CN104798980B - 一种牡蛎活性肽锌螯合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牡蛎活性肽锌螯合物及其制备方法和应用。牡蛎活性肽锌螯合物的制备方法，包括如下步骤：将牡蛎活性肽制成肽溶液后与锌源进行螯合反应，制得螯合反应液；采用有机溶剂对螯合反应液进行沉淀，制得牡蛎活性肽锌螯合物。特别是，牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分的质量百分含量为90％以上。本发明采用的牡蛎活性肽中蛋白质和肽的含量高、肽的分子量相对较低，该牡蛎活性肽致敏性弱、苦味值低、口感良好，在与锌螯合时的螯合率高，制得的牡蛎活性肽锌螯合物易于吸收和利用，在补锌的同时还可全面强化牡蛎活性肽的多种生理功效，具有良好的应用前景。

Description

一种牡蛎活性肽锌螯合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种肽锌螯合物，特别是涉及一种牡蛎活性肽锌螯合物及其制备方法和应用。

背景技术

锌是人体必需的微量元素之一，存在于80多种代谢相关酶中，如DNA聚合酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶等，参与核酸、蛋白质、脂肪、糖类等物质的合成与代谢，在人体生长发育、生殖遗传等重要生理过程中起到至关重要的作用。由于锌摄入、代谢、排泄障碍导致人体缺乏锌元素时，会出现生长、发育迟缓，智力障碍，免疫力低下及生殖功能下降的现象，导致一系列疾病的产生。我国居民普遍存在锌缺乏的问题，根据对19个省的调查表明，60％的学龄前儿童锌摄入量仅为正常值的50％左右，锌缺乏现象较为严重，因此通过营养强化剂补锌具有重要意义。

我国早期使用的补锌剂为氯化锌、硫酸锌、氧化锌等无机锌，这类补锌剂不仅对肠胃有刺激性，而且生物学效价低，已较少使用。目前广泛应用的补锌剂为葡萄糖酸锌、乳酸锌、乙酸锌、柠檬酸锌、甘氨酸锌等有机锌，其在口味、利用率和被人体的吸收性等方面均有较大的改善，特别是甘氨酸锌等氨基酸螯合锌具有良好的生物化学稳定性，易为人体所吸收，生物学效价明显优于其它有机锌。

肽锌螯合物作为一种新型补锌剂成为目前研究和开发的重点，其通过借助肽的生物活性功能，可进一步提高锌的吸收率和生物学效价。例如，公开号为CN 103494214 A的专利公开了一种酪蛋白磷酸肽锌螯合物，其是通过酶解酪蛋白获得的酪蛋白磷酸肽与无机锌进行螯合反应，制得酪蛋白磷酸肽锌螯合物，其虽可在一定程度上提高锌的吸收率，然而作为肽源的酪蛋白磷酸肽的生理功能有限。

牡蛎蕴含丰富的蛋白质、多肽、功能氨基酸等生理活性物质，其氨基酸组成均衡、水溶性好、稳定性高，且易于消化吸收，特别是多项研究表明，牡蛎肽具有抗菌、抗氧化、免疫调节、降血压等多种功能活性。尽管近年来诸多以牡蛎为原材料进行的活性肽研究屡见报道，然而这些报道中多中存在活性肽产率低、产品中蛋白和肽的含量低、制备过程复杂等问题；此外，由于鱼类、甲壳类、贝类、头足类等水产动物普遍存在致敏问题，并且普遍采用的酶解法不可避免地会使产品带有苦味，因此如何在制备牡蛎活性肽的过程中降低其致敏性和苦味，同时最大程度地保留活性肽的生理活性、提高牡蛎活性肽的产率及其蛋白和肽的含量，以及在保证肽锌螯合物中的肽的吸收性及生理功能的发挥的同时提高锌的螯合率等仍然成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种牡蛎活性肽锌螯合物及其制备方法和应用，其在采用分子量小、蛋白和肽含量高、致敏性和苦味值低的牡蛎活性肽作为肽源，并且在螯合时能够获得较高的螯合率和产率。

