 이는 RE인 Mnl I에 대한 완전 제한 부위를 포함하는 CESA 복합체를 형성하였다. 형광 신호의 증가가 후보 CESA 복합체의 절단을 나타내었다.
5.3.1: DF 가 결합하면 RERS " GAGG "의 3' 말단 바로 옆 인접한 위치에 닉이 형성된다
DF가 반응 1에 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.1(i)). 이는 DF의 결합으로 5' GAGG 3'인 Mnl I RERS의 3' 말단 바로 옆 인접한 위치에 닉이 형성되었을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다. 본 실시예에서, PESA는 전체 RERS 뿐만 아니라, 절단 부위도 포함하였고, 이로써, 비록 효율이 더 낮기는 하지만, 이는 또한 Mnl I에 의해 절단되었다. 따라서, DF의 부재하에서도 형광은 비록 DF를 포함하는 반응보다는 그 속도가 느리기는 하지만, 여전히 증가하였다(도 15.1(ii)).
5.3.2: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 3' 말단 내에 1개의 염기로 된 닉 이 형성된다
DF가 반응 2에 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.2(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.2(ii)). 이는 DF가 PESA 내에 5' GAGG 3' 부분 Mnl I 인식 서열의 마지막 3' 염기(G)를 공급함으로써 상기 서열을 완성하였을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
5.3.3: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 3' 말단 내에 2개의 염기로 된 닉이 형성된다
DF가 반응 3에 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.3(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.3(ii)). 이는 DF가 PESA 내에 5' GAGG 3' 부분 Mnl I 인식 서열의 마지막 2개의 3' 염기(GG)를 공급함으로써 상기 서열을 완성하였을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
5.3.4: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG " 내에 1개의 닉과 1개의 리보뉴클레오티드 염기인 2개의 염기가 형성된다
DF가 반응 4에 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.4(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.4(ii)). 이는 DF가 PESA 내에 5' GAGG 3' 부분 Mnl I 인식 서열의 마지막 2개의 3' 염기(GG)를 공급함으로써 상기 서열을 완성하였을 때, 심지어, 제2 염기가 리보뉴클레오티드(Gg)일 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
5.3.5: DF 가 결합하면 부분 RERS " GAGG "의 3' 말단 내에 3개의 염기로 된 닉 이 형성된다
DF가 반응 5에 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.5(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.5(ii)). 이는 DF가 PESA 내에 5' GAGG 3' 부분 Mnl I 인식 서열의 마지막 3개의 3' 염기(GGA)를 공급함으로써 상기 서열을 완성하였을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
5.3.6 DF 가 결합하면 RERS " GAGG "의 5' 말단 바로 옆 인접한 위치에 닉이 형성된다
DF가 인식 서열 및 절단 서열의 일부를 형성하였다. DF의 존재하에서(도 15.6(i)) 또는 DF의 부재하에서(도 15.6(h)) 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 DF가 5' GAGG 3'인 부분 Mnl I 인식 서열로부터 상류쪽으로 바로 옆에 EAS1의 3' 말단에 결합하였을 때, 어떤 절단가능한 CESA도 형성되지 않았다는 것을 나타낸다. DF를 첨가하면, 가능하게는 DF의 EAS1에의 하이브리드화에 기인하여 PESA에 대해 소광 효과를 나타냄으로써 가요성은 더 작고, 소광 정도는 더 우수한 구조체를 유도하였다.
5.3.7 DF 가 결합하면 RERS " GAGG "의 5' 말단으로부터 상류쪽으로 2개의 염기로 된 닉이 형성된다.
DF가 인식 서열 및 절단 서열의 일부를 형성하였다. 반응 7에서, DF가 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.7(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.7(ii)). 이는 DF가 PESA 내에 5' GAGG 3' 부분 Mnl I 인식 부위의 상류쪽으로 2개의 염기만큼 떨어진 위치의 서열에 결합하고, 절단 부위 중 하나를 제공하였을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
5.3.8 DF 가 결합하면 부분 RERS " CCTC "의 5' 말단 내에 2개의 염기로 된 닉이 형성된다
반응 8에서, DF가 첨가되었을 때, 시간 경과에 따른 형광은 증가하였다(도 15.8(i)). 대조적으로, DF가 첨가되지 않았을 때에는 시간 경과에 따른 신호 증가는 관찰되지 않았다(도 15.8(ii)). 이는 DF가 5' 말단으로부터 2개의 염기(CC)에 의해 5'CCTC3'인 부분 Mnl I 인식 서열을 완성하였을 때, Mnl I에 의해 절단가능한 CESA가 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
종합해 볼 때, 당업자가 절단가능한 CESA 구조체를 생성할 수 있도록 PESA 및 상응하는 DF를 디자인할 수 있는 방법은 상당히 유연적이라는 것이 반응 1부터 8까지의 결과를 통해 입증되었다. PESA를 CESA로 전환시킬 수 있는 DF 중에 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있는 능력은 특히 주목할 만하다(도 15.4(i)). 리보뉴클레오티드를 함유하는 DF를 사용할 수 있는 능력은 EzyAmp 반응을 개시시킬 수 있는 다양한 MNA자임을 사용할 수 있는 능력을 확장시켜 준다. 10:23 DNA자임으로부터 유도된 MNA자임을 사용하여 표적에 특이적인 방식으로 기질을 절단하여 DF 또는 DF들을 직접 생성하는 포맷에서, 절단된 두 단편은 모두 그의 절단된 말단에 둘 모두 리보뉴클레오티드를 포함할 것이다. 리보뉴클레오티드는 RERS 내에서 내성을 띨 수 있기 때문에, 상기 절단된 단편은 EzyAmp 반응에서 DF로서 유용할 것이다.
실시예 6
하기 실시예는 특이 효소에 의해 절단가능하거나, 절단가능하지 않은 다양한 이중체 구조체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증한다. 뉴클레아제에 의해 절단가능한 구조체는 이중체 기질, 예컨대, CESA 복합체이고, 본 실시예에서, 뉴클레아제는 제한 효소(RE)이다.
6.1. 올리고뉴클레오티드
하기 반응을 위해, 올리고뉴클레오티드 단편을 조합하고, 이중체 기질을 절단할 수 있는 다양한 RE의 능력을 테스트하기 위한 기질로서 사용하였다. CESA, PESA 및 EIC의 예시적인 구조체는 도 1에 도시되어 있다. 본 실시예에서, 다양한 이중체는 스크리닝된 특이적인 RE에 대한 RERS의 한 가닥을 형성하는 데 필요한 염기 모두를 포함하는 한 올리고뉴클레오티드를 포함하였다.
표지된 복합체의 절단에 의해 RE 절단 활성을 모니터링하였는데, 여기서, 형광단 및 소광제는 형광단과 소광제 사이의 물리적인 분리를 통해 검출가능한 신호가 발생될 수 있도록 복합체 상에 배치시켰다. 본 실시예에서, EAS1로 지정된 효소 증폭제 기질 올리고 1을 형광단 및 소광제로 표지하고, 이는 추가로 각 RE에 대한 RERS의 한 가닥을 형성하는 데 필요한 염기 모두에 상응하는 서열을 포함하였다. RE1F1(20)-JB는 5' 말단을 JOE로, 및 3' 말단을 BHQ로 표지하였다. EAS7-1(21)-FB는 5' 말단을 6-FAM으로, 및 3' 말단을 IaBFQ로 표지하였다. REF4F1-F1B는 내부의 4번 위치를 플루오레세인으로, 및 내부의 15번 위치를 IaBFQ로 표지하였다. EAS1-4(16)-BF는 5' 말단을 IaBFQ로, 및 3' 말단을 6-FAM으로 표지하였다. EAS5-1(18)-BF는 5' 말단을 IaBFQ로, 및 3' 말단을 6-FAM으로 표지하였다. EAS3-1(18)-BF는 5' 말단을 IaBFQ로, 및 3' 말단을 6-FAM으로 표지하였다.
EAS2로 지정된 제2 효소 증폭제 기질 올리고는 부분 RERS를 포함하였고, EAS1에 어닐링하였으며, 일부 경우에는 소광제 모이어티로 표지하였는데, 예를 들면, EAS6-1(10)-B는 5' 말단을 IaBFQ로 표지하였다. EAS1 및 EAS2는 함께 PESA 복합체의 구조상 등가물을 형성하였다(도 1C). 구동자 단편(DF)의 구조상 등가물에 상응하는 제3 단편의 하이브리드화를 통해, 기능면에서 반드시 그렇지는 않지만, 구조상으로는 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체와 등가인 이중체 구조체가 형성되었다(도 1A). 별법으로, 억제 단편(InF)의 구조상 등가물에 상응하는 제3 단편의 하이브리드화를 통해, 기능면에서 반드시 그렇지는 않지만, 구조상으로는 효소 억제 복합체(EIC)와 등가인 이중체 구조체가 형성되었다(도 1B). 일부 경우에, InF를 형광단 및/또는 소광제 모이어티로 표지하였다. Sub1(8:9)TRB2는 5' 말단을 텍사스 레드 형광단으로, 3' 말단을 BHQ2로 표지하였고; RE1S1(1A)(13)-5-B는 5' 말단을 IaBFQ로 표지하였다. 마지막으로, EAS1의 완전 보체 RE 인식 서열 모두를 포함하는 안티센스 대조군 가닥(ASC: Antisense Control strand)을 온전한 이중체의 RE 절단을 위한 양성 대조군으로서 포함하였다. 일부 경우에, ASC를 소광제 모이어티로 표지하였는데, 예를 들면, ASC-EAS6-1(8)-B은 5' 말단을 IaBFQ로 표지하였다.
적절한 채널에서 EAS1 상에 존재하는 형광단에 대해 다양한 RE가 상기 기술된 완전하게 조립된 이중체 구조체를 절단할 수 있는 능력, 또는 그러한 능력 부재에 관하여 모니터링하였다. 각 반응에 존재하는 상기 올리고뉴클레오티드의 명칭은 하기 표 8에 5'→3' 방향으로 열거되어 있다. RE의 인식 서열에 기여하는 염기는 하기 표 9에서 제공한다(여기서, '/'는 절단 부위를 표시한다).
[표 8]
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034

표 8 중의 각 올리고에 대한 서열은 하기 표 9에서 제공한다.
[표 9]
Figure pct00035
Figure pct00036
6.2. 반응 성분
하기 표 10에 열거된 하기 올리고뉴클레오티드 단편을 포함하도록 반응 A, B, C, D, E 및 F를 설정하였다.
Figure pct00037
모든 반응은 1 x NEB 완충제중 100 nM의 EAS1(표 11) 및 명시된 수치만큼의 유니트로 RE(표 11)를 함유하였다. 추가로, 반응 A는 각각 100 nM의 EAS2 및 DF를 함유하였고; 반응 B는 각각 100 nM의 EAS2 및 InF를 함유하였고; 반응 C는 100 nM의 EAS2를 함유하였고; 반응 D는 오직 EAS1만을 함유한 반면; 반응 E 및 F는 100 nM의 ASC를 함유하였다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 구입하였다. 일부 반응은 또한 상기의 특정 RE 사용에 따른 제조사의 권고 사항에 의해 지시되는 바와 같이 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 첨가하는 것을 포함한다. 반응 A 내지 E에 대한 구체적인 반응 조건은 하기 표 11에 제시되어 있다. 각 반응 F는 RE가 믹스에 첨가되지 않았다는 점을 제외하면, 반응 E와 동일하였다. RE에 의한 형광 표지된 EAS1의 절단에 기인하는 그의 변형과 관련된 형광 신호 변화를 모니터링함으로써 다양한 올리고 구조체의 절단, 또는 그의 부재를 측정하였다. 모든 반응 A, B, C, D, E 및 F는 명시된 온도하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였고, 모든 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 각 반응에 대한 형광을 총 100회의 사이클 동안 매 1초마다 판독하도록 프로그래밍하였다. 모든 반응을 2중으로 수행하였다.
Figure pct00038
6.3. 결과: 절단 검출
반응 A-F의 경우, 형광 증가가 검출되었다면, 이는 형광단 및 소광제가 분리되었음을 나타내는 것이고, 이는 하기 표 12에 '절단'으로 기록되었다. 어떤 형광 증가도 검출되지 않은 경우, 이는 형광단 및 소광제가 분리되지 않았음을 나타내는 것이고, 이는 하기 표 12에 '비절단'으로 기록되어 있다.
결과
RE 반응
A		 반응
B		 반응
C		 반응
D		 반응
E		 반응
F
PmeI 절단 비절단 비절단 비절단 절단 비절단
RsaI 절단 비절단 비절단 비절단 절단 비절단
Hpy8I 절단 비절단 비절단 비절단 절단 비절단
BssKI 절단 절단 절단 절단 절단 비절단
Styd4I 비절단 비절단 비절단 비절단 절단 비절단
EarI 절단 절단 비절단 비절단 절단 비절단
MspI 절단 절단 비절단 비절단 절단 비절단
AlwI 절단 절단 절단 비절단 절단 비절단
EAS1과, 그의 완전 상보적인 가닥, ASC를 포함하는 모든 양성 대조군 반응 E에서는 시간 경과에 따른 형광 신호의 증가가 관찰되었는데, 이는 상기 구조체가 쉽게 절단될 수 있다는 것을 나타낸다. 각각의 RE가 이중 가닥 복합체를 인식 및 절단할 수 있기 때문에 절단이 일어날 수 있었다. 반대로, 예상된 바와 같이, EAS1과, 그의 완전 상보적인 가닥, ASC는 포함하지만, 어떤 RE도 포함하지 않는 음성 대조군 반응 F의 경우에는 어떤 형광 신호 증가도 관찰되지 않았다.
다양한 완전 및 부분 이중체 구조체의 절단과 관련하여, RE는 다양한 RE에 의해 절단된 올리고 구조에 따라 4개의 기본 패턴(I 내지 IV) 중 하나로 나뉘었다. 각 패턴에 따라 작용하는 효소의 일례는 도 16에 도시되어 있다. 표 12에 제시된 상기 결과가 가지는 의미는 하기 표 13에 요약되어 있다.
패턴 예 본 실험을 위한 구체적인 스크리닝 조건하에서의 작용
(동일 조건하의) EzyAmp 에서의 유용성
I Styd4I 본 효소는 닉이 있는 RERS를 포함하는 이중 가닥 구조체를 절단하지 못하였고(즉, CESA를 절단하지 못하였고), 따라서, 이는 본 실시예에서 테스트되는 반응 조건하의 EzyAmp 검정법에 대해서는 유용하지 않을 것이다.
II PmeI,
RsaI,
Hpy8I		 본 효소는 닉이 있는 RERS를 포함하는 이중 가닥 구조체를 인식하고 절단하였지만(즉, CESA 복합체를 절단하였지만), RERS를 완성하기 위해 InF를 사용하는 구조체를 절단하지 못하였는 바(즉, EIC 복합체를 절단하지 못하였는 바), 이에 본 효소는 단일 튜브, 용액 중 검정법을 비롯한 EzyAmp 검정법에 대해서는 유용할 것이다.
III EarI,
MspI		 본 효소는 닉이 있는 RERS를 포함하는 이중 가닥 구조체를 인식하고 절단하였을 뿐만 아니라(즉, CESA를 절단하였을 뿐만 아니라), RERS를 완성하기 위해 InF를 사용하는 구조체도 절단하였다(즉, 상기 효소는 EIC 복합체와 등가인 구조체를 절단하였다). 테스트된 반응 조건하의, 개시 단편이 제1 PESA로부터 물리적으로 분리되어 있는 것인 EzyAmp 시스템에서, 예를 들어, 성분이 테더링되어 있거나(예컨대, 도 20), 또는 분리형 챔버에 존재하는 것인 검정법에서 유용할 것이다.
IV BssKI,
AlwI		 본 효소는 CESA, EIC 및 PESA 복합체를 절단하는 바, 상기 효소가 스크리닝되었던 조건 및 완충 시스템을 사용하는 EzyAmp 반응에 포함시키는 것은 적합하지 않을 것이다.
그러나, 각 RE의 작용은 이온 강도, pH, Mg 농도 및 RE 농도를 비롯한 다수의 인자에 따라 매우 달라질 수 있고, 따라서, 상기와 같은 분류 및 패턴은 오직 상기 반응 조건하에서만 이러한 RE에 관련되는 것일 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 그럼에도 불구하고, 본 실험은 EzyAmp 반응을 개발하는 데 사용될 수 있게 그를 적합화하기 위한 목적으로 뉴클레아제가 그러한 패턴으로 이중체 구조체를 절단할 수 있도록 뉴클레아제와 적합한 반응 조건의 조합을 찾아내는 스크리닝 검정법을 설정할 수 있는 과정을 보여준다.
실시예 7
하기 실시예는 2개의 상이한 CESA 복합체(CESA A 및 CESA B)가 그의 각각의 DF 중 어느 하나에 의한 개시에 대한 반응으로 상기 CESA 복합체의 완성 후 하나의 반응 튜브 내에서 단일 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 능력을 입증한다. 본 반응의 전략법은 도 17A에 도시되어 있다. 본 실시예에서, CESA는 각각의 CESA의 절단으로 다른 CESA에 대한 새로운 DF가 생성될 수 있도록 디자인되었다. 본 실시예에서, CESA A 및 CESA B를 상이한 형광단으로 표지하여, 각 CESA의 절단에 의해 발생된 형광 신호가 독립적으로 모니터링될 수 있도록 하였다.
