CN104131059A

CN104131059A - 一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽及其酶解制备方法与应用

Info

Publication number: CN104131059A
Application number: CN201410374772.1A
Authority: CN
Inventors: 吴晖; 任尧; 梁凯
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开了具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，包括：将汉麻籽粕干燥，粉粹成粉末，加入水均匀搅拌，pH调至8.0~10.5，温度调至30~80℃，匀速搅拌0.5h~2h，离心，上清液pH调至3~6，得蛋白沉淀；将蛋白加水溶解，比例为2~7g：100mL，pH调至7.0~9.5，再加入碱性蛋白酶，蛋白重量与该酶酶活之比0.1~5：1000，温度50~75℃，时间1~4h；将酶解液通过大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶柱分离纯化，收集干燥，得α-葡萄糖苷酶抑制活性肽粉。本发明为α-葡萄糖苷酶抑制活性物质增加了新来源，实现了原料的充分利用，具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点。

Description

一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽及其酶解制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽及其酶解制备方法与应用。

背景技术

汉麻，又称火麻，在人类历史发展上发挥着重要的作用，是制造纸张、服装、绳索等的重要原料。汉麻籽是汉麻加工后的重要副产物，也是一种珍贵的药食同源物质，含有丰富的蛋白质、卵磷脂、亚麻酸、维生素以及钙、铁等人体必需的矿物质元素，是营养的重要来源；对便秘、高血脂、高血压、糖尿病及肠胃病等均有良好的预防作用，是长寿之乡——巴马县——百岁老人长期食用的“天然保健品”。

目前，我国大部分汉麻产区将汉麻籽作为油料，仅用于提取汉麻籽油，而含有丰富蛋白质、氨基酸的汉麻籽粕则被废弃为饲料和肥料，从而导致汉麻籽资源的浪费，汉麻籽粕没有得到充分利用。本发明采用可控酶解的方法，通过生物蛋白酶对汉麻籽粕蛋白进行酶解催化作用，有可能把其中所隐藏的抑制α-葡萄糖苷酶活性肽片段释放出来，从而制备具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽。汉麻作为一种天然产物植物来源，来源广泛，如能提取出较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽来降低部分人群体内的血糖含量，对于汉麻籽粕的废物利用以及丰富降血糖多肽资源、防治糖尿病及并发症具有广阔的市场经济效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽及其酶解制备方法与应用。本发明方法能够实现原料的高效利用，具有高活性、高安全、简单可控、环境温和的制备特点。

本发明的目的由以下方案实现：

一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，包括如下步骤：

(1)取汉麻籽粕干燥至含水量3％以下，粉碎成细粉；

(2)干粉与水的比例为5～20g：100mL，将汉麻籽粕溶液pH调至8.0～10.5，温度调至30～80℃，以100～300r/min的速度均匀搅拌0.5h～2h加速溶解，然后取上清液。将上清液pH调至3～6，离心，将沉淀冷冻干燥，制得汉麻籽粕蛋白。

(3)将汉麻籽粕蛋白加水溶解，汉麻籽粕蛋白与水的比例为2～7g：100mL，控制pH值在7.5～9.5，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，蛋白酶与全蝎蛋白重量之比：0.1～5：1000，反应温度为50～75℃，以100～300r/min匀速搅拌1～4h；煮沸10min，灭酶活，结束反应。10000r/min离心，收集上清液，干燥，得到粗多肽粉末。

(4)大孔吸附树脂装柱：根据层析柱体积称取适量填料DA201-C进行预处理，反复倾倒上清液除去悬浮破碎颗粒，将填料加入层析柱，层析柱规格2.6×30cm，待稳定后，用3倍柱体积去离子水洗脱液(条件与洗脱时的相同)冲柱。

(5)多肽粉加水溶解，倒入DA201-C大孔吸附树脂交换柱，以0～100％不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集洗脱液，目的在于将粗多肽分离纯化，去除色素及其它杂质，富集75％乙醇洗脱下来小肽组分，干燥得到多肽粉末。

(6)葡聚糖凝胶装柱：根据层析柱体积称取适量填料Sephadex G-15进行预处理，反复倾倒上清液除去悬浮破碎颗粒，将填料加入层析柱，层析柱规格1.5×80cm，待稳定后，用3倍柱体积去离子水洗脱液(条件与洗脱时的相同)冲柱。

