CN107561071A - 一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，包括以下步骤：A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程；C:制备未知链霉素浓度的待测样液，得C品；D:取C品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733 nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。本发明的目的在于提供一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法；本发明不需要专业人员操作、操作简便、检测快速、成本低廉、检测结果直观、适合现场检测等优势。
Description
技术领域
本发明属于动物制品中抗生素残留检测领域，具体涉及一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法。
背景技术
链霉素属于氨基糖苷类抗生素，是继青霉素之后第二个开始生产并应用于临床的抗生素，是抗结核治疗中的主要用药，也是常见的兽用药。然而，过量的链霉素在畜牧业中的使用导致了食品中可能存在的链霉素残留会导致很多副作用，例如耳毒性、肾毒性，以及其它过敏反应和急性不良反应。农业部在相关文件中对动物制品中的链霉素的最大残留限量也做出了相关规定。因此，研究一种快速可靠的检测链霉素的方法具有重要意义。
传统的抗生素检测方法主要有微生物检测法，免疫分析法，仪器分析法、等方法。然而，微生物检测法周期长，耗时费力；因此需要开发更可靠快速检测抗生素的方法；免疫分析法如ELISA对环境有一定的依赖性；仪器分析法所需仪器通常比较昂贵，需配备专业的检测操作人员，检测费用较高。
现有利用纳米金比色检测的方法绝大多数是利用其聚集变色效应，其不足在于：该方法容易受到非靶标引起的非特异性聚集影响，非特异聚集将导致结果不准确，特异性不够。因此，现有的检测方法存在需要专业人员操作、操作复杂、检测时间长、费用高、检测结果不直观、不适合现场快速检测的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法。本发明不需要专业人员操作、操作简便、检测快速、成本低廉、检测结果直观、适合现场检测的优势。
本发明的技术方案：一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，包括以下步骤：
一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；
A1：制备已知链霉素浓度的检测溶液,得A1品；
A2：制备空白对照检测溶液,得A2品；
A3：取等体积的A1品和A2品，分别用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
A4：以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A1品的吸光值；
B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程；
C:用实际样液代替已知链霉素浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2方法即可制备得到未知链霉素浓度的待测样液，为C品；
D:取C品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，绘制链霉素吸光值变化量标准曲线的具体方法为：
A1：制备已知链霉素浓度的检测溶液,包括:
A1-1:取多支刻度离心管，将链霉素标准液与其核酸适配体序列混匀，之后加入纳米金，制备出待测样液，得A1-1品；
A1-2：将A1-1品与醋酸钠缓冲液混匀，之后加入H2O2和ABTS的混合液，混匀即可制备得到检测溶液，得A1品；
A2：取1支刻度离心管，用三蒸水替代已知浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2的方法即可制备得到空白对照溶液，为A2品；
A3：取等体积的A1品和A2品，分别用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
A4:以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A2品的吸光值；
所述步骤B中的线性回归方程为：y＝0.0036+0.2640x，其中x指链霉素浓度(μM)；
C、用实际样液代替已知链霉素浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2方法即可制备得到未知链霉素浓度的待测样液，为C品。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述链霉素核酸适配体的序列为：
5-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’，其浓度为5μM。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述纳米金溶液的浓度为2.492nM；H2O2溶液的浓度为4M；ABTS溶液的浓度为25mM。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述醋酸钠缓冲液的PH值为4.5，其浓度为5mM。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述的步骤A3和步骤D中，吸收光谱的获得方式为：取待测样叶和空白对照检测溶液于96孔酶标板，用酶标仪进行扫描测定733nm处吸光值；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述的A1品、A2品或C品制备过程中，在链霉素标准液与其核酸适配体序列混匀后进行第一次孵育，孵育温度为25-32℃，时间为25-35min，第二次孵育在加入纳米金、三蒸水或实际样液后进行，温度为25-32℃，时间为25-35min。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述的线性回归方程可检测链霉素浓度范围为0.1-0.5μM。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述链霉素核酸适配体的用量为4-6μL，所述纳米金的用量为150-250μL，H2O2溶液的用量为5-15μL，ABTS溶液的用量为5-15μL，所述醋酸钠溶液的用量为220-290μL。