本发明提供一种牡蛎活性肽锌螯合物的制备方法，包括如下步骤：

将牡蛎活性肽制成肽溶液后与锌源进行螯合反应，制得螯合反应液；

采用有机溶剂对所述螯合反应液进行沉淀，制得牡蛎活性肽锌螯合物。

进一步地，所述牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分的质量百分含量为90％以上。该牡蛎活性肽的分子量较小，不仅易于被人体吸收和利用，而且生物活性好，同时具有抗菌、抗氧化、免疫调节、降血压等多种生理功能。在本发明中，可以通过本领域的常规方法从牡蛎制取该牡蛎活性肽。

在一具体方案中，所述牡蛎活性肽是通过采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对牡蛎进行酶解所制备得到的。本发明人经研究发现：采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶同时对牡蛎进行酶解，在生成分子量较小的活性肽的同时可有效地抑制酶解过程中苦味涩味物质的产生和释放，因此既可以保证活性肽具有良好的吸收性，又可消除产品因酶解而带来的苦味等不良口感。

具体地，所述牡蛎活性肽可以通过如下方法制备得到：

1)将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆；

2)调节所述牡蛎浆的pH值至3-7后进行搅拌，随后固液分离并收取牡蛎渣料；

3)将所述牡蛎渣料加水混合并调节pH值至7-9，随后采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶后，制得牡蛎活性肽。

进一步地，步骤1)中可以控制去壳牡蛎与水的重量比为1:(1-5)。步骤2)中可以采用柠檬酸等调节pH值，并且可以控制搅拌时的温度为20-50℃，搅拌时间为1-5小时；该步骤主要用于除去牡蛎浆中的糖类和其他非蛋白物质，以利于后续酶解。步骤3)中可以控制牡蛎渣料与水的重量比为1:(1-5)，并且可以采用本领域常规方法进行灭酶，例如将酶解产物加热到100-120℃左右并保温10-30min。

特别是，进行酶解时，可以控制所述风味蛋白酶的用量为10-100U/g，所述木瓜蛋白酶的用量为10-100U/g，并且所述风味蛋白酶与所述木瓜蛋白酶的用量比为(1-4)：(1-3)，例如风味蛋白酶使用10-40U/g时，木瓜蛋白酶使用10-30U/g；进一步地，所述风味蛋白酶与所述木瓜蛋白酶的用量比优选为1：1。此外，可以控制酶解的温度为30-60℃，酶解时间为2-6小时；酶解时间过短不利于牡蛎蛋白降解为小分子肽，从而影响产品的吸收，而酶解时间过长则可能导致酶解产物中苦味涩味物质的产生，从而影响产品的口感，因此适宜的酶解时间为2-6小时。

进一步地，在进行所述酶解后还可以包括依次对酶解产物进行膜过滤和脱色。实施膜过滤和脱色可进一步提高牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分的质量百分含量，同时进一步脱除酶解过程中产生的苦味涩味物质。

具体地，可以将酶解产物离心后，对离心上清液进行膜过滤并收取透过液。在本发明中，离心可采用常规设备进行，例如碟片式离心机、管式离心机等，离心的转速可以为12000-16000r/min。此外，可以采用孔径为0.05-0.2μm的滤膜进行所述膜过滤；膜过滤时，可控制膜过滤的绝对压力为0.2-0.4MPa，温度为30-80℃。

进一步地，可以将膜过滤形成的透过液浓缩至固性物含量为20-50％后加入脱色剂进行脱色。在本发明中，可以采用常规方式进行所述浓缩，例如可采用三效降膜蒸发器进行蒸发浓缩，并且可控制蒸发时的蒸汽压为0.1±0.02MPa，蒸发温度为40-80℃。此外，本发明可以采用常规脱色剂进行脱色，脱色剂例如可以为活性碳粉，脱色剂的添加量可以为浓缩液质量的10％-30％，脱色时的温度可控制在50-90℃，脱色时间可以为1-3小时，脱色可在搅拌下进行。在脱色后，可通过过滤等常规方式去除脱色剂，例如板框过滤。在脱色后可进行灭菌和干燥，干燥例如可以为喷雾干燥，其条件可以为进口温度140-160℃，出口温度80-90℃。