7.1 올리고뉴 클레오티드
하기 반응에서, CESA A는 PESA A 및 DF-a(DF1)로 구성된 반면, CESA B는 PESA B 및 DF-b(DF-3EAS1_11)로 구성되었다. 결국, PESA A는 EAS1A(EAS1_10) 및 EAS2A(EAS2_11)로 구성되었고, PESA B는 EAS1B(EAS1_12) 및 EAS2B(EAS2_13)로 구성되었다. PESA A의 EAS2A는 그 안에 DF-b의 서열에 등가인 영역을 포함하였고, PESA B의 EAS2B는 그 안에 DF-a의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 본 실험은, DF-a 또는 DF-b가 반응 개시 시점에 첨가된 후, 각 DF가 반응 동안 각각 CESA B 또는 CESA A의 절단에 의해 생성될 수 있도록 디자인하였다. 본 과정에 대한 개략도는 도 17A에 도시되어 있다.
형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 JOE 모이어티로 표지하였다. EAS2A는 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, EAS1A에 어닐링시켰다. EAS1B는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인(6"FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2B는 3' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, EAS1B에 어닐링시켰다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF와 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00039
.
7.2 반응 조건
올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다. 모든 반응은 각각의 100 nM EAS1_10, EAS2_11, EAS1_12, EAS2_13 및 10 mM MgCl2(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 0.75 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 반응 A는 100 nM DF1(I) 또는 등가량의 물(II)을 첨가함으로써 개시시키고, 반응 B는 100 nM DF3ESA1_11(III) 또는 등가량의 물(IV)을 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 각각 FAM 및 JOE를 모니터링하기 위해 채널 1(FAM) 및 채널 2(HEX), 둘 모두에서 동시에 형광 신호를 측정하였다. 반응을 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 150회의 사이클 동안 매 1초 후 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: 모든 채널). 총 진행 시간은 40분이었다. 모든 반응을 2중으로 수행하였다.
7.3 결과: CESA A 및 CESA B의 절단 검출
각 반응에 대한 형광 변화를 시간에 대해 플롯팅하고, 이를 도 17B에 나타내었다. 반응 A에서, DF-a를 첨가한 결과, 시간 경과에 따른 JOE 형광 증가로 나타난 바와 같이(반응 A(ii) JOE: CESA A + DF-a), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA A 이중체 기질이 형성되었다. 동시에, 상기 반응에서는 시간 경과에 따른 FAM 형광 증가도 또한 관찰되었는데, 이는 CESA A 절단으로부터 DF-b가 생성되고, 같은 RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA B 이중체 기질이 형성되었다는 것을 나타내는 것이다(반응 A(i) FAM: CESA B + DF-a). 대조적으로, DF-a가 첨가되지 않은 대조군 반응에서는 어떤 JOE 또는 FAM 형광 증가도 관찰되지 않았는데(반응 A(II) DF-a 부재 대조군), 이는 개시 DF-a의 부재하에서는 CESA A 또는 CESA B 중 어느 것도 형성되지 않았다는 것을 나타내는 것이다.
반응 B에서, DF-b를 첨가한 결과, 시간 경과에 따른 FAM 형광 증가로 나타난 바와 같이(반응 B(v) FAM: CESA B + DF-b), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA B 이중체 기질이 형성되었다. 동시에, 상기 반응에서는 시간 경과에 따른 JOE 형광 증가도 또한 관찰되었는데, 이는 CESA B 절단으로부터 DF-a가 생성되고, 같은 RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA B 이중체 기질이 형성되었다는 것을 나타내는 것이다(반응 B(vi) JOE: CESA A + DF-b). 대조적으로, DF-b가 첨가되지 않은 대조군 반응에서는 어떤 JOE 또는 FAM 형광 증가도 관찰되지 않았는데(반응 B(IV) DF-b 부재 대조군), 이는 개시 DF-b의 부재하에서는 CESA A 또는 CESA B 중 어느 것도 형성되지 않았다는 것을 나타내는 것이다.
PESA A(EAS1A 및 EAS2A)와 EAS2B(상기와 관련하여 InF로서 작용) 사이, 및/또는 PESA B(EAS1B 및 EAS2B) 및 EAS2A(상기와 관련하여 InF로서 작용) 사이의 하이브리드화에 의해 추가의 절단불가능한 EIC 복합체 또한 형성될 수 있을 것으로 예상되었다.
종합해 보면, DF-a를 첨가하면, CESA A가 형성될 수 있고, 이로써 상기 CESA A는 Mnl I에 의해 절단됨으로써 추가로 a) JOE 형광을 증가시키고, b) EAS2A 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 DF-b 단편을 생성함으로써, 결국은 CESA B를 형성하고, 이로써, CESA B를 Mnl I에 의해 절단할 수 있고, 및 동시에 c) FAM 형광을 증가시킬 수 있고, d) EAS2B 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 DF-a 단편을 생성할 수 있다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다. 추가로, 반응 B에 DF-b를 첨가하면, CESA B가 형성될 수 있고, 이로써 상기 CESA B는 Mnl I에 의해 절단됨으로써 추가로 a) FAM 형광을 증가시키고, b) EAS2B 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 DF-a 단편을 생성함으로써, 결국은 CESA A를 형성하고, 이로써, CESA A를 Mnl I에 의해 절단할 수 있고, 및 동시에 c) JOE 형광을 증가시킬 수 있고, d) EAS1B 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 DF-b 단편을 생성할 수 있다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다. 따라서, CESA A 및 CESA B, 둘 모두는 그의 각각의 구동자 단편의 첨가에 의해 형성될 수 있고, 각 CESA의 절단은 다른 PESA를 완성할 수 있는 구동자 단편을 생성할 수 있다.
실시예 8
하기 실시예는 2개의 상이한 헤어핀 구조의(hair-pinned) CESA 복합체(CESA A 및 CESA B)가 그의 각각의 DF 중 어느 하나에 의한 상기 복합체의 완성 후 하나의 반응 튜브 내에서 단일 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 능력을 입증한다. 본 실시예에서, PESA A 및 PESA B는 5'→3' 방향으로 EAS1, 연결 서열 및 EAS2를 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드로 구성되었다. PESA A 및 PESA B는 분자내 헤어핀를 형성할 수 있다. 본 전략법을 도 18 패널 A에 도시되어 있다. 추가로, 본 실시예에서, 헤어핀 구조의 CESA는 각각의 CESA의 절단으로 다른 CESA에 대한 새로운 DF가 생성될 수 있도록 디자인되었다. 본 실시예에서, 생성된 CESA의 절단에 의해 발생되는 형광 신호가 상가 효과를 띠도록 PESA A 및 PESA B, 둘 모두를 같은 형광단으로 표지하였다.
8.1. 올리고뉴 클레오티드
하기 반응에서, CESA A는 PESA A(PESA_35) 및 DF-a(D1F-3Sub1)로 구성되고; CESA B는 PESA B(PESA_36) 및 DF-b(DF-3PESA_35)로 구성되었다.
PESA A(PESA_35)는 헤어핀을 형성할 수 있고, 이는 그 안에 DF-b의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. PESA B(PESA_36) 또한 헤어핀을 형성할 수 있고, 이는 그 안에 DF-a의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 본 실험은, 피드백 캐스케이드 반응에서 DF-a 또는 DF-b가 첨가되어 반응을 개시시킬 수 있고, 두 DF 모두 반응 동안 각각 CESA A 또는 CESA B의 절단에 의해 생성될 수 있도록 디자인하였다.
본 실시예에서, 각각 이중 표지된 PESA의 절단과 관련된 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, PESA A(PESA_35)는 그의 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, 내부를 (22번 위치의 T 염기상에서) 플루오레세인 모이어티로 표지하였고, PESA B(PESA 36)는 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, 내부를 (21번 위치의 T 염기상에서) 플루오레세인 모이어티하였다.
상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF와 등가인 것을 나타낸다. 내부 플루오레세인의 위치는 굵은체로 표지되어 있다. 5' 말단 상의 박스로 표시된 염기는 EAS1을 나타내고, 3'측의 박스로 표시된 염기는 EAS2를 나타낸다.
Figure pct00040
.
8.2. 반응 성분
올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다. 모든 반응은 뉴클레아제 무함유 물(앰비온), 1 NE버퍼 4, 1 x BSA 및 0.75 U Mnl I(이들 모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 반응의 총 부피는 25 ㎕로 이루어졌으며, 반응을 2중으로 수행하였다.
반응(i)은 100 nM PESA_35 & 10 nM DF1을 함유하였고; 반응(ii)는 100 nM PESA_35를 함유하였고; 반응(iii)은 100 nM PESA_36 및 10 nM DF-3PESA_35를 함유하였고; 반응(iv)는 100 nM PESA 36을 함유하였고; 반응(v)는 100 nM PESA 35, 100 nM PESA_36 & 10 nM DF1을 함유하였고; 반응(vi)은 100 nM PESA_35, 100 nM PESA_36 & 10 nM DF-3PESA 35를 함유하였고; 반응(vii)은 100 nM PESA 35 & 100 nM PESA_36을 함유하였고; 반응(viii)은 100 nM PESA_35, 100 nM PESA_36, 100 nM DF1 및 100 nM DF-3PESA_35를 함유하였다.
반응을 33℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광을 60회의 사이클 동안 매 5초마다 판독한 후(스캔 모드 FAM/SYBR; 채널 1 FAM), 이어서, 100회의 사이클 동안 매 25초 후 판독하였다(스캔 모드 FAM/SYBR; 채널 1 FAM). 총 진행 시간은 65분이었다. 같은 개수, 유형, 및 농도의 PESA를 포함하지만, 개시 DF는 포함하지 않는 각각의 상응하는 반응의 사이클 1회차의 값으로 형광을 정규화하였다.
8.3. 결과: PESA _35 및 PESA _36의 절단 검출
반응(i)에서, 헤어핀 PESA A와 함께 DF-a를 첨가한 결과, 시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이(도 18B; 반응(i)), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA A 이중체 기질이 형성되었다. 대조적으로, PESA A는 첨가되었지만, DF-a는 첨가되지 않은 반응(ii)에서, 시간 경과에 따른 형광 증가는 없는 것으로 나타난 바와 같이(도 18B; 반응(ii)), 절단가능한 CESA A 이중체 기질은 형성되지 않았다.
반응(iii)에서, 헤어핀 PESA B와 함께 DF-b를 첨가한 결과, 시간 경과에 따른 형광 증가로 나타난 바와 같이(도 18B; 반응(iii)), RE Mnl I에 대한 절단가능한 CESA B 이중체 기질이 형성되었다. 대조적으로, PESA B는 첨가되었지만, DF-b는 첨가되지 않은 반응(iv)에서, 시간 경과에 따른 형광 증가는 없는 것으로 나타난 바와 같이(도 18B; 반응(iv)), 절단가능한 CESA B 이중체 기질은 형성되지 않았다.
반응(v)에서, PESA A 및 PESA B, 둘 모두를 함유하는 믹스에 DF-a를 첨가하였을 때, 반응(i)과 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 형광 증가는 거의 배가된 결과를 얻었다(도 18B; 반응(v)). 이는 CESA A 절단 후 DF-b가 유리되고, 이어서, DF-b는 PESA B에 하이브리드화하여 CESA B를 형성하고, 결국에는 절단됨으로써 추가의 DF-a가 유리될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 반응(vi)에서, PESA A 및 PESA B, 둘 모두를 함유하는 믹스에 DF-b를 첨가하였을 때, 이 또한 반응(iii)과 비교하였을 ?, 시간 경과에 따른 형광 증가는 거의 배가된 결과를 얻었다(도 18B; 반응(vi)). 이는 CESA B 절단 후 DF-a가 유리되고, 이어서, DF-a는 PESA A에 하이브리드화하여 CESA A를 형성하고, 결국에는 절단됨으로써 추가의 DF-b가 유리될 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 어떤 DF도 첨가되지 않은, PESA A 및 PESA B로 이루어진 믹스를 함유하는 대조군 반응(vii)에서는 시간 경과에 따른 형광 증가는 없었다(도 18B; 반응(vii)). 이는 어느 DF 부재하에서도 PESA A 및 PESA B 사이에는 절단가능한 CESA 구조체가 형성될 수 없다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 반응(viii)(도 18B)은 두 PESA 모두가 이용가능한 DF를 포함하도록 DF-a, DF-b, PESA A 및 PESA B가 같은 농도로 (각각 100 nM씩) 혼합된 양성 대조군으로서 디자인되었다. 따라서, 모든 PESA는 CESA를 형성하여야 하고, 절단을 통해 상기 시스템에서 수득할 수 있는 최대 형광 변화를 일으켜야 했다. 반응(viii)의 반응 속도는 반응(v) & (vii)에 비하여 더 빠른 것으로 나타났지만, 최종 형광은 반응(v) 및 (vii)에서 관찰된 값과 유사하였다. 이는 10 nM의 DF-a(반응 v) 또는 DF-b(반응 vii)가 캐스케이드 반응을 개시할 수 있고, 이로써 결국에는, CESA B가 절단되었을 때, 추가의 DF-a의 생성에 의해, 및 CESA A가 절단되었을 때, 추가의 DF-b의 생성에 의해 구동되는, 각각의 100 nM의 CESA A 및 CESA B가 절단될 수 있다는 것을 입증하는 추가의 증거를 제시한다. 이는 PESA A 및 PESA B와 함께 DF-a 또는 DF-b를 포함시킴으로써 반응을 개시시키면, 반응 관찰 시간 이내에 PESA A 및 PESA B 올리고뉴클레오티드, 둘 모두가 완전하게 절단된다는 것을 나타낸다.
요약컨대,
(a) DF(DF-a 또는 DF-b)를 그의 매칭 헤어핀 PESA(각각 PESA A 또는 PESA B)에 첨가하면, RE Mnl I에 대한 이중체 기질인 절단가능한 CESA A 또는 CESA B가 형성될 수 있고, 이로써 형광이 증가될 수 있고,
(b) DF-a를 PESA A 및 PESA B의 혼합물에 첨가하면, CESA A가 형성되고, 이어서, 절단되고, 이를 통해 DF-b가 생성되고, DF-b는 PESA B와 하이브리드화하여 CESA B를 형성할 수 있고, 결국에는 절단됨으로써 DF-a를 유리시킬 수 있다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다. 유사하게, DF-b를 PESA A 및 PESA B의 혼합물에 첨가하면, CESA B가 형성되고, 이어서, 절단되고, 이를 통해 DF-a가 생성되고, DF-a는 PESA A와 하이브리드화하여 CESA A를 형성할 수 있고, 결국에는 절단됨으로써 DF-b를 유리시킬 수 있다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다. 이러한 피드백은 PESA A 및 PESA B가 모두가 절단될 때까지 계속 진행된다.
단, DF가 표적 특이 방식으로 생성될 수 있다면, 상기 증폭 캐스케이드는 임의 표적이 검출될 수 있도록 하면서, 신호를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 본 실시예에서의 DF 중 하나에 의해, 또는 새로운 PESA에 상보적인 DF에 의해 활성화될 수 있는 추가의 PESA가 생성될 수 있도록 헤어핀 PESA의 특이 서열을 변경시킬 수 있다.
실시예 9
하기 실시예는 DF 서열이 MNA자임 기질 서열의 일부가 아닌 것인 전략법을 사용하는 MNA자임에 의해 개시되는 EzyAmp 반응을 입증한다. 본 실시예에서 입증되는 전략법은 도 19A에 도시되어 있다. 본 실시예에서, 기질 서열은 DF에 상보적인 서열과, DF 신장부에 상보적인 서열 측면에 위치하였다. 기질 서열 그 자체는 상기 영역 중 어느 것에도 상보적이지 않기 때문에, 이에 기질 함유 올리고가 DF에 결합하였을 때, 단일 가닥 기질 루프가 형성되었다. 완전 기질이 결합하게 되면 DF는 차단되고, 이로써, PESA와 하이브리드화할 수 없게 된다. 루프화된 기질은 오직 특이 표적의 존재하에서 형성된 MNA자임에 의해 절단될 때에만 상기 복합체로부터 유리될 수 있도록 시스템을 디자인하였다. 기질 루프의 MNA자임 절단을 통해 DF가 유리되고, EzyAmp 신호 증폭 반응이 개시될 수 있다.
9.1 EzyAmp 올리고뉴클레오티드
본 EzyAmp 반응을 위해, 2개의 상이한 PESA 복합체(PESA A 및 PESA B)가 한 반응에 존재하였다. PESA A 및 DF-a(DF-3EAS2_11(22))의 하이브리드화를 통해 CESA A가 형성된 반면, PESA B 및 DF-b의 하이브리드화를 통해 CESA B가 형성되었다. PESA A는 EAS1A(EAS1_12) 및 EAS2A(EAS2_13)로 구성되었고, PESA B는 EAS1B(EAS1_10) 및 EAS2B(EAS2_11)로 구성되었다. PESA A의 EAS2A는 그 안에 DF-b의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. PESA B의 EAS2B는 그 안에 DF-a의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 본 실험은 DF-a 또는 DF-b가 기질-차단제의 절단에 의해 또는 반응 동안 각각 CESA B 또는 CESA A의 절단에 의해 생성될 수 있도록 디자인하였다. 본 과정에 대한 개략도는 도 19 패널 A에 도시되어 있다.
