CN105238545A - 一种小分子甲鱼肽和甲鱼油联产的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子甲鱼肽和甲鱼油联产的制备方法。包括：取宰杀弃内脏的甲鱼切块；高温高压预煮，冷却后沥干汤汁；绞碎后加入蒸馏水捣碎匀浆；高温加热后冷却离心获得油脂粗样，所得油脂粗样中加入酒精溶液冷冻结晶，获得凝固的甲鱼油粗样；所得沉淀加水，加入高pH蛋白酶和低pH蛋白酶分步酶解，灭菌处理后调pH进行过滤、超滤膜和纳滤膜处理；喷雾干燥即得甲鱼多肽粉产品。本发明能够实现油脂和蛋白的有效分离，提高了酶解效率，获得的甲鱼肽分子量主要集中在2kDa以下，所占比例98%以上。
Description
技术领域
本发明涉及水产品加工领域，尤其涉及一种小分子甲鱼肽和甲鱼油联产的制备方法。
背景技术
甲鱼又名鳖、团鱼，味道鲜美，含多种营养物质，是我国传统的保健食品原料。甲鱼富含蛋白质、脂肪、钙、铁以及多种维生素，具有补血、抗疲劳和强骨等多种功效。目前，甲鱼主要以鲜活销售为主，加工产品少，产品附加值低。研究表明，甲鱼油呈高度不饱和状态，含有人体必需的脂肪酸，具有较高的营养。甲鱼中蛋白质丰富，通常人体摄取的蛋白质经过消化道酶水解后,以多肽的形式直接吸收，并且二肽和三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快。
目前，已有关于甲鱼产品开发的相关研究，在甲鱼多肽制备方面，中国申请专利CN102286588A公开了甲鱼肽的制备方法、中国申请专利CN102286589A公开了甲鱼低聚肽的制备方法，中国申请专利CN101744090公开了一种甲鱼低分子多肽的制造方法，这类专利都采用酶解方法获得甲鱼多肽，对于蛋白资源的的高效利用和甲鱼的精深加工起到一定的作用，但是存在酶解效率低和低分子量多肽比例偏低等问题。在甲鱼油制备方面，中国申请专利CN1769409A一种精制甲鱼油的制备方法，对甲鱼油进行了精制，提高了品质，但产品形式单一。
以上这些研究存在以下缺陷：
（1）甲鱼属于爬行动物，含有硬骨、结缔组织和胶原等复杂成分，简单的加工处理方式不容易破坏这类组织，严重影响后续的酶解效率。
（2）由于生长环境等因素，甲鱼带有一定细菌，酶解后期加热处理能够起到一定灭菌作用，但较难达到理想效果，对产品品质产生不良影响。
（3）甲鱼中富含油脂，是制备甲鱼油的天然原料。油脂容易与蛋白发生结合，形成包裹层，影响蛋白酶酶解效率。前期人工剔除脂肪难以完全，同时存在人工成本高等问题，而在酶解后期处理达不到弃除脂肪的效果，油脂容易发生氧化，影响产品的品质；
（4）研究表明，分子量小于3kDa的多肽容易被人体吸收，然而以往专利由于酶解效率低，获得低分子量多肽所占比例不高。
（5）这类专利或专利申请大多以甲鱼为原料，研究产品多为单一利用甲鱼中蛋白资源或油脂成分，甲鱼资源未得到充分利用。
因此，继续一种从甲鱼中获得高比例的低分子量多肽和甲鱼油的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从甲鱼中获得高比例的低分子量多肽和甲鱼油制备方法。
为实现上述目的，本发明提供一种小分子甲鱼肽和甲鱼油联产的制备方法，步骤为，
（1）预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，清洗干净，切块后立即使用或冻存于-30℃冰箱中备用；
（2）高温高压预煮：将清洗干净的甲鱼放置于高温高压蒸汽杀菌进行高温高压处理，冷却后沥干汤汁；
（3）绞碎和匀浆：将处理后的甲鱼放入绞肉机中绞碎，绞碎后样品加入蒸馏水，并用组织捣碎机捣碎匀浆得到样品混合液；绞肉机实现了甲鱼肉和骨头的彻底粉碎，同时组织捣碎可实现蛋白样品的均匀分布，提高后续的酶解效果；
（4）蛋白与油脂分离：将捣碎后的样品混合液置于水浴锅，高温加热并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，离心取上层和中层即为油脂粗样，下层沉淀重复步骤一次，上层和中层与之前的上层与中层混合为油脂粗样；
（5）甲鱼油提取：往步骤（4）所得油脂粗样中加入酒精溶液，搅拌后-20℃下冷冻结晶，离心去掉酒精溶液，获得凝固的甲鱼油粗样；
（6）分步酶解：步骤（4）获得的沉淀加入蒸馏水，组织捣碎后调整pH，加入高pH蛋白酶进行一次酶解，酶解结束后加入低pH蛋白酶进行二次酶解得到酶解样品；
（7）膜处理：酶解样品高温处理后调pH至7.0，冷却后用滤袋过滤，再进行超滤膜和纳滤膜处理；
