CN101589761A - 一种工业用大麻籽抗氧化肽的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种工业用大麻籽抗氧化肽的制备方法和用途。本发明利用低温榨油后所得的工业用大麻籽粕和廉价易得的酶制剂，通过酶法水解，制备得到工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物，水解度为15％～20％，分子量分布为350－2000Da。将上述酶解物经大孔吸附静态或动态脱盐，真空浓缩，冷冻干燥，得到工业用大麻籽蛋白抗氧化肽。所得产品具有广泛的清除自由基能力。本发明的优点是原料来源简单，工艺流程简便；营养价值高，极易为人体吸收；清除自由基能力强，能抗疲劳，提高人体免疫力。因此，本发明产品具有很广阔的应用前景，可用作营养强化剂、保健品、饮料和化妆品的添加剂、食品中的抗氧化剂及医药领域。

Description

一种工业用大麻籽抗氧化肽的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物活性肽的制备工艺，更具体地说，涉及的是一种工业用大麻籽抗氧化肽的制备方法及应用。

背景技术

由于氧自由基可引起细胞损伤和死亡，皮肤衰老、色斑、皱纹及某些皮肤疾病的发生及食品的氧化酸败有密切关系。随着生活水平的提高，人们对营养摄入的要求越来越高。经植物蛋白制取的抗氧化肽因其安全性高、功能性好、价格低廉等优点，日益受到人们的关注，在食品和医药领域具有巨大的应用前景。

大麻具有悠久的种植历史，是人们最早的作物之一。考古资料显示，我国是最早驯化种植和加工大麻的地区，距今约5000-6000年。主要包括纤维型、药用型和野生型三大类。大麻曾经是人类所必需的纤维和食品的重要来源，广泛应用于制造绳索、帆布、服装、纸张、食品和油料等用途，对航海、军事、经济的发展产生了巨大的影响。

大麻在我国不同地区有不同的称谓，如线麻、火麻、寒麻、魁麻等。国际上将四氢大麻酚(THC)含量低于0.3％的品种称为工业用大麻(Industrial Hemp)或汉麻，高于0.3％的称为药用或毒品大麻。工业用大麻，

工业用大麻籽是工业用大麻植物的果实，含有约25～35％的油脂，20～25％的蛋白质，20～30％的碳水化合物。其中工业用大麻籽蛋白质是一种完全蛋白质，含有人体所需的8种必需氨基酸，蛋白中约有65％是麻仁球蛋白，容易被人体消化吸收，营养价值较高，可以作为功能性蛋白质应用于保健食品、食品中。目前，工业用大麻籽蛋白类产品只限于粗制的蛋白粉(蛋白质含量50～60％)，含有杂质较多，利用价值不高。利用丰富的籽粕资源，制备具有生理活性的多肽，并开发生产出风味和功能性好的高附加值产品，这对于满足人们对功能食品的需求、改善生活质量、预防疾病，具有显著的经济效益和社会效益。

目前，蛋白肽的生产大多采用水解蛋白的方法，如碱水解法，但这种方法收率低，成本高，无法实现工业化生产。国际上肽含量在95％以上的大豆蛋白肽，售价为12000元/吨(人民币)，而到目前为止，尚未见有工业用大麻籽蛋白肽产品。

专利号为ZL200410006119.6，名称为“大米蛋白肽的制备方法及其用途”的专利中公开了一种大米蛋白肽的制备方法，该蛋白肽利用工业大米渣为原料，通过双酶法一步水解制得大米蛋白肽的方法。所述的大米蛋白肽，它具有大米蛋白的优点，即易被人体吸收、能提高人体的免疫功能、抗疲劳、有利于儿童的生长发育，尤其是能促进儿童的智力发育，与其他的蛋白相比，营养价值高、不含胆固醇、有利于人体的心脑血管健康，安全性好。

申请号为200610000996.1，名称为“一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物及其制备方法和用途，其通过将胶原蛋白水解而获得的水解产物，该混合物的制备包括：使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；然后进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；最后对此水解液进行分离纯化和浓缩，得到该申请的源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物。

申请号为200610066895.4，名称为“源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途”，所述的抗氧化肽其具有如下之一的氨基酸序列：(1)Hyl-Cys；(2)Gln-Gly-Ala-Arg；(3)Leu-Gln-Gly-Met；(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。该抗氧化肽可以通过多肽仪化学方法合成，也可以通过将胶原蛋白水解，然后将获得的水解产物分离纯化而得。所述的抗氧化肽的抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。

综上所述，上述两篇专利申请公开的抗氧化肽都是从胶原蛋白中提取获得的，而这些胶原蛋白从猪、牛、鸡、鱼、火鸡等动物中提取，因此原料有限，所述的提取方法很复杂。而现有技术并没有公开以植物蛋白粉为原料提取抗氧化肽的方法，因此，研究人员以此为出发点，进行研究，得到本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工业用大麻籽蛋白抗氧化肽的制备方法，该方法以一种来源丰富、价格低廉的工业大麻籽粕为原料，提供一种条件温和、操作简单的工艺流程，且所制备的蛋白肽抗氧化活性较强、纯度较高。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种工业用大麻籽蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的方法包括：