올리고 절단시의 형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하고, EAS2A는 그의 말단을 3' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS1A 및 EAS2A를 서로 어닐링시켜 PESA A를 형성하였다. EAS1B는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2B는 3' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS1B 및 EAS2B를 서로 어닐링시켜 PESA B를 형성하였다.
상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 굵게 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF, 또는 그의 단축 버전과 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00041
.
9.2 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 조립 촉진제
촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임이 합성 표적, 즉, 조립 촉진제, AF-RO5의 존재하에서 형성될 수 있도록 파트자임을 디자인하였다. 조립 촉진제, 파트자임 A(RO5A4/3(8)) 및 파트자임 B(RO5B5/3(7))의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적과 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00042
.
9.3 MNA 자임 기질-차단제
MNA자임 기질 서열은 앞서 10:23 DNA자임으로부터 유도된 MNA자임에 대한 기질로서 사용된 바 있는 서열의 신장부를 구성하는 올리고 중의 RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열이었다. 본 실시예에서, 리포터 MNA자임 기질을 Sub3(8:7)으로 지정하였고, 이는 DF-a에 상보적인 서열과, DF 신장부에 상보적인 서열 측면에 위치하였다. 기질 서열 그 자체는 상기 영역 중 어느 것에도 상보적이지 않기 때문에, DF에 결합하였을 때, 단일 가닥 기질 루프가 형성되었다. 기질-차단제의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 기재되어 있다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타내고, 굵은체로 표시된 염기는 파트자임과 하이드리드화하고, 밑줄체로 표시된 염기는 DF-a에 결합한다.
Figure pct00043
.
9.4 반응 성분
형광 증가를 검출함으로써 표적의 존재하의 절단가능한 CESA의 형성을 측정하였다. 100 nM 표적 조립 촉진제 AF-RO5를 첨가함으로써 테스트 반응을 개시시키고, 대조군 반응은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응은 총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 100회의 사이클 동안 매 1초 후 채널 1(FAM)에서 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: FAM/SYBR만). 총 진행 시간은 115분이었다. 모든 반응은 200 nM 파트자임 A(RO5A4/3(8)), 200 nM 파트자임 B(RO5B5/3(7)), 200 nM의 기질-차단제(14Sub3(8:7)_16)(21)Inh(D2F-3EAS2_1l); 15 mM MgCl2 중 각각의 100 nM DF-3ESA1_11(22), EAS1_10, EAS2_11, EAS1_12, 및 EAS2_13(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 0.75 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 모든 반응은 2중으로 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다.
9.5 결과: CESA A 및 CESAB 의 절단 검출
표적이 존재하는 테스트 반응(도 19 패널 B 패널; 표적)에서 형광이 지수적으로 증가한 것이 관찰되었다. 이는 표적 조립 촉진제를 통해 파트자임 A 및 B가 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임으로 조립되고, 이를 통해 MNA자임 기질이 절단되었다는 것을 나타낸다. 기질 절단으로 DF-a에 결합되어 있던 단편은 해리되고, 이를 통해 DF-a는 (PESA A 및 PESA B로 구성된) 후속 EzyAmp 캐스케이드 반응을 개시시킬 수 있었다. 이러한 반응은, 유리된 DF-a가 (EAS1A 및 EAS1B에 의해 형성된) PESA A에 결합하여 CESA A를 형성하였을 때 개시되었으며, 이어서, CESA A는 Mnl I에 의해 절단되었다. 결국, 이를 통해 DF-b가 유리되었고, 추가로, 형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 상응하여 형광도 함께 동시에 증가하였다. 이어서, DF-b가 (EAS1B 및 EAS2B에 의해 형성된) PESA B에 결합하여 CESA B를 형성하고, 이는 Mnl I에 의해 절단되었다. 이를 통해 추가의 DF-a가 유리되어 다른 CESA A 및 CESA B 사이의 피드백 캐스케이드가 완성되었고, 형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 상응하여 형광도 함께 동시에 증가하였다.
표적 조립 촉진제가 첨가되지 않은 "표적 부재 대조군" 반응에서, FAM 신호의 지수적 증가는 관찰되지 않았지만, 단지 80분 경과 후에는 낮은 수준의 형광 이동은 있었다(도 19 패널 B; 표적 부재 대조군). 이는 DF-a를 유리시켜 후속 EzyAmp 반응을 개시시키기 위한 목적으로 기질의 MNA자임 절단을 개시시키기 위해서는 표적이 존재하여야 한다는 것을 나타낸다.
EzyAmp 반응은, DF 서열이 MNA자임 기질 서열의 일부일 필요가 없는 표적 의존 MNA자임 절단 단계에 의해 개시될 수 있도록 디자인될 수 있다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다. 상기 반응에서, PESA A와 EAS2B 사이의 하이브리드화, 및 절단되지 않은 상태에서는 InF로서의 작용을 하는 EAS1A와 PESA B 사이의 하이브리드화에 의해 EIC 복합체 또한 형성될 수 있다고 예상되었다.
실시예 10
하기 실시예는 완전 제한 부위를 포함하는 2개의 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 제한 효소의 능력을 입증한다.
10.1 올리고뉴클레오티드
하기 반응에서, 올리고뉴클레오티드 1(EAS1_1) 및 올리고뉴클레오티드 2(ASC-RE5F2(22)-FB)는 잠재적으로는 2가지 배향으로 하이브리드화할 수 있는데, 이 둘 모두를 통해 Mnl I에 대한 완전 인식 서열을 포함하는 부분적으로 상보적인 이중체가 형성될 것이다; 그러나, 두 이중체 모두 인식 부위와 절단 부위 사이에 수개의 쌍을 이루지 않은 염기를 가지게 될 것이다.
이중 표지된 단편의 절단 후, 형광단 및 소광제 모이어티 분리에 기인하는 형광 변화를 모니터링함으로써 RE Mnl I가 부분적으로 비상보적인 이중체를 절단할 수 있는 잠재능에 대해 조사하였다. 올리고뉴클레오티드 1는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 그의 3' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ")로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드 2는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인(6"FAM") 모이어티로, 및 3' 말단은 블랙 홀 소광제("BHQ_1") 모이어티로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 한 가닥을 형성한다.
Figure pct00044
.
10.2 반응 성분
모든 반응은 2중으로 수행되었고, 이는 100 nM 올리고뉴클레오티드 2 및 뉴클레아제 무함유 물 중 2 U의 Mnl I(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 함유하였고, 여기에, (i) 100 nM 올리고뉴클레오티드 1 또는 (ii) H2O을 첨가하였다. 채널 1(FAM)에서 형광 신호를 측정하였다. 반응을 총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 100회의 사이클 동안 매 8초 후 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: FAM/SYBR만). 총 진행 시간은 40분이었다.
10.3 결과: 올리고뉴클레오티드 1 및 2의 절단 검출
반응(i)에서, 올리고뉴클레오티드 1 및 2, 둘 모두가 존재함으로써 형광은 증가하였는데, 이는 Mnl I 절단을 통해 올리고뉴클레오티드 2에서 형광단이 소광제로부터 분리되었음을 나타내는 것이다. 대조적으로, 올리고뉴클레오티드 1의 부재하에서는 형광 증가는 관찰되지 않았는데(반응(ii)), 이는 올리고뉴클레오티드 2의 절단은 올리고뉴클레오티드 1과의 부분 이중체 형성에 의존하고, Mnl I 존재하의 신호는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 2의 절단에 기인하는 것이 아니라는 것을 나타낸다.
특정 RE, 예컨대, Mnl I가, 완전 이중 가닥 인식 서열을 포함할 수는 있지만, 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 전체 영역에 걸쳐 완전하게 상보적인 것은 아닌 부분적으로 상보적인 이중체를 절단할 수 있다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다. 본 관찰 결과는 인식 부위와 절단 부위 사이의 개입 서열에 미스매치를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 구성된 PESA 복합체를 디자인할 수 있고, 이로써, DF로서 작용할 수 있는 절단 단편의 해리 온도와 속도를 조작할 수 있는 새로운 도구를 제공한다.
실시예 11
하기 실시예는 단일 반응으로 동시에 진행되는 하기 단계들을 사용하여, 다양한 농도의 특이 표적을 검출 및 정량화하는 것을 예시한다: 단계 (i)에서, MNA자임은 표적의 존재하에서 형성되고, 이는 MNA자임 기질을 절단하여 제1 DF를 생성한다; 단계 (ii)에서, 상기 DF는 PESA에 하이브리드화하여 CESA를 형성하고, 이 CESA는 RE에 의해 절단되었을 때, 또 다른 DF를 생성하며, 동시에 형광단과 소광제는 분리됨으로써 형광 신호가 발생된다; 단계 (iv)에서, 제1 CESA의 절단에 의해 생성된 DF는 제2 PESA에 하이브리드화하여 제2 CESA를 형성하고, 이 제2 CESA가 RE에 의해 절단되었을 때, 형광 신호가 발생되고, 제1 DF와 같은 기능을 이행할 수 있는 DF가 유리된다; 단계 (v)에서, 단계 (iv) 및 (v)가 반복됨에 따라 피드백 루프가 형성된다. 뉴클레아제 절단을 통해 신호가 증폭되는 반응을 EzyAmp 반응이라 명명한다. 본 실시예에서, EzyAmp 반응은 한 반응의 튜브 내에서 단일 RE에 의해 절단되는 2개의 상이한 CESA 복합체(CESA A 및 CESA B)로 구성되었다. 본 실시예에서, 두 PESA 복합체 모두 같은 형광단으로 표지하였고, 이에, 생성된 CESA의 절단에 의해 발생되는 신호는 상가 효과를 띠었다.
11.1 EzyAmp 올리고뉴클레오티드
상기 EzyAmp 반응의 경우, 2개의 상이한 CESA 복합체(CESA A 및 CESA B)가 한 반응 안에 존재한다. CESA A는 PESA A 및 DF-a로 구성된 반면, CESA B는 PESA B 및 DF-b로 구성되었다. 결국, PESA A는 EAS1A(EAS1_10) 및 EAS2A(EAS2_11)로 구성되었고, PESA B는 EAS1B(EAS1_12) 및 EAS2B(EAS2_13)로 구성되었다. PESA A의 EAS2A는 그 안에 DF-b의 서열에 기능상 등가인 영역을 포함하였다. PESA B의 EAS2B는 그 안에 DF-a의 서열에 기능상 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 본 실험은, DF-a가 표적의 존재하에 반응 개시 시점에 생성될 수 있고, 각 DF가 반응 동안 각각 CESA B 또는 CESA A의 절단에 의해 생성될 수 있도록 디자인하였다. 피드백할 수 있는 CESA 복합체의 과정에 대한 예시적인 개략도는 도 17A, 18A, 19A 및 27A에 도시되어 있다.
형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2A 또한 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, EAS1A에 어닐링시켰다. EAS1B는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지한 반면, EAS2B는 3' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표시하고, EAS1A에 어닐링시켰다.
상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF와 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00045
.
11.2 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 표적 조립 촉진제
DF-a를 생성하기 위해, 기질(Sub1i-FIB)을, 합성 표적, 즉, 표적 조립 촉진제, AF-TL5의 존재하에서 형성된 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의해 절단되도록 디자인하였다. 표적 조립 촉진제, 파트자임 A(TL5A2(12)/1) 및 파트자임 B(TL5B5(12)/1)의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄 체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적과 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00046
.
11.3 MNA자임 기질
이중 표지된 리포터 MNA자임 기질의 절단에 의해 MNA자임 활성을 모니터링하였다. MNA자임 기질 서열은 앞서 8:17 DNA자임 기질로서 사용된 바 있는(문헌 [Li et al., 2000]), RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열이었다. 본 실시예에서, 리포터 MNA자임 기질을 Sub1i-FIB로 지정하고, 이를 내부 플루오레세인 dT("iFluorT") 모이어티 및 3' 말단의 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. Sub1i-FIB의 표지된 서열은 5'→3' 방향으로 하기와 같았으며, 여기서, 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 이탤릭체로 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF로서 작용하는 것을 나타낸다.
Figure pct00047
.
11.4 반응 성분
촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단을 형광 증가에 의해 측정하였다(그러나, 상기 형광은 EAS 올리고의 절단에 의해 발생된 형광과는 구별되지 않았는데, 그 이유는 MNA자임 기질 절단 및 CESA 절단, 둘 모두를 통해 같은 채널에서 검출되는 형광단이 유리되었기 때문이다). CESA A는 EAS1_10, EAS2_11 및 DF-1a의 하이브리드화에 의해 형성되고, CESA B는 EAS_12, EAS2_13 및 DF-b의 하이브리드화에 의해 형성되도록 올리고를 디자인하였다. 형광 표지된 CESA 성분인 EAS1_10 및 EAS1_12의 절단 또한 형광 증가에 의해 측정하였다. 표적 조립 촉진제 AF-TL5를 (i) 1 nM, (ii) 800 pM, (iii) 600 pM, (iv) 400 pM, (v) 200 nM (vi) 100 nM 또는 (vii) 50 nM의 농도로 첨가함으로써 2중의 테스트 반응을 개시시켰다. "표적 부재 대조군"(NTC) 2중 반응은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응은 총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 110회의 사이클 동안 매 1분 후 채널 1(FAM)에서 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: FAM SYBR만). 총 진행 시간은 120분이었다. 모든 반응은 10 mM MgCl2 중 0.75 U Mnl I(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 KOH를 사용하여 pH 8.3으로 조정된 1 x NE버퍼 1(뉴 잉글랜드 바이오랩스)과 함께, 300 nM 파트자임 A(TL5A2(12)/1), 150 nM 파트자임 B(TL5B3(12)/1), 및 30 nM Sub1i-FIB; 각각의 100 nM의 EAS1_10, EAS2_11, EAS1_12, 및 EAS2_13으로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다. 반응에 첨가된 표적 농도의 Ct 값으로부터 표준 곡선을 표적 농도의 로그 값에 대해 플롯팅하였다. Ct 값은 주어진 양의 표적이 역치 형광에 상응하는 신호를 발생시키는 데 소요되는 시간량(사이클 1회차는 대략 1분이다)이다. 역치는 형광 증가의 지수기의 시작점으로 설정하였다.
11.5 결과: 표적 핵산의 검출 및 정량화
도 21A 및 21B는 테스트 반응(i) 내지 (vii)에 첨가된 표적량에 상응하여, 다양한 시점에 시작되는 증가하는 형광 신호(로그 및 선형 플롯)을 나타낸 것이다. EzyAmp 반응에서 표적량이 신호를 발생시키는 데 소요되는 시간을 결정하였다. 표적 존재량이 적을수록, DF-a가 EzyAmp 피드백 반응을 시작하는 데 소요되는 시간은 더 장기화되고, 이로써, 역치 형광에 도달하는 데 소요되는 시간도 장기화된다. 표적이 첨가되지 않은 대조군 반응((viii) NTC)에서는 120분 경과 후에도 증가하는 신호는 관찰되지 않았으며, 이는 DF 생성 및 이후의 EzyAmp 신호 증폭을 위해서는 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임의 표적 의존 형성이 필요하다는 것을 제안한다. 추가로 더 낮은 저농도의 표적 또한 분석하였는데(데이터는 나타내지 않음), 1 pM만큼 낮은 농도는 주형 대조군 신호보다 큰 값으로 검출되지 않았다. 이는 25 ㎕ 반응 중 대략 25 amole 또는 107개 카피수의 표적 핵산 서열에 상응하는 값이었다.
도 21C는 테스트된 표적 농도 범위 이내에서 선형 표준 곡선이 형성될 수 있다는 관찰결과에 의한 검정법의 정량 능력을 보여주는 것이다. 1회 제한 효소 절단 이벤트당 DF 생성이 2배가 됨으로써, 시간 경과에 따른 신호는 지수적으로 증가한다. 이러한 지수 증가를 통해 PCR 지수 사이클 역치 방법(14.4 반응 성분에 기술)을 사용함으로 선형 곡선으로(여기서, 회귀값=0.99) Ct와 표적 농도 사이의 상관관계를 보여줄 수 있게 된다. 이러한 결과를 통해 EzyAmp가 표적 서열을 고감도로 정량적으로 검출할 수 있는 능력이 입증되었다.
실시예 12
본 실시예는 가설이고, 신호 증폭 캐스케이드를 개시하고 매개할 수 있는 엑소뉴클레아제 III(ExoIII)의 뉴클레아제 능력을 사용하는 전략법을 제공한다(도 23). 상기 효소는 DNA 이중체의 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거한다. 블런트 또는 오목형 3' 말단 상에서는 활성을 띠지만, 5개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 DNA 상에서는 활성을 띠지 않고, 이에, 5개 이상의 뉴클레오티드 또는 그보다 장쇄인 뉴클레오티드를 가지는 3' 돌출 말단은 절단하지 않을 것이다. 이는 또한 이중체 DNA 중 닉으로부터 가수분해를 시작함으로써 단일 가닥 갭을 형성할 수 있다. 올리고 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 존재하면 엑소뉴클레아제 활성은 차단된다.