采用上述方式制备的牡蛎活性肽中总蛋白含量为80％以上，进一步为85％以上；该总蛋白含量采用凯氏定氮法测得，并且该总蛋白指的是牡蛎活性肽中酸溶蛋白和酸不溶蛋白的总量，其中酸为15％的三氯乙酸。采用上述方式制备的牡蛎活性肽中肽含量为70％以上，该肽含量采用差量法测得，并且该肽含量指的是酸溶蛋白中非游离氨基酸的蛋白质含量。采用上述方式制备的牡蛎活性肽抗原抑制率高达80％以上，进一步为85％以上，其抗原性较牡蛎蛋白降低80％以上，所述抗原性采用间接竞争ELISA法测得。

在本发明中，可以采用常规方式进行肽与锌的螯合反应。在一实施方式中，将牡蛎活性肽制成浓度为0.05-0.3g/mL的肽溶液，并且将无机锌制成浓度为0.01-0.2g/mL的锌溶液作为所述锌源。其中，无机锌可选自锌盐，特别是可溶性锌盐，例如硫酸锌等。此外，配制时肽溶液和锌溶液时，可以去离子水作为溶剂。

进一步地，进行所述螯合反应时，可以控制所述牡蛎活性肽与所述无机锌的质量比为(1-32)：1，优选为(5-20)：1，并且在牡蛎活性肽制成的肽溶液与无机锌制成的锌溶液的混合溶液中，牡蛎活性肽的含量可控制为0.02-0.2g/mL，混合溶液的pH值为4-6；此外，可控制螯合反应的温度为30-70℃，螯合反应的时间为30-100min。

进一步地，在进行所述沉淀之前，还可以先将所述螯合反应液浓缩成浓缩液，再采用有机溶剂对所述浓缩液进行沉淀，其中控制所述浓缩液中牡蛎活性肽锌螯合物的质量百分含量为20-30％，所述有机溶剂与浓缩液的体积比为(1-6)：1。本发明所采用的有机溶剂例如可以为无水乙醇。该浓缩步骤有利于提高有机溶剂的沉淀效果，并且节省有机溶剂的用量。

进一步地，在所述沉淀之后还可以进行固液分离并收集沉淀，随后对沉淀进行干燥。本发明对固液分离的方式不作严格限制，例如可以为离心或过滤；对沉淀进行干燥的温度可以为35-55℃，干燥时间可以为3-8h，例如可以采用电热恒温鼓风干燥箱进行所述干燥。

采用上述方式制备的牡蛎活性肽锌螯合物的锌离子螯合率为80％以上。采用上述方式制备的牡蛎活性肽锌螯合物的得率为45％以上。

本发明还提供一种牡蛎活性肽锌螯合物，按照上述任一所述的制备方法制备得到。溶解性实验表明，该制备的牡蛎活性肽锌螯合物微溶于中性水溶液，在偏酸性和碱性条件下溶解度良好，溶液澄清透明，呈淡黄色。

本发明还提供上述的牡蛎活性肽锌螯合物在保健食品中的应用。保健食品例如可以为补锌剂，并且可将牡蛎活性肽锌螯合物制成口服液、片剂、胶囊、颗粒剂等剂型进行应用。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明采用牡蛎活性肽作为肽源，安全无毒，并且不存在疯牛病、口蹄疫、寄生虫传染等风险，此外还可避免一些宗教习惯和生活习俗的限制；特别是所采用的牡蛎活性肽分子量相对较小、蛋白和肽的含量高，在补锌的同时还可全面强化牡蛎活性肽本身所具有的抗菌、抗氧化、免疫调节、降血压等多种生理功效。

2、本发明采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶同时对牡蛎进行酶解，在生成分子量较小的活性肽的同时可有效地抑制酶解过程中苦味涩味物质的产生和释放，从而消除产品因酶解而带来的苦味等不良口感，制得的牡蛎活性肽锌螯合物口感良好，易为消费者所接受。

3、本发明的制备方法工艺简单、成本低廉，特别是小分子的牡蛎活性肽与锌源螯合时的螯合率高达80％以上，产品得率为45％以上，不仅可以充分发挥小分子牡蛎活性肽良好的吸收性和多种生理功能，此外还可提高锌在人体的吸收利用率，产品生物利用度高、稳定性好，应用前景广阔。