(1)以工业用大麻籽为原料，制备工业用大麻籽蛋白；

(2)在工业用大麻籽蛋白中加入蛋白酶进行酶解，得到工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液；

(3)将步骤(2)所得的抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行脱盐，将洗脱液浓缩和冷冻干燥后得到所述的工业用大麻籽抗氧化多肽。

本发明所述的步骤(3)包括：

将步骤(2)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行静态脱盐，在150～300r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，搅拌后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，再加体积百分比为70％～85％乙醇溶液洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥；优选搅拌的时间为3-8小时。

本发明所述的步骤(2)包括：

称取工业用大麻籽蛋白，加入去离子水搅拌均匀，在80～90℃的条件下进行预处理，然后降温，用NaOH溶液调pH至8.0～9.5，按酶和底物重量比为0.5～3％加入蛋白酶，控制反应体系的pH值8.0～9.5，反应1-3h后，在85～100℃灭酶，再用HCl溶液调节pH至6.8～7.2，最后经冷冻离心，取上清液进行浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。

本发明所述的步骤(2)包括：

按底物浓度50mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白于酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀，80～90℃预处理10～20min，再降温至50℃，用0.5-1.5mol/L NaOH调pH至8.0～9.5，按酶和底物重量比为0.5～3％加入蛋白酶，控制反应体系的pH值8.0～9.5，反应结束后，85～100℃灭酶5～10min，用0.5-1.5mol/L HCl调节pH至6.8～7.2，7000～10000r/min冷冻离心10～20min，上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。

本发明所述步骤(1)中的蛋白酶包括Alcalase 2.4L碱性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。

本发明所述的步骤(3)包括：将步骤(2)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行动态脱盐，采用的柱子条件：2.6×30cm；上样流速：1～2ml/min；水洗流速：1～2ml/min；乙醇洗脱流速：0.5～1ml/min；上样量：200～300mg，70％～85％乙醇洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥。

本发明所述步骤(3)中的大孔吸附树脂为DA201-C型树脂。

本发明所述工业用大麻籽蛋白的制备方法包括：

1)将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后的得到的麻仁在43℃，34Mpa的条件下萃取2小时，将油脂分离后的萃取产物进行粉碎，然后相同条件下再萃取2小时，CO₂超临界萃取后得到低温蛋白粕；

2)将低温蛋白粕进行粉碎，用60-100目筛过筛之后，在蛋白粕中加入8-11倍的40～50℃水，搅拌混合均匀，再用碱液调节pH值至8～10，保温搅拌20min，过滤去除不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品；

3)用稀盐酸溶液调节蛋白溶液粗品的pH值至4.5～5，沉淀之后，进行离心分离；离心分离后取沉淀，再用pH值为4.5～5的水洗涤3～4次，继续进行离心分离，取沉淀；在沉淀经均质后，用pH值为8～10的氢氧化钠溶液调节沉淀pH值至6～7，得到所述的浓缩蛋白溶液；

4)将上述浓缩蛋白溶液经过115-130℃高温瞬时灭菌，灭菌的时间为2-4s，之后进行喷雾干燥，得到工业用大麻籽分离蛋白。

本发明所述工业用大麻籽分离蛋白中蛋白纯度≥92％，总氨基酸含量≥85％。

本发明所述工业用大麻籽蛋白抗氧化肽在制备营养强化剂、保健品、动物食品、饮料和食品中的抗氧化剂或添加剂、化妆品或护肤品的应用。

本发明的技术方案：本发明涉及一种工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物的制备及其色谱分离纯化的方法，具体涉及以工业用大麻籽为原料，先制备工业用大麻籽蛋白，然后采用蛋白酶水解工业用大麻籽蛋白，采用DA201-C大孔吸附树脂进行脱盐，以DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率为指标，检测抗氧化肽的活性，其具体的制备方法包括：

(1)：按底物浓度50mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉于酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀，80～90℃预处理10～20min，迅速降温至50℃，用1.0mol/L NaOH调pH至8.0～9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为0.5～3.0％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为8.0-9.5值，反应1-3h后，85～100℃灭酶5～10min，添加1.0mol/L HCl溶液调节pH至6.8～7.2，7000～10000r/min冷冻离心10～20min，上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物粉剂。

本发明所述的工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物粉剂中粗蛋白含量≥88％，粗灰分含量≥6.5％，水分≥7％。

(2)将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化酶解物进行脱盐。

目前生物活性物质的脱盐方法主要有透析、超滤和纳滤等，但是这些方法对小分子物质脱盐效果不佳或无法实现，尽管电渗析可以用于小分子物质的脱盐，但是回收率不高、能源消耗大。吸附色谱法是最有可能对小分子有机物质进行脱盐的方法，它是根据溶质在吸附剂表面上的吸附强度不同而对溶质进行分离。其中大孔吸附树脂对多肽具有选择性吸附，用乙醇等有机溶剂洗脱也较为方便。

