CN106353309B - 一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种检测调制乳中酵母β‑葡聚糖含量的方法，该方法以水为溶剂对待测调制乳样品进行洗涤以除去干扰糖类，然后进行酸水解处理，最后采用GOPOD酶法显色、紫外‑可见光分光光度法测定待测样品的吸光值，然后利用酸处理后的葡萄糖标准曲线和C＝[(Ax‑A0)‑b]*1/a*c*0.9*1/m公式计算得到调制乳中β‑葡聚糖的含量。该方法具有样品预处理简单，葡萄糖损失小，操作简便，准确性好，精密度高，成本低廉的优势。

Description

一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法。

背景技术

β-葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分之一，约占其干重的30-60％，分子主链以β-1.3-糖苷键结合，支链以β-1.6-糖苷键结合。大量研究表明，酵母β-葡聚糖独特的三股螺旋结构使其具有独特的生理功效，如抗肿瘤、增强机体免疫力等，在食品工业中酵母β-葡聚糖还可作为增稠剂、脂肪替代品等。美国、中国和欧盟先后批准了酵母β-葡聚糖在食品工业的应用，近年来国内乳品工业愈发关注酵母β-葡聚糖在乳品中的应用，以满足消费者对营养健康的追求，并且改善乳品品质。由于目前国内尚未有乳品中酵母β-葡聚糖定量检测方法的国家和行业标准，为规范市场秩序、保障公平竞争，对建立一种准确性好、精密度高且操作简便、成本低廉的乳品中酵母β-葡聚糖定量检测方法产生了迫切需求。

目前检测酵母β-葡聚糖的思路在于先用酸或酶处理将β-葡聚糖水解成葡萄糖，再对单糖进行定量检测，经过换算得到β-葡聚糖含量。在对葡聚糖水解处理时，酶法因价格昂贵，限制了其在实验室的推广应用，而酸法水解廉价简便，酸解过程中葡聚糖虽有少量损失但可通过修正加以解决，因此综合来看酸法水解具有操作简单、成本低廉的特点，适合实验室常规检测分析。对单糖进行定量检测的方法主要有GOPOD法，苯酚-硫酸法、刚果红法、高效液相色谱法、气相色谱法、离子交换色谱-脉冲安培法和流动注射FIA荧光法。苯酚硫酸法为非专一性的总糖测定方法，不能排除其他糖类干扰，测定结果误差较大；高效液相色谱法、气相色谱法、离子交换色谱-脉冲安培法和流动注射FIA荧光法虽测定准确性有所提高，但所需仪器昂贵、操作复杂，也不利于在实验室的推广应用。

其中，付俊鹤等人在2013年发表了《牛奶中酵母β-葡聚糖的应用与测定》，此文章的测定原理在于根据葡聚糖酸水解生成葡萄糖，而干扰物乳糖水解后产生一个葡萄糖和一个半乳糖，分别测定水解后样品中葡萄糖和半乳糖含量，葡萄糖比乳糖多出的部分，就是葡聚糖的含量。其酸水解的条件为采用盐酸作为催化剂将酵母β-葡聚糖和乳糖水解，运用高效液相色谱测定葡萄糖和乳糖含量，进而计算出酵母β-葡聚糖的含量。结果表明，水解用盐酸浓度为1.0mol/L较为适宜，回收率实验表明，平均回收率在96.39％-97.22％之间，测定结果的RSD值在2.51％-5.38％之间；精密度实验表明，测定结果的RSD值为4.64％。