본 방법은 한 반응 챔버 또는 분리형 반응 챔버 내에 존재할 수는 있지만, 동일한 뉴클레아제인 ExoIII을 사용할 수 있는, 개시 단계 및 신호 증폭 단계를 포함한다.
12.1 개시 단계; 표적에 의존하는 방식으로 구동자 단편 생성
SIO가 오직 표적 핵산의 존재하에서만 가수분해되도록(도 23), ExoIII에 대한 기질로서 합성 개시제 올리고(SIO)를 디자인하였다. SIO는 그의 3' 말단에 표적에 상보적인 약 20개의 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 이를 톡해 특이 표적을 검출할 수 있게 된다. SIO는 또한 5' 말단에는 표적에 비상보적인 DF의 서열을 포함할 수 있다. 마지막으로, SIO는 표적 결합부 및 DF 부분의 접합부에 하나 이상의 포스포로티올화된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 형광단 및 소광제로 이중 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, SIO는 헤어핀 구조를 가질 수 있다.
본 반응의 단계는 도 23에 도시되어 있다. SIO가 표적에 결합하면(1단계), SIO의 DF 부분은 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고, 동시에 SIO의 표적 결합부는, SIO가 Exo III에 대한 적합한 기질로서의 역할을 할 수 있는 오목형 3' 말단을 가짐에 따라 이중체를 형성하게 된다. 이어서, Exo III은 포스포로티오에이트화된 뉴클레오티드(들) 위치의 뒤쪽에 있는 SIO를 가수분해함으로써 SIO의 DF 부분을 유리시킨다(2단계). 동시에, 가수분해를 통해 형광단 및 소광제는 분리되고, 이로써 형광은 증가하게 된다. 표적은 온전한 상태 그대로 유지되고, 자유롭게 재순환하여 추가 SIO에 결합할 수 있게 된다(3단계).
12.2 신호 증폭 단계: CESA 복합체의 형성 및 절단
신호 증폭 단계는 다른 변형의 EzyAmp 반응에서의 것과 유사한 단편, 즉, 상보적인 올리고뉴클레오티드 EAS1 및 EAS2를 포함하게 될 것이다. EAS1은 형광단 및 소광제로 표지될 수 있다. EAS1 및 EAS2는 서로에의 결합시, 각 말단에 5개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 3' 오버행을 가지는 PESA를 형성함으로써 DF 부재하에서 ExoIII 분해를 막을 수 있다. EAS1은 DF에 대한 결합부로서의 역할을 할 수 있는 보다 긴 장쇄의 오버행을 가질 수 있다. DF의 5' 말단의 서열은 EAS1에 상보적인 서열 이상으로 신장될 수 있고, 따라서, DF 결합을 통해 EAS1 상에 오목형 3' 말단을 가지는 CESA 복합체가 형성될 수 있다.
개시 단계에서 표적의 존재하에 DF가 SIO로부터 유리된 경우, 이는 이어서 자유롭게 PESA에 결합하게 되고, Exo III에 대한 기질로서의 역할을 할 수 있는 CESA를 형성하게 된다. DF의 3' 말단에 포스포로티올화된 염기가 존재하면, DF가 PESA에 결합하였을 때 형성되는 닉으로부터의 뉴클레아제 분해는 일어나지 못할 것이다. 그러나, CESA의 EAS1 가닥의 오목형 3' 말단은 Exo III에 의해 가수분해되고(5단계), 이로써, 형광단 및 소광제 분리에 기인하는 형광 증가가 일어나게 될 것이다. 추가로, DF는 온전하게 유리되어, 자유롭게 재순환하게 되고(6단계), 또 다른 PESA에 결합함으로써 또 다른 CESA를 형성하게 된다. 상기 전략법에서, 개시 단계 및 증폭 단계, 둘 모두 감도를 증가시키기 위해서 신호 증폭을 위한 표적 및 DF 재순환에 의존하게 될 것이다.
당업자에 의해 상기 계획안에 대한 다수의 변형 방법이 고안될 수 있다. 상기와 같이, PESA는 별개의 EAS1 및 EAS2 올리고로부터 형성될 수 있거나, 또는 EAS1 및 EAS2는 링커 서열에 의해 결합되어 헤어핀 구조를 가지는 PESA를 형성할 수 있다. 각 단계는 한 챔버 안에서, 또는 분리형 챔버에서 수행될 수 있다. 추가로, 형광단 및 소광제 표지의 위치와 관련해서는 유연적이다.
그럼에도 불구하고, 상기 제안된 전략법은 EzyAmp 반응의 기본 단계, 즉, (i) 표적에 의존하는 방식으로 올리고뉴클레오티드(예컨대, SIO)를 DF로 전환하는 단계; (ii) 그 자체만으로는 뉴클레아제에 대한 기질이 아닌 것인 PESA를 제공하는 단계, (iii) DF를 PESA에 하이브리드화하여 CESA를 형성하는 단계; 및 (iv) CESA를 뉴클레아제와 하이브리드화하여 검출가능한 신호를 발생시키고, 추가로, DF를 유리시켜 이러한 DF가 추가의 PESA를 CESA 복합체로 전환시킬 수 있도록 하는 것인 단계를 따른다.
실시예 13
하기 실시예는 2개의 상이한 DF의 존재하에 2개의 독립된 CESA가 형성되는 것을 동시에 모니터링할 수 있도록 EzyAmp 시스템을 다중화시킬 수 있는 능력을 입증한다. 본 실시예에서, 2개의 상이한 PESA 복합체(PESA A 및 PESA B)를 독립적으로 모니터링할 수 있도록 하기 위해 2개의 상이한 형광단으로 표지하였다. PESA A는 DF-a의 존재하에서만 CESA A를 형성하고, PESA B는 DF-b의 존재하에서만 CESA B를 형성한다. 완전하게 조립된 CESA A 및 CESA B 복합체가 형성되면, RE인 Mnl I에 대한 RERS가 완성된다.
13.1 올리고뉴클레오티드
하기 반응에서, CESA A는 PESA A 및 DF-a로 구성된 반면, CESA B는 PESA B 및 DF-b로 구성되었다. 결국, PESA A는 EAS1A 및 EAS2A로 구성되었고, PESA B는 EAS1 B 및 EAS2B로 구성되었다. 본 실험은 오직 DF-a만이 PESA A에 결합하여 CESA A를 형성할 수 있게 하고, 오직 DF-b만이 PESA B에 결합하여 CESA A를 형성할 수 있게 디자인하였다.
형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A(RE1F1(20T)(20)-BJ)는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("LAbFQ")로, 및 3' 말단은 JOE로 표지하였다. EAS1A에 어닐링하는 EAS2A(RE1S1(1A)(13)-5-B) 또한 그의 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("LAbFQ")로 표지하였다. EAS2B(ESA33)는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인("FAM")으로 표지하고, EAS2B에 어닐링하는 EAS1B(ESA34_2)는 3' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ")로 표지하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성한다.
Figure pct00048
.
13.2 반응 조건
올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다. 모든 반응은 15 mM MgCl2 중 각각의 100 nM EAS1A(RE1F1(20T)(20)-BJ), EAS2A(RE1F1(20T)(20)-BJ), EAS1B(ESA34_2) 및 EAS2B(ESA33)(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 뉴클레아제 무함유 물(앰비온), 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 2 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. DF-a(DF1-(10)) 및/또는 DF-b(D2F-3ESA31(22))를 첨가함으로써 반응을 개시시킨 반면, 대조군 반응은 25 ㎕의 총 반응 부피로 물을 첨가함으로써 개시시켰다. 각 반응에 사용된 DF-a 및/또는 DF-b의 농도는 하기 표 14에 제공한다. 채널 1(모니터 FAM) 및 채널 2(모니터 JOE), 둘 모두에서 동시에 형광 신호를 측정하였다. 반응을 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 100회의 사이클 동안 매 1초 후 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: 모든 채널). 총 진행 시간은 29분이었다.
Figure pct00049
13.3 결과: 절단 검출
각 반응의 JOE 및 FAM, 둘 모두에 대한 형광 신호를 시간에 대해 플롯팅하였다(도 25). DF-a를 첨가한 결과, 시간 경과에 따라 JOE 형광이 증가하였다. JOE 신호 증가는 DF-a가 PESA A를 완성함으로써 CESA A가 형성되고, 이어서, CESA A는 Mnl I에 의해 절단되었다는 것을 나타낸다. 결국, 절단된 EAS1A 및 EAS2A의 올리고 단편의 해리를 통해 JOE 형광단 및 소광제가 분리된다. 반응(i)-(v)(도 25)에서 관찰되는 바와 같이, JOE 형광 신호의 증가 속도는, 각 반응 중에 존재하는 DF-a의 비율(%)이 감소함에 따라서 감소하였다.
DF-b를 첨가한 결과, 시간 경과에 따라 FAM 형광이 증가하였다. FAM 신호 증가는 DF-b가 PESA B를 완성함으로써 CESA B가 형성된다는 것을 나타낸다. Mnl I에 의해 CESA B가 절단되면, 절단된 EAS1B 및 EAS2B의 올리고 단편이 해리되고, 이로써, FAM 형광단 및 그의 소광제가 분리된다. 반응(i) 내지 (v) (도 25)에서 관찰되는 바와 같이, FAM 형광 신호의 증가 속도는, 각 반응에 첨가되는 DF-b의 비율(%)이 감소함에 따라서 감소하였다.
DF-a 또는 DF-b 중 어느 것도 첨가되지 않은 대조군 반응에서, FAM 또는 JOE 형광 증가는 관찰되지 않았고, 이는 이중체 EzyAmp 반응이 하나 이상의 DF의 존재에 대해 특이성을 가진다는 것을 입증한다.
오직 DF-a만이 존재하는 반응(i)에서, FAM이 아닌, JOE에 대해서만 형광 증가가 관찰되었는데, 이는 DF-a가 CESA A의 형성에 특이적이라는 것을 나타내는 것이었다. 유사하게, 오직 DF-b만이 존재하는 반응(v)에서, JOE가 아닌, FAM에 대해서만 형광 증가가 관찰되었는데, 이는 DF-b가 CESA B의 형성에 특이적이라는 것을 나타내는 것이었다. 전체 DF-a + DF-b 중에 존재하는 DF-a의 비율(%)이 (i) 100%에서부터 (ii) 90%로, (iii) 50%로, (v) 10%로 변함에 따라, 그에 상응하여 JOE 형광이 감소하는 것이 관찰되었다(도 25). 유사하게, 전체 DF-a + DF-b 중에 존재하는 DF-b의 비율(%)이 (i) 100%에서부터 (ii) 90%로, (iii) 50%로, (v) 10%로 변함에 따라, 그에 상응하여 JOE 형광이 감소하는 것이 관찰되었다.
다중화 EzyAmp 시스템의 예시적인 전략법이 도 13에 도시되어 있다. 본 실험을 통해 단일 다중화 EzyAmp 반응에서의 1 초과의 표적의 다중화 검출에 대한 잠재성이 입증되었다. 예를 들어, DF-a는 (예컨대, 제1 MNA자임에 의한 제1 MNA자임 기질의 절단에 의해) 오직 표적 A의 존재하에서만 표적 특이 방식으로 생성될 수 있고, DF-b는 (예컨대, 제2 MNA자임에 의한 제2 MNA자임 기질의 절단에 의해) 오직 표적 B의 존재하에서만 표적 특이 방식으로 생성될 수 있다. 본 실시예에서 입증된 EzyAmp 시스템을 사용하여 DF-a 및/또는 DF-b의 존재가 검출되었다면, 이때 JOE 증가는 표적 A의 존재를 나타내는 것이고, FAM의 증가는 표적 B의 존재를 나타내는 것이 될 것이다. JOE 또는 FAM 중 어느 것도 증가하지 않았다면, 이는 표적이 존재하지 않았다는 것을 나타내는 것이며, JOE 및 FAM이 증가하였다면, 이는 두 표적 모두 존재한다는 것을 나타내는 것이 될 것이다.
실시예 14
하기 실시예는, 비록 DF 서열이 여전히 같은 분자 내에 포함되어 있을 수 있기는 하지만, DF 서열이 기질로서 MNA자임에 의해 인식되는 서열의 일부가 아닌 것인 전략법을 사용하는 MNA자임에 의해 개시되는 EzyAmp 반응을 입증한다(도 24D). 본 실시예에서, 기질 및 DF는 기질-차단제-DF 올리고라고 명명되는 장쇄의 헤어핀 구조의 분자의 일부이다. 헤어핀 내의 단일 가닥 루프는 기질로서 MNA자임에 의해 인식되는 서열을 포함하였다. 상기 헤어핀의 줄기는 상보적인 차단제 서열에 하이브리드화할 수 있는 DF-a의 서열을 포함하였다. 상기 입체구조에서, DF는 PESA와 하이브리드화하는 데 이용될 수 없다. 표적의 존재하에서 형성된 MNA자임에 의해 MNA자임 기질 루프가 절단되었을 때에만 오직 DF가 유리될 수 있도록 시스템을 디자인하였다. MNA자임에 의해 개시되는 DF 유리를 통해 EzyAmp 신호 증폭 반응이 개시될 수 있다.
14.1 EzyAmp 올리고뉴 클레오티드
본 EzyAmp 반응을 위해, 2개의 상이한 PESA 복합체(PESA A 및 PESA B)가 한 반응에 존재하였다. PESA A 및 DF-a의 하이브리드화를 통해 CESA A가 형성된 반면, PESA B 및 DF-b의 하이브리드화를 통해 CESA B가 형성되었다. PESA A는 EAS1A(EAS1_12) 및 EAS2A(EAS2_13)로 구성되었고, PESA B는 EAS1B(EAS1_10) 및 EAS2B(EAS2_11)로 구성되었다. PESA A의 EAS2A는 그 안에 DF-b의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. PESA B의 EAS2B는 그 안에 DF-a의 서열에 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 본 실험은 개시 DF-a가 기질-차단제-DF 헤어핀 올리고의 MNA자임 절단에 의해 표적에 의존하는 방식으로 생성될 수 있도록 디자인하였다. 후에, EzyAmp 캐스케이드 반응 동안, DF-a 및 DF-b는 각각 CESA B 또는 CESA A의 절단에 의해 생성될 수 있다. 유사의 예시적인 캐스케이드 반응은 도 19A에 도시되어 있다; 그러나, 개시 단계는 도 24D에 도시되어 있는 것과 같다(도 24C에 도시되어 있는 단계와는 대조적으로, 이는 도 19A의 개시 구조체와 유사하다).
올리고가 절단되었을 때 일어나는 형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하고, EAS2A는 그의 말단을 3' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS1A 및 EAS2A를 서로 어닐링시켜 PESA A를 형성하였다. EAS1B는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2B는 3' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. EAS1B 및 EAS2B를 서로 어닐링시켜 PESA B를 형성하였다.
상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 굵게 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF, 또는 그의 단축 버전과 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00050
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14.2 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 표적 조립 촉진제
촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임이 합성 표적, 즉, 조립 촉진제, AF-RO5의 존재하에서 형성될 수 있도록 파트자임을 디자인하였다. 조립 촉진제, 파트자임 A(RO5A4/3(8)) 및 파트자임 B(RO5B5/3(7))의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적과 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00051
.
14.3 MNA 자임 기질-차단제- DF
MNA자임 기질 서열은 앞서 10:23 DNA자임으로부터 유도된 MNA자임에 대한 기질로서 사용된 바 있는 서열의 신장부를 구성하는 올리고 중의 RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열이었다. 기질은 헤어핀 구조의 기질-차단제-DF 분자의 줄기로부터 바깥쪽으로 루프를 형성하였는데, 이는 상기 서열이 올리고의 서열 중 어느 부분에도 상보적이지 않았기 때문이다. 줄기는 또한 DF-a의 서열을 포함하였다. 상기 헤어핀 분자 가운데 있는 (비기질) 루프는 비상보적인 dT 염기 스트레치로 구성되었다. 헤어핀 구조의 기질-차단제-DF 올리고의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 기재되어 있다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타내고, 굵은체로 표시된 염기는 파트자임과 하이드리드화하고, 밑줄체로 표시된 염기는 DF-a의 서열(굵게 이탤릭체로 표시) 또한 포함하는 줄기를 형성하고, 이탤릭체로 표시된 T 염기 스트레치는 헤어핀의 가운데 있는 루프를 형성한다.
Figure pct00052
.
14.4 반응 성분
형광을 모니터링함으로써 표적의 존재하의 절단가능한 CESA의 형성을 측정하였다. 100 nM 표적 조립 촉진제 AF-RO5를 첨가함으로써 테스트 반응을 개시시키고, 대조군 반응은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응은 총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 100회의 사이클 동안 매 1초 후 채널 1(FAM)에서 판독하였다(스캔 모드: FAM/SYBR만). 총 진행 시간은 115분이었다. 모든 반응은 200 nM 파트자임 A(RO5A4/3(8)), 200 nM 파트자임 B(RO5B5/3(7)), 70 nM Hp5(Sub3(8:7))Inh(D2F-3EAS2_1l), 15 mM MgCl2 중 각각의 100 nM의 EAS1_10, EAS2_11, EAS1_12, 및 EAS2_13(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 0.75 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 모든 반응은 2중으로 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다.