大孔吸附树脂是非离子型高分子多孔性吸附剂，是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构，在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，在整个颗粒内部及外部都具有表面活性，它对化合物的吸附作用主要是基于化合物的疏水基团与非极性吸附剂之间的范德华引力，这样就可以对不同极性的化合物进行分离，同时也可通过本身的多孔网状孔穴结构对分子大小不同的化合物加以筛选。由于树脂与被分离成分之间的吸附为物理吸附，被吸附的物质较易洗脱，并具有成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点，因此大孔吸附树脂分离技术现已大量用于环保、化工、医药和食品行业。本发明通过多种大孔吸附树脂的性能比较，采用DA201-C大孔吸附树脂对进行工业用大麻籽抗氧化多肽酶解物进行脱盐。

静态脱盐方法：将步骤(1)所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化酶解液，采用DA201-C大孔树脂静态脱盐。在150～300r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽，搅拌3～8小时后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加70％～85％乙醇洗脱。静态脱盐，树脂吸附量250～360mg/g干树脂，脱盐率为85％～90％。

或采用大孔吸附树脂进行动态脱盐：

本发明上样200～300mg，用去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加70％～85％乙醇洗脱。采用的柱尺寸：2.6×30cm；上样流速：1～2ml/min；去离子水洗流速：1～2ml/min；70％～85％乙醇洗脱流速：0.5～1ml/min。动态吸附树脂吸附量20～35mg/g干树脂，脱盐率为90％～97％。

动态吸附具有脱盐彻底，洗脱液用量少和回收率高的优点，适于工业化生产使用。对同一浓度的上样溶液，若吸附流速过大，被吸附物质来不及扩散到树脂的内表面就提早泄露而造成样品流失，树脂的吸附量就会下降；但吸附流速过小，吸附时间就会延长。确定最佳的吸附流速通常应综合考虑树脂的吸附效果和工作效率。解吸流速一般都比吸附流速慢一倍以上。

(3)将步骤(2)所得体积百分比为70％～85％乙醇洗脱液，在45～60℃的条件下进行旋转蒸发浓缩，冷冻干燥：所述的冷冻干燥利用LABCONco.6L Freeze Dry System进行，其真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h。旋转蒸发所得乙醇可回收利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，这些都是常规的检测方法。具体步骤如下：

①DPPH自由基清除能力的测定

将酶解产物配成一定浓度的溶液，另配制浓度为1×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液，避光保存。取2mL试样与2mL DPPH无水乙醇溶液混合，并剧烈振荡，在室温下反应30min，然后在517nm处测定吸光值Ai。空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。DPPH自由基的清除率用下式计算：

式中：A0-对照组吸光度；Ai-样品组吸光度；Aj-空白组吸光度。

②超氧阴离子自由基清除能力的测定

恒温25℃下，取50mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液3mL(其中含1mmol/L的EDTA)，50mmol/L邻苯三酚10μL，迅速混匀，置于1em石英比色皿中，在325nm处每隔30s测定吸光度一次，反应4.5min结束，以吸光度对时间作图，求得斜率即为邻苯三酚自氧化速率为A0。在3mL pH 8.250mmol/L的Tris-HCl缓冲液中加适量酶解产物，用上述方法测样品325nm处的邻苯三酚自氧化速率As。清除率按下式计算：

③羟基自由基清除能力的测定

取0.1mL的FeSO4-EDTA混合液(10mmol/mL)于试管中，加入0.3mL 2-脱氧核糖(10mmol/mL)，然后加入0.2mL一定浓度的酶解产物，用pH 7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液定容至1.9mL，再加入0.1mL H₂O₂(10mmol/mL)，混匀后置于37℃恒温水浴中反应1h。之后加入1mL 2.8％(w/w)三氯乙酸(TCA)溶液和1mL 1.0％(w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混匀，沸水浴中反应15min，冷却后在532nm处测定吸光度值。

不加入清除剂时的吸光度为Ac，加入样品后若有清除·OH作用，则能抑制氧化产物的生成，其吸光度减少，测得吸光度为As，实际空白吸光以A₀表示，则清除能力下式计算：

IC₅₀表示自由基清除率为50％时的样品浓度。

(5)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。

脱盐酶解产物的氨基酸组成

氨基酸简称	脱盐后氨基酸含量(g/100g)	氨基酸简称	脱盐后氨基酸含量(g/100g)
				天冬氨酸Asp	10.05	蛋氨酸Met	2.14
谷氨酸Glu	17.65	苯丙氨酸Phe	4.12
				丝氨酸Ser	4.36	异亮氨酸Ile	3.69
组氨酸His	2.79	亮氨酸Leu	7.05
				甘氨酸Gly	3.11	赖氨酸Lys	2.37
苏氨酸Thr	2.29	脯氨酸Pro	4.56
				精氨酸Arg	10.08	色氨酸Trp
丙氨酸Ala	3.19	疏水性氨基酸	34.47
				酪氨酸Tyr	4.08	必需氨基酸	23.17
半胱氨酸Cys-s	2.31	总氨基酸	87.83
				缬氨酸Val	5.64

氨基酸组成测定方法：HPLC法，具体步骤为：将60mg至100mg工业用大麻籽抗氧化多肽置于水解管中，加入6mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24h，冷却后定容、过滤、蒸干，再加入0.02mol/L的HCl溶液，在空气中放置30min，采用Agilent1100液相色谱仪测定氨基酸的含量。

