CN105738488A - 一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法。具体而言,本发明的检测方法包括如下步骤:1)前处理步骤:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对乳或乳制品进行酶解,将酶解产物离心后用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀,向沉淀中加入一元酸进行加热水解;2)分析步骤:采用离子色谱的方法测定前处理产物中葡萄糖的含量,计算乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析检测方法,特别是一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法。
背景技术
酵母β-葡聚糖(yeastbetaglucan)是一种从酵母细胞壁中提取的葡萄糖聚合物,其分子结构主链包含β-1,3-D糖苷键,而支链包含β-1,6-D糖苷键,两者之比约为85:15。酵母β-葡聚糖的线性分子聚合度为1500、分子量约为240kDa,支链分子聚合度为140、分子量约为22kDa。酵母β-葡聚糖作为重要的食品膳食纤维来源,具有增强免疫力、防氧化辐射、抗肿瘤炎症、降低血脂胆固醇、促进伤口愈合等诸多营养价值和生理功能。2010年6月卫生部9号公告批准酵母β-葡聚糖作为新资源食品,2012年卫生部6号公告批准酵母β-葡聚糖用作食品添加剂(营养强化剂)。作为原料,酵母β-葡聚糖在食品和保健品中的应用更为广泛。饮用添加酵母β-葡聚糖的牛乳中可实现增强免疫力的功效。
由于酵母β-葡聚糖是一种水不溶性多糖,并与甘露聚糖、蛋白或几丁质等物质相互结合,其测定方法一直是个研究难点。目前,对酵母β-葡聚糖的测定多采用苯酚-硫酸法,但是此方法灵敏度较低,且易受其它多糖或单糖的干扰,造成测定结果不准确。为了改善测定结果的准确性,通常进行预处理。例如,可利用强酸将葡聚糖水解为葡萄糖的预处理方式,随后使用高效液相色谱法测定葡萄糖含量,从而间接计算葡聚糖含量([非专利文献1])。然而,该采用高效液相色谱法对葡萄糖进行分析时,由于葡萄糖在紫外区域无吸收,一般采用示差折光检测器和蒸发光散射检测器进行检测;虽然无需衍生,然而该方法的灵敏度很低,仅适合于常量样品的分析。此外,常用的氨基柱对多组分糖的分离效果有限。
相比之下,离子色谱法不仅能够分析阴阳离子,还能够过将非离子型化合物转变为离子型化合物的预处理,对非离子型化合物进行测定。例如,在非专利文献2中,在碱性条件下将酵母细胞壁中的β-葡聚糖和甘露寡糖解离成阴离子,经阴离子交换色谱柱分离,在脉冲安培检测器中发生氧化还原反应产生电流响应,从而检测β-葡聚糖和寡糖的含量。该测定方法具有显著的优点:样品前处理非常简单,不需要预先衍生就能分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖;检测灵敏度极高,含量低至pmol级的样品亦可被检测。然而,该预处理方法需要采用200mmol/LNaOH中和葡聚糖水解液中剩余H2SO4,导致大量盐生成,对后续的离子色谱造成干扰。专利CN102809620A采用盐析法提取乳品中的酵母β-葡聚糖,乳液中的葡聚糖伴随蛋白盐析沉降与之形成共沉淀物。由于沉淀蛋白与挟裹入沉淀物中的乳糖和无机盐去除困难,检测受基质干扰严重,此外该方法前处理操作复杂、费时且受人为影响因素多,测定结果重复性不好,难以在实际样品测定中推广应用。
对于在乳或乳制品中添加酵母β-葡聚糖而言,由于在加工过程中采用高速剪切均质破碎乳品中的脂肪颗粒,不溶于水的葡聚糖颗粒也遭到破坏,导致葡聚糖固体粒径由最初的数十微米缩小至0.2至1.0μm,大部分集中在0.4至0.6μm,大小不均一且普遍被蛋白质包被。此外,乳品基质极其复杂,其中的脂肪球、蛋白束、稳定剂和香精配料都将影响对酵母β-葡聚糖的提取与纯化,因此如何准确测定乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖仍是具有挑战性的课题。目前,只有AOAC32.2.10标准《AOACOfficialMethod995.16β-D-GlucaninBarleyandOats》和农业行业标准NY/T2006-2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》对水溶性β-葡聚糖的检测进行了标准化,但对于水不溶性β-葡聚糖,特别是乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖,国内外均缺少的成熟的检测标准和相关技术。
