CN109400699A - 甲鱼肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甲鱼肽的制备方法：先将清洗干净的甲鱼放置于高温高压蒸汽下处理，冷却后沥干，再将捣碎后甲鱼组织匀浆在高温条件下进行处理，离心之后底部沉淀即得到甲鱼蛋白，然后将甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成甲鱼蛋白溶液，添加复合酶和酶解助剂进行反应，并控制酶解时间、温度及pH，酶解结束后，灭酶，冷却至室温后离心，所得上清液即为甲鱼肽溶液，并对甲鱼肽溶液脱色脱腥，之后使用微滤膜和超滤膜处理，最后将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽。本发明制备方法工艺简单，酶解效率高，便于商业化发展，所制备的甲鱼肽纯度高、感官品质良好、无色无味无杂、低分子量多肽比例高，生物活性好，便于机体吸收利用。
Description
技术领域
本发明涉及甲鱼深加工技术领域，特别涉及甲鱼肽的制备方法。
背景技术
甲鱼又名鳖、团鱼，不仅肉味鲜美，营养丰富，富含蛋白质、脂肪、钙、铁以及多种维生素，而且全身各部分均可入药，具有滋阴清热、补中益气和延缓衰老等功效，是我国传统的保健食品原料。
甲鱼肽是甲鱼蛋白经过复合酶水解而获得的小分子肽，从而增加原食品蛋白质中没有的生物学功能。现代营养学研究发现，人体摄入的蛋白质大多是以寡肽的形式被消化吸收的，多肽的生物效价比游离氨基酸要高。目前已有多种活性多肽的研究和产品，如胶原蛋白肽、乳铁蛋白活性多肽、鹿茸活性多肽、大豆肽等，它们具有多种生理功能，如抗氧化、降血压和免疫调节等。
近年来，国内外市场对甲鱼的需求日益增长，极大地促进了甲鱼养殖业和加工业的发展，但是目前，甲鱼主要以鲜活销售为主，加工产品少，产品附加值低，将其加工成高附加值的甲鱼肽具有巨大的发掘潜力，发展前景广阔，因此，寻找一种简单有效的甲鱼肽制备方法对甲鱼的深加工行业具有深远的意义。
现有技术如授权公告号为CN 102286588 B的中国发明专利，公开了一种甲鱼肽的提取方法，该制备方法为以甲鱼为原料，用碱性蛋白酶或用中性蛋白酶酶解，碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.2-5%，中性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.1-4%，酶解时间为1-10h，酶解后酶解液升温至85-120℃，灭酶10-60min，喷雾干燥得到甲鱼肽，该方法操作简单，口感好，成本低，环保高效，适合工业化大生产。但是，该制备方法制备过程复杂，酶解效率较低，低分子量多肽比例偏低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备工艺简单、酶解效率高、低分子量多肽比例高，制得的甲鱼肽感官品质良好、无色无味无杂、纯度好、生物活性好、便于商业化发展的甲鱼肽制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
甲鱼肽的制备方法，包括甲鱼预处理、甲鱼胶原蛋白的提取、甲鱼胶原蛋白酶解、甲鱼肽溶液的纯化，具体步骤如下：
甲鱼预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，并用冰水清洗干净，然后将清洗干净的甲鱼放置于0.10-0.15MPa，120-125℃蒸汽下处理10-20min，冷却后沥干，放入绞肉机中绞碎，绞碎后再加入甲鱼碎肉重量2-4倍的蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎得到甲鱼匀浆，备用，高温高压蒸汽处理能够杀灭甲鱼所带细菌，也可起到甲鱼蛋白变性的作用，同时组织捣碎可实现甲鱼蛋白的均匀分布，有利于提高后续酶解效率；
甲鱼蛋白的提取：将甲鱼匀浆液置于水浴锅中，在80-100℃下加热20-30min，并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，并在转速为4000-8000rpm下离心10-20min，收集离心后底部沉淀即得到甲鱼蛋白，高温处理使甲鱼蛋白在加热条件下变性，离心后甲鱼蛋白沉淀在底部，而甲鱼中的油脂漂浮于上层，可实现油脂和蛋白的有效分离；
甲鱼蛋白酶解：将得到的甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成浓度为5-8%的甲鱼蛋白溶液，然后添加复合酶和酶解助剂，连续搅拌酶解液2-3h，控制酶解温度50-65℃，调节pH为7.5-10，酶解结束后，沸水浴灭酶5-10min，冷却至室温后在3500-4000rpm条件下离心10-15min，所得上清液即为甲鱼肽溶液，使用复合酶和酶解助剂对甲鱼蛋白进行处理，可将甲鱼蛋白的螺旋结构完全打开，将多肽链上的特定氨基酸残基切断，使肽链变成分子量较低的短肽链，显著提高甲鱼蛋白溶液的水解度；