附图说明

图1为4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液的凝胶渗透色谱图。

图2为本发明实施例1制备的牡蛎活性肽的凝胶渗透色谱图。

图3为本发明实施例2制备的牡蛎活性肽的凝胶渗透色谱图。

图4为本发明实施例3制备的牡蛎活性肽的凝胶渗透色谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、牡蛎活性肽的制备及质量检测

1.1制备牡蛎活性肽

将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入600kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆，随后向牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调节pH值至3左右后，在20℃下搅拌1小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料。

将上述牡蛎渣料以1:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH值至7-9后，加热至60℃，按每克牡蛎渣料加入10U的风味蛋白酶和10U的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解6小时后将酶解液加热到100℃维持15min左右进行灭酶。

采用管式离心机在14000r/min的转速下对上述灭酶后的酶解液进行离心，收取离心上清液，并用孔径为0.05μm的超滤设备进行膜过滤，条件为压力0.2MPa，温度35℃，制得牡蛎活性肽透过液。

采用三效降膜蒸发器将上述透过液蒸发浓缩至浓缩液的固形物含量约为25％，控制浓缩时的蒸汽压为0.1MPa，温度为45℃；随后，按照该牡蛎活性肽浓缩液总质量的10％加入活性炭粉，在50℃下保温搅拌1小时进行脱色；再采用离心喷雾干燥器对脱色后的浓缩液进行干燥，其中进口温度为160℃，出口温度为85℃，收集干燥产物，制得26kg牡蛎活性肽。

1.2牡蛎活性肽中蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法对牡蛎活性肽中蛋白质含量进行测定，参照国标GB/T 5009.5进行。上述方法测定的蛋白质含量为干基数据，该蛋白质含量为牡蛎活性肽中的总蛋白含量，包括酸溶蛋白和酸不溶蛋白，测定结果见表1。

1.3牡蛎活性肽中肽含量测定

采用差量法对牡蛎活性肽中低聚肽含量进行测定，参照GB/T 22492-2008进行。上述方法测定的肽含量为干基数据，该肽含量指的是酸溶蛋白中非游离氨基酸的蛋白质含量，测定结果见表1。

1.4牡蛎活性肽中各组分的相对分子量及分子量分布的测定

利用GEL-HPLC检测上述制备的牡蛎活性肽中各组分的相对分子量及分子量分布范围：

(1)液相色谱条件：

色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1(体积比)；检测波长：UV220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于10000，活性肽的分配系数(Kd)应在0-1之间。

(2)相对分子量校正曲线制作

四种不同相对分子质量的肽标准品为：细胞色素C(MW12500)，杆菌酶(MW1450)，乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)，乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。

分别用流动相配制成0.1％(W/V)不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm-0.5μm聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图得到相对分子质量校正曲线及其方程。

(3)样品的制备

称取上述制备的牡蛎活性肽20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm-0.5μm的聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤，制得牡蛎活性肽溶液。

(4)实验数据分析与处理

由4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液后进样，通过凝胶渗透色谱图得出4种标准品的保留时间，见图1。

将制备的牡蛎活性肽溶液于GEL-HPLC中以上述色谱条件进行进样分析，得到其凝胶色谱图，如图2所示，其中横坐标为保留时间，纵坐标为220nm下检测响应值。

用数据处理软件将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品牡蛎活性肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量分布范围，结果如表2所示。

1.5牡蛎活性肽样品的致敏性检测

用包被液稀释牡蛎主要过敏原蛋白Crag 1抗原，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃过夜。加封闭液进行封闭，每孔200μL，37℃放置1h。然后，加入100μL PBS稀释的牡蛎活性肽样品溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体，作为样品孔；不加抗原孔作为无竞争反应体系，即仅添加稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体的孔，作为阴性孔；同时以未经任何处理的牡蛎蛋白PBS溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体作为对照孔。37℃放置2h。倾去孔内的液体，用250μL/孔清洗液4次洗板，甩干。用封闭液将HRP-羊抗兔IgG稀释，加入100μL/孔，37℃温育1h。用清洗液洗4次，甩干。加新鲜配制的TMB底物溶液100μL/孔，37℃暗处反应10min显示蓝色，加50μL/孔终止液以终止反应，颜色变黄，最后用酶联免疫检测仪双波长测定各孔的吸光值。

