CN104805164A - 一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法。本发明的方法包括对牡蛎进行磨浆、水洗和酶解处理。按照本发明方法得到牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上，牡蛎活性肽中总蛋白含量达到了80％以上，肽含量达到70％以上，分子量小于1000Da的组分占90％以上，可以作为新的功能性营养成分应用于食品、保健食品和药品的开发与生产。

Description

一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法

技术领域

本发明涉及一种肽的制备方法，尤其涉及一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法，可应用于功能食品和营养保健制品，属生物技术领域。

背景技术

自1975年Hughes等报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，人们已经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽，并且已经有研究证明，经酶解天然来源蛋白原料后得到的各种生物活性肽类制品不仅更易于人体吸收，而且其特有的结构和性质通常能表现出抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血压、增强免疫力等一系列生理功能，对天然来源的蛋白实施酶解制备生物活性肽，还具有原料来源广泛、无毒副作用、可规模化生产、价格便宜等优点。

牡蛎是我国四大经济水产之一，蕴含丰富的蛋白质、多肽、多糖和功能氨基酸等生理活性物质,以及多种人体必需的维生素、矿物质，具有很高的营养价值。近年诸多以牡蛎为原材料进行的活性肽研究屡见报道，然而这些报道中多中存在活性肽产率低，制备过程复杂等问题。并且由于鱼类、甲壳类、贝类、头足类等水产动物普遍存在致敏问题，如何在制备牡蛎活性肽的过程中降低其致敏性，同时能最大程度保留活性肽的生理活性、提高牡蛎活性肽的产率，成为有待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法，以拓宽牡蛎蛋白的加工和利用途径，同时得到具有保健功效的牡蛎活性肽，并可应用于工业化方法。

本发明还提供了一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽，所述牡蛎活性肽通过以上方法制得，所述牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上，牡蛎活性肽中总蛋白含量达到了80％以上，肽含量达到70％以上，分子量小于1000Da的组分占90％以上。

本发明提供的一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法，包括

1)将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆，去壳牡蛎与水的重量比为1:1-5；

2)在所述牡蛎浆中加入柠檬酸调整pH至3-7，然后在20℃-50℃条件下搅拌该牡蛎浆1-5小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料；

3)将该牡蛎渣料以1-5:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至30℃-60℃，按每克牡蛎渣料加入10-100U的风味蛋白酶和10-100U的木瓜蛋白酶，酶解2-6小时，最后将酶解液加热灭酶，收取酶解液，经后处理成为所述活性肽。

本发明采用了磨浆、水洗处理与酶解相结合的工艺，对牡蛎蛋白进行酶解，最终得到具有生物活性的牡蛎肽，本发明称为“牡蛎活性肽”。可以根据需要对酶解产物实施适当的加工纯化，得到相关形态的牡蛎活性肽产品，例如液态或粉体等。

根据本发明的一个实施方案，还包括以下制备牡蛎活性肽粉的步骤：

1)对所得到的酶解液进行离心，转速12000-16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05-0.2μm的膜过滤设备进行过滤，条件为压力0.2-0.4MPa，温度30-80℃，制得牡蛎活性肽透过液；

2)将上述牡蛎活性肽透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固含量为20-50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40-80℃，按照浓缩液总固含量10％-30％的比例加入活性炭粉进行脱色，并过滤、灭菌；

3)用离心喷雾干燥器将上述脱色后的浓缩液进行干燥处理，条件为进口温度140-160℃，出口温度80-90℃，制成牡蛎活性肽粉。

根据本发明的方法，首先要求对作为原料的牡蛎蛋白粉实施磨浆、水洗目的是以除去原料中的糖类和其他非蛋白物质，提供作为用于酶解制取牡蛎活性肽的原料(酶解底物)。

对磨浆、水洗处理后的料液进行固液分离(例如离心分离)并收取渣料，渣料作为酶解底物。

本发明采用的酶解过程包括了对磨浆、水洗处理的料液进行风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解，而所使用的酶制剂均可来自市售产品，并按照其要求的酶解条件实施即可，例如，在所使用酶制剂的适宜的pH环境及酶解温度下控制适当的酶解时间完成所需酶解。在一个具体方案中，可按照每克牡蛎渣料加入10-100U(酶活力单位，U)的风味蛋白酶和10-100U的木瓜蛋白酶继进行酶解。对所购得的酶制剂的酶活力通过简单换算即可确定具体用量。