甲鱼肽溶液的纯化：将甲鱼肽溶液稀释10-15倍，加入脱色脱腥助剂，调节pH为3.5-4.0，在40-50℃下处理50-60min，结束后过滤，并将滤液在50-60℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000Da超滤膜，最后将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽，所得到的甲鱼肽感官品质良好，无色无味无杂，低分子量多肽比例较高，生物活性好，便于机体吸收利用。
作为优选，酶解过程中所添加的酶解助剂为重量配比为0.07-0.09:1的硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的混合物，其添加量为复合酶重量的0.3-0.5%，硫酸锰和N-乙酰神经氨酸搭配使用，发挥协同增效作用，一方面可以提高复合酶的活性，促进酶与甲鱼蛋白之间的结合，进而提高酶解速率；另一方面通过影响羟脯氨酸上的活性基团使甲鱼蛋白的螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，酶结合位点增多，有利于酶解过程中酶与底物的结合，提高酶解液中的多肽含量，且所得多肽的分子量较低，可见，酶解助剂的添加能够显著提高酶解效率，可制得低分子量比例高，生物活性较好的甲鱼肽。
作为优选，酶解过程中复合酶为重量配比为1:0.6-0.9碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，添加量为甲鱼蛋白溶液重量的1.0-1.5%，碱性蛋白酶的水解能力强，但是酶切位点少，切下的肽段大小不均一，导致酶解液经离心后大部分大的肽段被沉淀下来，导致可溶性多肽含量低，而木瓜蛋白酶的作用位点多，能够将胶原蛋白酶解成比较均匀的中等分子肽段，可溶性多肽含量较多，因此将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶搭配使用，所得到的甲鱼肽酶解液中多肽分子量低，同时多肽含量较高。
作为优选，甲鱼肽溶液纯化过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：白土粉3-5份、酵母10-15份、β-D-酚酞葡萄糖苷酸4-6份、二甘醇1-2份，β-D-酚酞葡萄糖苷酸和二甘醇发挥协同作用，一方面可影响酵母的生长和代谢，激发代谢生成酶的活性，加强对甲鱼肽溶液中以羰基化合物和醇类物质为主的腥味物质的转化作用，达到甲鱼肽脱腥的目的；另一方面也可作用于甲鱼蛋白的螺旋肽链被切断变成短肽后所暴露出的有色、带苦味的疏水氨基酸，并通过范德华力和疏水作用力将这些氨基酸的活性基团包合，以去除甲鱼肽的腥苦味，因此，在白土粉和酵母的基础上搭配使用β-D-酚酞葡萄糖苷酸和二甘醇，可有效对甲鱼肽溶液进行脱色脱腥处理，且蛋白损失率较低，可制备出无色无味，感官品质良好的甲鱼肽。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明甲鱼肽的制备工艺简单，酶解效率高，便于商业化；2）本发明甲鱼肽的低分子量多肽比例高，生物活性好，便于机体吸收利用；3）本发明甲鱼肽纯度高，感官品质良好，无色无味无杂，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
甲鱼肽的制备方法，包括甲鱼预处理、甲鱼胶原蛋白的提取、甲鱼胶原蛋白酶解、甲鱼肽溶液的纯化，具体步骤如下：
1）甲鱼预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，并用冰水清洗干净，然后将清洗干净的甲鱼放置于0.1MPa，120℃蒸汽下处理10min，冷却后沥干，放入绞肉机中绞碎，绞碎后再加入甲鱼碎肉重量4倍的蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎得到甲鱼匀浆，备用，高温高压蒸汽处理能够杀灭甲鱼所带细菌，也可起到甲鱼蛋白变性的作用，同时组织捣碎可实现甲鱼蛋白的均匀分布，有利于提高后续酶解效率；
2）甲鱼蛋白的提取：将甲鱼匀浆液置于水浴锅中，在80℃下加热20min，并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，并在转速为4000rpm下离心20min，收集离心后底部沉淀即得到甲鱼蛋白，高温处理使甲鱼蛋白在加热条件下变性，离心后甲鱼蛋白沉淀在底部，而甲鱼中的油脂漂浮于上层，可实现油脂和蛋白的有效分离；
3）甲鱼蛋白酶解：将得到的甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成浓度为8%的甲鱼蛋白溶液，然后添加复合酶和酶解助剂，连续搅拌酶解液2h，控制酶解温度50℃，调节pH为8.0，酶解结束后，沸水浴灭酶5min，冷却至室温后在3500rpm条件下离心10min，所得上清液即为甲鱼肽溶液，使用复合酶和酶解助剂对甲鱼蛋白进行处理，可将甲鱼蛋白的螺旋结构完全打开，将多肽链上的特定氨基酸残基切断，使肽链变成分子量较低的短肽链，显著提高甲鱼蛋白溶液的水解度；
4）甲鱼肽溶液的纯化：将甲鱼肽溶液稀释10倍，加入脱色脱腥助剂，调节pH为3.5，在40℃下处理50min，结束后过滤，并将滤液在50℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000Da超滤膜，最后将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽，所得到的甲鱼肽感官品质良好，无色无味无杂，低分子量多肽比例较高，生物活性好，便于机体吸收利用。