(6)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。

相对分子质量分布的测定方法：采用高效液相排阻色谱(high performance sizeexclusion chromatography，HPSEC)法。

仪器：Waters 600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器(波长220nm)和M 32工作站)；

色谱柱：TSKgel 2000 SWXL 300nm×7.8mm

流动相体积比：乙醇∶水∶氯乙酸＝45∶54∶1；

检测波长：220nm；

流量：0.5mL/min；

柱温：30℃；

样品制备：吸取样品2mL于10mL容量瓶中，用流动相稀释到刻度，用微孔过滤膜过滤后进样。

(7)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为15％～20％。

蛋白质水解度(DH)是指在蛋白质水解反应过程中被裂解的肽键占蛋白质总肽键的百分数。

在碱性或中性条件下水解时，DH的测定采用pH-Stat法：

蛋白质在水解时总是伴随着质子的释放与吸收，这个反应发生在中性和微碱性介质中，如果反应时pH在氨基和羧基的pK值范围之外，而反应体系要维持pH恒定，则必须随时加入一定量的酸或碱。pH一定时，加碱物质的量与水解肽链物质的量成正比关系，比例常数即为NH4⁺的解离常数α。记录不同时刻为维持反应体系pH恒定而消耗的碱液的毫升数，消耗的碱的量即为表征蛋白质水解的程度。这种方法的优点是不变性。由于它的简单、快速和可重复性，通常被用于水解度的在线测定。

式中：B——碱液体积/L；

      N_b——碱液的浓度/mol·L^-1；

      α——氨基的解离度，可查表得；

      Mp——底物中蛋白质总量/g；

      h_tot——底物中蛋白质肽键总数/mol·g^-1蛋白质(h_tot＝8.0)。

本发明所述的工业用大麻籽蛋白的制备方法包括：

1、将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后的得到的麻仁在43℃，34Mpa的条件下萃取2小时，将油脂分离后的萃取产物进行粉碎，然后相同条件下再萃取2小时，CO₂超临界萃取后得到低温蛋白粕。

以上步骤涉及的是工业用大麻籽CO2超临界萃取提取油脂的方法。经过筛选分级之后，选出质量优良的工业用大麻籽，然后进行机械砻碾脱壳，为之后的提取油脂作好充分的准备。工业用大麻籽中蛋白质含量为25～35％，油脂含量为25～35％。由于蛋白质在高温条件下容易变性，因此本发明采用CO2超临界萃取方法提取油脂，工艺过程温度低，效率高，得到的蛋白粕中油脂含量＜2％。

2、将低温蛋白粕进行粉碎，用60-100目筛过筛之后，在蛋白粕中加入8-11倍的40～50℃水，搅拌混合均匀，再用碱液调节pH值至8～10，保温搅拌20min，过滤去除不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品；

经过上述步骤(1)处理过的低温蛋白粕中残油率很低，将所述低温蛋白粕用粉碎机进行粉碎，目的是为了使液料(包括水和碱液)与物料充分混合，增大接触面积，使蛋白粕中的蛋白质提取比较完全。过筛是为了让物料颗粒保持一致，同时将蛋白粕中粗大的部分筛选出来，避免对后续浓缩蛋白溶液的制备造成影响。

该步骤中所述的碱液为氢氧化钠溶液、亚硫酸钠溶液和亚硫酸氢钠溶液中的一种，所述碱液的质量百分比浓度为20-30％，选择上述浓度的碱液既可以避免加入碱液时局部碱性强pH值过高而导致蛋白变性，同时也能兼顾具体的调节pH值的时间，提高蛋白粉的生产效率。

3、用稀盐酸溶液调节蛋白溶液粗品的pH值至4.5～5，沉淀之后，进行离心分离；离心分离后取沉淀，再用pH值为4.5～5的水洗涤3～4次，继续进行离心分离，取沉淀；在沉淀经均质后，用pH值为8～10的氢氧化钠溶液调节沉淀pH值至6～7，得到所述的浓缩蛋白溶液。

该步骤中所述的稀盐酸溶液为浓度为2mol/L的盐酸溶液，离心分离转速为3000～4000r/min，离心时间为10～20min。经过这一步骤处理之后，浓缩蛋白液中的蛋白的质量百分比浓度为70-75％。该步骤能最大程度的将蛋白质沉淀下来，从而提高产品的蛋白浓度。

本发明所述的均质是指经管道解碎器(用于解碎大颗粒不易分散的物料)粉碎后加7-10倍水进行溶解，然后在20-25MPa的压力下均质。在用稀盐酸溶液调节蛋白溶液的pH值至4.5～5，沉淀之后，进行离心分离；离心分离后取沉淀，再用pH值为4.5～5的水洗涤3～4次，继续进行离心分离，这样更能去除蛋白溶液中杂质，进而提高蛋白溶液的浓度。本发明中用pH值为4.5～5的水洗涤沉淀，脱除盐分，洗涤次数为3～4次，而现有技术中一般提取蛋白质的方法中一般选用清水进行洗涤，本发明这样处理的目的在于保持酸性环境，令已经沉淀的蛋白不重新溶解，用一般清水因为清水的pH在6.5左右，容易导致蛋白重新溶解，降低得率。