该方法仅适用于纯牛奶体系中酵母β-葡聚糖的测定，因该方法利用样品酸水解后样品中葡萄糖比乳糖多出的部分，计算葡聚糖的含量，方法不具有一般性。在纯牛奶体系中对酵母β-葡聚糖测定产生干扰的主要是乳糖，而在调制乳体系中因添加了蔗糖等其他糖类物质，均可水解产生葡萄糖，采用此方法无法排除除乳糖外添加的其他糖类物质的影响，会使测定结果偏大。该方法未考虑葡聚糖在酸水解为葡萄糖和半乳糖过程中单糖可能的损失，在制作标准曲线时未采用相同的酸水解处理修正该损失，故最终的测定结果可能与实际含量有偏差。此外，该方法在测定时，牛奶中酵母β-葡聚糖的最小添加量为480mg/kg，受产品成本和添加限量要求的影响，在实际生产中会控制酵母β-葡聚糖的添加量，故该方法不能反映添加量较少时，测定结果的准确性和精密度。此外，该方法利用乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀牛奶中的蛋白，而实际上在离心过程中蛋白即可发生沉淀，高温酸水解时蛋白也可以进一步变性而后离心沉淀，故该步操作对最后的测定结果意义不大，增加了操作难度和成本，而且该方法采用高效液相色谱测定，结果受进样条件的影响，仪器昂贵，操作复杂。

申请号为201210309893.9，发明名称为“一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法”的专利公开了利用盐酸催化酵母β-葡聚糖和乳糖水解，在制作葡萄糖和半乳糖的标准曲线时，通过对标准品溶液进行酸处理以修正酸水解时葡萄糖和半乳糖的损失，运用高效液相色谱测定葡萄糖和乳糖含量，根据葡萄糖比半乳糖多出的部分计算出酵母β-葡聚糖的含量。

该发明采用两次水洗和一次醇洗对待测样品进行洗涤，不能保证最大程度除去干扰葡聚糖测定的其他糖类物质，使测定结果不可靠；该方法同样采用乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质，增加了操作难度和成本，且没有实际意义；采用高效液相色谱法检测葡萄糖和半乳糖，仪器昂贵，操作复杂，测定结果易受进样条件和检测器类型的影响，不利于在常规实验室的推广应用。

因此，需要克服现有检测技术中选择性差、准确性低、操作繁杂和仪器昂贵等不足，排除调制乳中糖类食品添加剂对测定结果的影响，开发出一种准确性好、精密度高且操作简便、成本低廉，适于在实验室推广应用的检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的新方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷和不足，提供一种准确性好、操作简便、成本低廉的检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品预处理

取待测样品，以水为溶剂对其进行浸提以除去其他糖分；酸法水解浸提后的样品，得待测样品水解液备用；

(2)对待侧样品进行测定

向所述待测样品水解液中加入GOPOD酶，显色后，采用紫外-可见分光光度法进行测定，得吸光度数值；

(3)绘制葡萄糖标准工作曲线

采用与步骤(1)相同的酸法水解方法对葡萄糖标准品进行处理，并向所得溶液中加入水，配制成不同浓度梯度的标准溶液，最后向所述标准溶液中加入GOPOD酶，显色后，采用与步骤(2)相同的紫外-可见分光光度法测定各标准溶液的吸光度，以所述标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程；

(4)计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量

采用如下公示计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量：

C＝[(Ax-A0)-b]*1/a*c*0.9*1/m

其中，C为调制乳中酵母β-葡聚糖含量(单位：mg/kg调制乳)；Ax为待测样品的吸光度值；A0为以水为空白的吸光度值；c为待测样品溶液稀释倍数；0.9为葡萄糖与葡聚糖换算系数；m为待测样品的质量(单位：g)；a为回归方程的斜率；b为回归方程的截距。

调制乳是以不低于80％的生牛(羊)乳或复原乳为主要原料，添加其他原料或食品添加剂或营养强化剂，采用适当的杀菌或灭菌工艺制成的液体产品。作为一类复杂的食品体系，调制乳中酵母β-葡聚糖含量的检测易受乳糖和其他糖类食品添加剂的干扰，导致测定结果的准确性低，可重复性差。因此，对调制乳样品进行预处理以尽量除去其他物质的干扰，是确保测定结果精准度的关键。

现有技术在待测样品处理过程中常先用酶法或添加蛋白沉淀剂的方法专门脱除蛋白，以期减少酵母β-葡聚糖在测定中的损失和对测定结果的干扰。事实上，无论是酶解还是沉淀，在离心洗涤时，蛋白或肽均与酵母β-葡聚糖共沉淀，并不能达到与多糖分离的目的，此举不仅操作繁杂，还增加了检测成本。