14.5 결과: CESA A 및 CESA B의 절단 검출
표적이 존재하는 테스트 반응에서는 형광 증가가 관찰되었다. 이는 표적 조립 촉진제를 통해 파트자임 A 및 B가 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임으로 조립되고, 이를 통해 기질-차단제-DF 헤어핀 올리고의 MNA자임 기질부가 절단되었다는 것을 나타낸다. 기질 절단으로 DF-a에 결합되어 있던 단편은 해리되고, 이를 통해 DF-a는 (PESA A 및 PESA B를 포함하는) 후속 EzyAmp 반응을 개시시킬 수 있었다. 이러한 EzyAmp 캐스케이드는, 유리된 DF-a가 (EAS1A 및 EAS1B에 의해 형성된) PESA A에 결합하여 CESA A를 형성하였을 때, 개시되었다. CESA A가 Mnl I에 의해 절단되었을 때, DF-b가 유리되었다. 추가로, CESA A 상에 존재하는 형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 상응하여 형광도 함께 동시에 증가하였다. 이어서, DF-b가 (EAS1B 및 EAS2B에 의해 형성된) PESA B에 결합하여 CESA B를 형성하고, 이는 Mnl I에 의해 절단되었다. 이를 통해 추가의 DF-a가 유리되어 다른 CESA A 및 CESA B 사이의 피드백 캐스케이드가 완성되었고, CESA B 상에 존재하는 형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 상응하여 형광도 함께 동시에 증가하였다.
표적 조립 촉진제가 첨가되지 않은 "표적 부재 대조군" 반응에서, FAM 신호의 지수적 증가는 관찰되지 않았다. 이는 DF-a를 유리시키고, 후속 EzyAmp 반응을 개시시키기 위한 목적으로 헤어핀 구조의 기질-차단제-DF-올리고내 기질부의 MNA자임 절단을 개시시키기 위해서는 표적이 존재하여야 한다는 것을 나타낸다.
EzyAmp 반응은 선행(upfront) MNA자임 단계의 부가에 의해 표적 의존성이 되도록 디자인될 수 있고, 개시 DF의 서열은 MNA자임에 의해 그의 기질로서 인식되는 서열의 일부일 필요가 없다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다.
실시예 15
하기 실시예는 단일 반응으로 동시에 진행되는 하기 단계들을 사용하여, 2가지 농도의 (RNA로부터 역전사된) cDNA를 검출하는 것을 예시한다: 단계 (i)에서, MNA자임은 표적 cDNA의 존재하에서 형성되고, 이는 MNA자임 리포터 기질을 절단하여 제1 DF(DF-a)를 생성한다; 단계 (ii)에서, 상기 DF-a는 PESA A에 하이브리드화하여 CESA A를 형성하고, 이 CESA A는 RE에 의해 절단되었을 때, 또 다른 DF(DF-b)를 생성하며, 동시에 형광단과 소광제는 분리됨으로써 검출가능한 형광 신호가 발생된다; 단계 (iv)에서, DF-b는 제2 PESA(PESA B)에 하이브리드화하여 CESA B를 형성하고, 이 CESA B가 절단되었을 때, 검출가능한 형광 신호가 발생되고, DF-a와 같은 기능을 이행할 수 있는 DF가 유리된다; 단계 (v)에서, 단계 (iv) 및 (v)가 반복됨에 따라 피드백 루프가 형성된다. 뉴클레아제 절단을 통해 신호가 증폭되는 반응을 EzyAmp 반응이라 명명한다.
15.1 EzyAmp 올리고뉴클레오티드
상기 EzyAmp 반응의 경우, 2개의 상이한 CESA 복합체(CESA A 및 CESA B)가 한 반응 안에 존재한다. CESA A는 PESA A 및 (MNA자임 기질의 절단에 의해, 또는 CESA B의 절단에 의해 생성된) DF-a로 구성된 반면, CESA B는 PESA B 및 (EAS2A(EAS2_11)의 절단에 의해 생성된) DF-b로 구성되었다. 결국, PESA A는 EAS1A(EAS1_10) 및 EAS2A(EAS2_11)로 구성되었고, PESA B는 EAS1B(EAS1_12) 및 EAS2B(EAS1_13)로 구성되었다. PESA A의 EAS2A는 그 안에 DF-b의 서열에 기능상 등가인 영역을 포함하였고, PESA B의 EAS2B는 그 안에 DF-a의 서열에 기능상 등가인 영역을 포함하였다. 따라서, 각각의 DF는 반응 동안 각각 CESA B 또는 CESA A의 절단에 의해 생성될 수 있었다.
형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광을 측정함으로써 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1A는 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로, 및 3' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지하였다. EAS2A 또한 5' 말단을 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하고, EAS1A에 어닐링시켰다. EAS1B는 그의 말단을 5' 말단은 6-플루오레세인("6-FAM") 모이어티로 표지한 반면, EAS2B는 3' 말단을 블랙 홀 FQ("BHQ1") 모이어티로 표지하고, EAS1A에 어닐링시켰다.
상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성하고, 여기서, 이탤릭체로 표시된 염기는 보다 긴 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 콘텍스트에 존재하는 DF와 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00053
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15.2 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 표적
촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임이 표적인, PPIA의 cDNA의 존재하에서 형성될 수 있도록 파트자임을 디자인하였다. 파트자임 A(PPIAA2/1) 및 파트자임 B(PPIAB3/1)의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 조립된 MNA자임의 활성을 띠는 촉매성 코어의 적어도 일부를 형성하고, 굵은체로 표시된 염기는 표적과 하이브리드화하고, 이탤릭체로 표시된 염기는 MNA자임 기질에 하이브리드화한다.
Figure pct00054
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PPIA cDNA 표적은 유전자 특이 3' 프라이머(3PPIA)의 사용으로 생성되었다. 프라이머의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있다.
Figure pct00055
.
15.3 MNA 자임 기질
이중 표지된 핵산 리포터 MNA자임 기질의 절단에 의해 MNA자임 활성을 모니터링하였다. MNA자임 기질 서열은 앞서 8:17 DNA자임 기질로서 사용된 바 있는(문헌 [Li et al., 2000]), RNA 및 DNA 염기, 둘 모두를 포함하는 키메라 서열이었다. 본 실시예에서, 리포터 MNA자임 기질을 (Sub1i-FIB로) 지정하고, 내부 플루오레세인 dT("iFluorT") 모이어티 및 3' 말단의 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였다. Sub1i-FIB의 표지된 서열은 하기와 같았다(5'→3' 방향). 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 이탤릭체로 표시된 염기는 DF-a를 형성하고, 밑줄체로 표시된 염기는 RE인 Mnl I에 대한 인식 서열의 일부를 형성한다.
Figure pct00056
.
15.4 표적 생성
K562 세포주(프로메가(Promega))로부터 유래된 전체 RNA의 역전사에 의해 표적 cDNA를 생성하였다. 테트로(Tetro) cDNA 합성용 키트를 사용하여 제조사(바이오라인(Bioline: 호주))의 설명서에 따르되, 단, 예외적으로, 200 nM의 유전자 특이 3' 프라이머(3PPIA)를 사용하여 PPIA cDNA를 생성함으로써 역전사를 수행하였다.
15.5 EzyAmp 반응 성분 및 조건
형광 증가에 의해 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임에 의한 MNA자임 기질의 절단, 및 RE인 Mnl I에 의한 형광 표지된 CESA 성분, EAS1_10 및 EAS1_12의 절단을 측정하였다. 표적(PPIA cDNA; 반응(i) 115 pg, 반응(ii) 23 pg)을 첨가함으로써 테스트 반응을 개시시키고, "표적 부재 대조군" 반응(반응(iii))은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 모든 반응은 총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 2중으로 수행하였다. 각 반응에 대한 형광 신호를 150회의 사이클 동안 매초 후 채널 1(FAM)에서 판독하였다(스캔 모드: FAM/SYBR만). 모든 반응은 10 mM MgCl2 중 0.75 U Mnl I(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 1 x NE버퍼 1(뉴 잉글랜드 바이오랩스; KOH를 이용하여 pH 8.5로 조정된 것)과 함께, 300 nM 파트자임 A(PPIAA2/1), 150 nM 파트자임 B(PPIAB3/1), 및 30 nM Sub1i-FIB; 각각 100 nM의 EAS1_10, EAS2_11, EAS1_12, 및 EAS2_13으로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다.
15.6 결과: 표적 cDNA 의 존재 검출
도 26은 115 pg의 cDNA를 함유하는 반응(i), 및 23 pg의 cDNA를 함유하는 반응(ii)의 형광 증가를 보여주는 것이다. EzyAmp 반응에서 표적량이 형광 신호 발생에 소요되는 시간을 결정한다. 표적 분자가 적게 존재할수록, 검출가능한 형광 신호가 발생되는 데 소요되는 시간이 길어진다. '표적 부재 대조군' 반응(반응(iii))에서 대략적으로 처음 110분 동안 신호 증가는 관찰되지 않았다(하지만, 상기 시간 이후 약간의 형광 이동은 관찰되었다). 이는 DF가 생성되고, 이후 EzyAmp 신호 증폭을 위해서는 촉매적으로 활성을 띠는 MNA자임이 형성되어야 했고, 상기와 같은 형성은 적합한 표적(본 실시예에서, PPIA cDNA)의 존재하에서만 개시되었다는 것을 나타낸다.
실시예 16
하기 실시예는 TspRI로 알려져 있는 내열성 RE에 의해 절단가능하거나, 절단가능하지 않은 다양한 이중체 구조체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증한다.
16.1. 올리고뉴클레오티드
하기 반응에서, 올리고뉴클레오티드 단편을 조합하여 이중체를 형성하고, 상기 이중체를 RE인 TspRI에 대한 기질로서 작용할 수 있는 그의 능력에 대하여 테스트하였다. CESA, PESA 및 EIC의 예시적인 구조체는 도 1에 도시되어 있다. 본 실시예에서, 다양한 이중체는 TspRI에 대한 이중 가닥 RERS의 한 가닥을 형성하는 데 필요한 염기 모두를 포함하는 한 올리고뉴클레오티드를 포함하였다.
TspRI에 의한 CESA 복합체의 절단 후, 형광단 및 소광제 모이어티의 분리에 기인하는 형광 변화를 관찰함으로써 RE 절단 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1은 말단을 그의 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ") 모이어티로 표지하였고, 이는 RE인 TspRI에 대한 RERS의 한 가닥을 형성하는 데 필요한 염기 모두에 상응하는 서열을 포함하였다. EAS2는 말단을 그의 3' 말단은 6-플루오레세인("FAM") 모이어티로 표지하였고, 이는 RERS의 제2 가닥을 형성하는 데 필요한 염기 중 일부를 포함하였다. EAS2 및 EAS1은 어닐링하여 PESA 복합체를 형성하도록 디자인하였다(도 1C). (오직 데옥시리보뉴클레오티드로만 구성된) DF-1 또는 (데옥시리보뉴클레오티드 및 하나의 리보뉴클레오티드로 구성된) DF-2와 PESA의 하이브리드화는 그를 통해 각각 모든 DNA 뉴클레오티드와 함께 RERS를 포함하거나, 또는 하나의 RNA 뉴클레오티드와 함께 RERS를 포함하는 CESA가 형성될 수 있도록 디자인하였다(도 1A). 별법으로, 억제 단편(InF)의 하이브리드화는 그를 통해 효소 억제 복합체(EIC)가 형성될 수 있도록 디자인하였다(도 1B). InF를 내부의 14번 위치의 T 염기 상에서 플루오레세인 모이어티로 표지하고, 3' 말단은 IaBFQ 모이어티로 표지하였다. 마지막으로, 완전 연속 RERS를 포함하는 안티센스 대조군 가닥(ASC)을 하기 표 15에 5'→3' 방향으로 열거되어 있다. TspRI의 인식 부위 및 절단 부위에 기여하는 염기는 5'NNCASTGNN/3' 및 3'/NNGTSACNN5'이다(여기서, "N"은 임의의 염기일 수 있고, "S"는 C 또는 G일 수 있고, "/"는 절단 부위를 표시한다).
Figure pct00057
표 15 중의 각 올리고에 대한 서열은 하기 표 16에서 제공한다. 대문자는 DNA를 나타내고, 소문자는 RNA를 나타낸다. 잠재적으로 TspRI 인식 부위 및 절단 부위에 기여할 수 있는 염기는 굵은체로 표시되어 있다.
Figure pct00058
16.2. 반응 성분
하기 표 15에 열거된 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 반응 A, B, C, D, E 및 F를 설정하였다. 모든 반응은 뉴클레아제 무함유 물 중 100 nM의 EAS1, 1 BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 20 mM MgCl2(앰비온), 및 20 mM 트리스 HCl(pH 8.5)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)); 50 mM 아세트산칼륨(시그마-알드리치); 1 mM DTT(시그마-알드리치) 및 10 mM 아세트산마그네슘(시그마-알드리치))을 포함하였다. 반응 A 내지 E는 2 U TspRI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 포함하는 반면, 반응 F는 포함하지 않았다. 추가로, 반응 A는 각각의 100 nM의 EAS2 및 DF-1을 포함하였고; 반응 B는 각각의 100 nM의 EAS2 및 DF-2를 포함하였고; 반응 C는 각각의 100 nM의 EAS2 및 InF를 포함하였고; 반응 D는 100 nM의 EAS2를 포함하였고; 반응 E 및 F는 100 nM의 ASC를 포함하였다. 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 구입하였다. 반응은 총 부피를 25 ㎕로 하여 47℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 수행하였다. 각 시료에 대한 형광을 채널 1(FAM; 스캔 모드 SYBR/FAM만)에서 총 100회의 사이클 동안 매 1초 후 판독하도록 프로그래밍하였다(총 반응 시간은 대략 17분이었다).
16.3. 결과: 절단 검출
EAS1 및 그의 완전 상보적인 가닥, ASC를 포함하는 반응 E에서는 시간 경과에 따른 형광 신호의 증가가 관찰되었는데, 이는 상기 구조체가 TspRI에 의해 쉽게 절단된다는 것을 나타낸다. EAS1 및 그의 완전 상보적인 가닥, ASC는 포함하지만, TspRI은 포함하지 않는 반응 F의 경우, 형광 증가는 관찰되지 않았다.
반응 A에서는 형광 증가가 관찰되었는데, 이는 (오직 DNA로만 구성된) DF-1이 PESA에 결합할 수 있고, RER을 완성하고, RE에 의해 절단된 CESA를 형성하였다는 것을 나타낸다. 이는 TspRI가 그의 제한 부위 내에 닉을 포함하는 이중체를 절단할 수 있다는 것을 입증하였다. RERS를 완성하는 서열의 일부로서 리보뉴클레오티드를 가지는 DF-2를 포함하는 반응 B에서도 또한 형광 증가가 관찰되었다. 이는 CESA가 형성되었고, TspRI가 이중체의 인식 서열 및 절단 서열 내에 닉 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 것인 이중체를 절단할 수 있다는 것을 나타낸다. 대조적으로, PESA 및 InF를 포함하는 반응 C에서 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 상기 올리고가 EIC를 형성하였다는 것을 나타낸다. 유사하게, 오직 PESA만을 포함한 반응 D에서 형광 증가는 관찰되지 않았는데, 이는 RE에 의해 절단되기 위해서는 완전 RERS가 요구된다는 것을 나타낸다. 따라서, TspRI는 실시예 6, 표 13에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, 패턴 II를 보이는 효소와 유사한 것이었다.
결론적으로, TspRI는 그의 활성이 이중체 기질의 구조체를 변형시킴에 따라 조작될 수 있기 때문에, EzyAmp에서 사용하기에 이상적인 후보 RE라고 볼 수 있다. 상기 효소는 또한 고도로 내열성이고, 따라서, 가열에 의한 변성에 대하여 내성을 띤다. 따라서, 상기 효소는 주형, 예컨대, 게놈 DNA와 혼합될 수 있고, 가열을 통해 이중 나선의 두 가닥으로 분리될 수 있고, 이로써, 단백질 또는 핵산 효소에 의한 절단에 적합한 단일 가닥 주형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA 주형은 MNA자임에 대한 조립 촉진제로서 작용할 수 있고, 따라서, EzyAmp 반응을 개시시키는 데 사용될 수 있다. TspRI와 유사하게, MNA자임은 PCR 반응에서의 유용성을 통해 입증된 바와 같이, 열 변성 단계에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 별법으로, 단일 가닥 DNA는 도 8 내지 11에 도시된 것과 유사한 전략법에서 합성 올리고 개시제(SIO)에 의한 결합에 이용될 수 있고, 이어서, 내열성 단백질 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다.