间接竞争ELISA中被测物和包被的牡蛎主要过敏原蛋白竞争与抗体结合，因此包被抗原与抗体生成复合物的量与被测物中抗原量成反比，被测物消除的抗原性大小可用抗原抑制率表示，测定结果见表1。

1.6牡蛎活性肽的口感评价

将上述制备的牡蛎活性肽溶于弱酸性水中，制成质量含量为10％的牡蛎活性肽溶液；组织20人评定小组(男女各半)对牡蛎活性肽溶液进行苦味评价，评价方法为：取1mL牡蛎活性肽溶液，对其进行梯度稀释至刚好尝出苦味为止，将稀释倍数计为苦味值，计算20人的平均苦味值，结果见表1。

2、制备牡蛎活性肽锌螯合物

用去离子水将上述制备的牡蛎活性肽配制成0.10g/mL的溶液，并且用去离子水将硫酸锌配制成0.08g/mL的溶液。

将上述硫酸锌溶液缓慢加入至牡蛎活性肽溶液中，并使混合溶液中牡蛎活性肽与硫酸锌的质量比为20：1，牡蛎活性肽浓度为0.06g/mL，混合溶液的pH值约为5.3，随后将混合溶液的温度升至50℃，在搅拌下保温反应60min；反应结束后，将反应液放入旋转蒸发仪进行浓缩，控制浓缩时的温度为65℃，待样品中牡蛎活性肽锌螯合物的质量浓度为25％时，停止浓缩，制得浓缩液。

将浓缩液冷却至室温后，加入5倍体积的无水乙醇进行沉淀，随后将沉淀形成的沉淀液过滤，并用无水乙醇洗涤沉淀1次后，收集沉淀，并置入电热恒温鼓风干燥箱中，于45℃下干燥8h，制得牡蛎活性肽锌螯合物。

2.1锌含量测定

称取0.03-0.1g牡蛎肽锌螯合物，置于50mL锥形瓶中，加少量水润湿，滴加2滴硫酸溶液(1+1)溶解，加10ml水、2ml氟化氨饱和溶液、0.5ml硫脲溶液(200g/L)和0.04g抗坏血酸，摇匀溶解后加入3ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5～6)和2滴二甲酚橙指示液(2g/L)，用乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液滴定由紫红色变为亮黄色为终点，同时做空白试验。

结果计算：试样中锌含量X以质量百分数(％)表示，按下式计算：

式中：

V—滴定试样溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；

v—滴定空白溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；

C—乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

m—称取的牡蛎肽锌螯合物质量，g；

65.39—锌的相对分子质量。

2.2锌的螯合率及螯合物得率计算

锌的螯合率(％)＝W₁/W₀

W₀—反应体系中锌的总质量，g；

W₁—螯合物中锌的总质量，g。

螯合物的得率(％)＝W₃/W₂

W₂—初始反应物的总质量，g；

W₃—反应后牡蛎肽锌螯合物的总质量，g。

螯合率和得率结果见表1。

实施例2

1、牡蛎活性肽的制备及质量检测

将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入1800kg水并碾磨成牡蛎浆，随后向牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调节pH值至5左右后，在30℃下搅拌3小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料。

将上述牡蛎渣料以3:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH值至7-9后，加热至45℃，按每克牡蛎渣料加入50U的风味蛋白酶和50U的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解4小时后灭酶。

在14000r/min的转速下对上述灭酶后的酶解液进行离心，收取离心上清液，并用孔径为0.06μm的超滤设备进行膜过滤，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得牡蛎活性肽透过液。

将上述透过液蒸发浓缩至浓缩液的固形物含量约为40％后，按照该牡蛎活性肽浓缩液总质量的20％加入活性炭粉，在80℃下保温搅拌2小时进行脱色，经喷雾干燥，制得20kg牡蛎活性肽。