本发明简化了待测样品预处理方法，直接用水对调制乳样品进行离心洗涤，利用水溶性差异，除去干扰测定的乳糖和其他糖类食品添加剂，具有操作简便，杂质去除彻底的优势。

具体而言，本发明所述浸提操作为：按照1：(10-25)的料液比，向待测样品中加入水，于60-100℃浸提，离心浸提后的溶液，弃去上层液体，即得。

其中，所述水优选为超纯水。

优选地，重复上述浸提操作2-6次，以确保充分除去待测样品中其他物质对测定结果的干扰。

进一步优选地，还包括先对待测样品进行离心处理，弃去上层液体后，再对剩余样品进行浸提的步骤。其中，所述离心的条件为：于4000-10000rpm下离心10-30min。离心能够初步去除调制乳样品中的不相关物质，确保后续浸提操作的充分、完全。

作为最优选的浸提操作，具体为：于4000-10000rpm条件下离心待测样品10-30min，弃掉上层液体；按照料液比1:10-1:25，向所得样品中加入超纯水，于60-100℃下浸提20-60min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤2-6次，直至上层液体中不含干扰糖。

其中，所述料液比的单位为g：mL。

与背景技术中付俊鹤论文中提及的方法相比，本发明的方法在样品酸水解之前，利用超纯水对调制乳进行离心洗涤，不仅能排除乳糖的影响，还能除去体系中其他糖类物质的影干扰，且本发明的方法具有一般性，即适合于不同配方的调制乳体系，而不仅仅局限于纯牛奶。

其中，本发明步骤(1)中，所述酸法水解为：先用质量分数为60-75％的浓硫酸对待测样品进行浓酸水解，然后再用浓度为1-3mol/L的稀硫酸对浓酸水解后的样品进行稀酸水解。

优选地，所述浓酸水解在常温下进行。

优选地，所述稀酸水解在60-100℃进行。

最优选地，所述酸法水解的操作具体为：向待测样品中加入质量分数为60-75％的浓硫酸，于室温下水解2-4h；然后加入超纯水使硫酸浓度达到1-3mol/L，于60-100℃水解1-5h，调节pH值为6-8，即得。

本发明采用先浓硫酸降解，再稀硫酸水解的方法对β-葡聚糖进行降解，其中，浓酸水解能够破坏葡聚糖的三股螺旋结构被，致使更多的葡糖残基暴露于溶液相，增大其其水合程度，有助于其更好地分散于溶液中，形成一种微溶胶态，确保酸解效果；在浓酸水解的基础上继续进行稀酸水解，能够进一步彻底水解葡聚糖为葡萄糖。与采用单一浓度的酸解法相比，本发明先用浓酸再用稀酸水解的方法，具有葡聚糖的酸解损失小，回收率高的特点，能够确保检测结果的精准度。同时，与现有常用的混合酶法水解相比，还具有成本低、易于推广的优势。

优选地，所述紫外-可见分光光度法采用500-520nm吸收波长进行检测。进一步优选采用510nm吸收波长进行检测。

本发明在定量方法上采用GOPOD酶法和紫外-可见光分光光度法对酸处理水解后的葡萄糖进行定量，与现有苯酚-硫酸法选择性差、测定结果易受其他糖类干扰相比，GOPOD法的专一性强，测定结果更准确；与现有的高效液相色谱和气相色谱检测方法(需对样品进行衍生化处理)相比，分光光度法仪器具有简单稳定，操作方便，测定结果不受进样量和检测器影响的优势。

由于在对样品进行酸化处理过程中，易造成葡萄糖的损失，进而影响测定结果的精准度，因此，本发明的测定方法还包括采用标准曲线法以修正该损失的步骤。即按照与待测样品相同的酸法水解条件对葡萄糖标准品进行酸化处理，并绘制标准曲线，以校正由于葡萄糖损失而对测定结果造成的偏差。