[非专利文献1]:牛乳中酵母β-葡聚糖的应用与测定,付俊鹤等,《食品工业科技》2013年第4期;
[非专利文献2]:离子色谱—脉冲安培检测法测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖,李仁勇等,《食品与发酵工业》20008年第12期。
发明内容
为解决上述难题,本发明提供了一种测定乳和乳制品中酵母β-葡聚糖的新方法。具体而言,本发明的乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法包括如下步骤:
1)前处理步骤:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对乳或乳制品进行酶解,将酶解产物离心后用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀,向沉淀中加入一元酸进行加热水解;
2)分析步骤:采用离子色谱的方法测定前处理产物中葡萄糖的含量,计算乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的含量。
具体而言,本发明是通过如下技术方案实现的:
1.一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法,所述方法包括如下步骤:
1)前处理步骤:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对所述乳或乳制品进行酶解,将酶解产物离心后用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀,向沉淀中加入一元酸进行加热水解,得到前处理产物;
2)分析步骤:采用离子色谱法测定所述前处理产物中葡萄糖的含量,然后计算所述乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的含量。
2.如段落1所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述中性蛋白酶为所述碱性蛋白酶为
3.如段落1或2所述的方法,其中,所述前处理步骤中,处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述中性蛋白酶的酶活力为1.0×10-4AU/mL至1.0×10-3AU/mL,和/或处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述碱性蛋白酶的酶活力为2.8×10-4AU/mL至2.8×10-3AU/mL。
4.如段落1-3中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述中性蛋白酶的酶活力为5.0×10-4AU/mL,所述碱性蛋白酶的酶活力为1.4×10-3AU/mL。
5.如段落1-4中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解温度为40~50℃。
6.如段落5所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解温度为45℃。
7.如段落1-6中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解时间为0.5~6小时。
8.如段落7所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解时间为2小时。
9.如段落1-8中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述离心的转速为8000~12000rpm。
10.如段落9所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述离心的转速为10000rpm。
11.如段落1-10中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀进行1~3次。
12.如段落1-11中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述一元酸使用浓度为1mol/L的盐酸。
13.如段落1-12中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的时间为0.5~2小时。
14.如段落13所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的时间为1小时。
15.如段落1-14中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的温度为110~130℃。