(7)多肽粉加水溶解，倒入Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱，以去离子水洗脱，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集洗脱液，目的在于将粗多肽进一步分离纯化，去除低活性肽，富集高活性的小肽组分，浓缩，干燥，得汉麻籽粕多肽粉末。

(8)汉麻籽粕多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性指标评价。采用α-葡萄糖苷酶抑制活性对多肽的降血糖进行体外活性评价。

优选地，所述的汉麻品种为汉麻Cannabis sativa L.。

优选地，所述碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶的活力为393235U/g。

优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述pH调至8.0～10.5，控制pH值在7.5～9.5具体为：用0.1～2.0mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调至所需pH值；所述将pH调至3～6，具体为：用0.1～2.0mol/L的盐酸(HCl)溶液将pH调至所需值。

优选地，汉麻籽粕蛋白重量与碱性蛋白酶酶活之比0.1～5：1000，优选0.2～4：1000。

优选地，步骤(5)中所述的以0～100％不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，具体为0％,25％,50％,75％,100％乙醇，所述富集为大孔吸附树脂交换柱中的75％乙醇洗脱组分。

优选地，步骤(7)中所述的富集高活性的小肽组分为第四洗脱组分。

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽，所述汉麻多肽的分子量范围为＜1000Da。

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的汉麻多肽应用于制备具有降血糖、预防糖尿病功效的功能性食品，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。

本发明的原理：在碱性条件下，以水解酶为催化剂，使汉麻籽粕蛋白进行水解，将酶解液进行分离纯化，以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标，制备得到汉麻籽活性多肽。

汉麻粕多肽产品以口服的形式进入体内，经人体消化酶：胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解消化，在小肠被吸收利用，发挥功效。

本发明所制备的汉麻酶解多肽液，可直接喷雾干燥，制成降血糖多肽粉，也可加入乳糖、甘露醇等，混合均匀，分装，冷冻干燥，制成冻干粉剂、片剂，也可制成口服液方便人体快速吸收，还可制成胶囊，直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高功效。

与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1.本发明提高了汉麻籽粕的生物活性利用率。选定简便可控的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，将汉麻蛋白进行酶解利用。蛋白质中肽链打开，获得小分子活性多肽。此蛋白酶相比于传统的催化用酶，具有高效的酶解能力，在较短时间内即可完成对底物蛋白的高度水解，方便针对任一水解段地目标多肽进行分离筛选，可控性高，相比传统的直接口服，水煮提药、醇提给药等提取方法更为高效，所得产品主要成分为多肽类，成分简单，安全可靠，能高效被人体吸收。

2.产品的活性高。本发明采用酶解法得到高α-葡萄糖苷酶抑制活性的酶解物，再通过分离纯化得到具有更高活性的多肽类，见表1和图1,2。当经过凝胶Sephadex G-15分离纯化后，所得多肽活性达到IC₅₀：0.11mg/mL，高于阳性对照阿卡波糖的IC₅₀值1.10mg/mL。

3.多肽为小分子肽类，分子量小于1000Da，见图3。进入人体被吸收后，可以直接穿过小肠壁进入血液高效发挥作用，稳定性高。

4.用途明确，可作为降血糖、防治糖尿病的原料，辅以乳糖、甘露醇等，制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。目前尚未发现有汉麻粕蛋白多肽应用于降血糖功能性食品的报道。

附图说明

图1为采用碱性蛋白酶对汉麻粕蛋白酶解所得不同水解度酶解物的活性比较；

图2为酶解产物过凝胶Sephadex G-15分离柱的分离峰图。

图3为经凝胶Sephadex G-15分离出的第四个组分的分子量分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

以下实施例中过大孔吸附树脂交换柱前，交换柱的处理步骤为称取填料DA201-C进行预处理，先用80％乙醇浸泡洗涤三次，去除上清液；再用蒸馏水同样浸泡洗涤三次，反复倾倒上清液除去悬浮破碎颗粒，将填料加入层析柱，层析柱规格2.6×30cm，待稳定后，用3倍柱体积去离子水洗脱液冲柱，流速控制在1.0mL/min。