优选地，本发明在绘制标准工作曲线时，当线性范围为0.2-15μg/mL时，线性关系良好，R²＞0.99，定量准确。

具体而言，不同浓度梯度的标准溶液的数量为3-8个，本发明优选6个，进一步优选地，不同浓度梯度分别为0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL。

作为本发明最优选的方案，所述检测方法包括如下步骤：

(1)待测样品预处理

称取调制乳样品，于4000-10000rpm离心10-30min，弃掉上层液体，按照料液比1:10-1:25，向剩余样品中加入水，于60-100℃下浸提20-60min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤2-6次，直至上层液体中不含干扰糖；

(2)对待侧样品进行测定

向所述待测样品水解液中加入GOPOD酶，显色后，采用紫外-可见分光光度法，于510nm测定吸光度值；

(3)绘制酸处理后的葡萄糖标准工作曲线

取葡萄糖标准品，加入60-75％硫酸溶液，室温下静置2-4h；加入超纯水使硫酸溶液浓度达到1-3mol/L，在60-100℃下水解1-5h，调节pH至6.0-8.0，得水解后的葡萄糖溶液备用；

取适量所述水解后的葡萄糖溶液，以水为溶剂，配制成0.5、1、2、4、8、12μg/mL的水解后的葡萄糖标准溶液；

向所述标准溶液中加入GOPOD酶，显色反应后，采用紫外-可见分光光度法，于510nm下测定各标准溶液的吸光度值，以水解后的葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程；

(4)计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量

采用如下公示计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量：

C＝[(Ax-A0)-b]*1/a*c*0.9*1/m

其中，C为调制乳中酵母β-葡聚糖含量(单位：mg/kg调制乳)；Ax为待测样品的吸光度值；A0为以水为空白的吸光度值；c为待测样品溶液稀释倍数；0.9为葡萄糖与葡聚糖换算系数；m为待测样品的质量(单位：g)；a为回归方程的斜率；b为回归方程的截距。

上述公式中，c为待测样品溶液的稀释倍数，所述稀释倍数为待测样品酸化水解定容后的体积(mL)。例如，待测样品进行酸化处理后，定容至50mL，则稀释倍数为50。

其中，A0的测定方法同样是在510nm波长下进行。

本发明所述的检测方法适用于检测添加有酵母β-葡聚糖的乳制品。所述调制乳优选为液态乳或乳粉冲调乳。其中所述乳粉冲调乳指的是固态乳粉末冲调后得到的液态乳冲调乳。

本发明所述的检测方法，与现有技术相比，具有如下优势：

(1)在样品酸水解之前，利用超纯水对调制乳进行离心洗涤，操作简单，除杂彻底；

(2)利用紫外-可见光分光度计检测葡萄糖含量，操作简单、成本低廉且结果稳定，适合在常规实验室推广应用；

(3)本方法检测的最小添加量为50mg/kg，此时回收率达到80％以上，RSD值为3.8％，在低添加量时表现出良好的准确性和精密度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。

附图说明

图1为实施例1中标准工作曲线；

图2为实施例2中标准工作曲线；

图3为实施例3中标准工作曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的原料或试剂均为已知产品，可市购获得；涉及到的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。

实施例1

一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准工作曲线

准确配制1mg/mL的葡萄糖标准液1mL于50mL离心管中，加入60％硫酸溶液3mL，室温下静置4h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到1mol/L，在100℃水解5h；取出冷却至室温，调节pH至6.0，用超纯水定容至50mL，得水解后的葡萄糖溶液；

取适量所述水解后的葡萄糖溶液，以超纯水为溶剂，配制成0.5、1、2、4、8、12μg/mL的水解后的葡萄糖标准溶液；

分别取所述标准溶液5mL溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。将反应后溶液用超纯水定容到10mL，于510nm下测定吸光度值，以水解后的葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线(如图1所示)，回归方程为：y＝0.0129x-0.0017。