（8）喷雾干燥：将获得的样品进行喷雾干燥，即得甲鱼多肽粉产品。
进一步，所述步骤（1）中，清洗所用的清水为4-10℃的冰水。
进一步，所述步骤（2）中，高温高压处理条件为0.1MPa，121℃，处理时间为10～20min。121℃高温高压预煮能够杀灭甲鱼所带细菌，同时起到甲鱼蛋白变性的作用，有利于后续酶解效率提高；
进一步，所述步骤（3）中，处理后的甲鱼为甲鱼肉和甲鱼骨头的混合物；
任选的，组织捣碎机所用转速为3000-5000rpm/min，组织捣碎时间为3-5min。
进一步，所述步骤（4）中，高温加热所用温度为80-100℃，加热时间为20-30min；
任选的，离心所用转速为4000-8000rpm，离心时间为10-20min，温度为4-20℃。
本发明采用80-100℃预处理，使水溶性蛋白在加热条件下变性，离心后沉淀，而油脂漂浮于上层和中层，实现油脂和蛋白的有效分离。
进一步，所述步骤（5）中，所用酒精浓度为75-100体积%，加入量为油脂粗样体积的2-4倍；
任选的，冷冻结晶20-30小时，优选24小时；
任选的，离心所用转速为4000-8000rpm，离心时间为10-20min，温度为4-20℃；
进一步，所述步骤（6）中，加入2-4倍体积的蒸馏水，4000-5000rpm组织捣碎；
任选的，所述高pH蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶；优选的，加酶量为0.5～1重量%，反应时间为1～2h；
任选的，所述低pH蛋白酶为木瓜蛋白酶或中性蛋白酶；优选的，加酶量为0.5～1重量%，反应时间为1～2h。
进一步，所述步骤（7）中，酶解样品于90℃～95℃高温处理10～20min，并用1MNaOH调整pH至7.0，冷却后用滤袋过滤，再进行超滤膜和纳滤膜处理；
优选的，所述超滤膜所用孔径为5000～20000道尔顿，纳滤膜200～300道尔顿。
进一步，所述步骤（8）中，喷雾干燥的进口温度设置为170～190℃，出口温度为85～100℃。
本发明能够实现油脂和蛋白的有效分离，提高了蛋白酶的酶解效果，提高了酶解效率，获得的甲鱼肽分子量主要集中在2kDa以下，所占比例98%以上；
本发明采用超滤和纳滤膜相结合的手段，提高了效率，同时也提升了产品品质。
本发明采用生物技术及物理方法，实现对甲鱼油脂和蛋白进行高效利用，对于有效提高提高产品附加值。
本发明采用分步酶解，一步酶解所用高pH蛋白酶对甲鱼蛋白进行酶解，一步酶解后酶解液pH值随之降低，二步酶解在不调整pH的情况下采用低pH蛋白酶酶解，这个过程中避免了pH调整中无机盐的带入。同时，采用分步酶解能够使得酶解更加充分，最终将大分子逐步降解为小分子，直至2KD左右，故获得的多肽主要集中在2kDa以下。
附图说明
图1是本发明实施例2所得产品的HPLC液相GPC软件处理图。
图2是本发明实施例3甲鱼蛋白分布酶解过程的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多重”的含义是两个（组或重）或两个（组或重）以上。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
（1）预处理：选取鲜活甲鱼原料，宰杀后弃内脏498g，清洗干净，切块后2504g；
（2）高温高压预煮：将清洗干净的甲鱼放置于采用高温高压蒸汽杀菌锅（0.1MPa，121℃）高温高压处理20min，冷却后沥干汤汁；
（3）绞碎和匀浆：将步骤（2）处理后的甲鱼放入绞肉机中绞碎，绞碎后样品加入6.5L体积蒸馏水，用组织捣碎机匀浆5min；组织捣碎机转速为3000rpm/min，时间5min；
（4）蛋白与油脂分离：将捣碎后的样品混合液置于水浴锅，100℃加热30min并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，4-20℃下，4000rpm，离心20min，取上层和中层即为油脂粗样，下层沉淀，重复步骤一次；
（5）甲鱼油提取：将步骤（4）上层和中层样品溶液，加入75%酒精溶液10L，搅拌后-20℃下冷冻结晶，4-20℃下，4000rpm，离心20min，去掉酒精溶液，获得凝固的甲鱼油粗样202.0g；
（6）分步酶解：步骤（4）获得的沉淀加入3.7L蒸馏水，组织捣碎后调整pH7.2，加入0.5重量%复合蛋白酶室温进行一次酶解2h，酶解结束后加入0.8重量%木瓜蛋白酶室温进行二次酶解1.5h；