前述动物制品中链霉素残留的快速检测方法，所述链霉素核酸适配体的用量为5μL，所述纳米金的用量为200μL，H2O2溶液的用量为10μL，ABTS溶液的用量为10μL，所述醋酸钠溶液的用量为270μL。
本发明的有益效果：1、醋酸钠缓冲液中的纳米金由于包裹了链霉素适配体，其催化活性受到抑制，无法在H2O2作用下催化氧化ABTS，体系表现为红色；当加入链霉素，适配体与之结合并离开纳米金表面，纳米金则其对底物H2O2和ABTS的亲和力提高，催化活性增强，底物ABTS被催化氧化，体系由原先的红色变成绿色或灰绿色，颜色变化明显，因此本快速检测方法具有肉眼可辨的特点，检测结果直观；在733nm处出现特征吸收峰，且吸光值变化幅度与链霉素的浓度成正比，因而该方法可以用于链霉素检测。
2、本方法利用样品在醋酸钠缓冲液体系中测得的吸光度值，并查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量，因此检测不需要依赖大型仪器设备，不需要专业人员操作，且操作简单快速，检测快速、成本低廉，可以广泛应用于动物制品中链霉素的检测。
附图说明
图1是加入链霉素前后检测溶液的颜色变化和吸光度变化示意图；
图2是向检测溶液加入不同浓度链霉素的吸收光谱示意图；
图3是不同浓度链霉素与体系吸光值变化(⊿A)的对应关系示意图；
图4是其它抗生素对链霉素检测的影响的示意图；
图5是应用于实际样品中链霉素检测的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1
一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，包括以下步骤：
A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；
A1-1:取14刻度离心管，分别加入5μL浓度为5μM的链霉素适配体和不同浓度的链霉素标准液，使得整个检测体系中的链霉素含量维持在0.1-1.2μM，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，加入200μL浓度为2.492nM的纳米金在30℃条件下继续孵育30min，得A1-1品；
A1-2：在A1-1品中加入270μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入10μL的4M H2O2和10μL的25mM ABTS混合液至500μL，得A1品，充分混匀后留作以下测定用。
测定制备的已知链霉素浓度的检测溶液(A1品)，纳米金的使用终浓度为2.492nM，链霉素核酸适配体的序列终浓度为50nM；H2O2的终浓度为80mM，ABTS的终浓度为0.5mM，醋酸钠缓冲液的PH为4.5，浓度为5mM。
A2：制备空白对照溶液，取1支刻度离心管，分别加入5μL浓度为5μM的链霉素适配体和不同浓度的链霉素标准液，使得整个检测体系中的链霉素含量维持在0.1-1.2μM，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，然后加入5μL的三蒸水在30℃条件下继续孵育30min，再加入270μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入10μL的4M H2O2和10μL的25mMABTS混合液至500μL，得A2品
A3：分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定733nm处吸光值。全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。具体见附图1，从附图1中可以证明用该方法检测链霉素是可行的。附图1中，
(1)纳米金+适配体+H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
(2)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线；
(3)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+10μM链霉素吸光值的变化曲线；
(4)H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线
(5)H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
A4:以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A2品的吸光值，该标准曲线如附图2所示；
B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程，其线性回归方程为y＝0.0036+0.2640x，其中x指链霉素浓度(μM)。
C:制备未知链霉素浓度的待测样液C品；
另取4支刻度离心管，，分别加入5μL浓度为5μM的链霉素适配体和10μL含有链霉素的牛奶实际样液(分别命名为牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4)，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，加入200μL浓度为2.492nM的纳米金在30℃条件下继续孵育30min，再加入270μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入10μL的4M H2O2和10μL的25mM ABTS混合液至500μL，为C品
D:取200μLC品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。
链霉素适配体序列组成为:
5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。
线型回归方程可检测的链霉素浓度的范围为0.1-0.5μM，
实际样本检测效果验证：用本发明方法测定市售牛奶的牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4，往样品中分别加入0.4μM、0.6μM、0.7μM和1.0μM的链霉素，得到的回收率为94.3％-101.7％，证明本方法可靠性。
本发明方法最低检测限为86nM。
实施例2
一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，包括以下步骤：