上述酶解过程中所添加的酶解助剂为重量配比为0.07:1的硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的混合物，其添加量为复合酶重量的0.3%，硫酸锰和N-乙酰神经氨酸搭配使用，发挥协同增效作用，一方面可以提高复合酶的活性，促进酶与甲鱼蛋白之间的结合，进而提高酶解速率；另一方面通过影响羟脯氨酸上的活性基团使甲鱼蛋白的螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，酶结合位点增多，有利于酶解过程中酶与底物的结合，提高酶解液中的多肽含量，且多肽的分子量较低，可见，酶解助剂的添加能够显著提高酶解效率，可制得低分子量比例高，生物活性较好的甲鱼肽。
上述酶解过程中复合酶为重量配比为1:0.6碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，添加量为甲鱼蛋白溶液重量的1.0%，碱性蛋白酶的水解能力强，但是酶切位点少，切下的肽段大小不均一，导致酶解液经离心后大部分大的肽段被沉淀下来，导致可溶性多肽含量低，而木瓜蛋白酶的作用位点多，能够将胶原蛋白酶解成比较均匀的中等分子肽段，可溶性多肽含量较多，因此将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶搭配使用，所得到的甲鱼肽酶解液中多肽分子量低，同时多肽含量较高。
上述甲鱼肽溶液纯化过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：白土粉3份、酵母10份、β-D-酚酞葡萄糖苷酸6份、二甘醇1份，β-D-酚酞葡萄糖苷酸和二甘醇发挥协同作用，一方面可影响酵母的生长和代谢，激发代谢生成酶的活性，加强对甲鱼肽溶液中以羰基化合物和醇类物质为主的腥味物质的转化作用，达到甲鱼肽脱腥的目的；另一方面也可作用于甲鱼蛋白的螺旋肽链被切断变成多肽后所暴露出的有色、带苦味的疏水氨基酸，并通过范德华力和疏水作用力将这些氨基酸的活性基团包合，以去除甲鱼肽液的腥苦味，因此，在白土粉和酵母的基础上搭配使用β-D-酚酞葡萄糖苷酸和二甘醇，可有效对甲鱼肽溶液进行脱色脱腥处理，且蛋白损失率较低，可制备出无色无味，感官品质良好的甲鱼肽。
实施例2：
甲鱼肽的制备方法，包括甲鱼预处理、甲鱼胶原蛋白的提取、甲鱼胶原蛋白酶解、甲鱼肽溶液的纯化，具体步骤如下：
1）甲鱼预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，并用冰水清洗干净，然后将清洗干净的甲鱼放置于0.13MPa，122℃蒸汽下处理20min，冷却后沥干，放入绞肉机中绞碎，绞碎后再加入甲鱼碎肉重量4倍的蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎得到甲鱼匀浆，备用；
2）甲鱼蛋白的提取：将甲鱼匀浆液置于水浴锅中，在100℃下加热30min，并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，并在转速为6000rpm下离心20min，收集离心后底部沉淀即得到甲鱼蛋白；
3）甲鱼蛋白酶解：将得到的甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成浓度为6%的甲鱼蛋白溶液，然后添加复合酶和酶解助剂，连续搅拌酶解液3h，控制酶解温度65℃，调节pH为8.5，酶解结束后，沸水浴灭酶10min，冷却至室温后在4000rpm条件下离心15min，所得上清液即为甲鱼肽溶液；
4）甲鱼肽溶液的纯化：将甲鱼肽溶液稀释15倍，加入脱色脱腥助剂，调节pH为4.0，在50℃下处理60min，结束后过滤，并将滤液在50℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000Da超滤膜，最后将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽。
上述酶解过程中所添加的酶解助剂为重量配比为0.09:1的硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的混合物，其添加量为复合酶重量的0.4%。
上述酶解过程中复合酶为重量配比为1:0.9碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，添加量为甲鱼蛋白溶液重量的1.5%。
上述甲鱼肽溶液纯化过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：白土粉5份、酵母15份、β-D-酚酞葡萄糖苷酸6份、二甘醇1份。
实施例3：
甲鱼肽的制备方法，包括甲鱼预处理、甲鱼胶原蛋白的提取、甲鱼胶原蛋白酶解、甲鱼肽溶液的纯化，具体步骤如下：
1）甲鱼预处理：选取新鲜甲鱼原料，宰杀后弃内脏，并用冰水清洗干净，然后将清洗干净的甲鱼放置于0.15MPa，125℃蒸汽下处理10min，冷却后沥干，放入绞肉机中绞碎，绞碎后再加入甲鱼碎肉重量4倍的蒸馏水，使用组织捣碎机捣碎得到甲鱼匀浆，备用；