4、将上述浓缩蛋白溶液经过115-130℃高温瞬时灭菌，灭菌的时间为2-4s，之后进行喷雾干燥，得到工业用大麻籽分离蛋白粉。所述工业用大麻籽分离蛋白粉中蛋白纯度≥92％，总氨基酸含量≥85％。

本发明所述的高温瞬时灭菌，既不会使蛋白质变性，同时能对蛋白溶液进行杀菌，由于上述工业用大麻籽分离蛋白粉中含有人体所需的八种氨基酸，所述蛋白粉应用于食品、保健品行业中，所以这一步的进行显得非常重要。最后，将高温瞬时灭菌后的浓缩蛋白溶液采用喷雾干燥法进行干燥，得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

本发明通过上述制备方法制备得到的工业用大麻籽分离蛋白粉中蛋白质纯度≥92％；水分≤8％；灰分≤6％；脂肪≤0.5％，细度(过80～120目筛)≥98％；菌落总数≤30000cfu/g；大肠杆菌≤30MPN/100g，NSI(氮溶解指数)≥30％。上述分离蛋白粉，按照制作保健功能食品的技术工艺需要适量添加，制成系列保健食品，也可以作为蛋白添加剂，应用于制作冰淇淋、饮料、糕点、麦片等食品领域中。

本发明的有益效果：本发明提供的工业用大麻籽蛋白抗氧化肽产品，是一种来自天然蛋白的酶解物，清除自由基能力很强，适用于运动饮料、营养强化剂、婴幼儿食品、味精等调味品添加剂、面包蛋糕等抗氧化剂；可作为抗氧化剂添加至化妆品、护肤品、日常护理用品；可直接食用或作为动物饲料；可应用于医药领域等。

本发明所提供的工业用大麻籽蛋白抗氧化肽的制备方法，其制备流程简单，实用性强，采用有效的分离纯化途径得到纯度较高的工业用大麻籽抗氧化活性多肽，具有较好的应用前景。本发明对于促进工业用大麻产品的深加工及综合利用，研究和开发功能性食品配料，解决三农问题都具有重要的意义。

附图说明

图1工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布

具体实施方式

实施例1-5涉及工业用大麻籽蛋白粉的制备

实施例1

将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后得到的麻仁进行二氧化碳超临界萃取，在43℃，34MPa条件下萃取2小时，提取油脂后将萃取产物粉碎，在上述条件下再萃取2小时，提取油脂之后得到工业用大麻籽低温蛋白粕。所述工业用大麻籽低温蛋白粕中，残油率1.5％。将得到的低温蛋白粕利用粉碎机进行粉碎，过60目筛，取过筛之后的蛋白粕10kg，加入100kg 50℃的温水，搅拌均匀，用质量百分比浓度为30％的NaOH溶液调节pH值至9.5，保温搅拌15分钟，真空抽滤除去不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品。将上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀盐酸调节pH值至4.5，待沉淀之后，离心分离取沉淀，再用pH值为4.5的水洗涤4次，离心分离取沉淀，所述离心分离时转速为4000r/min，离心时间为15分钟。将沉淀采用管道破碎机进行破碎后在52℃下，25MPa的压力下均质，再用pH值为8的NaOH溶液调节沉淀pH值至6.5，得到浓缩蛋白液，将浓缩蛋白液经过115℃高温瞬时灭菌，灭菌时间为2s，再进行喷雾干燥法进行干燥后得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

样品经检测，蛋白质含量为94.0％，总氨基酸含量为93.2％，水分2.8％，脂肪0.25％，灰分2.95％；细度(过80～120目筛)98％；菌落总数15000cfu/g；大肠杆菌20MPN/100g，NSI(氮溶解指数)32.91％。

实施例2

将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后得到的麻仁进行二氧化碳超临界萃取，在43℃，34MPa条件下萃取2小时，提取油脂后将萃取产物粉碎，在上述条件下再萃取2小时，提取油脂之后得到工业用大麻籽低温蛋白粕。所述工业用大麻籽低温蛋白粕中，残油率1.2％。将得到的低温蛋白粕利用粉碎机进行粉碎，过80目筛，取过筛之后的蛋白粕10kg，加入80kg 45℃的温水，搅拌均匀，用质量百分比浓度为25％的亚硫酸钠溶液调节pH值至8，保温搅拌25分钟，真空抽滤除去不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品。将上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀盐酸调节pH值至4.8，待沉淀之后，离心分离取沉淀，再用pH值为4.8的水洗涤3次，离心分离取沉淀，所述离心分离时转速为3000r/min，离心时间为20分钟。将沉淀采用管道破碎机进行破碎后在55℃下，22MPa的压力下均质，再用pH值为9的NaOH溶液调节沉淀pH值至6.5，得到浓缩蛋白液，将浓缩蛋白液经过115℃高温瞬时灭菌，灭菌时间为2S，再进行喷雾干燥后得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