采用实施例1方法对该牡蛎活性肽的质量进行检测，牡蛎活性肽中的蛋白质含量、肽含量、抗原抑制率及口感评价结果见表1，凝胶色谱图见图3，相对分子量及分子量分布见表2。

2、制备牡蛎活性肽锌螯合物

用去离子水将上述制备的牡蛎活性肽配制成0.30g/mL的溶液，并且用去离子水将硫酸锌配制成0.2g/mL的溶液。

将上述硫酸锌溶液缓慢加入至牡蛎活性肽溶液中，并使混合溶液中牡蛎活性肽与硫酸锌的质量比为10：1，牡蛎活性肽浓度为0.2g/mL，混合溶液的pH值约为5.10，将混合溶液的温度升至30℃后，在搅拌下保温反应100min；反应结束后，将反应液放入旋转蒸发仪进行浓缩，控制浓缩时的温度为85℃，待样品中牡蛎活性肽锌螯合物的质量浓度为20％时，停止浓缩，制得浓缩液。

将浓缩液冷却至室温后，加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀，随后将沉淀形成的沉淀液过滤，并用无水乙醇洗涤沉淀3次后，收集沉淀，并置入电热恒温鼓风干燥箱中，于55℃下干燥3h，制得牡蛎活性肽锌螯合物，螯合率和得率结果见表1。

实施例3

1、牡蛎活性肽的制备及质量检测

将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入3000kg水并碾磨成牡蛎浆，随后向牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调节pH值至7左右后，在50℃下搅拌5小时，离心去上清液，得到牡蛎渣料。

将上述牡蛎渣料以5:1的水渣比加水混合、搅拌，调pH值至7-9后，加热至60℃，按每克牡蛎渣料加入100U的风味蛋白酶和100U的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解2小时后灭酶。

在16000r/min的转速下对上述灭酶后的酶解液进行离心，收取离心上清液，并用孔径为0.1μm的超滤设备进行膜过滤，条件为压力0.4MPa，温度60℃，制得牡蛎活性肽透过液。

将上述透过液蒸发浓缩至浓缩液的固形物含量约为45％后，按照该牡蛎活性肽浓缩液总质量的30％加入活性炭粉，在85℃下保温搅拌3小时进行脱色，经喷雾干燥，制得18kg牡蛎活性肽。

采用实施例1方法对该牡蛎活性肽的质量进行检测，牡蛎活性肽中的蛋白质含量、肽含量、抗原抑制率及口感评价结果见表1，凝胶色谱图见图4，相对分子量及分子量分布见表2。

2、制备牡蛎活性肽锌螯合物

用去离子水将上述制备的牡蛎活性肽配制成0.05g/mL的溶液，并且用去离子水将硫酸锌配制成0.05g/mL的溶液。

将上述硫酸锌溶液缓慢加入至牡蛎活性肽溶液中，并使混合溶液中牡蛎活性肽与硫酸锌的质量比为5：1，牡蛎活性肽浓度为0.04g/mL，混合溶液的pH值约为4.95，将混合溶液的温度升至70℃后，在搅拌下保温反应30min；反应结束后，将反应液放入旋转蒸发仪进行浓缩，控制浓缩时的温度为60℃，待样品中牡蛎活性肽锌螯合物的质量浓度为30％时，停止浓缩，制得浓缩液。

将浓缩液冷却至室温后，加入6倍体积的无水乙醇进行沉淀，随后将沉淀形成的沉淀液过滤，并用无水乙醇洗涤沉淀2次后，收集沉淀，并置入电热恒温鼓风干燥箱中，于35℃下干燥6h，制得牡蛎活性肽锌螯合物，螯合率和得率结果见表1。

对照例1

除按每克牡蛎渣料加入20U的碱性蛋白酶和20U的木瓜蛋白酶进行酶解外，其余与实施例1相同，制得牡蛎肽锌螯合物，其中各项检测结果见表1。

对照例2

除按每克牡蛎渣料加入50U的木瓜蛋白酶进行酶解、酶解pH为6外，其余与实施例1相同，制得牡蛎肽锌螯合物，其中各项检测结果见表1。

对照例3

除按每克牡蛎渣料加入30U的胃蛋白酶进行酶解，酶解pH为4，并且不经过膜过滤和脱色而直接按照实施例1方法依次进行离心、浓缩、干燥，制得牡蛎肽锌螯合物，其中各项检测结果见表1。

