CN102488137B

CN102488137B - 一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用

Info

Publication number: CN102488137B
Application number: CN2011103626526A
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 夏海洋; 姚翔
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102488137A

Abstract

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，属于酶制剂﹑食品添加剂技术领域。枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶发酵液经过离心、澄清、浓缩、脱盐和冷冻干燥得固体酶。利用中性蛋白酶和氨肽酶以一定比例添加复配酶解大米，酶解后的营养米游离氨基酸含量也显著增加。通过分析营养米酶解后水解液的DPPH消除能力、超氧自由基消除能力，羟自由基消除能力和还原力等几项指标，表明大米中蛋白质酶解为较高比例小分子肽后可使其营养米的抗氧化活性得到较大幅度的提高，抗氧化活力的稳定性较高。本发明将营养米的酶解加工与风味功能性加工有机地结合，起到强化营养米的风味与功能因子的作用，在风味功能营养米的开发上有广泛的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用

技术领域

一种食品级枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。

随着大米加工水平的提高，大米加工精度等级也越来越高，营养物质的损失也越来越严重。营养米可以满足人们对维生素及矿物质的日常需求，在正常饮食条件下便可获得充足维生素。目前市场上已有各种营养米的产品，但口感较普通大米较差，为提高营养米口感，特开发风味营养米。

在大米加工过程中添加合适的蛋白酶，使风味前体物水解，从而释放出风味物质，增强和改善营养颗粒的风味。风味营养米的开发除可满足人体对营养素的正常需求外，还可为特殊人群提供健康饮食。如肾脏病人，肾脏病患者对饮食有很高要求，尤其不可食用蛋白含量高的食物。正常情况下，人体摄入蛋白后经过代谢，大部分都会成为含氮废物，由肾脏排出体外。所以含蛋白食物会加重肾脏的代谢负担，加重病情，肾脏病人多选择无蛋白或低蛋白食物。风味营养米中的蛋白质已被酶解为各种氨基酸，可直接为人体吸收，不仅可以减轻肾脏负担而且可以确保营养摄入的全面均衡。风味营养米的开发对肾脏病患者具有重要意义。不同年龄段人群对营养要求各异，可根据营养要求研制不同类型的风味营养米，如特别针对儿童的营养米，可通过颜色及气味和口感激发儿童摄入欲望。针对老年人的营养米，可提前将大米成分适当降解，减少老年人消化负担。由此可见，风味营养米的研制是对现有营养米的有益补充，对于提高我国人口健康状况具有积极作用。

发明内容

本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，制备风味功能性营养米。

本发明的技术方案：

大米经过粉碎后成为大米粉末。中性蛋白酶和固体氨肽酶对大米粉末进行复配酶解。以DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映营养米抗氧化肽的抗氧化活性。并选择在后续工艺采用的条件下对其抗氧化活性稳定性进行研究。

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用：

(1)将大米用粉碎机粉碎，得到大米粉末。

(2)用5g大米粉末为底物，以50mL水为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配的风味蛋白酶进行酶解，中性蛋白酶（E1）︰固体氨肽酶（E2）的质量比控制为5︰1，加酶总量为底物质量的0.5%-2%；50℃酶解6h。煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静置12 h后4℃10000rpm离心20min，上清液为大米多肽混合物。分析测定其中分子量小于1kDa的占90%以上；其对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为大于20%，35%，50%，其还原能力为VC的0.9倍以上，表现出较强的体外抗氧化活性。

B 风味功能性营养米抗氧化稳定性研究

(1) 经过60℃20min处理后，上清液对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为21.02%，37.79%，50.42%，其还原能力为VC的0.97倍.