실시예 17
하기 실시예는 CESA가 그의 매칭 DF의 존재하에서 형성된 이후, RE에 의해 절단될 수 있는 능력을 입증한다. 본 전략법에서, CESA의 절단에 의해 생성된 단편 중 하나는 원래의 DF의 단축 버전에 상응하는 것이었다. 따라서, 상기 절단 단편은 도 27A에 도시되어 있는 바와 같이, 또 다른 PESA에 대한 DF로서 작용할 수 있는 잠재성이 있으며, 이로써, 자기 피드백 신호 증폭이 형성된다.
17.1 올리고뉴 클레오티드
하기 반응에서, CESA는 PESA 및 DF(DF1)로 구성되었다. 결국, PESA A는 EAS1(EAS1_1) 및 EAS2(EAS2_2)로 구성되었다. PESA의 EAS2는 그 안에 DF의 단축 서열에 등가인 영역을 포함하였다.
형광단 및 소광제의 분리에 상응하는 형광 변화에 의해 RE 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에서, EAS1은 그의 말단을 5' 말단은 아이오와 블랙 FQ("IAbFQ")로, 및 3' 말단은 블랙 홀 소광제 1("BHQ_1")로 표지하였다. EAS2는 5' 말단을 6-플루오레세인("6-FAM")으로 표지하고, EAS1에 어닐링시켰다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 5'→3' 방향으로 열거되어 있으며, 여기서, 밑줄체로 표시된 염기가 Mnl I에 대한 인식 서열(CCTC 또는 GAGG)의 적어도 일부를 형성한다. 이탤릭체로 굵게 표시된 염기는 EAS2의 콘텍스트에 존재하는 단축 버전의 DF1과 등가인 것을 나타낸다.
Figure pct00059
.
17.2 반응 조건
올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT)로부터 구입하였다. 모든 반응은 10 mM MgCl2 중 각각의 100 nM EAS1_1 및 EAS2_2(앰비온), 1 x BSA(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 x NE버퍼 4(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 뉴클레아제 무함유 물(앰비온) 및 0.75 U Mnl I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 이루어진 벌크 믹스를 함유하였다. 반응의 총 부피는 25 ㎕였다. 테스트 반응(i)은 100 nM DF를 첨가함으로써 개시시키고, 대조군 반응(ii)은 H2O를 첨가함으로써 개시시켰다. 반응은 35℃하에 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(바이오래드)에서 2중으로 진행하였다. 각 시료에 대한 형광을 200회의 사이클 동안 매 30초 후 판독하도록 프로그래밍하였다(스캔 모드: FAM/SBYR만). 총 진행 시간은 125분이었다.
17.3 결과: CESA 절단 검출
2중으로 수행된 각 반응의 형광 판독값의 평균을 시간에 대해 플롯팅하고, 이를 도 27B에 나타내었다. 반응(i)에서, DF를 첨가한 결과, 시간 경과에 따라 형광이 증가하였다(i). 대조적으로, DF의 부재하에서는 시간 경과에 따른 형광 증가는 관찰되지 않았다(ii).
CESA 형성을 위해서는 DF가 첨가되어야 한다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다. 결국, Mnl I에 의해 CESA가 절단되면, (형광 증가로 나타나는 바와 같이) 형광단 및 소광제 모이어티를 포함하는 것을 비롯한 단편의 해리가 일어났다. 추가로, 절단 단편 중 하나는 원래의 DF 서열의 단축 버전에 상응하였다. 이러한 새로운 DF는 잠재적으로는 또 다른 PESA에 결합함으로써 개시 DF와 동일한 기능을 수행할 수 있는 것이었다.
SEQUENCE LISTING <110> SpeeDx Pty Ltd <120> Signal Amplification <130> P011726C <140> PCT/AU2011/001504 <141> 2011-11-21 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Nt.AlwI restriction enzyme recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 tgannnnnnn ntgct 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Eco606ORF4215P restriction enzyme recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 tgannnnnnn ntgct 15 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Bgl I restriction enzyme recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 gccnnnnngg c 11 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Bcg I 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recognition sequence 5' strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 nncctcnnnn nnn 13 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Mnl I restriction enzyme recognition sequence 3' strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 nnggagnnnn nn 12 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctcttcctcg tcttcacatc cta 23 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 taggatgtga agacga 16 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Sequence: synthetic oligonucleotide with ribonucleotide at position nine <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctcactatag gaagagat 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ctcttcctca gcagttcatc 20 <210> 29 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gatgaactgc tga 13 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 gctcctcatc cagcagcggt cgaaatagtg ag 32 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 atctcttctc cgagcgtgta cgacaatggc 30 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 gccattgtcg tacacctgct ggatgaggag c 31 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 tctcttccnn nnnnn 15 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 tctcttccgg annnn 15 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 tctcttcctc nnnnn 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 tctcttcctc ttcnn 15 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 nnnnnncctt cnnn 14 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 nnngcgcctt cnnn 14 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ctcttcctca gcagttcatt 20 <210> 40 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 aatgaactgc tga 13 <210> 41 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 cctcnnnnnn n 11 <210> 42 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 gaggnnnnnn 10 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 catctcttcc tcagagcctg actt 24 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 aagtcaggtg ctgagg 16 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 aagtcaggtg ctgag 15 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ctcttcctca gcacctgatt 20 <210> 47 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 aatcaggtgc tga 13 <210> 48 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 aagtcaggtg ctg 13 <210> 49 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aggaagagat g 11 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 tccgcagcct cccttctcta c 21 <210> 51 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gaggctgcgg a 11 <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gtagagaagg 10 <210> 53 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 gggaggctgc gga 13 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 tggttgagca gagagggatc atc 23 <210> 55 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 tctctgctca acca 14 <210> 56 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: nucleic acid comprising partial EarI restriction enzyme recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 gagaagnnnn 10 <210> 57 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: nucleic acid comprising partial AlwI restriction enzyme recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (6)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 cctagnnnnn 10 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 gatgaactgc tgaggaagag at 22 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 caggatgtga agacgaggaa gaagat 26 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 ctcttccact tgatcccgta t 21 <210> 61 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 atacgggatc aagt 14 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 atacgggatc aagtggaaga gat 23 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 ctctccaggc aagaggt 17 <210> 64 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 acctacttgc ct 12 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 acctacttgc ctggaagaga t 21 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ctcttccgga gttgct 16 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 agcaactccg gaagagat 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 tcagcagttt aaacaacc 18 <210> 69 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ggttgtttaa 10 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ggttgtttaa actgctga 18 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 tcagcagtac acagaacc 18 <210> 72 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 ggttctgtgt 10 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 ggttctgtgt actgctga 18 <210> 74 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 aatcaggtgc tga 13 <210> 75 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 tcagtcccac gtgtga 16 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 tcagcacctc acacgtggga agag 24 <210> 77 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 atctcttcct ctacaccttt tttttttttt tttttaggtg tgga 44 <210> 78 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 tccacacctc tcttcctttt tttttttttt tttttggaag aga 43 <210> 79 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ggaagagatg 10 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 ggtgctgata ctgcgctctg gg 22 <210> 81 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag gttgtgc 37 <210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 ttggtgaggc tagctgtgga gacggattac accttc 36 <210> 83 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg 43 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Sequence: synthetic oligonucleotide with ribonucleotides at positions twenty-two and twenty-three <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 cccagagcgc agtccacaac cgucaccaat cagcacc 37 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ctcttcctct cttcccggat gtcggcctcc tagtacagcg 40 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 taggatgtga agacgaggaa gagat 25 <210> 87 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 tgctcatctc agcggtcgaa atagtgagt 29 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 catctcttct ccgagcgtct acgacaat 28 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 attgtcgtag acctgagatg agca 24 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Sequence: synthetic oligonucleotide with ribonucleotide at position ten <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 actcactata ggaagagatg 20 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 cgacgtcctc aacaggcaac acc 23 <210> 92 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 ttcgttgcct gttga 15 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ggacgtcgta ctgcgctctg gg 22 <210> 94 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Sequence: synthetic oligonucleotide with ribonucleotides at positions forty-one and forty-two <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ggtgctgata ctgctttttt tttttttgca gtccacaacc gucaccaaat cagcacc 57 <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 tggttggatg ggcaagcatg tgcggtcgaa atagtgagt 39 <210> 96 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 catctcttct ccgagcgtgt ttggcaaagt gaaagaag 38 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gcgctccatg gcctccac 18 <210> 98 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 agatccttgt cgcagtgtat agtgagtgcc tgg 33 <210> 99 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 cactgcgaca aggatct 17 <210> 100 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 ccaggcactc actata 16 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Sequence: synthetic oligonucleotide with ribonucleotide at position sixteen <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 ccaggcactc actata 16 <210> 102 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ccaaaccagg cactcactat aggaagagat g 31 <210> 103 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 ccaggcactc actatacact gcgacaagga tct 33 <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 atcacatccg ggaagaga 18

Claims (263)

  1. 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물.
  2. EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 조성물.
  3. 다성분 핵산 효소(MNA자임), MNA자임 기질, EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
    MNA자임은 MNA자임 조립 촉진제의 존재하에서 자기 조립되어 MNA자임을 형성하는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하고, 상기 적어도 제1 및 상기 제2 파트자임은 각각 기질 아암부, 촉매성 코어부, 및 센서 아암부를 포함하고, 센서 아암은 상기 MNA자임 조립 촉진제와 상호작용하여 제1 및 제2 파트자임을 이들의 각각의 촉매성 코어부의 회합을 위한 근접한 위치에 유지시켜 MNA자임의 촉매성 코어를 형성하고, 상기 촉매성 코어는 상기 MNA자임 기질을 변형시켜 제1 DF를 형성할 수 있고;
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이며, 제1 DF는 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 적어도 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2 가닥이 제1 DF를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가닥이 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결되는 것인 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치하는 것인 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조립 촉진제는 확인하고자 하는 표적인 것인 조성물.
  9. 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 조성물로서, 여기서,
    SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 기질을 형성할 수 있고, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 이중체 기질을 절단함으로써 제1 DF를 생성할 수 있고;
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있는 것인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 제한 효소가 아닌 것인 조성물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레아제가 동일한 뉴클레아제인 것인 조성물.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레아제가 상이한 뉴클레아제인 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉(nick)을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 조성물.
  17. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 닉이 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치하는 것인 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열을 완성하는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 절단 서열을 완성하는 것인 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 제1 DF가 1 이상의 염기를 상기 서열에 제공하는 것인 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF가 2 이상의 염기를 상기 서열에 제공하는 것인 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF가 3 이상의 염기를 상기 서열에 제공하는 것인 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 상기 EAS1 및 EAS2의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 3' 바로 옆에 있는 것인 조성물.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 상기 EAS1 및 EAS2의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 5' 바로 옆에 있는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF가 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는 것인 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1 및 EAS2가 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부가 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비(non)올리고뉴클레오티드 링커인 것인 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 상기 EAS1 또는 EAS2 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행(overhang)부를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있는 것인 조성물.
  32. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부의 일부가 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있는 것인 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 제1 DF 및 상기 제2 DF가 동일한 것이 아닌 것인 조성물.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 제1 DF 및 상기 제2 DF가 동일한 것인 조성물.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서, 제2 DF가 상기 제1 DF의 단편이거나, 또는 상기 제1 DF가 상기 제2 DF의 단편인 것인 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 제2 DF, EAS1, 및 EAS2가 조립되어 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 조성물.
  37. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3) 및 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4)를 추가로 포함하고, 여기서, EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고, EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, EAS3 및 EAS4는 오직 제2 DF와의 조립시에만 추가 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, EAS3 또는 EAS4가 제3 DF를 포함하는 것인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 제3 DF가 상기 제1 DF와 동일한 것인 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 제3 DF가 상기 제1 DF와 동일하지 않은 것인 조성물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 조성물 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일한 것인 조성물.
  42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 조성물 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하지 않고, 여기서, 상기 조성물은 상기 추가 뉴클레아제를 포함하는 것인 조성물.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 조성물.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DF의 상기 EAS3에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 뉴클레아제 절단 서열을 완성하는 것인 조성물.
  46. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DF가 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는 것인 조성물.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS3 및 EAS4가 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 조성물.
  48. 제47항에 있이서, 상기 헤어핀 루프부가 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커인 것인 조성물.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 상기 EAS3 또는 EAS4 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함하는 것인 조성물.
  50. 골격 올리고뉴클레오티드, EAS1, EAS2, EAS3, 및 EAS4를 포함하는 제1 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) 상기 EAS1을 포함하는 제1부(portion)로서, 여기서, 상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS2의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부;
    (ii) 상기 EAS3을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS3의 일부는 상기 EAS4의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS3 및 EAS4는 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부
    를 포함하는 것인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 골격 올리고뉴클레오티드, 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5), 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6), 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7), 및 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8)를 포함하는 제2 복합체를 추가로 포함하고,
    여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) 상기 EAS5를 포함하는 제1부로서, 여기서, 상기 EAS5의 일부는 상기 EAS6의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5의 일부는 상기 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 또는 EAS6의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS5 및 EAS6은 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제3 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제3 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부; 및
    (ii) 상기 EAS7을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS7의 일부는 상기 EAS8의 일부에 상보적이고, 상기 EAS8의 일부는 상기 제1 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 DF를 포함하고, EAS7 및 EAS8은 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제4 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제4 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부
    를 포함하는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, EAS1이 EAS7과 동일하고/거나, EAS2가 EAS8과 동일하고/거나, EAS3이 EAS5와 동일하고/거나, EAS4가 EAS6과 동일한 것인 조성물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 제1 뉴클레아제가 제3 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제2 뉴클레아제가 제4 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레아제가 동일한 것인 조성물.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 복합체가 이들의 각각의 상보적인 제3부를 통해 하이브리드화함으로써 제1 이중 복합체를 형성하는 것인 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 조성물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 조성물.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 연결이 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 공유 결합 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성되는 것인 조성물.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 연결이 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드들 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성되는 것인 조성물.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 조성물.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF의 상기 EAS2 또는 EAS8에의 결합 및/또는 상기 제2 DF의 상기 EAS3 또는 EAS5에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 서열을 완성하는 것인 조성물.
  63. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF의 상기 EAS2 또는 EAS8에의 결합 및/또는 상기 제2 DF의 상기 EAS3 또는 EAS5에의 결합이 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 서열 또는 상기 뉴클레아제 절단 서열에 제공하지 않는 것인 조성물.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되는 효소 증폭제 기질 쌍이 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부가 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커인 것인 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함하는 것인 조성물.
  67. SIO를 포함하는 조성물로서, 상기 SIO는
    (i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인, 제1부 및 제2부; 및
    (ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서,
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 가진 이중체 구조체를 제공하고,
    EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고,
    EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 의한 분해(digestion)가 가능한 오목형(recessed) 3' 말단을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인, EAS1 및 EAS2
    를 포함하는 것인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 SIO가 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 엑소뉴클레아제가 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 5개 이상의 염기의 3' 오버행을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(linkage)을 분해할 수 없는 것인 조성물.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 제1 DF가 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 사용하여 생성되는 것인 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 엑소뉴클레아제가 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 엑소뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 III인 것인 조성물.
  74. 제71항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 T7 엔도뉴클레아제 I, RN아제 H, 플랩(Flap) 뉴클레아제, 또는 멍빈(Mung Bean) 뉴클레아제인 것인 조성물.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 것인 조성물.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 형광단 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하는 것인 조성물.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 파트자임, 조립 촉진제, MNA자임 기질, DF, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, 또는 SIO가 포스포로티오에이트, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시히드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실퀘오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 퀘오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘 및 베타 D-아라비노실 티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오티드 치환 또는 부가를 포함하는 것인 조성물.
  78. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MNA자임 파트자임, MNA자임 기질 또는 그의 조합 중 1 이상이 압타머 또는 그의 일부를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 압타머 또는 그의 일부가 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 그의 유도체, 또는 그의 조합 중 1 이상을 포함하는 것인 조성물.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, SIO, DF 또는 뉴클레아제가 고체 지지체에 부착되어 있는 것인 조성물.
  81. 제1항, 제2항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF가 오직 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 조성물.
  82. 제3항, 제9항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF가 상기 표적과는 별개의 것인 조성물.
  83. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 표적을 검출하기 위한 것이고, 제1 DF는 상기 표적과는 별개의 것인 조성물.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 또 다른 EAS와 하이브리드화함으로써 1 초과의 DF와 하이브리드화할 수 있는 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 형성할 수 있는 것인 조성물.
  85. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 포함하는 것인 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 상기 MNA자임이 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은(same) 기질을 인식하고 절단하는 것인 조성물.
  87. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 별개의 표적들에 대해 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 포함하는 것인 조성물.
  88. 제9항 또는 제67항에 있어서, 상기 조성물이 별개의 표적들에 대하여 상보성(complementarity)을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 포함하는 것인 조성물.
  89. 제1항 내지 제3항, 제9항, 제50항 및 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상이한 제1 DF와 조립된 2 이상의 별개의 제1 CESA 복합체를 포함하는 것인 조성물.