（7）膜处理：酶解后样品90℃高温处理10min，并用1MNaOH调整pH至7.0，冷却后滤袋过滤，将获得的溶液分别进行超滤膜和纳滤膜处理，超滤膜所用孔径为5000道尔顿，纳滤膜300道尔顿浓缩（进压:0.8MPa，出压:0.8MPa，温度:23～26℃）；
（8）喷雾干燥：将步骤（7）获得的样品进行喷雾干燥，进口温度170℃，出口温度85℃，得到甲鱼多肽粉产品270.2g；
实施例2：
（1）预处理：选取鲜活甲鱼原料，宰杀后弃内脏260g，清洗干净，切块后1298g；
（2）高温高压预煮：将清洗干净的甲鱼放置于采用高温高压蒸汽杀菌锅（0.1MPa，121℃）高温高压处理20min，冷却后沥干汤汁；
（3）绞碎和匀浆：将步骤（2）处理后的甲鱼放入绞肉机中绞碎，绞碎后样品加入3.7L体积蒸馏水，用组织捣碎机捣碎匀浆5min；组织捣碎机转速为5000rpm/min，时间3min；
（4）蛋白与油脂分离：将捣碎后的样品混合液置于水浴锅，80℃加热30min并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，4-20℃下，4000rpm，离心20min，取上层和中层即为油脂粗样，下层沉淀，重复步骤一次；
（5）甲鱼油提取：将步骤（4）上层和中层样品溶液，加入95%酒精溶液5L，搅拌后-20℃下冷冻结晶，4-20℃下，4000rpm，离心20min，去掉酒精溶液，获得凝固的甲鱼油粗样125.3g。
（6）分步酶解：步骤（4）获得的沉淀加入2.3L蒸馏水，组织捣碎后调整pH7.2，加入0.8重量%碱性蛋白酶室温进行一次酶解1.5h，酶解结束后加入0.5重量%木瓜蛋白酶室温进行二次酶解1h；
（7）膜处理：酶解后样品95℃高温处理10min，冷却后用滤袋过滤，将获得的溶液分别进行超滤膜和纳滤膜处理，超滤膜所用孔径为10000道尔顿，纳滤膜300道尔顿浓缩（进压:0.8MPa，出压:0.8MPa，温度:23～26℃）；
（8）喷雾干燥：将获得的样品进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为90℃，获得甲鱼多肽粉产品135.6g；
所得甲鱼多肽粉产品进行HPLC，得到图1的HPLCGPC生成图。其中图中●表示不同分子量标准品（左→右）：①小清蛋白：11515Da；②脯氨酸内肽酶小肽：4907Da；③P012005：1199Da；④YGDEY：645Da。结果用GPC软件分析，从图中可以看出，获得的产品多肽主要集中在2kDa以下，所占比例98.3%。
实施例3：
（1）预处理：选取鲜活甲鱼原料，宰杀后弃内脏185g，清洗干净，切块后960g；
（2）高温高压预煮：将清洗干净的甲鱼放置于采用高温高压蒸汽杀菌锅（0.1MPa，121℃）高温高压处理15min，冷却后沥干汤汁；
（3）绞碎和匀浆：将步骤（2）处理后的甲鱼放入绞肉机中绞碎，绞碎后样品加入3.0L体积蒸馏水，用组织捣碎机捣碎匀浆5min；组织捣碎机转速为4000rpm/min，时间4min；
（4）蛋白与油脂分离：将捣碎后的样品混合液置于水浴锅，100℃加热20min并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，4-20℃下，4000rpm，离心20min，取上层和中层即为油脂粗样，下层沉淀，重复步骤一次；
（5）甲鱼油提取：将步骤（4）上层和中层样品溶液，加入95%酒精溶液4L，搅拌后-20℃下冷冻结晶，4-20℃下，4000rpm，离心20min，去掉酒精溶液，获得凝固的甲鱼油粗样92.4g；
（6）分步酶解：步骤（4）获得的沉淀加入3.7L蒸馏水，组织捣碎后调整pH8.0，加入0.5重量%胰蛋白酶室温进行一次酶解1h，酶解结束后加入1重量%中性蛋白酶室温进行二次酶解2h；
（7）膜处理：酶解后样品90℃高温处理10min，并用1MNaOH调整pH至7.0冷却后滤袋过滤，将获得的溶液分别进行超滤膜和纳滤膜处理，超滤膜所用孔径为20000道尔顿，纳滤膜300道尔顿（进压:0.8MPa，出压:0.8MPa，温度:23～26℃）；
（8）喷雾干燥：将获得的样品进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为90℃，，即得甲鱼多肽粉产品95.2g；