(2) 经过80℃1min处理后，上清液对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为20.98%，37.78%，50.21%，其还原能力为VC的0.97倍。

(3) 经过95℃2min处理后，上清液对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为21.01%，37.62%，50.07%，其还原能力为VC的0.97倍。

C 枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米酶解的应用研究

（1）中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米酶解液中多肽分子量分布。经过高效液相色谱分析多肽分子量分布，发现中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米后，酶解液中多肽小于1kDa的可占90%以上。结果如图1。

（2）中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米酶解液中游离氨基酸的测定。氨基酸分析液相色谱仪(Ag1100) 游离氨基酸的总含量从43.5315mg/mL提高到105.896mg/mL；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从3.5631mg/mL提高到7.5819 mg/mL；甘氨酸的含量从1.9140 mg/mL提高到3.1073mg/mL；天冬氨酸的含量从2.5826 mg/mL提高到4.4292 mg/mL；谷氨酸的含量从1.0569 mg/mL提高到9.1716 mg/mL。结果如图2。

固体氨肽酶的酶活

LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6.075gTris溶于900mL蒸馏水，用浓HCl调至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺（L-leu-pNA）作为底物，取0.1g底物溶于1mL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0.1g固体氨肽酶粉用Tris-HCl缓冲液定容到100mL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和1mL底物L-leu-pNA，一个加入1mL酶液，另一个加入1mL Tris-HCl缓冲液作为对照，在50℃水浴反应10min后，405nm比色测定酶活。

酶活公式：酶活=A×105.7×4×n/10

其中：A为待测酶液的吸光度；n为待测酶液的稀释倍数。

酶活力定义：50℃，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。

测定样品对DPPH自由基即二苯代苦味肼基自由基的清除率

采用消除DPPH自由基法。取2mL待测样品，加入2mL质量浓度为0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液，混合均匀后反应20min，在转速3500 r/min下，离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Ai；另取2mL待测样品于试管中，加入无水乙醇2 mL，反应20min，在转速3500r/min下离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Aj；以2mL质量浓度0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液和2mL无水乙醇反应作为参比，其在波长517nm处吸光度记为A₀，按照下列式子计算样品对DPPH自由基的清除率：

清除率=(1—

)

100%

测定样品对超氧自由基的清除率

称取适量酶解产物溶解于1mL的蒸馏水中，取0.1 mL加入2.8 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)，空白对照管以双蒸馏水代替样品，震荡混匀，在25℃水浴保温10 min 后加入0.1 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液(25℃水浴预热)，迅速混匀并开始计时，每隔30 s在325 nm处测定吸光度值A₃₂₅，5 min后结束，以0.1 mL 双蒸水加2.8 mL 的Tris-HCL 缓冲溶液调零。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V。按下式计算清除率：

式中：A _空白——空白样的吸光度；

A _样——样品的吸光度。

测定样品对羟自由基的清除率

在2 mL待测样品中，分别加入2 mL浓度为6 mmol/L的FeSO₄，2 mL浓度为6 mmol/L的H₂O₂，混合后室温静置10 min，然后加入2 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸，混合均匀，室温静置30 min后，在波长510 nm处测量其吸光度，记录为A _i；用蒸馏水代替水杨酸再次测量其吸光度，记录为A _j，空白对照组以蒸馏水代替样品，测量吸光度，记录为A _o。清除羟自由基计算公式为：

清除率=(1—

)

100%

测定样品还原力

在15mL试管中分别加入不同浓度样品1mL，磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.6) 2.5mL和1%铁氰化钾5mL，置于50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸5mL，摇匀。吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液。样品在700nm处测定吸光值，反应物的吸光值越大表明还原力越强。

本发明的有益效果：固体氨肽酶的提取方法容易扩大生产，通过中性蛋白酶和固体氨肽酶复配酶解大米后，酶解液中呈味氨基酸含量变高，可增加鲜味，在风味功能性营养米开发中具有很好的应用空间；同时得到的活性物质抗氧化能力显著提高，在制备抗血压、抗氧化活性肽方面具有很好的应用前景，对风味功能性营养米的深加工和充分合理利用有很好的发展前景。