(2)待测样品预处理

a、样品洗涤：称取2.000g加钙调制乳样品于聚丙烯离心管中，称样前充分混匀样品，边搅拌边称样。室温下4000rpm离心30min，弃掉上层液体。向离心管中加入超纯水后充分涡旋振荡，料液比1：25，于100℃下浸提60min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤2次，直至上层液体中不含干扰糖；

b、样品酸水解：向洗涤后的沉淀中加入60％硫酸溶液3mL，室温下静置4h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到1mol/L，在100℃水解5h；取出冷却至室温，调节pH至6.0，用超纯水定容至50mL。

c、GOPOD酶法显色：取5mL定容后的样品溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。

(3)紫外-可见光分光光度法测定

将上述反应液定容到10mL，紫外-可见光分光光度法，于510nm下测定溶液的吸光度值。

(4)计算调制乳中酵母β-葡聚糖含量

采用C＝[(Ax-A0)-b]*1/a*50*0.9*1/m公式计算酵母β-葡聚糖含量。

上述公式中，C为调制乳中酵母β-葡聚糖含量(mg/kg调制乳)

Ax为待测样品的吸光度值；

A0为以超纯水为空白的吸光度值；

50为样品溶液稀释倍数；

0.9为葡萄糖与葡聚糖换算系数；

m为称取的待测样品的质量(单位：g)；

a为回归方程的斜率；

b为回归方程的截距；

经计算，本实施例中检测到的加钙调制乳中酵母β-葡聚糖的含量为58.56mg/kg。

实施例2

一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准工作曲线

准确量取浓度1.5mg/mL的葡萄糖标准溶液1mL于50mL离心管中，加入68％硫酸溶液2mL，室温下静置3h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到2mol/L，在80℃水解3h；取出冷却至室温，调节pH至7.0，用超纯水定容至50mL，得水解后的葡萄糖溶液；

取适量所述水解后的葡萄糖溶液，以超纯水为溶剂，配制成0.5、1、2、4、8、12μg/mL的水解后的葡萄糖标准溶液；

分别取所述标准溶液5mL溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。将反应后溶液用超纯水定容到10mL，于510nm下测定吸光度值，以水解后的葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线(如图2所示)，回归方程为：y＝0.0126x-0.0048。

(2)待测样品预处理

a、样品洗涤：称取2.000g早餐奶样品于聚丙烯离心管中，称样前充分混匀样品，边搅拌边称样。室温下8000rpm离心20min，弃掉上层液体。向离心管中加入超纯水后充分涡旋振荡，料液比1：15，于80℃下浸提40min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤4次，直至上层液体中不含干扰糖；

b、样品酸水解：向洗涤后的沉淀中加入68％硫酸溶液2mL，室温下静置3h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到2mol/L，在80℃水解3h；取出冷却至室温，调节pH至7.0，用超纯水定容至50mL。

c、GOPOD酶法显色：取5mL定容后的样品溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。

(3)紫外-可见光分光光度法测定

将上述反应液定容到10mL，紫外-可见光分光光度法，于510nm下测定溶液的吸光度值。

(4)计算调制乳中酵母β-葡聚糖含量：同实施例1

本实施例中检测到的早餐奶中酵母β-葡聚糖的含量为62.39mg/kg。

实施例3

一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准工作曲线

准确量取浓度为2mg/mL葡萄糖标准溶液1mL于50mL离心管中，加入75％硫酸溶液1mL，室温下静置2h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到3mol/L，在60℃水解1h；取出冷却至室温，调节pH至8.0，用超纯水定容至50mL，得水解后的葡萄糖溶液；

取适量所述水解后的葡萄糖溶液，以超纯水为溶剂，配制成0.5、1、2、4、8、12μg/mL的水解后的葡萄糖标准溶液；

分别取所述标准溶液5mL溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。将反应后溶液用超纯水定容到10mL，于510nm下测定吸光度值，以水解后的葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线(如图3所示)，回归方程为：y＝0.0164x-0.0051。