对于经过酶解的酶解物料需要实施灭酶，可以通过维持对该物料加热一定时间，实现灭酶。例如，灭酶条件可以为：将酶解物料加热到100-130℃，维持10s-15min。也可以根据所使用的酶制剂以及酶解程度而自行确定适当的灭酶操作，例如，也可以采用高温瞬时灭酶。

酶解液经灭酶和必要分离浓缩处理，即可成为本发明所需要的牡蛎活性肽产物，可以根据最终产品的要求，进一步进行脱色，然后经调配成液体产品，或者经干燥成为粉状产品。

在一个具体实施方案中，对于灭酶后的酶解液采用活性炭脱色，基于浓缩液总固含量加入10％-30％的活性炭粉，加热至40-80℃，保温搅拌1-3小时。

本发明提供的是一种工业化生产工艺，所使用的设备均可商购得到，具体规格和型号均按照需要选择配套即可。例如，

所述对牡蛎浆实施离心分离以及制取纯化的渣料的分离操作时，均可使用碟片式离心机或其它相关设备。

对灭酶后的酶解液实施离心分离时，可使用管式离心机或其它可行的设备。对离心清液则可进一步通过膜过滤实现纯化，得到澄清的牡蛎活性肽透过液，可以选择采用0.05-0.2μm的膜过滤设备，例如微滤或超滤设备进行过滤。

对透过液浓缩制取固含量为20-50％的浓缩液时，可使用三效降膜蒸发器，控制蒸汽压0.1±0.02MPa，浓缩温度不高于80℃，例如40-80℃，当然，也可使用其它常用的蒸发设备。

本发明还提供了按照上述方法制备的一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽。

本发明还提供了所述的具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽作为产品或原料在保健功能性食品或药剂中的应用。

本发明方法成的牡蛎活性肽通过间接竞争ELISA方法检测其抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上。采用凯氏定氮法方法检测牡蛎活性肽的总蛋白含量(即牡蛎活性肽中酸溶蛋白和酸不溶蛋白的总量，酸为15％三氯乙酸)达到了80％以上(现有其他产品总蛋白含量只有50％-60％)，采用差量法测得肽含量(即酸溶蛋白中非游离氨基酸的蛋白质含量)达到70％以上，进一步通过高效液相色谱法检测该牡蛎活性肽中各组分的分子量分布，其中分子量小于1000Da的组分占到了牡蛎活性肽的90％以上，说明活性肽段在本发明方法制备的牡蛎活性肽中得以富集，进而使得具有多种多样的生理活性的牡蛎活性肽肽段能够最大限度的发挥其应有的生理功能。

附图说明

图1为4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液的凝胶渗透色谱图。

图2为牡蛎活性肽样品1的凝胶渗透色谱图。

图3为牡蛎活性肽样品2的凝胶渗透色谱图。

图4为牡蛎活性肽样品3的凝胶渗透色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。

牡蛎活性肽的制备

实施例1

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入600kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至3，然后在20℃条件下搅拌该牡蛎浆1小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料；

3)将该牡蛎渣料以1:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至60℃，按每克牡蛎渣料加入10U的风味蛋白酶和10U的木瓜蛋白酶，酶解6小时，然后，将该酶解物料加热到100℃维持15min左右进行灭酶；

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液离心处理，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液；将上述离心清液用孔径0.05μm的超滤设备进行过滤截留大分子组分，条件为压力0.2MPa，温度35℃，制得牡蛎活性肽透过液；

5)用三效降膜蒸发器将上述透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为25％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度45℃；按照该降压牡蛎活性肽浓缩液总质量10％的比例加入活性炭粉，加热到50℃，保温搅拌1小时后，过滤得到脱色后的牡蛎活性肽浓缩液；