过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱前，葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱的处理步骤为：称取填料Sephadex G-15进行预处理，反复倾倒上清液除去悬浮破碎颗粒，将填料加入层析柱，层析柱规格1.5×80cm，待稳定后，用3倍柱体积去离子水洗脱液冲柱，流速控制在0.3mL/min。

实施例1

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为5g:100mL，pH调至10，温度调至50℃，以200r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4，得到蛋白沉淀，将其pH调至6.5，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为7g：100mL，控制pH值在8.0，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比0.5:1000，反应温度为55℃，搅拌速度为100r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.53mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例2

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为10g:100mL，pH调至9.5，温度调至40℃，以250r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为5g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比2:1000，反应温度为65℃，搅拌速度为150r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.36mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例3

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为15g:100mL，pH调至10，温度调至55℃，以100r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调至4.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.8，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为4g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比0.1～5:1000，反应温度为50～75℃，搅拌速度为200r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.11mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例4

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为20g:100mL，pH调至10.5，温度调至40℃，以200r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.5，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为4g：100mL，控制pH值在8.8，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比0.3:1000，反应温度为55℃，搅拌速度为250r/min，反应时间3.8h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.26mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例5

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为5g:100mL，pH调至10，温度调至45℃，以150r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为6g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比1:1000，反应温度为65℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3.6h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.42mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例6

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为8g:100mL，pH调至9.5，温度调至55℃，以200r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.8，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为4g：100mL，控制pH值在8.6，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比3.5:1000，反应温度为60℃，搅拌速度为220r/min，反应时间3.8h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.25mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例7

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为15g:100mL，pH调至10，温度调至35℃，以120r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为3.5g：100mL，控制pH值在8.2，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比2:1000，反应温度为55℃，搅拌速度为180r/min，反应时间3.7h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.56mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例8

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为20g:100mL，pH调至9.2，温度调至45℃，以200r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.8，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为3.5g：100mL，控制pH值在9.0，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比3.5:1000，反应温度为60℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3.9h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.68mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例9

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为10g:100mL，pH调至9.0，温度调至40℃，以250r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为4g：100mL，控制pH值在8.0，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比4:1000，反应温度为60℃，搅拌速度为100r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.45mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例10

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为16g:100mL，pH调至10，温度调至50℃，以120r/min的速度均匀搅拌1.5h，取上清液，再将pH调至4.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.8，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为5g：100mL，控制pH值在8.6，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比2.5:1000，反应温度为55℃，搅拌速度为200r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.22mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例11

取500g汉麻籽粕干粉，干粉与水的比例为10g:100mL，pH调至9.0，温度调至40℃，以200r/min的速度均匀搅拌1.6h，取上清液，再将pH调至4.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至6.8，干燥，制得汉麻籽粕蛋白。将此蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为4g：100mL，控制pH值在8.2，再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，蛋白重量与该酶酶活之比2.5:1000，反应温度为55℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3.6h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂交换柱(DA201-C)，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，收集第四洗脱组分，冷冻干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性为IC₅₀：0.32mg/mL的降血糖多肽粉。

实施例12

本发明采用体外α-葡萄糖苷酶抑制活性指标对活性成分的降血糖效果进行评价，评价方法如下：(以下的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性试验所用到的汉麻籽粕多肽是用实施例8所制备得到的产物进行试验的)

1.材料：PNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)、α-葡萄糖苷酶，阿卡波糖，均购于美国Sigma公司。

2.步骤：本检测在96微孔板上进行。微孔板上加112μL磷酸钾缓冲液(pH 6.8)，再加入0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20μL，8μL样品溶液，混匀，然后37℃恒温15min，加入20μL 2.5mmol/L PNPG，混匀后再37℃恒温反应15min。最后加入0.2mol/L的Na₂CO₃溶液80μL，于405nm波长下测定吸光值(OD)，计算公式为：

式中：OD_A：样A的光密度值，样A在反应中不加抑制剂；OD_B：样B的光密度值，样B在反应中加抑制剂；OD_C：样C的光密度值，样C在反应中以缓冲液代替抑制剂和PNPG溶液。