2）甲鱼蛋白的提取：将甲鱼匀浆液置于水浴锅中，在100℃下加热20min，并不断搅拌，反应结束后冷却至室温，并在转速为8000rpm下离心20min，收集离心后底部沉淀即得到甲鱼蛋白；
3）甲鱼蛋白酶解：将得到的甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成浓度为6%的甲鱼蛋白溶液，然后添加复合酶和酶解助剂，连续搅拌酶解液3h，控制酶解温度50℃，调节pH为9.5，酶解结束后，沸水浴灭酶10min，冷却至室温后在4000rpm条件下离心10min，所得上清液即为甲鱼肽溶液；
4）甲鱼肽溶液的纯化：将甲鱼肽溶液稀释10倍，加入脱色脱腥助剂，调节pH为4.0，在50℃下处理60min，结束后过滤，并将滤液在50℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000Da超滤膜，最后将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽。
上述酶解过程中所添加的酶解助剂为重量配比为0.09:1的硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的混合物，其添加量为复合酶重量的0.5%。
上述酶解过程中复合酶为重量配比为1:0.9碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，添加量为甲鱼蛋白溶液重量的1.5%。
上述甲鱼肽溶液纯化过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：白土粉3份、酵母10份、β-D-酚酞葡萄糖苷酸5份、二甘醇2份。
对照组：
本对照组与实施例1相比，步骤3甲鱼蛋白酶解过程中只添加复合酶，除此外的方法步骤均相同。
实施例4：
为了对比本发明效果，分别对实施例1、实施例2、实施例3和对照组所制备的甲鱼肽溶液中相对分子质量在1000-2000和＜1000的甲鱼肽含量进行测试，具体结果如表1。
表1甲鱼肽溶液中低分子肽含量表
| 相对分子质量在1000-2000的含量/% | 相对分子质量在＜1000的含量/% | |
| 实施例1 | 12 | 76 |
| 实施例2 | 22 | 80 |
| 实施例3 | 14 | 77 |
| 对照组 | 23 | 40 |
从表1可以看出，与对照组相比，实施例1、实施例2和实施例3所制备的甲鱼肽溶液中相对分子质量在＜1000的甲鱼肽含量较高，可见，本发明甲鱼肽的低分子量比例高，生物活性好，应用范围广。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述制备步骤如下：
1）甲鱼预处理：将清洗干净的甲鱼放置于高温高压蒸汽下处理，冷却、沥干，捣碎得甲鱼组织匀浆，备用；
2）甲鱼胶原蛋白的提取：将甲鱼组织匀浆在高温下进行处理，离心之后底部沉淀即得到甲鱼蛋白；
3）甲鱼胶原蛋白酶解：将甲鱼蛋白与蒸馏水混合配成甲鱼蛋白溶液，添加复合酶和酶解助剂进行反应，并控制酶解时间、温度及pH，酶解结束后，灭酶，冷却至室温后离心，所得上清液即为甲鱼肽溶液，所述酶解助剂为硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的混合物；
4）甲鱼胶原蛋白多肽液的纯化：将甲鱼肽溶液稀释，加入脱色脱腥助剂，控制温度、时间及pH，反应结束后使用微滤膜和超滤膜过滤，将滤液旋转蒸发浓缩，低温冷冻，真空干燥即得到甲鱼肽。
2.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1高温高压条件为0.10-0.15MPa，120-125℃。
3.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2的高温条件为80-100℃。
4.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3硫酸锰和N-乙酰神经氨酸的重量配比为0.07-0.09:1，其添加量为复合酶重量的0.3-0.5%。
5.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3复合酶为重量配比为1:0.6-0.9碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，其添加量为甲鱼蛋白溶液重量的1.0-1.5%。
6.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3酶解温度为50-65℃，酶解时间为2-3h，调节pH为7.5-10。
7.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：白土粉3-5份、酵母10-15份、β-D-酚酞葡萄糖苷酸4-6份、二甘醇1-2份。
8.根据权利要求1所述的甲鱼肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4酶解液脱色脱腥过程中控制温度为35-40℃，pH为4.0-5.0，处理时间为50-60min。
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