16.如段落15所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的温度为121℃。
17.如段落1-16中任一项所述的方法,其中,所述分析步骤中,在进行所述离子色谱法之前,对所述前处理产物进行稀释。
有益效果
本发明人发现,结合利用酶解、离心分离以及酸解的前处理步骤,能够直接将酵母β-葡聚糖从乳或乳制品中提取出来,所获得的产物中蛋白、乳糖和其他小分子含量低,从而在其后的分析步骤中不需考虑乳液中蛋白和其他小分子化合物干扰。这样的前处理步骤提高了水不溶性酵母β-葡聚糖从乳或乳制品中的析出率。
具体而言,首先,使用蛋白酶对乳或乳制品样品进行酶解处理可显著降低测定中乳或乳制品中的蛋白对葡聚糖的干扰。因此,在本发明的前处理步骤中,使用蛋白酶消化乳或乳制品中含有的大量蛋白。例如,牛乳中蛋白的含量约占全乳的3.3%~3.5%,其种类主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具有重要生理功能的酶类,其中酪蛋白占蛋白总重的78.8%。采用蛋白酶酶解蛋白,可将蛋白或多肽链中的肽键进行全部或部分拆分,使其变成小分子量的肽类或氨基酸。蛋白四级结构的破坏将有助于被包裹的葡聚糖的析出,从而提高提取效率。然而,由于单酶水解能力有限、水解度不高,采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶协同水解可在较短时间内获得较高水解度,生成相对分子量较小的多肽。
随后,通过离心实现酶解后样品中小分子与葡聚糖颗粒的分离。离心处理后能够得到葡聚糖的粗沉淀。随后,通过用纯水或去离子水对葡聚糖粗沉淀物进行清洗,可有效去除葡聚糖的粗沉淀上附着的乳糖、淀粉辅料以及内源性小分子。
在采用一元酸对葡聚糖进行水解的过程中,一元酸对离子色谱分离干扰小,并能够获得较高的葡萄糖转化率。通过控制加热水解的时间和温度,能够减少对生成的葡萄糖的破坏作用,从而有效提高葡萄糖的转化率。
另一方面,在本发明的分析步骤中,对文献中葡萄糖离子色谱分离条件进行优化。首先,由于牛乳酸解液中含有Cl-,为在离子色谱的分离中降低Cl-对单糖阴离子产生的干扰,在进行所述离子色谱分析前,通过对氮吹除盐酸法或直接稀释法对前处理获得的葡聚糖水解液进行稀释。对葡聚糖水解液中葡萄糖与半乳糖检测的影响进行比较发现,采用直接稀释法测定结果重复性更好。此外,通过调整洗脱液中OH-离子强度,能够实现葡萄糖及半乳糖在阴离子交换色谱柱上完全分离;色谱分离结束后采用高浓度醋酸盐清洗阴离子交换柱,保证葡萄糖在离子色谱仪上保留时间高度重复。
通过本发明方法进行的测定,相对标准偏差(RSD)仅为1.69%,回收率达到78.2%,而检出限低至0.4mg/100g,在检测灵敏度和选择性方面均优于传统的高效液相色谱方法。
附图说明
图1示出根据本发明方法的前处理步骤中,中性蛋白酶和碱性蛋白酶用量与样品蛋白水解度的关系。
图2示出根据本发明方法的前处理步骤中,酶解时间与样品蛋白水解度的关系。
图3A-3C示出根据本发明实施方式测定的不同样品的离子色谱图。图3A为含有5μg/mL半乳糖和5μg/mL葡萄糖的标准溶液的离子色谱图;图3B为本发明方法测定的未添加酵母β-葡聚糖的空白对照牛奶样品的离子色谱图;图3C为经本发明方法测定的20g酵母β-葡聚糖的牛奶样品(表1中编号2014010891的样品)的离子色谱图。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本发明所使用的术语“乳或乳制品”包括牛乳、羊乳、水牛乳、马乳等,还包括以牛乳、羊乳、水牛乳、马乳等为原料制成的鲜乳、乳粉、炼乳、奶油、干酪、干酪素和乳糖等制品。优选地,本发明的乳或乳制品为牛乳。
本发明所使用的术语“酵母β-葡聚糖”是提取自食用酵母细胞壁的结构性多糖。优选地,本发明的酵母β-葡聚糖为酿酒酵母β-葡聚糖。
在优选的实施方式中,本发明前处理步骤中使用的中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别为:所述中性蛋白酶为碱性蛋白酶为在优选的实施方式中,处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述中性蛋白酶的酶活力为1.0×10-4AU/mL至1.0×10-3AU/mL、优选5.0×10-4AU/mL,和/或处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述碱性蛋白酶的酶活力为2.8×10-4AU/mL至2.8×10-3AU/mL、优选1.4×10-3AU/mL。在优选的实施方式中,所述酶解的酶解温度为40~50℃、优选45℃。在优选的实施方式中,所述酶解的酶解时间为1~6小时、优选2小时。在优选的实施方式中,所述离心的转速为8000~12000rpm、优选10000rpm。在优选的实施方式中,所述用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀进行1~3次。在优选的实施方式中,所述一元酸使用浓度为1mol/L的盐酸。在优选的实施方式中,所述加热水解的时间为0.5~2小时,优选1小时。在优选的实施方式中,所述加热水解的温度为110~130℃、优选121℃。