样品经检测，蛋白质含量为90.8％，总氨基酸含量为90.1％，水分5.8％，脂肪0.35％，灰分3.05％；细度(过80～120目筛)98％；菌落总数15000cfu/g；大肠杆菌20MPN/100g，NSI(氮溶解指数)34.28％。

实施例3

将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后得到的麻仁进行二氧化碳超临界萃取，在43℃，34MPa条件下萃取2小时，提取油脂后将萃取产物粉碎，在上述条件下再萃取2小时，提取油脂之后得到工业用大麻籽低温蛋白粕。所述工业用大麻籽低温蛋白粕中，残油率1.8％。将得到的低温蛋白粕利用粉碎机进行粉碎，过100目筛，取过筛之后的蛋白粕10kg，加入110kg 48℃的温水，搅拌均匀，用质量百分比浓度为28％的NaOH溶液调节pH值至10，保温搅拌，真空抽滤除去不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品。将上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀盐酸调节pH值至4.9，待沉淀之后，离心分离取沉淀，再用pH值为4.9的水洗涤4次，离心分离取沉淀，所述离心分离时转速为3500r/min，离心时间为20分钟。将沉淀采用管道破碎机进行破碎后在55℃下，22MPa的压力下均质，用pH值为10的NaOH溶液调节沉淀pH值至7，得到浓缩蛋白液，将浓缩蛋白液经过125℃高温瞬时灭菌，灭菌时间为4s，再进行喷雾干燥后得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

样品经检测，蛋白质含量为92.5％，总氨基酸含量为93.2％，水分4.6％，脂肪0.5％，灰分2.4％；细度(过80～120目筛)98％；菌落总数15000cfu/g；大肠杆菌20MPN/100g，NSI(氮溶解指数)35.04％。

实施例4

将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后得到的麻仁进行二氧化碳超临界萃取，在43℃，34MPa条件下萃取2小时，提取油脂后将萃取产物粉碎，在上述条件下再萃取2小时，提取油脂之后得到工业用大麻籽低温蛋白粕。所述工业用大麻籽低温蛋白粕中，残油率1.2％。将得到的低温蛋白粕利用粉碎机进行粉碎，过100目筛，取过筛之后的蛋白粕10kg，加入90kg 50℃的温水，搅拌均匀，用质量百分比浓度为30％的亚硫酸氢钠溶液调节pH值至9.5，保温搅拌，真空抽滤除去不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品。将上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀盐酸调节pH值至5.0，待沉淀之后，离心分离取沉淀，再用pH值为5.0的水洗涤4次，离心分离取沉淀。将沉淀采用管道破碎机进行破碎后在55℃下，22MPa的压力下均质，用pH值为8的NaOH溶液调节沉淀pH值至6.5，得到浓缩蛋白液，将浓缩蛋白液经过115℃高温瞬时灭菌，灭菌时间为2S，再进行喷雾干燥后得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

样品经检测，蛋白质含量为93.0％，总氨基酸含量为92.4％，水分3.5％，脂肪0.4％，灰分3.1％；细度(过80～120目筛)98％；菌落总数15000cfu/g；大肠杆菌8MPN/100g，NSI(氮溶解指数)34.67％。

实施例5

将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后得到的麻仁进行二氧化碳超临界萃取，在43℃，34MPa条件下萃取2小时，提取油脂后将萃取产物粉碎，在上述条件下再萃取2小时，提取油脂之后得到工业用大麻籽低温蛋白粕。所述工业用大麻籽低温蛋白粕中，残油率1.6％。将得到的低温蛋白粕利用粉碎机进行粉碎，过60目筛，取过筛之后的蛋白粕10kg，加入100kg 50℃的温水，搅拌均匀，用质量百分比浓度为30％的NaOH溶液调节pH值至9.5，保温搅拌，真空抽滤除去不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品。将上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀盐酸调节pH值至4.5，待沉淀之后，离心分离取沉淀，再用pH值为4.5的水洗涤4次，离心分离取沉淀。将沉淀采用管道破碎机进行破碎后在55℃下，22MPa的压力下均质，用pH值为8的NaOH溶液调节沉淀pH值至6.5，得到浓缩蛋白液，将浓缩蛋白液经过120℃高温瞬时灭菌，灭菌时间为3s，再进行喷雾干燥后得到工业用大麻籽分离蛋白粉。

样品经检测，蛋白质含量为93.5％，总氨基酸含量为92％，水分2.3％，脂肪0.3％，灰分3.9％；细度(过80～120目筛)99％；菌落总数10000cfu/g；大肠杆菌15MPN/100g，NSI(氮溶解指数)31.85％。

实施例6-10涉及工业用大麻籽抗氧化多肽的制备

实施例6

(1)：按底物浓度50mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉100g于酶反应器中，加入2L去离子水进行搅拌均匀，80℃预处理20min，迅速降温至50℃，用1.0mol/LNaOH调pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为3.0％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为8.0值，反应结束后，在100℃灭酶5min，添加1.0mol/L HCl调pH至7.2，在7000r/min冷冻离心20min，上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备酶解物粉剂。