所得甲鱼蛋白分步酶解过程进行电泳，得到图2的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为标准蛋白样品，泳道2-5分别为一次酶解中1.0%胰蛋白酶酶解15min，30min，45min和60min，泳道6-9分别是酶解反应60min后加入1.0%中性蛋白酶酶解二次酶解30min，60min，90min和120min。从图中可以看出，经1%的胰蛋白酶酶解1h和1%的中性蛋白酶酶解2h后，随着时间的延长甲鱼蛋白逐渐被降解，到3h时甲鱼蛋白被完全降解。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种小分子甲鱼肽和甲鱼油联产的制备方法，其特征在于，包括，
（1）预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，清洗干净，切块后立即使用或冻存于-30℃冰箱中备用；
（2）高温高压预煮：将清洗干净的甲鱼放置于高温高压蒸汽杀菌进行高温高压处理，冷却后沥干汤汁；
（3）绞碎和匀浆：将处理后的甲鱼放入绞肉机中绞碎，绞碎后样品加入蒸馏水，并用组织捣碎机捣碎匀浆得到样品混合液；
（4）蛋白与油脂分离：将捣碎后的样品混合液置于水浴锅，高温加热并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，离心取上层和中层即为油脂粗样，下层沉淀重复步骤一次，上层和中层与之前的上层与中层混合为油脂粗样；
（5）甲鱼油提取：往步骤（4）所得油脂粗样中加入酒精溶液，搅拌后-20℃下冷冻结晶，离心去掉酒精溶液，获得凝固的甲鱼油粗样；
（6）分步酶解：步骤（4）获得的沉淀加入蒸馏水，组织捣碎后调整pH，加入高pH蛋白酶进行一次酶解，酶解结束后加入低pH蛋白酶进行二次酶解得到酶解样品；
（7）膜处理：酶解样品高温处理后调pH至7.0，冷却后用滤袋过滤，再进行超滤膜和纳滤膜处理；
（8）喷雾干燥：将步骤（7）所得进行喷雾干燥，即得甲鱼多肽粉产品。
2.根据权利要求1所述的甲鱼油和小分子甲鱼肽联产制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，清洗所用的清水为4-10℃的冰水。
3.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，高温高压处理条件为0.1MPa，121℃，处理时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，处理后的甲鱼为甲鱼肉和甲鱼骨头的混合物；
任选的，组织捣碎机所用转速为3000-5000rpm/min，组织捣碎时间为3-5min；
任选的，绞碎后样品加入2-4倍体积蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，高温加热所用温度为80-100℃，加热时间为20-30min；
任选的，离心所用转速为4000-8000rpm，离心时间为10-20min，温度为4-20℃。
6.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所用酒精浓度为75-100体积%，加入量为油脂粗样体积的2-4倍；
任选的，冷冻结晶20-30小时，优选24小时；
任选的，离心所用转速为4000-8000rpm，离心时间为10-20min，温度为4-20℃。
7.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，加入2-4倍体积的蒸馏水，4000-5000rpm组织捣碎；
任选的，所述高pH蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶；优选的，加酶量为0.5～1重量%，反应时间为1～2h；
任选的，所述低pH蛋白酶为木瓜蛋白酶或中性蛋白酶；优选的，加酶量为0.5～1重量%，反应时间为1～2h。
8.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中，酶解样品于90℃～95℃高温处理10～20min，并用1MNaOH调整pH至7.0，冷却后用滤袋过滤，再进行超滤膜和纳滤膜处理；
优选的，所述超滤膜所用孔径为5000～20000道尔顿，纳滤膜200～300道尔顿。
9.根据权利要求1所述的小分子甲鱼肽和甲鱼油联产制备方法，其特征在于，所述步骤（8）中，喷雾干燥，进口温度设置为170～190℃，出口温度为85～100℃。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |