CN102286588B - 甲鱼肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供了一种甲鱼肽的提取方法，以甲鱼为原料用碱性蛋白酶或用中性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.2-5%，中性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.1-4%，酶解时间为1-10h，酶解后酶解液升温至85-120°C，灭酶10-60min，喷雾干燥得到甲鱼肽；本方法操作简便，口感好，成本低，环保高效，适合工业化大生产。

Description

甲鱼肽的制备方法

技术领域

本发明涉及甲鱼的深加工技术领域，具体涉及一种以甲鱼为原料，利用生物复合酶酶解制备甲鱼肽的方法。 

背景技术

甲鱼又名鳖、团鱼，有补血、强骨、抗疲劳、延年益寿之功效，是我国传统食品，也是开发高级保健食品的良好原料；甲鱼的主要营养成分为蛋白质、脂肪、铁、钙、动物胶、角质白及多种维生素等。甲鱼含有很高的蛋白质，大约每公斤有165克蛋白质，而食物或药物中的蛋白质一般要被消化液酶解为低聚肽或氨基酸而被机体吸收和利用，因此吸收慢，利用率低，所以也达不到应有的药效。 

利用现代生物酶解技术，超滤和薄膜浓缩，喷雾干燥技术处理得到的小分子甲鱼低聚肽，可以克服上述问题，使甲鱼低聚肽口服能够更完全和直接被消化道吸收，目前，提取甲鱼低聚肽的方法主要有碱液提取法和生物酶解法，前者在提取过程中加入大量的碱处理，既破坏了蛋白质的成分，造成成品苦咸等不良口感，而且对环境造成污染；申请号201010103157.9专利文献中公开了甲鱼小分子多肽的制备方法：用胰酶在55-60℃酶解1-4h，在90-95℃保温10h,降温至60℃，加入复合蛋白酶酶解1-4h，再经过去油脂，活性炭脱色，真空浓缩，醇沉，高温灭菌，喷雾干燥得到成品。该方法胰蛋白酶但是成本高，操作流程太长，步骤繁琐，不适合工业化生产。   

发明内容

针对现有技术的酶解液存在腥味，咸味和分子量大，分子量分布不集中，成本高的缺陷，本发明的目的在于提供了一种甲鱼肽的提取方法，以甲鱼为原料用碱性蛋白酶或用中性蛋白酶酶解，喷雾干燥得到的甲鱼肽；本方法操作简便，口感好，成本低，环保高效，适合工业化大生产。 

为了实现上述技术目的，本发明采取以下技术措施： 

一种甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1.  按原料甲鱼的重量的0.2-5%的比率加入碱性蛋白酶，40-70℃恒温酶解1-10h,或按原料甲鱼重量的0.1-4%的比率加入中性蛋白酶，40-70℃恒温酶解1-10h,将得到的酶解液升温至85-120℃，灭酶10-60min，过滤；

2.  滤液浓缩，干燥即得到甲鱼肽。

本发明也可以先把原料甲鱼去除内脏和油脂，搅碎，煎煮1-10h，冷却至40-70℃后再进行酶解。 

优选的制备方法如下： 

1.   按原料甲鱼的重量的0.5-3%的比率加入碱性蛋白酶，50-65℃恒温酶解2-4h,或按原料甲鱼重量的0.5-3%的比率加入中性蛋白酶，50-65℃恒温酶解2-6h,将得到的酶解液升温至95-110℃，灭酶20-40min;过滤

2.   滤液浓缩，喷雾干燥即得到甲鱼肽。

上述步骤中也可以先把原料甲鱼去除内脏和油脂，搅碎，煎煮2-4h，冷却至50-65℃后再进行酶解。 

更优的方法： 

1.   按原料甲鱼的重量的2%的比率加入碱性蛋白酶，60℃恒温酶解3h,或按原料甲鱼重量的2%的比率加入中性蛋白酶，60℃恒温酶解4h,将得到的酶解液升温至100℃，灭酶30min;过滤

2.   滤液经薄膜浓缩，喷雾干燥即得到甲鱼肽。

上述步骤中也可以先把原料甲鱼去除内脏和油脂，搅碎，煎煮4h，冷却至60℃后再进行酶解。 

本品为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的全体。 

与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果如下： 

1.    本发明方法提取的甲鱼肽纯度高，分子量集中，其中酶解液中分子量在10000-140道尔顿达到99%以上，其中1000-140道尔顿达到50%以上。

2.    本发明生产出来的甲鱼肽的人体容易吸收。 

3.    本方法避免了调节PH，纳滤脱盐工序，减少了工业成本，改善了成品的风味，提高了肽的得率。 

4.    本发明的生产周期短，操作简便，成本低，产品质量可靠，安全无毒副作用，可广泛用于保健品、药品等领域。 

具体实施方式

实施例1 

一、制备方法，其步骤如下：

1.以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，去除内脏和油脂，搅碎，加入1000L纯水，100℃煎煮2h；

2.冷却至60℃，按原料甲鱼的重量的2%的比率加入碱性蛋白酶2kg，60℃恒温酶解3h,或按原料甲鱼重量的1%的比率加入中性蛋白酶1kg，55℃恒温酶解4h,将得到的酶解液升温至100℃，灭酶30min;过滤

3.滤液浓缩密度1.05-1.1之间，喷雾干燥即得到11.64kg粉末甲鱼肽。

二、甲鱼肽含量测定 

1．方法提要

低分子量的蛋白质水解物（包含肽类及游离氨基酸）可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质物质，测定出离心清液中的酸溶蛋白质含量，清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为肽的含量。

2．分析步骤 

2.1 酸溶蛋白质含量的测定

称取2g（精确至1mg）样品，加入至10mL容量瓶中，用15%三氯乙酸溶液定容，混合均匀，静置10min。将样品溶液在4000rpm下离心10min后，取全部清液，按GB/T 5009.5规定的方法测定清液中的酸溶蛋白质，蛋白质换算系数为6.25。检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。

2.2 游离氨基酸含量的测定 

样品前处理：称取20～30mg样品，精确到0.0001g，用3％磺基水杨酸溶液溶解均匀。将样品溶液转移至50ml容量瓶中，定容。将样品溶液在转速为4000r/min离心机上离心5min得清液，再用0.45μm微孔滤膜过滤清液，将滤液转移至50ml容量瓶中，定容后作为仪器检测用样品。其余操作同GB 12292水果、蔬菜汁 游离氨基酸含量的测定规定的方法。

2.3 结果的表述 

肽的含量 按式（1）计算：

……………………………………………………（1）

式中：  

——样品中肽含量（以干基计），%；

——样品中酸溶蛋白质含量（以干基计），%；

——样品中游离氨基酸含量（以干基计），%。

2．4测定结果 

测定成品中肽的含量，结果见表1。

表1甲鱼肽粉中肽的含量测定结果 

样品	甲鱼肽
		肽含量	60.58%

3.相对分子质量小于1000道尔顿的肽所占比例(高效凝胶过滤色谱法) 

3.1方法提要 

采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件（即GPC软件），对色谱图及其数据进行处理，计算得到肽的相对分子质量大小及分布范围。 

3.2试剂 

乙腈：色谱纯；三氟醋酸：分析纯；水：超纯水或二次蒸馏水。

相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素C（cyyochrome,MW12500）；抑酞酶（aprotinin,MW6500）；杆菌酶（bacitracin,MW1450）；乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451）；乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW189）。 

3.3仪器和设备 

高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；流动相真空抽滤脱气装置；超声波振荡器；分析天平：感量0.0001g。

3.4色谱条件与系统适应性实验 

色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱；流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1（体积比）检测波长：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数（N）按三肽标准品（乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸）峰计算不低于5000，低聚肽的分配系数（Kd）应在0～1之间。 

3.5相对分子质量校正曲线制作 

分别用流动相配制成0.1%（W/V）的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数（lgMW）对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

3.6样品制备 

称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。

3.7相对分子质量的计算 

将3.6制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000道尔顿以下的肽的峰面积相对百分比之和。 

3.8测定结果 

甲鱼肽分子量分布范围测定结果见表6，7。

表2甲鱼肽结果 

分子量范围	开始时间min	结束时间min	重均分子量	峰面积%（λ220nm）
					1000-10000	14.126	18.905	3018	25.44
500-1000	18.905	21.009	634	30.08
					140-500	21.009	23.455	320	31.45
70-140	23.189	24.805	105	13.03

以上结果表明，甲鱼肽分子量主要集中在140-1000道尔顿，占60%以上。 

实施例2 

一、甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1.  以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，去内脏，油脂，搅碎，煎煮1h；

2.  冷却至40℃，按原料甲鱼的重量的5%的比率加入碱性蛋白酶，40℃恒温酶解10h,或按原料甲鱼重量的4%的中性蛋白酶，40℃恒温酶解10h,将得到的酶解液升温至85℃，灭酶10min；

3.  浓缩，喷雾干燥即得到12.07kg甲鱼肽成品。

二、甲鱼肽含量测定： 

按照实施例1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在140-2000道尔顿，占60%以上。 

实施例3 

一、    甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1.  以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg ，搅碎，煎煮4h；

2.  冷却至65℃，按原料甲鱼的重量的3%的比率加入碱性蛋白酶，65℃恒温酶解2h,或按原料甲鱼重量的3%的中性蛋白酶，65℃恒温酶解4h,将得到的酶解液升温至120℃，灭酶60min;

3.  浓缩，喷雾干燥即得到13.20kg甲鱼肽成品。

二、甲鱼肽含量测定： 

按照实施例1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在10000道尔顿以下，占99%以上，其中在140-2000道尔顿，占60%以上。 

实施例4 

一、        甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1.以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，搅碎，煎煮3h

2.冷却至50-62℃，按原料甲鱼的重量的0.2%的比率加入碱性蛋白酶，70℃恒温酶解2-4h,或按原料甲鱼重量的0.1%的中性蛋白酶，70℃恒温酶解0.3-2h,将得到的酶解液升温至100℃，灭酶40min;

3.浓缩，干燥即得到15.6kg甲鱼肽成品。

二、甲鱼肽含量测定： 

按照实施例1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在300-700道尔顿，占20%以上。 

实施例5 

甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1.以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼100kg，搅碎，煎煮3h

2.冷却至50-62℃，按原料甲鱼的重量的0.5%的比率加入碱性蛋白酶，50℃恒温酶解2-4h,或按原料甲鱼重量的0.5%的中性蛋白酶，50℃恒温酶解2-4h,将得到的酶解液升温至100℃，灭酶20min;

3.浓缩，干燥即得到13.6kg甲鱼肽成品。

Claims (2)

1.一种甲鱼肽的制备方法，包括原料甲鱼酶解、浓缩、干燥，其特征在于：用碱性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.2-5%，酶解时间为1-10h；或用中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.1-4%，酶解时间为1-10h；酶解后酶解液升温至85-120°C，灭酶10-60min。

2.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.5-3%，酶解时间为2-4h；或中性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.5-3%，酶解时间为2-4h；酶解后酶解液升温至95-110°C，灭酶20-40min。

3.根据权利要求2所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的2%，酶解时间为3h；或中性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的2%，酶解时间为4h；酶解后酶解液升温至100°C，灭酶30min。