(2)：将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解物静态脱盐方法：将步骤(1)所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，采用DA201-C大孔树脂静态脱盐。在150r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽，搅拌3小时后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加70％乙醇洗脱。静态脱盐，树脂吸附量260mg/g干树脂，脱盐率为85.75％。

(3)将步骤(2)所得70％乙醇洗脱液，在45℃的条件下将所述乙醇洗脱液进行旋转蒸发浓缩，再进行冷冻干燥，冷冻干燥：LABCONco.6L Freeze Dry System真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h，得到所述的抗氧化肽36克。旋转蒸发所得乙醇可回收再利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其IC₅₀分别为2.75mg/ml，3.05mg/ml，7.70mg/ml；测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为17％。

实施例7

(1)：按底物浓度45mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉90克于酶反应器中，加入2L去离子水进行搅拌均匀90℃预处理10min，迅速降温至50℃，用1.0mol/L NaOH调pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为0.5％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为9.0值，反应结束后，在85℃灭酶10min，添加1.5mol/L HCl调pH至6.8，在10000r/min冷冻离心10min，将得到的上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备酶解物粉剂。

(2)：将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液进行动态脱盐：所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用DA201-C大孔树脂动态脱盐，上样300mg，用去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加85％乙醇洗脱。采用的柱尺寸：2.6×30cm；上样流速：1ml/min；去离子水洗流速：1ml/min；75％乙醇洗脱流速：0.5ml/min。动态吸附树脂吸附量35mg/g干树脂，脱盐率为97％。

(3)将步骤(2)所得75％乙醇洗脱液，在60℃的条件下将所述乙醇洗脱液进行旋转蒸发浓缩，再进行冷冻干燥，冷冻干燥：LABCONco.6L Freeze Dry System真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h，得到所述的抗氧化肽55克。旋转蒸发所得乙醇可回收利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其IC₅₀分别为2.95mg/ml，3.25mg/ml，7.82mg/ml；测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分别为10.05g/100g、17.65g/100g和10.08g/100g。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为18％。

实施例8

(1)：按底物浓度55mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉110克于酶反应器中，加入2L去离子水进行搅拌均匀90℃预处理10min，迅速降温至50℃，用1.0mol/LNaOH调pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为1.5％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为9.5值，反应结束后，在95℃灭酶8min，添加1.0mol/L HCl溶液调节pH至7.0，在9000r/min冷冻离心12min，将得到的上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备酶解物粉剂。

(2)：将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液进行动态脱盐：所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化酶解液，采用DA201-C大孔树脂动态脱盐，上样200mg，用去离子水，洗至电导率与水接近，加70％～85％乙醇洗脱。采用的柱尺寸：2.6×30cm；上样流速：1.5ml/min；去离子水洗流速：1.5ml/min；80％乙醇洗脱流速：1ml/min。动态吸附树脂吸附量20mg/g干树脂，脱盐率为90％。

(3)：将步骤(2)所得80％乙醇洗脱液，在55℃的条件下将所述乙醇洗脱液进行旋转蒸发浓缩，再进行冷冻干燥，冷冻干燥：LABCONco.6L Freeze Dry System真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h，得到所述的抗氧化肽55～65克。旋转蒸发所得乙醇可回收利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其IC₅₀分别为2.85mg/ml，3.36mg/ml，7.33mg/ml；测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分别为10.34g/100g、17.88g/100g和10.36g/100g。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为15％。

实施例9

(1)：按底物浓度48mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉96克于酶反应器中，加入2L去离子水进行搅拌均匀90℃预处理10min，迅速降温至50℃，用1.2mol/L NaOH调pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为2.5％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为8.5值，反应结束后，在95℃灭酶10min，添加1.2mol/L HCl调pH至7.1，在8500r/min冷冻离心15min，将得到的上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备酶解物粉剂。

(2)：将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液进行动态脱盐：所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用DA201-C大孔树脂动态脱盐，上样250mg，用去离子水，洗至电导率与水接近，加70％～85％乙醇洗脱。采用的柱尺寸：2.6×30cm；上样流速：1～2ml/min；去离子水洗流速：1～2ml/min；70％～85％乙醇洗脱流速：0.5～1ml/min。动态吸附树脂吸附量20～35mg/g干树脂，脱盐率为90％～97％。

(3)将步骤(2)所得70％～85％乙醇洗脱液，在50℃的条件下将所述乙醇洗脱液进行旋转蒸发浓缩，再进行冷冻干燥，，冷冻干燥：LABCONco.6L Freeze Dry System真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h。旋转蒸发所得乙醇可回收利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其IC₅₀约为2.75mg/ml，3.05mg/ml，7.70mg/ml；测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分别为10.05g/100g、17.65g/100g和10.08g/100g。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为20％。

实施例10

(1)：按底物浓度50mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白粉100克于酶反应器中，加入2L去离子水进行搅拌均匀，88℃预处理12min，迅速降温至50℃，用1.2mol/LNaOH调pH至8.5，按酶和底物重量比([E]/[S])为2.0％加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反应体系的pH为8.3值，反应结束后，在100℃灭酶5min，添加1.2mol/L HCl调pH至7.2，在8500r/min冷冻离心18min，上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷冻干燥制备酶解物粉剂。