  90. (a) 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 다성분 핵산(MNA자임) 기질을 제공하는 단계로서, 여기서, 파트자임은 표적의 존재하에서 자기 조립되어 1 이상의 MNA자임을 형성하는 것인 단계;
    (b) MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 MNA자임의 촉매 활성을 통해 상기 1 이상의 MNA자임 기질로부터 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)를 생성하는 것인 단계;
    (c) 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
    (d) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체가 형성될 수 있도록 허용하고,
    (2) 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
    (e) 제1 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
    (f) 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제1 뉴클레아제를 제1 CESA 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
    를 포함하는, 표적을 검출하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 제1 뉴클레아제에 대한 상기 인식 부위 및/또는 상기 절단 부위를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 제1 DF가 MNA자임 기질의 절단에 의해 생성되는 것인 방법.
  93. 제90항 또는 제91항에 있어서, 제1 DF가 2 이상의 MNA자임 기질의 결찰에 의해 생성되는 것인 방법.
  94. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 제2 가닥이 제1 DF를 포함하는 것인 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가닥이 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결되는 것인 방법.
  97. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치하는 것인 방법.
  98. (a) 적어도 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO)를 제공하는 단계;
    (b) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 뉴클레아제에 대한 이중체 기질을 형성하는 단계;
    (c) SIO 및 표적의 하이브리드화에 의해 형성된 이중체 기질을 절단할 수 있는 제1 뉴클레아제를 제공하는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 이중체 기질의 절단을 통해 제1 DF가 생성되는 것인 단계;
    (d) EAS1 및 EAS2를 제공하는 단계로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인 단계;
    (e) (1) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립되어 제1 CESA가 형성될 수 있도록 허용하고,
    (2) 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위가 형성될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 제1 DF와 접촉시키는 단계;
    (f) 제2 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및
    (g) 제2 뉴클레아제와 인식 부위와의 상호작용 및 절단 부위에서의 절단을 허용하는 조건하에서 제2 뉴클레아제를 제1 CESA와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 절단을 통해 표적이 존재함을 나타내는 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
    를 포함하는, 표적을 검출하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 제1 뉴클레아제는 오직 상기 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 상기 SIO를 절단하여 상기 제1 DF를 생성하는 것인 방법.
  100. 제98항에 있어서, 제1 뉴클레아제는 오직 상기 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 상기 표적을 절단하여 상기 제1 DF를 생성하는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 제한 효소가 아닌 것인 방법.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 방법.
  103. 제90항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CESA 복합체의 절단을 통해 추가의 DF가 유리될 수 있고, 추가의 DF가 추가의 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가의 CESA 복합체를 형성하고, 1 이상의 뉴클레아제를 사용하여 추가의 CESA 복합체를 절단함으로써 추가의 검출가능한 결과를 얻고 추가의 DF를 유리시킴으로써 검출가능한 결과의 추가 증가를 촉진시키는 것인 방법.
  104. (a) 제1 DF를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 DF는 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
    (b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
    EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적이고;
    EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하는 것인, EAS1 및 EAS2; 및
    (ii) 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3)의 일부가 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4)의 일부에 상보적이고;
    EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS3 및 EAS4
    를 제공하는 단계;
    (c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
    (ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA 복합체를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
    (d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하고;
    (ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA 복합체를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제2 CESA 복합체를 절단하는 것인 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드(cascade)를 사용하여 표적을 검출하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 제1 CESA 복합체 및 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제가 동일한 뉴클레아제인 것인 방법.
  107. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제가 상이한 뉴클레아제인 것인 방법.
  108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS3 또는 상기 EAS4의 일부가 추가의 DF를 포함하고, 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리되는 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 추가의 DF의 일부가 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5)의 제1부에 상보적이고, 여기서, 상기 EAS5의 제2부는 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6)의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 및 EAS6은 상기 추가의 DF와 조립됨으로써 제3 CESA 복합체를 형성하는 것인 방법.
  110. 제108항에 있어서,
    (i) 추가의 DF의 일부가 상기 제1 DF와 동일하거나;
    (ii) 추가의 DF가 상기 제1 DF와 동일하거나; 또는
    (iii) 추가의 DF가 상기 제1 DF의 단편이고;
    여기서, 상기 추가의 DF는 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 방법.
  111. (a) 적어도 제1 DF 및 제2 DF를 생성하는 단계로서, 상기 제1 DF는 오직 제1 표적의 존재하에서만 생성되고, 상기 제2 DF는 오직 제2 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
    (b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
    EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS1 및 EAS2; 및
    (ii) EAS3의 일부가 EAS4의 일부에 상보적이고:
    EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS3 및 EAS4
    를 제공하는 단계;
    (c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
    (ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA 복합체를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제1 CESA 복합체를 절단함으로써 제1 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계;
    (d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA 복합체를 형성하고;
    (ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA 복합체의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA 복합체를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 절단 부위에서 상기 제2 CESA 복합체를 절단함으로써 제2 검출가능한 결과를 얻는 것인 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 제1 검출가능한 결과는 상기 제2 검출가능한 결과와는 별개의 것인, 캐스케이드를 사용하여 복수 개의 별개의 표적을 검출하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제가 동일한 뉴클레아제인 것인 방법.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제 및 상기 제2 뉴클레아제가 상이한 뉴클레아제인 것인 방법.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 EAS1 또는 상기 EAS2의 일부가 추가의 DF를 포함하고, 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리되고;
    (ii) 상기 추가의 DF가 2 이상의 추가 EAS 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가 CESA 복합체를 형성하고, 뉴클레아제에 의한 상기 추가 CESA 복합체의 절단을 통해 상기 제1 검출가능한 결과가 증가되는 것인 방법.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 EAS3 또는 상기 EAS4의 일부가 추가의 DF를 포함하고, 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 복합체의 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 상기 추가의 DF가 유리되고;
    (ii) 상기 추가의 DF가 2 이상의 추가 EAS 올리고뉴클레오티드와 조립됨으로써 추가 CESA 복합체를 형성하고, 뉴클레아제에 의한 상기 추가 CESA 복합체의 절단을 통해 상기 제2 검출가능한 결과가 증가되는 것인 방법.
  116. (a) 제1 구동자 단편을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 구동자 단편은 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
    (b) (i) EAS1의 일부가 EAS2의 일부에 상보적이고:
    EAS1의 일부가 제1 DF의 일부에 상보적이고;
    EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하고;
    EAS1 또는 EAS2가 지지체에 테더링되어 있는 것인, EAS1 및 EAS2; 및
    (ii) EAS3의 일부가 EAS4의 일부에 상보적이고;
    EAS3의 일부가 제2 DF의 일부에 상보적이고;
    EAS3 또는 EAS4의 일부가 제3 DF를 포함하고;
    EAS3 또는 EAS4가 지지체에 테더링되어 있는 것인, EAS3 및 EAS4
    를 제공하는 단계;
    (c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 상기 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA를 형성하고;
    (ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
    (d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA를 형성하고;
    (ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있는 제3 DF가 유리되는 것인 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법.
  117. 제104항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제1 DF가,
    SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
    이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계
    에 의해 생성되고,
    여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제1 DF가 유리되는 것인 방법.
  118. 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제2 DF가,
    SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
    이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계
    에 의해 생성되고,
    여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제2 DF가 유리되는 것인 방법.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단하여 상기 DF를 생성하는 것인 방법.
  120. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단하여 상기 DF를 생성하는 것인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제가 제한 효소가 아닌 것인 방법.
  122. 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 방법.
  123. 제117항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIO가 지지체에 부착되어 있는 것인 방법.
  124. 제104항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제1 DF가 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하는 단계, 및 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제1 DF를 제공하는 것인 방법.
  125. 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제2 DF가 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하는 단계, 및 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제2 DF를 제공하는 것인 방법.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 제2 가닥이 상기 DF를 포함하는 것인 방법.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가닥이 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결되는 것인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부가 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커인 것인 방법.
  130. 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치하는 것인 방법.
  131. 제104항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS3 및 EAS4가 상기 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분들 간에 형성된 이중 가닥부, 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분인 것인 방법.
  132. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1 및 EAS2가 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분들 간에 형성된 이중 가닥부 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체의 성분인 것인 방법.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부가 올리고뉴클레오티드 링커 또는 비올리고뉴클레오티드 링커인 것인 방법.
  134. 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 복합체가 한(one) EAS 올리고뉴클레오티드로부터 신장된 5' 또는 3' 오버행잉형 단일 가닥부를 더 포함하는 것인 방법.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부가 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하는 것인 방법.
  136. 제104항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, EAS3 및/또는 EAS4가 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  137. 제136항에 있어서, EAS3이 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, EAS4가 추가의 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 추가의 소광제 부분은 제2 뉴클레아제에 의한 제2 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  138. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, EAS1 및/또는 EAS2가 검출가능한 부분 및/또는 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  139. 제138항에 있어서, EAS1이 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, EAS2가 추가의 소광제 부분을 포함하고, 상기 검출가능한 부분 및 추가의 소광제 부분은 제1 뉴클레아제에 의한 제1 CESA 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  140. 제135항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 부분이 형광단인 것인 방법.
  141. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 방법.
  142. 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 방법.
  143. 제104항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있고/거나, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 방법.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 닉이 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치하는 것인 방법.
  145. 제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  146. 제90항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF의 상기 EAS1에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성하는 것인 방법.
  147. 제104항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DF의 상기 EAS2에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성하는 것인 방법.
  148. 제146항 또는 제147항에 있어서, DF가 1 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 서열 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공하는 것인 방법.
  149. 제146항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, DF가 2 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공하는 것인 방법.
  150. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, DF가 3 이상의 염기를 상기 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위에 제공하는 것인 방법.
  151. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 3' 바로 옆에 있는 것인 방법.
  152. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 형성된 부분 뉴클레아제 인식 부위의 5' 바로 옆에 있는 것인 방법.
  153. 제90항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DF가 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 부위 또는 상기 뉴클레아제 절단 부위에 제공하지 않는 것인 방법.
  154. 제104항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DF가 어떤 염기도 상기 뉴클레아제 인식 부위 또는 상기 뉴클레아제 절단 부위에 제공하지 않는 것인 방법.
  155. (a) 제1 구동자 단편을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 구동자 단편은 오직 상기 표적의 존재하에서만 생성되는 것인 단계;
    (b) 제1 골격 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) EAS1을 포함하는 제1부로서, 여기서,
    상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고;
    EAS2의 일부는 제1 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
    EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 구동자 단편을 포함하는 것인 제1부;
    (ii) EAS3을 포함하는 제2부로서, 여기서,
    상기 EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고;
    상기 EAS3의 일부는 제2 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
    상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 구동자 단편을 포함하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부
    를 포함하는 것인 단계;
    (c) (i) 제1 DF가 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 상기 (a)의 제1 DF와 접촉시켜 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제1 CESA를 형성하고;
    (ii) 제1 뉴클레아제와 제1 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제1 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제1 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해 제2 DF가 유리되는 것인 단계;
    (d) (i) 제2 DF가 EAS3 및 EAS4와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS3 및 EAS4를 제2 DF와 접촉시켜 제2 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제2 CESA를 형성하고;
    (ii) 제2 뉴클레아제와 제2 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제2 CESA를 제2 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제2 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있는 제1 DF가 유리되는 것인 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 제1 CESA 복합체 및/또는 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법.
  156. 제155항에 있어서, 상기 제1 CESA 복합체의 절단 및 상기 제2 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  157. 제155항 또는 제156항에 있어서,
    (a) 골격 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 복합체를 제공하는 단계로서, 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5)를 포함하는 제1부로서, 여기서,
    상기 EAS5의 일부는 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6)의 일부에 상보적이고;
    EAS5의 일부는 제2 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
    EAS5 또는 EAS6의 일부는 제1 구동자 단편을 포함하는 것인 제1부; 및
    (ii) 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7)를 포함하는 제2부로서, 여기서,
    상기 EAS7의 일부는 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8)의 일부에 상보적이고;
    상기 EAS8의 일부는 제1 구동자 단편의 일부에 상보적이고;
    EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 구동자 단편을 포함하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부
    를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 제1 복합체의 제3부와 상기 제2 복합체의 제3부의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 상기 제1 및 제2 복합체를 접촉시켜 제1 이중 복합체를 형성하는 단계;
    (c) (i) 제2 DF가 EAS5 및 EAS6과 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS5 및 EAS6을 상기 (a)의 제2 DF와 접촉시켜 제3 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제3 CESA를 형성하고;
    (ii) 제3 뉴클레아제와 제3 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제3 CESA를 제3 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제3 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 제1 CESA를 형성할 수 있고 상기 EAS7 및 EAS8과 조립됨으로써 상기 제4 CESA를 형성할 수 있는 제1 DF가 유리되는 것인 단계;
    (d) (i) 제1 DF가 EAS7 및 EAS8과 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS7 및 EAS8을 제1 DF와 접촉시켜 제4 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 포함하는 제4 CESA를 형성하고;
    (ii) 제4 뉴클레아제와 제4 CESA의 인식 부위 및 절단 부위와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제4 CESA를 제4 뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 제4 뉴클레아제에 의한 상기 절단 부위에서의 절단을 통해, 상기 EAS3 및 EAS4와 조립됨으로써 상기 제2 CESA를 형성할 수 있고 상기 EAS5 및 EAS6과 조립됨으로써 상기 제3 CESA를 형성할 수 있는 제2 DF가 유리되는 것인 단계
    를 더 포함하고;
    여기서, 상기 제3 CESA 복합체 및/또는 상기 제4 CESA 복합체의 절단을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 제3 CESA 복합체의 절단 및 상기 제4 CESA 복합체의 절단을 통해 각각 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, EAS1이 EAS7과 동일하고/거나, EAS2가 EAS8과 동일하고/거나, EAS3이 EAS5와 동일하고/거나, EAS4가 EAS6과 동일한 것인 방법.
  160. 제157항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 방법.
  161. 제160항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 방법.
  162. 제160항 또는 제161항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 방법.
  163. 제161항 또는 제162항에 있어서, 상기 연결이 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성되는 것인 방법.
  164. 제161항 또는 제162항에 있어서, 상기 연결이 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성되는 것인 방법.
  165. 제155항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제1 DF가,
    SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써, 개시제 뉴클레아제에 의해 쉽게 변형될 수 있는 이중체 구조체를 형성하는 단계, 및
    이중체 구조체를 상기 개시제 뉴클레아제와 접촉시키는 단계
    에 의해 생성되고,
    여기서, 이중체 구조체 중 쌍을 이룬 또는 쌍을 이루지 않은 영역의 개시제 뉴클레아제에 의한 변형을 통해 상기 제2 DF가 유리되는 것인 방법.
  166. 제165항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단하여 상기 DF를 생성하는 것인 방법.
  167. 제165항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단하여 상기 DF를 생성하는 것인 방법.
  168. 제167항에 있어서, 상기 개시제 뉴클레아제가 제한 효소가 아닌 것인 방법.
  169. 제155항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 제1 DF가 2 이상의 파트자임 및 1 이상의 MNA자임 기질을 제공하는 단계, 및 표적의 존재하에 MNA자임의 자기 조립 및 촉매 활성을 허용하는 조건하에서 파트자임을, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시키는 단계에 의해 생성되고, 여기서, 상기 촉매 활성이 상기 기질을 변형시켜 상기 제1 DF를 제공하는 것인 방법.
  170. 제157항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7 및 EAS8 중 임의의 하나 이상이 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, 여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 CESA의 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  171. 제157항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) EAS1은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS2는 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
    (ii) EAS3은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS4는 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
    (iii) EAS5는 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS6은 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고/거나;
    (iv) EAS7은 검출가능한 부분을 포함하고 상기 EAS8은 소광제 부분을 포함하거나, 또는 그 반대로 포함하고;
    여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 CESA의 절단시에 분리되고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  172. 제155항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 뉴클레아제가 상기 제1, 제2 또는 제3 뉴클레아제에 대한 상기 인식 서열을 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  174. 제155항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 DF의 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드에의 결합이 부분 뉴클레아제 인식 부위 및/또는 부분 뉴클레아제 절단 부위를 완성하는 것인 방법.
  175. 제157항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되는 효소 증폭제 기질 쌍이 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 방법.
  176. 제90항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 제1 DF가 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제로부터 선택되는 뉴클레아제를 사용하여 생성되는 것인 방법.
  177. 제176항에 있어서, 엑소뉴클레아제가 뉴클레아제 BAL-31, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, T7 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  178. 제176항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 T7 엔도뉴클레아제 I, RN아제 H, 플랩 뉴클레아제, 또는 멍빈 뉴클레아제인 것인 방법.
  179. (a) (i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서, 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인, 제1부 및 제2부; 및
    (ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 가진 이중체 구조체를 제공하고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적인 것인, EAS1 및 EAS2;
    (iii) 제1 엑소뉴클레아제
    를 제공하는 단계; 및
    (b) (i) SIO와 표적의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 상기 SIO를, 표적을 함유할 것으로 추정되는 시료와 접촉시킴으로써 제1 엑소뉴클레아제에 대한 이중체 기질을 형성하며, 여기서, 제1 엑소뉴클레아제에 의한 이중체 구조체의 변형을 통해 상기 이중체 기질로부터 상기 제1 DF가 유리되고;
    (ii) 제1 DF가 상기 EAS1 및 EAS2와 조립될 수 있도록 허용하는 조건하에서 EAS1 및 EAS2를 (b)의 제1 DF와 접촉시켜 제2 엑소뉴클레아제에 대한 기질을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고;
    (iii) 제2 엑소뉴클레아제와 제1 CESA 복합체와의 상호작용을 허용하는 조건하에서 제1 CESA를 제2 엑소뉴클레아제와 접촉시키고, 여기서, 제2 엑소뉴클레아제에 의한 제1 CESA 복합체의 변형을 통해, 추가 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 추가의 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 상기 제1 DF가 상기 제1 CESA 복합체로부터 유리되는 것인 단계
    를 포함하고;
    여기서, 이중체 구조체의 상기 변형 및/또는 제1 CESA 복합체의 상기 변형을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인, 캐스케이드를 사용하여 표적을 검출하는 방법.