6)然后，用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度160℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得26Kg牡蛎活性肽样品1。

实施例2

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入1800kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至5，然后在30℃条件下搅拌该牡蛎浆3小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料；

3)将该牡蛎渣料以3:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至45℃，按每克牡蛎渣料加入50U的风味蛋白酶和50U的木瓜蛋白酶，酶解4小时，然后，将该酶解物料加热到100℃维持15min左右进行灭酶。

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液离心处理，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液；将上述离心清液用孔径0.06μm的超滤设备进行过滤截留大分子组分，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得牡蛎活性肽透过液；

5)用三效降膜蒸发器将上述透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为40％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度60℃；按照该降压牡蛎活性肽浓缩液总质量20％的比例加入活性炭粉，加热到80℃，保温搅拌2小时后，过滤得到脱色后的牡蛎活性肽浓缩液；

6)然后，用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度140℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得20Kg牡蛎活性肽样品2。

实施例3

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入3000kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至7，然后在50℃条件下搅拌该牡蛎浆5小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料；

3)将该牡蛎渣料以5:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至60℃，按每克牡蛎渣料加入100U的风味蛋白酶和100U的木瓜蛋白酶，酶解2小时，然后，将该酶解物料加热到100℃维持15min左右进行灭酶。

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液离心处理，转速16000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液；将上述离心清液用孔径0.1μm的超滤设备进行过滤截留大分子组分，条件为压力0.4MPa，温度60℃，制得牡蛎活性肽透过液；

5)用三效降膜蒸发器将上述透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为45％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度65℃；按照该降压牡蛎活性肽浓缩液总质量30％的比例加入活性炭粉，加热到85℃，保温搅拌3小时后，过滤得到脱色后的牡蛎活性肽浓缩液；

6)然后，用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度155℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得18Kg牡蛎活性肽样品3。

牡蛎活性肽中蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法对牡蛎活性肽中蛋白质含量的进行测定，参照国标GB/T 5009.5进行。

测得的实施例1-3制备的牡蛎活性肽样品1-3中的蛋白质含量分别为85.36％，89.11％，91.05％，均为干基数据。此处的蛋白质含量为牡蛎活性肽样品1-3中的总蛋白含量，包括酸溶蛋白和酸不溶蛋白。

牡蛎活性肽中肽含量测定

采用差量法对牡蛎活性肽中低聚肽含量进行测定，参照GB/T22492-2008进行。

测得的实施例1-3制备的牡蛎活性肽样品1-3中的肽含量分别为77.71％，75.36％，73.29％，均为干基数据。此处的肽含量指的是酸溶蛋白中非游离氨基酸的蛋白质含量。在本申请的方案中，酸不溶蛋白通常为大分子蛋白，在人体内先被消化分解才能被吸收利用，上述肽含量反映了制备的牡蛎活性肽中更容易被人体直接吸收利用的肽含量。

牡蛎活性肽中各组分相对分子量及分布范围检测

利用GEL-HPLC检测所述牡蛎活性肽样品1-3中各组分相对分子量及分布范围：

(1)液相色谱条件

色谱柱：TSKgel G2000SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1(体积比)；检测波长：UV220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于10000，低聚肽的分配系数(Kd)应在0-1之间。

(2)相对分子量校正曲线制作

四种不同相对分子质量的肽标准品为：细胞色素C(MW12500)，杆菌酶(MW1450)，乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)，乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。

分别用流动相配制成0.1％(W/V)不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm-0.5μm聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图得到相对分子质量校正曲线及其方程。

(3)样品的制备

称取肽样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm-0.5μm聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。

(4)实验数据分析与处理

由4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液后进样，通过凝胶渗透色谱图得出4种标准品的保留时间，见图1。

将牡蛎活性肽样品于GEL-HPLC中进样以后，得到其凝胶色谱图，如图2-4所示。其中横坐标为保留时间，纵坐标为220nm下检测响应值。

将制备的实施例1-3的牡蛎活性肽样品1-3溶液在上述色谱条件下分析，然后用数据处理软件将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量分布范围，结果如表1所示。