(2)：将步骤(1)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解物静态脱盐方法：将步骤(1)所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，采用DA201-C大孔树脂静态脱盐。在300r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽，搅拌8小时后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加85％乙醇洗脱。静态脱盐，树脂吸附量60mg/g干树脂，脱盐率为90％。

(3)将步骤(2)所得85％乙醇洗脱液，在45℃的条件下将所述乙醇洗脱液进行旋转蒸发浓缩，再进行冷冻干燥，冷冻干燥：LABCONco.6L Freeze Dry System真空度＜0.12mPa；冷阱温度：-45℃；冻干温度：第一阶段，-30℃1h；第二阶段，-8℃24h；第三阶段，-4℃8h；第四阶段，25℃3h，得到所述的抗氧化肽60克。旋转蒸发所得乙醇可回收利用。

(4)测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其IC₅₀分别为2.80mg/ml，3.43mg/ml，7.50mg/ml；测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸组成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350～2000Da。测定步骤(3)所得工业用大麻籽抗氧化多肽的水解度为17％。

Claims (10)

1、一种工业用大麻籽抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)以工业用大麻籽为原料，制备工业用大麻籽蛋白；

(2)在工业用大麻籽蛋白中加入蛋白酶进行酶解，得到工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液；

(3)将步骤(2)所得的抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行脱盐，将洗脱液浓缩和冷冻干燥后得到所述的工业用大麻籽抗氧化多肽。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)包括：将步骤(2)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行静态脱盐，在150～300r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，搅拌后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，再加体积百分比为70％～85％乙醇溶液洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥；优选搅拌的时间为3-8小时。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括：

称取工业用大麻籽蛋白，加入去离子水搅拌均匀，在80～90℃的条件下进行预处理，然后降温，用NaOH溶液调pH至8.0～9.5，按酶和底物重量比为0.5～3％加入蛋白酶，控制反应体系的pH值8.0～9.5，反应1-3h后，在85～100℃灭酶，再用HCl溶液调节pH至6.8～7.2，最后经冷冻离心，取上清液进行浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括：

按底物浓度45-55mg/mL，优选所述浓度为50mg/mL，称取工业用大麻籽蛋白于酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀，80～90℃预处理10～20min，再降温至50℃，用0.5-1.5mol/L NaOH溶液调pH至8.0～9.5，按酶和底物重量比为0.5～3％加入蛋白酶，控制反应体系的pH值8.0～9.5，反应结束后，85～100℃灭酶5～10min，用0.5-1.5mol/L HCl调节pH至6.8～7.2，7000～10000r/min冷冻离心10～20min，上清液浓缩，得到的溶液即为工业用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。

5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的蛋白酶包括Alcalase 2.4L碱性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。

6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)包括：将步骤(2)所得的工业用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附树脂进行动态脱盐，采用的柱子条件：2.6×30cm；上样流速：1～2ml/min；水洗流速：1～2ml/min；乙醇洗脱流速：0.5～1ml/min；上样量：200～300mg，70％～85％乙醇洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后即得所述的工业用大麻籽抗氧化多肽；所述的树脂优选为DA201-C型树脂。

7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)包括：将步骤(1)所得的工业用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用大孔树脂静态脱盐，在150～300r/min转速下，加入工业用大麻籽蛋白抗氧化肽，搅拌3～8小时后，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加70％～85％乙醇洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后即得所述的工业用大麻籽抗氧化肽；所述的树脂优选为DA201-C型树脂。

8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工业用大麻籽蛋白的制备方法包括：

1)将工业用大麻籽筛选除去杂质后进行分级，然后机械砻碾脱壳；脱壳后的得到的麻仁在43℃，34Mpa的条件下萃取2小时，将油脂分离后的萃取产物进行粉碎，然后相同条件下再萃取2小时，CO₂超临界萃取后得到低温蛋白粕；

2)将低温蛋白粕进行粉碎，用60-100目筛过筛之后，在蛋白粕中加入8-11倍的40～50℃水，搅拌混合均匀，再用碱液调节pH值至8～10，保温搅拌20min，过滤去除不溶性杂质，获得蛋白溶液粗品；

3)用稀盐酸溶液调节蛋白溶液粗品的pH值至4.5～5，沉淀之后，进行离心分离；离心分离后取沉淀，再用pH值为4.5～5的水洗涤3～4次，继续进行离心分离，取沉淀；在沉淀经均质后，用pH值为8～10的氢氧化钠溶液调节沉淀pH值至6～7，得到所述的浓缩蛋白溶液；

4)将上述浓缩蛋白溶液经过115-130℃高温瞬时灭菌，灭菌的时间为2-4s，之后进行喷雾干燥，得到工业用大麻籽分离蛋白。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述工业用大麻籽分离蛋白中蛋白纯度≥92％，总氨基酸含量≥85％。

10、根据权利要求1所述工业用大麻籽抗氧化肽在制备营养强化剂、保健品、动物食品、饮料和食品中的抗氧化剂或添加剂、化妆品或护肤品的应用。

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