  180. 제179항에 있어서, 이중체 구조체의 상기 변형 및 제1 CESA 복합체의 상기 변형을 통해 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  181. 제179항 또는 제180항에 있어서, 상기 SIO가 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 것인 방법.
  182. 제179항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 엑소뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 III인 것인 방법.
  183. 제179항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIO 및/또는 상기 EAS1이 검출가능한 부분 및 소광제 부분을 포함하고, 여기서, 상기 검출가능한 부분 및 소광제 부분은 상기 엑소뉴클레아제에 의한 변형시 분리될 수 있고, 이로써 검출가능한 결과를 얻는 것인 방법.
  184. 제183항에 있어서, 상기 검출가능한 부분이 형광단인 것인 방법.
  185. 제90항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 결과가 형광 분광법, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법, 원편광 이색법, 면역검정법, 크로마토그래피, 방사선 측정법, 광도 측정법, 섬광조영술, 전자 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광법, 효소법 또는 그의 임의 조합에 의해 검출되는 것인 방법.
  186. 제90항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 결과를 측정하고, 여기서, 상기 측량의 규모 및/또는 검출가능한 결과의 누적 속도가 표적의 양 (quantity)을 나타내는 것인 방법.
  187. 제90항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소형 분자, 중합체, 금속 이온, 금속 염, 프리온, 핵산 또는 그의 임의의 유도체, 일부 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  188. 제187항에 있어서, 핵산이 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프레(pre)- 및 프리(pri)-마이크로RNA, 다른 비코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  189. 제187항 또는 제188항에 있어서, 핵산의 공급원이 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 및 그의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  190. 제187항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 증폭되는 것인 방법.
  191. 제98항, 제104항, 제111항, 제116항, 및 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF가 상기 표적과는 별개의 것인 방법.
  192. 제90항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 또 다른 EAS와 하이브리드화함으로써 1 초과의 DF와 하이브리드화할 수 있는 부분 효소 신호 증폭제(PESA) 복합체를 형성할 수 있는 것인 방법.
  193. 제90항 내지 제97항, 제124항, 제125항, 및 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 표적 분자의 상이한 부분들에 대하여 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  194. 제193항에 있어서, 상기 표적 분자의 상이한 부분들에 대하여 특이적인 상기 MNA자임이 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은 기질을 인식하고 절단하는 것인 방법.
  195. 제90항 내지 제97항, 제124항, 제125항, 및 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 별개의 표적에 대한 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  196. 제98항, 제117항, 제118항, 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 별개의 표적에 대하여 상보성을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  197. 제90항, 제98항, 제104항, 제11항, 제116항 및 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상이한 제1 DF와 조립된 2 이상의 별개의 제1 CESA 복합체를 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  198. 뉴클레아제; 및
    EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인 EAS1 및 EAS2
    를 포함하는, 신호 증폭용 키트.
  199. 뉴클레아제;
    EAS1 및 EAS2로서, 여기서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부는 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
    표적에 상응하는 MNA자임으로 조립되도록 디자인된 복수 개의 파트자임; 및
    MNA자임 기질로서, 여기서, 상기 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적인 것인 MNA자임 기질
    을 포함하고;
    여기서, EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트.
  200. 뉴클레아제;
    EAS1 및 EAS2로서, EAS1의 일부 및 EAS2의 일부가 상보적인 것인 EAS1 및 EAS2;
    표적에 하이브리드화하여 뉴클레아제 기질을 형성하도록 디자인된 복수 개의 SIO
    를 포함하고;
    상기 뉴클레아제 기질의 일부가 EAS1의 일부에 상보적이고;
    EAS1 및 EAS2는 오직 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 상기 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 복합체를 형성하는 것인, 표적 검출용 키트.
  201. 제1 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS1) 및 제2 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS2)를 포함하는 키트로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 구동자 단편 올리고뉴클레오티드(DF)와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 완전 효소 신호 증폭제(CESA) 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 키트.
  202. EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서, EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성하고, 제1 DF의 일부는 EAS1의 일부에 상보적인 것인 키트.
  203. 다성분 핵산 효소(MNA자임), MNA자임 기질, EAS1, EAS2, 및 제1 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
    MNA자임은 MNA자임 조립 촉진제의 존재하에 자기 조립하여 MNA자임을 형성하는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 제1 및 상기 제2 파트자임은 각각 기질 아암부, 촉매성 코어부, 및 센서 아암부를 포함하고, 센서 아암은 상기 MNA자임 조립 촉진제와 상호작용하여 제1 및 제2 파트자임을 이들의 각각의 촉매성 코어부의 회합을 위한 근접한 위치에 유지시켜 MNA자임의 촉매성 코어를 형성하고, 상기 촉매성 코어는 상기 MNA자임 기질을 변형시켜 제1 DF를 형성할 수 있고;
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, 제1 DF는 EAS1 및 EAS2와 조립됨으로써 상기 적어도 제1 뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 절단 부위를 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인, 키트.
  204. 제203항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 제1 및 제2 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 복합체의 제1 가닥이고, 여기서, 상기 제1 가닥은 내부 루프부를 포함하고, 내부 루프부 내의 염기는 제2 가닥의 염기에 하이브리드화하지 않고, MNA자임은 내부 루프부를 절단할 수 있는 것인 키트.
  205. 제204항에 있어서, 상기 제2 가닥이 제1 DF를 포함하는 것인 키트.
  206. 제204항 또는 제205항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가닥이 한쪽 말단에서 헤어핀 루프부에 의해 연결되는 것인 키트.
  207. 제203항에 있어서, 상기 MNA자임 기질이 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 루프부이고, 상기 MNA자임은 헤어핀 루프부를 절단할 수 있고, 상기 제1 구동자 단편은 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드 중 이중 가닥 줄기부의 한 가닥에 위치하는 것인 키트.
  208. 제203항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 조립 촉진제가 확인하고자 하는 표적인 것인 키트.
  209. 제1 합성 개시제 올리고뉴클레오티드(SIO), EAS1, EAS2, 제1 뉴클레아제, 및 제2 뉴클레아제를 포함하는 키트로서, 여기서,
    SIO는 표적과 하이브리드화함으로써 이중체 기질을 형성할 수 있고, 여기서, 상기 제1 뉴클레아제는 이중체 기질을 절단함으로써 제1 DF을 생성할 수 있고;
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2는 오직 제1 DF와의 조립시에만 상기 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 키트.
  210. 제209항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 SIO가 표적과 하이브리드화한 경우에만 SIO를 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있는 것인 키트.
  211. 제209항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제는 오직 표적이 SIO와 하이브리드화한 경우에만 표적을 절단함으로써 상기 제1 DF를 생성할 수 있는 것인 키트.
  212. 제211항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 제한 효소가 아닌 것인 키트.
  213. 제209항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 키트.
  214. 제209항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레아제가 동일한 뉴클레아제인 것인 키트.
  215. 제209항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레아제가 상이한 뉴클레아제인 것인 키트.
  216. 제201항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 키트.
  217. 제209항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제1 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 키트.
  218. 제216항 또는 제217항에 있어서, 상기 닉이 뉴클레아제 인식 부위 내에, 뉴클레아제 절단 부위에, 또는 뉴클레아제 인식 부위와 절단 부위 사이에 위치하는 것인 키트.
  219. 제216항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  220. 제198항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1 및 EAS2가 상기 EAS1 및 EAS2의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS1의 한쪽 말단을 상기 EAS2의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 키트.
  221. 제220항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 상기 EAS1 또는 EAS2 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함하는 것인 키트.
  222. 제198항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS1 또는 EAS2의 일부가 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있는 것인 키트.
  223. 제220항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 루프부의 일부가 제2 DF를 포함하고, 여기서, 상기 제2 DF는 뉴클레아제에 의한 상기 제1 CESA 복합체의 변형시에 유리될 수 있는 것인 키트.
  224. 제222항 또는 제223항에 있어서, 상기 제1 DF 및 상기 제2 DF가 동일한 것이 아닌 것인 키트.
  225. 제222항 또는 제223항에 있어서, 상기 제1 DF 및 상기 제2 DF가 동일한 것인 키트.
  226. 제222항 또는 제223항에 있어서, 상기 제2 DF가 상기 제1 DF의 단편이거나, 또는 상기 제1 DF가 상기 제2 DF의 단편인 것인 키트.
  227. 제225항 또는 제226항에 있어서, 상기 제2 DF, EAS1, 및 EAS2가 조립되어 상기 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인 키트.
  228. 제222항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS3) 및 제4 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS4)를 추가로 포함하고, 여기서, EAS3의 일부는 EAS4의 일부에 상보적이고, EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, EAS3 및 EAS4는 오직 제2 DF와의 조립시에만 추가 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 키트.
  229. 제228항에 있어서, EAS3 또는 EAS4가 제3 DF를 포함하는 것인 키트.
  230. 제229항에 있어서, 제3 DF가 상기 제1 DF와 동일한 것인 키트.
  231. 제229항에 있어서, 제3 DF가 상기 제1 DF와 동일하지 않은 것인 키트.
  232. 제228항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 키트 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일한 것인 키트.
  233. 제228항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 키트 중의 또 다른 뉴클레아제와 동일하지 않고, 여기서, 상기 키트는 상기 추가 뉴클레아제를 포함하는 것인 키트.
  234. 제228항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 뉴클레아제가 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 키트.
  235. 제228항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  236. 제228항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAS3 및 EAS4가 EAS3 및 EAS4의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 상기 EAS3의 한쪽 말단을 상기 EAS4의 한쪽 말단과 연결하는 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 키트.
  237. 제236항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 상기 EAS3 또는 EAS4 중 어느 하나로부터 신장된 단일 가닥 5' 또는 3' 오버행부를 포함하는 것인 키트.
  238. 골격 올리고뉴클레오티드, EAS1, EAS2, EAS3, 및 EAS4를 포함하는 제1 복합체를 포함하는 키트로서, 여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) 상기 EAS1을 포함하는 제1부로서, 여기서, 상기 EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS2의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고, EAS1 또는 EAS2의 일부는 제2 DF를 포함하고, EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제1 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부;
    (ii) 상기 EAS3을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS3의 일부는 상기 EAS4의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3의 일부는 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS3 또는 EAS4의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS3 및 EAS4는 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제2 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제2 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부
    를 포함하는 것인 키트.
  239. 제238항에 있어서, 골격 올리고뉴클레오티드, 제5 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS5), 제6 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS6), 제7 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS7), 및 제8 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드(EAS8)를 포함하는 제2 복합체를 추가로 포함하고,
    여기서, 상기 골격 올리고뉴클레오티드는
    (i) 상기 EAS5를 포함하는 제1부로서, 여기서, 상기 EAS5의 일부는 상기 EAS6의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5의 일부는 상기 제2 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS5 또는 EAS6의 일부는 상기 제1 DF를 포함하고, EAS5 및 EAS6은 오직 상기 제2 DF와의 조립시에만 제3 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제3 CESA 복합체를 형성하는 것인 제1부; 및
    (ii) 상기 EAS7을 포함하는 제2부로서, 여기서, 상기 EAS7의 일부는 EAS8의 일부에 상보적이고, 상기 EAS8의 일부는 상기 제1 DF의 일부에 상보적이고, 상기 EAS7 또는 EAS8의 일부는 상기 제2 DF를 포함하고, EAS7 및 EAS8은 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제4 뉴클레아제에 대한 인식 서열 및 절단 서열을 함유하는 제4 CESA 복합체를 형성하는 것인 제2부; 및
    (iii) 제1부와 제2부를 연결하는 제3부로서, 여기서, 상기 제3부는 상기 제1 복합체의 골격의 제3부에 상보적인 것인 제3부
    를 포함하는 것인 키트.
  240. 제239항에 있어서, EAS1이 EAS7과 동일하고/거나, EAS2가 EAS8과 동일하고/거나, EAS3이 EAS5와 동일하고/거나, EAS4가 EAS6과 동일한 것인 키트.
  241. 제239항 또는 제240항에 있어서, 제1 뉴클레아제가 제3 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제2 뉴클레아제가 제4 뉴클레아제와 동일하고/거나, 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레아제가 동일한 것인 키트.
  242. 제239항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 복합체가 이들의 각각의 상보적인 제3부를 통해 하이브리드화함으로써 제1 이중 복합체를 형성하는 것인 키트.
  243. 제242항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 키트.
  244. 제243항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상을 상기 제2 이중 복합체의 EAS1-EAS8 중 임의의 하나 이상과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 키트.
  245. 제243항 또는 제244항에 있어서, 상기 제1 이중 복합체가 상기 제1 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8을 상기 제2 이중 복합체의 EAS2 및/또는 EAS8과 연결함으로써 상기 제2 이중 복합체에 연결되는 것인 키트.
  246. 제244항 또는 제245항에 있어서, 상기 연결이 화학적 하이브리드화, 항체, 올리고뉴클레오티드 링커, 비올리고뉴클레오티드 링커, 및 펩티드 링커 중 임의의 하나 이상을 사용함으로써 달성되는 것인 키트.
  247. 제244항 또는 제245항에 있어서, 상기 연결이 상기 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 비오티닐화 및 아비딘을 사용한 다중 비오티닐화된 효소 증폭제 기질 올리고뉴클레오티드의 복합체 형성을 통해 달성되는 것인 키트.
  248. 제239항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제가 상기 제2 CESA 복합체를 형성하는 두 가닥 중 1 이상에 닉을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 것인 키트.
  249. 제239항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 뉴클레아제가 Mnl I, Rsa I, Pme I, Hpy 8I, Msp I, Ear I, 및 TspR I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  250. 제239항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, EAS1 및 EAS2; EAS3 및 EAS4; EAS5 및 EAS6; 및 EAS7 및 EAS8로부터 선택되는 효소 증폭제 기질 쌍이 상기 쌍의 각 구성원의 상보적인 부분들의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기부, 및 줄기부의 한쪽 말단에 연결된 헤어핀 루프부를 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드의 성분인 것인 키트.
  251. SIO를 포함하는 키트로서, 상기 SIO는
    (i) 표적 가닥에 상보적인 제1부 및 상기 표적 가닥에 상보적이지 않은 제2부로서, 여기서, 상기 제1부 및 제2부는 포스포로티오에이트에 의해 분리되어 있고, 상기 제2부는 제1 DF를 포함하는 것인, 제1부 및 제2부; 및
    (ii) EAS1 및 EAS2로서, 여기서,
    EAS1의 일부는 EAS2의 일부에 상보적이고, EAS1 및 EAS2의 하이브리드화에 의해 어느 한쪽 말단에 3' 오버행을 가진 이중체 구조체를 제공하고,
    EAS1의 일부는 제1 DF의 일부에 상보적이고,
    EAS1 및 EAS2는 오직 상기 제1 DF와의 조립시에만 제1 뉴클레아제에 의한 분해가 가능한 오목형 3' 말단을 포함하는 제1 CESA 복합체를 형성할 수 있는 것인, EAS1 및 EAS2
    를 포함하는 것인 키트.
  252. 제251항에 있어서, 상기 SIO가 상보적인 두 부분의 하이브리드화에 의해 형성된 이중 가닥 줄기, 단일 가닥 헤어핀 루프, 및 3' 오버행을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드인 것인 키트.
  253. 제251항 또는 제252항에 있어서, 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인 것인 키트.
  254. 제198항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 것인 키트.
  255. 제198항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 EAS가 형광단 부분 및 소광제 부분을 포함하는 것인 키트.
  256. 제198항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 MNA자임 파트자임, MNA자임 기질, EAS1, EAS2, EAS3, EAS4, EAS5, EAS6, EAS7, EAS8, SIO, DF 또는 뉴클레아제가 고체 지지체에 부착되어 있는 것인 키트.
  257. 제199항, 제200항, 제208항, 및 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DF가 상기 표적과는 별개의 것인 키트.
  258. 제199항 또는 제203항에 있어서, 상기 키트가 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 제1 및 제2 MNA자임을 포함하는 것인 키트.
  259. 제258항에 있어서, 상기 표적 분자의 상이한 부분들에 특이적인 상기 MNA자임이 상기 표적의 존재하에서의 조립시에 같은 기질을 인식하고 절단하는 것인 키트.
  260. 제199항 또는 제203항에 있어서, 상기 키트가 별개의 표적들에 대한 특이성을 가지는 2 이상의 상이한 MNA자임을 포함하는 것인 키트.
  261. 제200항, 제209항 및 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 별개의 표적들에 대하여 상보성을 가진 2 이상의 상이한 SIO를 포함하는 것인 키트.
  262. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  263. 제198항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트 사용을 위한 설명서를 추가로 포함하는 키트.
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