表1各实施例和对照例的检测结果

由表1结果可知：

1、采用本发明各实施例方法制备的牡蛎活性肽中的肽含量高达70％以上，牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分的含量为90％以上，说明本发明采用的牡蛎活性肽更容易被人体直接吸收利用；而采用采用其它方式进行酶解时牡蛎肽中的肽含量以及分子量小于1000Da的组分的含量均较低，人体吸收性较差。

2、采用本发明各实施例方法制备的牡蛎活性肽中苦味成分少，口感较好，说明本发明方法能够有效抑制酶解产物中苦味物质的产生；而采用其它方式进行酶解时牡蛎肽苦味值高，说明其无法有效避免酶解过程中的苦味涩味成分的释放，产品口感不佳。

3、采用本发明各实施例方法制备的牡蛎活性肽中的抗原抑制率高达85％以上，说明本发明方法能够有效地去除牡蛎蛋白的致敏性；而采用其它方式进行酶解时对牡蛎蛋白致敏性的去除效果有限。

4、采用本发明各实施例方法制备的牡蛎活性肽制备牡蛎肽锌螯合物时螯合率高、产品得率高，制得的牡蛎活性肽锌螯合物不仅可用于补锌，同时还可全面强化牡蛎活性肽的多种生理功效，应用前景广阔。

表2各实施例的牡蛎活性肽的相对分子量及分子量分布

分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。以最小二肽(Gly-Gly)的分子量132Da和最大三肽(Trp-Trp-Trp)的分子量576Da作为分子量范围界值，用峰面积归一化法计算所述牡蛎活性肽样品的相对分子质量分布范围。

由上述分子量分布结果可以看出，本发明各实施例制备的牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分均占到90％以上。按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的活性肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在132Da-576Da的肽占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。由此说明，本发明各实施例制备的牡蛎活性肽在人体吸收利用率极高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种牡蛎活性肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将牡蛎活性肽制成浓度为0.05-0.3g/mL的肽溶液，并将无机锌制成浓度为0.01-0.2g/mL的锌溶液作为锌源，将所述肽溶液与锌源进行螯合反应，制得螯合反应液，其中控制所述牡蛎活性肽与所述无机锌的质量比为5-20：1，螯合反应的温度为30-70℃，螯合反应的时间为30-100min，所述牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分的质量百分含量为90%以上，所述无机锌为硫酸锌；

将所述螯合反应液浓缩成浓缩液，采用有机溶剂对所述浓缩液进行沉淀，制得牡蛎活性肽锌螯合物，其中控制所述浓缩液中牡蛎活性肽锌螯合物的质量百分含量为20-30%，所述有机溶剂与浓缩液的体积比为1-6：1，所述有机溶剂为无水乙醇；

其中，所述牡蛎活性肽是通过如下方法制备得到：

1）将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆，控制去壳牡蛎与水的重量比为1：1-5；

2）采用柠檬酸以调节所述牡蛎浆的pH值至3-7后进行搅拌，控制搅拌时的温度为20-50℃，搅拌时间为1-5小时，随后固液分离并收取牡蛎渣料；

3）将所述牡蛎渣料加水混合并调节pH值至7-9，随后采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶后，对酶解产物进行离心、膜过滤和脱色，得到所述牡蛎活性肽；

其中，酶解过程中，控制所述风味蛋白酶的用量为10-100U/g，所述木瓜蛋白酶的用量为10-100U/g，并且风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的用量比为1-4：1-3，酶解温度为30-60℃，酶解时间为2-6小时；

采用孔径为0.05-0.2μm的滤膜进行所述膜过滤，并控制膜过滤的绝对压力为0.2-0.4MPa，温度为30-80℃。

2.一种牡蛎活性肽锌螯合物，其特征在于，是按照权利要求1所述的制备方法制备得到。

3.权利要求2所述的牡蛎活性肽锌螯合物在制备保健食品中的应用。