本发明分析步骤可使用本领域惯用的离子色谱分析方法。在优选的实施方式中,在进行所述离子色谱法之前,对前处理获得的葡聚糖水解溶液(即,前处理产物)进行稀释。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明,这些实施例仅用于举例说明本发明,不应被解释为对本发明的限制。
本发明实施例中使用的乳或乳制品为同一批次的蒙牛乳业生产的鲜奶产品,酵母β-葡聚糖为安琪酵母的酵母葡聚糖G70。本发明实施例中采用的中性蛋白酶是诺维信公司的其原液的酶活力为0.8AU/g,密度为1.25g/ml。所采用的碱性蛋白酶为诺维信公司的其原液的酶活力为2.4AU/g,密度为1.17g/mL。
利用如下方法制备添加有酵母β-葡聚糖的牛奶:将新鲜牛奶加热至80℃,根据实施例加入酵母β-葡聚糖,用均质机高速剪切10min进行混合,冷却备用。
除非特别指明,实施例所采用的添加有酵母β-葡聚糖的牛奶中酵母β-葡聚糖的含量为42mg/100g牛奶。
实施例1:中性蛋白酶和碱性蛋白酶的用量、酶解时间与样品蛋白水解度的关系
本实施例采用蛋白水解度作为衡量蛋白水解程度的指标。
以0.02%、0.05%、0.1%、0.15%与0.2%(v/v)的体积比向添加有酵母β-葡聚糖的牛奶中加入中性蛋白酶原液和碱性蛋白酶原液的等体积混合液(按上文中提到的密度加以折算,在待酶解的牛奶中,Neutrase中性蛋白酶的酶活力分别是1.0×10-4AU/mL、2.5×10-4AU/mL、5.0×10-4AU/mL、7.5×10-4AU/mL、1.0×10-3AU/mL,Alcalase碱性蛋白酶的酶活力分别是2.8×10-4AU/mL、7.0×10-4AU/mL、1.4×10-3AU/mL、2.1×10-3AU/mL、2.8×10-3AU/mL),45℃下进行酶解6小时。酶解完成后,采用pH-state法测定各样品的蛋白水解度。结果如图1所示,上述蛋白酶混合液的最佳用量为0.1%(v/v),对应于中性蛋白酶的酶活力为5.0×10-4AU/mL、碱性蛋白酶的酶活力为1.4×10-3AU/mL的情况。
以0.1%(v/v)的比例向添加有酵母β-葡聚糖的牛奶中加入中性蛋白酶原液和碱性蛋白酶原液的等体积混合液,45℃下酶解,分别在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0小时时取样,采用pH-state法测定取出的各样品的蛋白水解度。结果如图2所示,最佳酶解时间为2小时。
实施例2:实际样品的测定
样品1-12(样品编号见表1)均为添加有42mg/100g酵母β-葡聚糖的牛奶样品。
1)前处理步骤:以0.1%(v/v)的比例分别向12个酵母β-葡聚糖牛奶样品中加入中性蛋白酶原液和碱性蛋白酶原液的等体积混合液,45℃下酶解2小时后,以10000rpm转速将获得的酶解产物离心。弃去上清液,使用纯水将获得的葡聚糖粗沉淀清洗两次。随后在沉淀中加入1mol/L盐酸,121℃水解1小时。
2)分析步骤:采用离子色谱方法对前处理步骤后样品的葡萄糖进行测定。在进行所述离子色谱分析前,采用直接稀释法对前处理获得的葡聚糖水解溶液进行稀释,使得待测定的葡萄糖浓度处于线性范围(即,下文中所述的0.5~20μg/mL)。分析步骤采用的优化的色谱分离条件为:色谱柱为DionexCarboPacPA10色谱柱(4.0×250mm,5μm),流动相为15mmolNaOH溶液,流速为1ml/min,30℃柱温下等度洗脱。检测器为安培检测器。
按照式(1)计算样品牛奶中酵母β-葡聚糖的含量,数值以毫克每百克表示:
式中:
X——样品中酵母β-葡聚糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
C——样液中葡萄糖的测定值,单位为微克每毫升(μg/mL);
V——样品的最后定容体积,单位为毫升(mL);
m——样品质量,单位为克(g);
F——葡聚糖水解校正因子,F=1.78;
d——稀释倍数;
0.9——葡萄糖转换为葡聚糖系数;
1000——由μg/mL换算成mg/mL的换算因子。
100——由mg/g换算成mg/100g的换算因子。