A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；
A1-1:取14刻度离心管，分别加入4μL浓度为5μM的链霉素适配体和不同浓度的链霉素标准液，使得整个检测体系中的链霉素含量维持在0.1-1.2μM，充分混匀后置于25℃条件下孵育25min，加入150μL浓度为2.492nM的纳米金在25℃条件下继续孵育25min，得A1-1品；
A1-2：在A1-1品中加入220μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入5μL的4M H2O2和5μL的25mM ABTS混合液至500μL，得A1品，充分混匀后留作以下测定用。
A2：制备空白对照溶液，取1支刻度离心管，分别加入4μL浓度为5μM的链霉素适配体和5μL三蒸水，充分混匀后置于25℃条件下孵育25min，然后加入150μL的三蒸水纳米金在25℃条件下继续孵育25min，再加入220μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入5μL的4M H2O2和5μL的25mM ABTS，得A2品
A3：分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰。全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。具体见附图1，从附图1中可以证明用该方法检测乐链霉素是可行的。附图1中
(1)纳米金+适配体+H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
(2)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线；
(3)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+10μM链霉素吸光值的变化曲线；
(4)H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线；
(5)H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
A4:以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A2品的吸光值，该标准曲线如附图2所示；
B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程，其线性回归方程为y＝0.0036+0.2640x，其中x指链霉素浓度(μM)。
C:制备未知链霉素浓度的待测样液C品；
另取4支刻度离心管，分别加入4μL浓度为5μM的链霉素适配体和10μL含有链霉素的牛奶实际样液(分别命名为牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4)，充分混匀后置于25℃条件下孵育25min，加入150μL浓度为2.492nM的纳米金在25℃条件下继续孵育25min，再加入220μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入5μL的4M H2O2和5μL的25mM ABTS，为C品
D:取200μLC品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。
链霉素适配体序列组成为:
5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。
线型回归方程可检测的链霉素浓度的范围为0.1-0.5μM。
实际样本检测效果验证：用本发明方法测定市售牛奶的牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4，往样品中分别加入0.4μM、0.6μM、0.7μM和1.0μM的链霉素，得到的回收率为94.3％-101.7％，证明本方法可靠性。
本发明方法最低检测限为86nM。
实施例3
一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，包括以下步骤：
A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；
A1-1:取14刻度离心管，分别加入6μL浓度为5μM的链霉素适配体和不同浓度的链霉素标准液，使得整个检测体系中的链霉素含量维持在0.1-1.2μM，充分混匀后置于32℃条件下孵育35min，加入250μL浓度为2.492nM的纳米金在32℃条件下继续孵育35min，得A1-1品；
A1-2：在A1-1品中加入290μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入15μL的4M H2O2和15μL的25mM ABTS混合液至500μL，得A1品，充分混匀后留作以下测定用。
A2：制备空白对照溶液，取1支刻度离心管，分别加入6μL浓度为5μM的链霉素适配体和不同浓度的链霉素标准液，使得整个检测体系中的链霉素含量维持在0.1-1.2μM，充分混匀后置于32℃条件下孵育35min，然后加入250μL的三蒸水在32℃条件下继续孵育35min，再加入290μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入15μL的4M H2O2和15μL的25mM ABTS，得A2品
A3：分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰。全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。具体见附图1，从附图1中可以证明用该方法检测乐链霉素是可行的。附图1中，
(6):纳米金+适配体+H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
(7)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线；
(8)纳米金+适配体+H2O2+ABTS+10μM链霉素吸光值的变化曲线；
(9)H2O2+ABTS+1μM链霉素吸光值的变化曲线
(10)H2O2+ABTS吸光值的变化曲线；
A4:以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A2品的吸光值，该标准曲线如附图2所示；