(2)待测样品预处理

a、样品洗涤：称取2.000g乳粉冲调乳样品(液体)于聚丙烯离心管中，称样前充分混匀样品，边搅拌边称样。室温下10000rpm离心10min，弃掉上层液体。向离心管中加入超纯水后充分涡旋振荡，料液比1：10，于60℃下浸提20min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤6次，直至上层液体中不含干扰糖；

b、样品酸水解：向洗涤后样品中加入75％硫酸溶液1mL，室温下静置2h；加入超纯水，使硫酸溶液浓度达到3mol/L，在60℃水解1h；取出冷却至室温，调节pH至8.0，用超纯水定容至50mL。

c、GOPOD酶法显色：取5mL定容后的样品溶液于10mL容量瓶中，加入3mLGOPOD酶溶液，于室温下反应1h。

(3)紫外-可见光分光光度法测定

将上述反应液定容到10mL，紫外-可见光分光光度法，于510nm下测定溶液的吸光度值。

(4)计算调制乳中酵母β-葡聚糖含量:同实施例1

本实施例中检测到的早餐奶中酵母β-葡聚糖的含量为53.54mg/kg。

方法学验证

准确度及精密度试验

在纯牛奶基质中进行加标回收率实验，验证方法的准确度具体实验方法为:在纯牛奶中进行加标回收率实验，实验共进行三个水平，加入酵母β-葡聚糖的浓度为50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg。其余同实施例1的操作。实验得到的加标回收率及RSD如下表1所示:

表1：加标回收试验结果

通过上述结果表明，本发明的方法具有良好的回收率和精密度，能够满足定量分析要求。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种检测调制乳中酵母β-葡聚糖含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测样品预处理

取待测样品，以水为溶剂对其进行浸提以除去其他糖分；酸法水解浸提后的样品，得待测样品水解液备用；

(2)对待侧样品进行测定

向所述待测样品水解液中加入GOPOD酶，显色后，采用紫外-可见分光光度法进行测定，得吸光度数值；

(3)绘制葡萄糖标准工作曲线

采用与步骤(1)相同的酸法水解方法对葡萄糖标准品进行处理，并向所得溶液中加入水，配制成不同浓度梯度的标准溶液，最后向所述标准溶液中加入GOPOD酶，显色后，采用与步骤(2)相同的紫外-可见分光光度法测定各标准溶液的吸光度，以所述标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程；

(4)计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量

采用如下公式计算待测样品中酵母β-葡聚糖含量：

C＝[(Ax-A0)-b]*1/a*c*0.9*1/m

其中，C为调制乳中酵母β-葡聚糖含量，单位：mg/kg调制乳；Ax为待测样品的吸光度值；A0为以水为空白的吸光度值；c为待测样品溶液稀释倍数；0.9为葡萄糖与葡聚糖换算系数；m为待测样品的质量，单位：g；a为回归方程的斜率；b为回归方程的截距；

所述浸提操作具体为：于4000-10000rpm条件下离心待测样品10-30min，弃掉上层液体；按照料液比1:10-1:25，向所得样品中加入超纯水，于60-100℃下浸提20-60min，趁热离心，弃掉上层液体后重复浸提、离心步骤2-6次，直至上层液体中不含干扰糖；

步骤(1)中，所述酸法水解为：先用质量分数为60-75％的浓硫酸对浸提处理后的待测样品进行浓酸水解，然后再用浓度为1-3mol/L的稀硫酸对浓酸水解后的样品进行稀酸水解。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓酸水解在常温下进行，和/或，所述稀酸水解在60-100℃进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酸法水解的具体操作为：向待测样品中加入质量分数为60-75％的浓硫酸，于室温下水解2-4h；然后加入水使硫酸浓度达到1-3mol/L，于60-100℃水解1-5h，调节pH值为6-8，即得。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述标准工作曲线的线性范围为0.2-15μg/mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述不同浓度梯度分别为0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL。

6.根据权利要求1～3或5任一项所述的方法，其特征在于：所述紫外-可见分光光度法采用500-520nm吸收波长进行检测。