表1

分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。以最小二肽(Gly-Gly)的分子量132Da和最大三肽(Trp-Trp-Trp)的分子量576Da作为分子量范围界值，用峰面积归一化法计算所述牡蛎活性肽样品的相对分子质量分布范围。

由分子量分布结果可以看出，上述样品中分子量小于1000Da的组分均占到90％以上。如果按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的低聚肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在132Da-576Da的肽占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。

牡蛎活性肽样品的致敏性检测

用包被液稀释牡蛎主要过敏原蛋白Crag 1抗原，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃过夜。加封闭液进行封闭，每孔200μL，37℃放置1h。然后，加入100μL PBS稀释的牡蛎活性肽样品溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体，作为样品孔；不加抗原孔作为无竞争反应体系，即仅添加稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体的孔，作为阴性孔；同时以未经任何处理的牡蛎蛋白PBS溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体作为对照孔。37℃放置2h。倾去孔内的液体，用250μL/孔清洗液4次洗板，甩干。用封闭液将HRP-羊抗兔IgG稀释，加入100μL/孔，37℃温育1h。用清洗液洗4次，甩干。加新鲜配制的TMB底物溶液100μL/孔,37℃暗处反应10min显示蓝色，加50μL/孔终止液以终止反应，颜色变黄，最后用酶联免疫检测仪双波长测定各孔的吸光值。

间接竞争ELISA中被测物和包被的牡蛎主要过敏原蛋白竞争与抗体结合，因此包被抗原与抗体生成复合物的量与被测物中抗原量成反比，被测物消除的抗原性大小可用抗原抑制率表示。

根据上述方法测得的实施例1-3制备的牡蛎活性肽样品1-3的抗原抑制率分别为87.57％，89.96％，91.23％。

可以看出，采用本发明的方案制备的牡蛎活性肽，所述牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上，总蛋白含量达到了80％以上(现有其他产品蛋白含量只有50％-60％)，肽含量达到70％以上，牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分占90％以上，可以作为新的功能性营养成分应用于食品、保健食品和药品的开发与生产。

Claims (10)

1.一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆，去壳牡蛎与水的重量比为1:1-5；

2)在所述牡蛎浆中加入柠檬酸调整pH至3-7，然后在20℃-50℃条件下搅拌该牡蛎浆1-5小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料；

3)将该牡蛎渣料以1-5:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至30℃-60℃，按每克牡蛎渣料加入10-100U的风味蛋白酶和10-100U的木瓜蛋白酶，酶解2-6小时，最后将酶解液加热灭酶，收取酶解液，经后处理成为所述活性肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下制备牡蛎活性肽粉的步骤，具体步骤如下：

1)对所得到的酶解液进行离心，转速12000-16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05-0.2μm的膜过滤设备进行过滤，条件为压力0.2-0.4MPa，温度30-80℃，制得牡蛎活性肽透过液；

2)将上述牡蛎活性肽透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固含量为20-50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40-80℃，按照浓缩液总固含量10％-30％的比例加入活性炭粉进行脱色，并过滤、灭菌；

3)用离心喷雾干燥器将上述脱色后的浓缩液进行干燥处理，条件为进口温度140-160℃，出口温度80-90℃，制成牡蛎活性肽粉。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液加热灭酶的条件是，加热到100℃，灭酶15min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对牡蛎浆离心分离时采用碟片式离心机。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对酶解液进行离心是采用管式离心机。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述膜过滤设备选自微滤或超滤设备。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述牡蛎活性肽透过液采用三效降膜蒸发器进行蒸发浓缩。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加入活性炭粉进行脱色的条件为加热到50℃-90℃，保温并搅拌1-3小时。

9.一种具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽，根据权利要求1-8任一项所述方法制得，其特征在于，分子量小于1000Da的组分占90％以上，所述牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上。

10.权利要求9所述的具有低致敏性的高蛋白牡蛎活性肽作为产品或原料在保健功能性食品或药剂中的应用。