B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程，其线性回归方程为y＝0.0036+0.2640x，其中x指链霉素浓度(μM)。
C:制备未知链霉素浓度的待测样液C品；
另取4支刻度离心管，分别加入6μL浓度为5μM的链霉素适配体和10μL含有链霉素的牛奶实际样液(分别命名为牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4)，充分混匀后置于32℃条件下孵育35min，加入250μL浓度为2.492nM的纳米金在32℃条件下继续孵育35min，再加入290μL 5mM的醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH为4.5)，最后再加入15μL的4M H2O2和15μL的25mM ABTS，为C品
D:取200μLC品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。
链霉素适配体序列组成为:
5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。
线型回归方程可检测的链霉素浓度的范围为0.1-0.5μM，
实际样本检测效果验证：用本发明方法测定市售牛奶的牛奶-1、牛奶-2、牛奶-3和牛奶-4，往样品中分别加入0.4μM、0.6μM、0.7μM和1.0μM的链霉素，得到的回收率为94.3％-101.7％，证明本方法可靠性。
本发明方法最低检测限为86nM。
Claims (10)
1.一种动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A:绘制链霉素吸光值变化量标准曲线；
A1：制备已知链霉素浓度的检测溶液,得A1品；
A2：制备空白对照检测溶液,得A2品；
A3：取等体积的A1品和A2品，分别用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
A4：以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品B品的吸光值-A2品的吸光值；
B:根据⊿A随链霉素变化的标准曲线建立链霉素浓度与⊿A之间的线性回归方程；
C:用实际样液代替已知链霉素浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2方法即可制备得到未知链霉素浓度的待测样液，为C品。
D:取C品，按步骤A3方法测定其吸光值，并求得其在733nm处与A2品的差值⊿A，查标准曲线，可以求得不同样品中链霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：绘制链霉素吸光值变化量标准曲线的具体方法为：
A1：制备已知链霉素浓度的检测溶液,包括:
A1-1:取多支刻度离心管，将链霉素标准液与其核酸适配体序列混匀，之后加入纳米金，制备出待测样液，得A1-1品；
A1-2：将A1-1品与醋酸钠缓冲液混匀，之后加入H2O2和ABTS的混合液，混匀即可制备得到检测溶液，得A1品；
A2：取1支刻度离心管，用三蒸水替代已知浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2的方法即可制备得到空白对照溶液，为A2品；
A3：取等体积的A1品和A2品，分别用酶标仪进行扫描测定733nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
A4:以不同浓度的链霉素与测定的⊿A绘制⊿A随链霉素变化的标准曲线，⊿A为A1品的吸光值-A2品的吸光值；
所述步骤B中的线性回归方程为：y＝0.0036+0.2640x，其中x指链霉素浓度(μM)；
C、用实际样液代替已知链霉素浓度的链霉素标准液，按照A1-1和A1-2方法即可制备得到未知链霉素浓度的待测样液，为C品。
3.根据权利要求1所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述链霉素核酸适配体的序列为：
5-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’，其浓度为5μM。
4.根据权利要求1所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述纳米金溶液的浓度为2.492nM；H2O2溶液的浓度为4M；ABTS溶液的浓度为25mM。
5.根据权利要求2所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述醋酸钠缓冲液的PH值为4.5，其浓度为5mM。
6.根据权利要求2所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述的步骤A3和步骤D中，吸收光谱的获得方式为：取待测样叶和空白对照检测溶液于96孔酶标板，用酶标仪进行扫描测定733nm处吸光值；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。
7.根据权利要求2所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述的A1品、A2品或C品制备过程中，在链霉素标准液与其核酸适配体序列混匀后进行第一次孵育，孵育温度为25-32℃，时间为25-35min，第二次孵育在加入纳米金、三蒸水或实际样液后进行，温度为25-32℃，时间为25-35min。
8.根据权利要求2所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述的线性回归方程可检测链霉素浓度范围为0.1-0.5μM。
9.根据权利要求2所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述链霉素核酸适配体的用量为4-6μL，所述纳米金的用量为150-250μL，H2O2溶液的用量为5-15μL，ABTS溶液的用量为5-15μL，所述醋酸钠溶液的用量为220-290μL。
10.根据权利要求9所述的动物制品中链霉素残留的快速检测方法，其特征在于：所述链霉素核酸适配体的用量为5μL，所述纳米金的用量为200μL，H2O2溶液的用量为10μL，ABTS溶液的用量为10μL，所述醋酸钠溶液的用量为270μL。
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Citations (7)
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