经本方法处理的牛奶乳糖干扰极低(如图3B所示,空白对照中几乎不存在半乳糖),在水解产物中基本检不出半乳糖,因此在计算葡萄糖时无需扣除半乳糖。
结果如表1和图3所示。采用本研究建立的样品前处理步骤和分析步骤测定的12个添加有酵母β-葡聚糖的牛奶样品的酵母β-葡聚糖含量,最低检出值为35.75mg/100g,最高检出值为41.97mg/100g,平均检出值为38.51mg/100g,相对标准偏差(RSD)为1.69%。
表1各样品中酵母β-葡聚糖的检测结果
(全部样品中酵母β-葡聚糖的添加量为42mg/100g)
实施例3:方法的灵敏度、准确度和精密度分析
使用纯水配制0.5、1.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0μg/mL一系列浓度的葡萄糖标准溶液和样品溶液,对分析的灵敏度、准确度和精密度进行评估。
在与实施例2相同的色谱条件下测定得到葡萄糖标准溶液的线性回归方程为Y=2.865X+0.395,线性范围是0.5~20μg/mL,线性相关系数为0.9995,检测限为0.1μg/mL,相对标准偏差为0.15%(n=6)。
以乳制品中添加酵母β-葡聚糖的浓度为42.00mg/100g作为标准样,制备标准样的70%、100%和130%三种添加水平的样品,测定三种浓度下的样品回收率:当添加量为70%时,测定值为22.32mg/100g,回收率为75.9%,相对标准偏差为1.41%(n=6);当添加量为100%时,测定值为32.84mg/100g,回收率为78.2%,相对标准偏差为2.24%(n=6);当添加量为130%时,测定值为39.80mg/100g,回收率为72.9%,相对标准偏差为3.01%(n=6)。
Claims (10)
1.一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法,所述方法包括如下步骤:
1)前处理步骤:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对所述乳或乳制品进行酶解,将酶解产物离心后用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀,向沉淀中加入一元酸进行加热水解,得到前处理产物;
2)分析步骤:采用离子色谱法测定所述前处理产物中葡萄糖的含量,然后计算所述乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的含量。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述步骤前处理步骤具有如下条件中的一个或多个:
所述中性蛋白酶为所述碱性蛋白酶为
处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述中性蛋白酶的酶活力为1.0×10-4AU/mL至1.0×10-3AU/mL、优选5.0×10-4AU/mL,和/或处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述碱性蛋白酶的酶活力为2.8×10-4AU/mL至2.8×10-3AU/mL、优选1.4×10-3AU/mL。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解温度为40~50℃、优选45℃。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述酶解的酶解时间为0.5~6小时、优选2小时。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述离心的转速为8000~12000rpm、优选10000rpm。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀进行1~3次。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述一元酸使用浓度为1mol/L的盐酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的时间为0.5~2小时、优选1小时。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其中,所述前处理步骤中,所述加热水解的温度为110~130℃、优选121℃。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中,所述分析步骤中,在进行所述离子色谱法之前,对所述前处理产物进行稀释。
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