CN104764790B

CN104764790B - 基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN104764790B
Application number: CN201510135113.7A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 崔洁; 黄加栋; 刘素; 徐伟; 王虹智; 郭玉娜; 许颖; 邱婷婷
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104764790A

Abstract

本发明提供基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，包括金电极，金电极上依次修饰有MB capture probe层、HAP与ssDNA层；同时，提供了其制备方法，本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补链霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

Description

基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

链霉素( streptomycin, SM) 是一种常见的氨基葡萄糖型抗生素, 是由土壤放线菌产生的，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有显著的抗菌效果, 能够有效抑制细菌的生长和繁殖(如：结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其他传染病)。可有效防治植物细菌病害，例如：梨火疫病、蓝莓菌、烟草野火病等，因此目前常用于畜牧业和水产业中。然而链霉素在畜牧业中的滥用造成农产品中的药物残留引发一些疾病。因此，检测食品中的链霉素的残留量已变得非常重要。

检测链霉素的方法主要有链霉素的检测方法主要包括微生物法、免疫分析法、色谱法和其他方法。

目前，主要用来检测链霉素的方法包括微生物法和高效液相色谱法（HPLC）。然而这两种方法均存在自身不可避免的缺陷。微生物分析法的稳定性差，灵敏度低，菌不易筛选；而HPLC需要较为昂贵的样品预处理。因此，目前需要建立一种高灵敏度，高效，特异性检测链霉素的方法来检测食品中残留的链霉素。

发明内容

为了解决现有技术中检测链霉素的方法的缺陷，本发明提供一种高特异性和灵敏性、成本低、高效快速的基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器。同时，本发明还提供了基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了3条DNA链：

①一发卡结构HAP，其作用是特异性识别并捕获链霉素

②一条ssDNA辅助单链

③一条修饰在金电极表面的MB capture probe，能与ssDNA完全互补

三条DNA链序列：

Aptamer即HAP：

3’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTGCAGGCGGATCCAGACCCCAAACACAA-5’（ SEQ ID NO：1）；

ssDNA: 3’-GTCTGGATCCGCCTGC-5’（ SEQ ID NO：2）；

MBcapture probe: 3’SH-GCAGGCGGATCCAGAC-MB 5’（ SEQ ID NO：3）。

发卡结构HAP 3’端（HAP序列中的加粗部分）可以与链霉素特异性识别并紧密结合，发卡构象发生变化。

辅助链ssDNA可以与发卡部分碱基（HAP序列中有下划线部分）互补配对。

修饰有亚甲基蓝（MB）捕获探针（MBcapture probe）的碱基序列与ssDNA完全互补。其3’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将捕获探针固定在电极表面。其5’端修饰有亚甲基蓝（MB），它可以一定的电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测MB氧化还原信号差值来达到定量的检测目标物的目的。

本发明中用到了一种酶：限制性核酸外切酶ExoⅢ。ExoⅢ能且只能剪切DNA双链，可以将与HAP杂交的ssDNA剪切掉，得以循环，实现信号放大。

本发明中链霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过一步循环的方式来实现信号的放大，从而实现链霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：发夹结构的DNA中有目标物的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构链打开。此时均相中的ssDNA就可以与打开的发夹结构发生互补配对，从而将ssDNA与HAP 固定到一起。此时在Exo Ⅲ核酸外切酶的作用下，将杂交的双链上ssDNA水解。使打开的HAP可以与其他ssDNA杂交，实现HAP的循环利用及信号的循环放大。由于单链的MBcapture probe是一种柔性结构，5’ 端的MB离电极表面很近，可以产生较大的电信号。当MBcapture probe与ssDNA杂交后，形成的杂交双链是一种刚性结构，致使5’ 端的MB远离电极表面，阻碍了MB与电极之间的电子传递，产生的电信号降低。本发明就是根据反应前后的电信号差来实现目标物的定量检测。

在均相反应中，放大的反应条件为37℃，反应时间是2h。

一种基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，在金电极上依次修饰有MBcapture probe层、HAP与ssDNA层；

所述的生物传感器， MB capture probe层的厚度为10±2nm、HAP与ssDNA层的厚度为15±2nm。

所述的生物传感器， HAP 层中HAP（摩尔）与Exo Ⅲ（活性）的摩尔与活性的比为1：250。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将MB capture probe层修饰到电极表面；

（3）将HAP 层修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选将MB capture probe层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μM的capture probe 10μL滴加到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。

所述的制备方法，优选将HAP层修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、ssDNA、HAP和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）向离心管中加入核酸外切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（3）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好MB capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05 μM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将MB capture probe固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，在37℃孵育2h使均相中的ssDNA与电极表面的MB capture probe 完成杂交反应，从而将ssDNA固定到电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补链霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用链霉素的适体作为识别物质实现了对目标物链霉素的高特异性检测；

2、利用核酸外切酶，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用；实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；

3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

4、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；

5、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中链霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为实施例41标准曲线图。

图2为本发明的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的MB capture probe（10μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10X的缓冲液（buffer），1μL浓度为50μM的 ssDNA，1μL发夹结构的DNA链（10μM）和1μL不同浓度的目标物（100pM，500pM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM）加入到预先准备好的灭菌的离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、继续向a步的离心管中加入核酸外切酶（1μL）。震荡30s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育2h；

c、将b步反应后的溶液（10μL）滴加到预先修饰好capture probe的电极上。然后将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2h；

d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

链霉素的浓度（nM）	电流大小（μA）
		0.5	0.80
1	1.17
		5	1.49
10	1.86
		50	2.25
100	2.63
		500	3.06
1000	3.39

检测结果如图1所示，待测目标位浓度分别为 100pM（1×10^-16mol，括号中为待测目标物的实际的量），500pM（5×10^-16mol），1nM（1×10^-15mol），5nM（5×10^-15mol），10nM（1×10^-14mol），50nM（5×10^-14mol），100nM（1×10^-13mol），500nM（5×10^-13mol），1μM（1×10^-12mol）。图中我们可以看到，在链霉素的浓度在100pM 到 1μM时，链霉素浓度的对数与电流大小成正比关系，拟合曲线：I=1.11+0.72lgC（I是电流，C是链霉素的浓度），同时，我们在100pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为3.4×10^-16mol。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，其特征在于，在金电极上依次修饰有MB capture probe层、HAP与ssDNA层；

所述的生物传感器， MB capture probe层的厚度为10±2nm、HAP与ssDNA层的厚度为15±2nm；

其制备包括以下步骤：

（1）对金电极进行预处理；

（2）将MB capture probe层修饰到电极表面；

（3）将HAP 与ssDNA层修饰到电极表面；

步骤（3）的具体操作步骤为：

1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、1μL的浓度为50μM的 ssDNA、1μL的浓度为10μM HAP和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

2）向离心管中加入核酸外切酶Exo Ⅲ，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

3）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好MB capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；

其中，HAP 层中HAP与核酸外切酶Exo Ⅲ的摩尔与活性的比为1：250;

所述的MB capture probe的核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示；

所述的HAP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示；

所述的ssDNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2 所示。

2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（1）的具体操作步骤为，取金电极在0.3μM和0.05 μM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（2）的具体操作步骤为：将10μM的MB capture probe 10μL滴加到经过预处理的金电极表面，在25℃下孵育2h。