IC₅₀值：样品选取合适的4～6个浓度梯度，测定反应的OD值，分别计算各浓度的抑制率，然后用SPSS19.0软件求出相应的半数抑制浓度(IC₅₀)值。每个样品平行做3份，具体结果见表1和图1,2。当经过凝胶Sephadex G-15分离纯化后，所得多肽活性达到IC₅₀：0.11mg/mL，IC₅₀值低于阿卡波糖的1.10mg/mL，可以看出其活性明显高于阳性对照阿卡波糖。

表1经不同浓度乙醇洗脱和过凝胶Sephadex G-15分离纯化后的各组分活性

(表1中，D1：25％乙醇洗脱下来的组分，D2：50％乙醇洗脱下来的组分，D3：75％乙醇洗脱下来的组分，D4：100％乙醇洗脱下来的组分；G₁：过凝胶SephadexG-15分离出的第一组分，G₂：过凝胶Sephadex G-15分离出的第二组分，G₃：过凝胶Sephadex G-15分离的第三组分，G₄：过凝胶Sephadex G-15分离出的第四组分)

由图1可知，通过不同浓度的汉麻籽粕酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制活性比较表明，底物蛋白的水解度(DH)需要大于9.68％，所得酶解物才具有目标活性，并随样品浓度增加，活性增强，在相同浓度下，底物蛋白DH在20.14％下的酶解物活性最高，其α-葡萄糖苷酶活性抑制率达到49.83％，IC₅₀值为63.26mg/mL，经过两步分离纯化后，多肽的IC₅₀值达到0.11mg/mL，显著高于阳性对照阿卡波糖的1.10mg/mL，证明用此法获得抗凝血多肽的方法可行。

图2为经过大孔吸附树脂后的第三组分凝胶Sephadex G-15分离纯化图。由图2可知，该组分被明显分成了4个组分，第四组分G₄的活性最高，IC₅₀值为0.11mg/mL，这个组分为所得的抑制α-葡萄糖苷酶活性的最终产品。

图3为经凝胶Sephadex G-15分离出的第四个组分的分子量分布图。由图3可知本发明所得多肽为小分子肽类，分子量小于1000Da，进入人体被吸收后，可以直接穿过小肠壁进入血液高效发挥作用，稳定性高。

上述实施例为本发明较佳的方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取汉麻籽粕干燥，粉碎成细粉；加水溶解，干粉与水的比例为5~20g:100 mL，pH调至8.0~10.5，温度调至30~80℃，以100~300r/min的速度均匀搅拌0.5h~2h以加速溶解，取上清液调pH至3~6，离心，将沉淀冷冻干燥，制得汉麻籽粕蛋白；

（2）将汉麻籽粕蛋白加水溶解，比例为2~7g:100 mL，控制pH值在7.5~9.5，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，反应温度为50~75℃，以100~300 r/min匀速搅拌1~4h；煮沸10min，灭酶活，结束反应；10000r/min离心，收集上清液，过大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶，以水洗脱，收集洗脱液，富集洗脱下来的高活性多肽组分，浓缩，干燥，得汉麻籽粕多肽粉末。

2. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：所述的汉麻品种为汉麻Cannabis sativa L.。

3. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：所述取汉麻籽粕干燥中干燥具体为：干燥至汉麻籽粕的含水量小于3%。

4. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶的活力为393235 U/g。

5. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：制备过程中，用1mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液将pH调至8.0~10.5，用1mol/L的盐酸（HCl）溶液将pH调至3~6。

6. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：汉麻籽粕蛋白重量与碱性蛋白酶酶活之比0.1~5：1000。

7. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：分离纯化所用大孔吸附树脂类型为DA201-C，将75%乙醇洗脱组分收集，冷冻干燥；所述过大孔吸附树脂具体为：将上清液倒入DA201-C大孔吸附树脂交换柱，以0~100%不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，在波长214 nm处测定吸光度，富集75%乙醇洗脱下来小肽组分。

8. 根据权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽的酶解制备方法，其特征在于：分离纯化所用葡聚糖凝胶类型为Sephadex G-15，收集第4洗脱组分，冷冻干燥。

9.由权利要求1-8所述制备方法制备得到一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽，其特征在于，所述汉麻多肽的分子量范围为＜1000 Da。

10.权利要求9所述的一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的汉麻籽粕多肽应用于制备具有α-葡萄糖苷酶抑制活性功效的降血糖功能性食品，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。