附图说明

图1氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解大米酶解液中多肽分布图谱；

图2氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解大米酶解液中游离氨基酸图谱；

图3风味功能性营养米酶解段流程示意图。

具体实例方式

实施例1

将枯草芽孢杆菌Zj016（【食品与发酵工业】2006年32卷第3期已公开）发酵液在4℃，10000rpm离心10min收集3.5L发酵液，在4℃下加入(NH₄)₂SO₄700 g(边加边搅拌)，4℃10000rpm离心10min收集澄清液3.6L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到1.4L，流速35mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后1.4L，流速40 mL/min；将浓缩脱盐液冷冻干燥后得到固体氨肽酶，得到的固态氨肽酶的酶活为7.9×10³ U/g。以5g大米粉末为底物，以50mL水为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，中性蛋白酶（E1）︰固体氨肽酶（E2）的质量比为5︰1，其中复配酶加入总量为底物的0.8%；50℃酶解6h。煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静置12 h后4℃、10000rpm离心20min，上清液为大米多肽混合物。其对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为21.11%，37.98%，51.65%，分别是同浓度下VC 的0.79，0.73，0.87倍；其还原能力为VC的0.98倍，表现出较强的体外抗氧化活性。酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从43.5315mg/mL提高到105.896mg/mL；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从3.5631mg/mL提高到7.5819 mg/mL；甘氨酸的含量从1.9140 mg/mL提高到3.1073mg/mL；天冬氨酸的含量从2.5826 mg/mL提高到4.4292mg/mL；谷氨酸的含量从1.0569 mg/mL提高到9.1716mg/mL。

后期加工：酶解后产物，包括上清液和沉淀，经60-95℃、20-2min，干燥处理制得风味功能性营养米；其抗氧化活性均保持在98%以上，稳定性好。

实施例2

将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4℃，10000rpm离心10min收集2.5L发酵液，在4℃下加入(NH₄)₂SO₄500 g(边加边搅拌)，4℃，10000rpm离心10min收集澄清液2.5L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到0.85L，流速30mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后0.85L，流速40 mL/min，将浓缩脱盐液冷冻干燥后得到固体氨肽酶。得到的固态氨肽酶的酶活为6.7×10³ U/g。以5g大米粉末为底物，以50mL水为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，中性蛋白酶（E1）︰固体氨肽酶（E2）的质量比为5︰1，其中复配酶的加入总量为底物的1.2%；50℃酶解6h。煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静置12 h后4℃，10000rpm离心20min，上清液为大米多肽混合物。其对超氧自由基、DPPH·和羟自由基的清除率分别为20.05%，40.74%，56.13%，分别是同浓度下VC 的0.75，0.79，0.94倍；其还原能力为VC的1.25倍，表现出较强的体外抗氧化活性。酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从43.5315mg/mL提高到105.896mg/mL；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从3.5631mg/mL提高到7.5819 mg/mL；甘氨酸的含量从1.9140 mg/mL提高到3.1073mg/mL；天冬氨酸的含量从2.5826 mg/mL提高到4.4292mg/mL；谷氨酸的含量从1.0569 mg/mL提高到9.1716mg/mL。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在制备大米多肽混合物工艺中的应用，其特征在于：

（1）将大米用粉碎机粉碎，得到大米粉末；

（2）以5g大米粉末为底物，以50mL水为介质，用中性蛋白酶和枯草芽孢杆菌氨肽酶复配的风味蛋白酶进行酶解，中性蛋白酶︰枯草芽孢杆菌氨肽酶的质量比控制为5︰1，加酶总量为底物质量的0.5%-2%；50℃酶解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静置12h后4℃10000rpm离心20min，上清液为大米多肽混合物，分析测定其中分子量小于1kDa的占90%以上；该大米多肽混合物对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率分别为大于20%，35%，50%，其还原能力为VC的0.9倍以上，表现出较强的体外抗氧化活性；酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量提高到100mg/mL以上；主要呈味氨基酸：丙氨酸含量提高到7.5 mg/mL以上；甘氨酸含量提高到3mg/mL以上；天冬氨酸含量提高到4mg/mL以上；谷氨酸含量提高到9mg/mL以上。