CN108130183A - 一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法 - Google Patents

一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，包括步骤：S1.甲鱼碎料液加入复合蛋白酶A酶解；S2.过滤甲鱼酶解产物分离甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，离心得甲鱼肉水相产物和甲鱼肉油相产物；S3.甲鱼肉水相产物进行脱腥、脱色、精滤、浓缩、干燥得甲鱼肉低聚肽粉；S4.甲鱼碎骨液经蒸煮、过滤得骨渣和碎骨液体产物、离心得甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；S5.甲鱼骨蛋白液加入复合蛋白酶B酶解得甲鱼骨蛋白酶解产物；S6.甲鱼骨蛋白酶解产物经脱腥、脱色、精滤、浓缩、干燥得甲鱼骨蛋白低聚肽粉；S7.骨渣处理得甲鱼背甲粉；S8.甲鱼肉油相产物和甲鱼骨油相产物混合得甲鱼油。本发明可以充分利用甲鱼资源，避免资源浪费。

Description

一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法
技术领域
本发明涉及生物化学酶解提取领域，更具体地，涉及一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法。
背景技术
甲鱼又称鳖、团鱼、脚鱼、水鱼,脊索动物门，脊椎动物亚门，爬行纲，龟鳖目，鳖科，鳖属，是一种珍贵的水生经济动物。
甲鱼肉质鲜嫩味美，含有丰富的蛋白质、硫胺素、核黄素、尼克酸、卵磷脂等营养成分，其中蛋白中的氨基酸种类全、含量高，配比也比较合理，其必需氨基酸特别是人体主要限制性氨基酸赖氨酸和呈香味的谷氨酸含量明显高于其他食品；肉中维生素含量丰富，尤其是维生素E和B族维生素；肉中矿物元素含量也很高，除了含有大量对人体有益的钙质外，还含有与生长发育关系密切的铁、锌、铜、锰、铬等微量元素。甲鱼外壳中含有大量的动物胶、角蛋白、碘质及维生素D和维生素B17。甲鱼脂肪中有70％以上为不饱和脂肪酸，高于一般鱼类，高度不饱和脂肪酸占25％以上，其中DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)含量很高。
甲鱼的药用价值在《本草纲目》中早有记载：“鳖肉滋阴补血、养心肾、清热消淤、健脾胃”，甲鱼也已为世人所公认，有防止动脉硬化、高血压、糖尿病和延年益寿等滋补、治疗功效。甲鱼的背甲亦可入药，具有滋阴退烧和软坚散结的作用。同时甲鱼油中含有的多不饱和脂肪酸也对预防脑血栓、心肌梗塞和心绞痛等心脑血管疾病具有显著疗效。
但是当前甲鱼肽制备方法工艺繁琐、耗时长，生产成本较高；甲鱼肉经高温预处理，多数未经脱腥脱色等原因使得产品存在味道和色泽及口感较差的缺陷；单纯提取甲鱼肽，造成甲鱼骨、甲鱼油的资源浪费。因此亟需一种甲鱼生物活性成分的集成提取方法，提高甲鱼的利用率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中甲鱼利用率低的缺陷，提供一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，通过对甲鱼的集成加工，充分提取甲鱼中的甲鱼肉低聚肽、甲鱼骨蛋白低聚肽、甲鱼背甲粉和甲鱼油，提高甲鱼的利用率，避免资源浪费。
为实现上述目的，本发明提供了一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，所述方法包括以下步骤：
S1.将甲鱼去内脏后绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水得到甲鱼碎料液，调节所述甲鱼碎料液pH为7.0～9.0并加入复合蛋白酶A，以所述甲鱼碎料液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶A的加入量为1.0～5.0％，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼碎料液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼酶解产物；
S2.过滤分离所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物离心得到甲鱼肉水相产物和甲鱼肉油相产物；
S3.于60～70℃条件下，对所述甲鱼肉水相产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼肉脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉；
S4.将所述步骤S2中得到的甲鱼碎骨与纯净水混合均匀并高压蒸煮1～5h后得到碎骨混合液，过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；
S5.调节所述甲鱼骨蛋白液的pH为7.0～9.0并向所述甲鱼骨蛋白液中加入复合蛋白酶B，以所述甲鱼骨蛋白液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶B的加入量为1.0～5.0％，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼骨蛋白液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；
S6.于60～70℃条件下，对所述甲鱼骨蛋白酶解产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲鱼骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨蛋白精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉；
S7.所述步骤S4中洗涤后的骨渣经漂洗、脱水、烘干、粉碎后得到甲鱼背甲粉；
S8.将所述步骤S2中的甲鱼肉油相产物和所述步骤S4中的甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
本发明提供的集成提取方法具有如下所述的优点：
(1)以液体中蛋白质为指标进行复合蛋白酶的精准投放，保证酶解条件最适，降低运行成本、保证工艺的稳定；
(2)甲鱼肉不经蒸煮直接酶解，保留甲鱼肉中原有蛋白酶的活性，可以减少用酶量，降低生产成本，同时避免高温蒸煮影响甲鱼肉口感，提高产品质量；
(3)复合蛋白酶A、B经单酶筛选和优化组合，提高了酶解的效率，低聚肽产品收率超过15％，产品分子量小于1kDa的低聚肽占总蛋白比例超过98％；
(4)产品均通过脱色、脱腥处理，口感好，不腥不苦；
(5)将甲鱼肉、甲鱼骨中活性成分甲鱼肉低聚肽、甲鱼骨蛋白低聚肽、甲鱼油和甲鱼背甲粉全部分离，使甲鱼肉、骨资源得到充分利用，降低了这些产品的原料成本，大大提高了企业经济效益，同时又做到除清洗设备的少量废水外无废物排放，减轻了环境污染。
附图说明
图1是本发明的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。
在以下本发明的具体实施方式中，请参阅图1，图1是本发明的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法的流程示意图。
如图1所示，本发明的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，包括以下步骤：
S1.将甲鱼去内脏后绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水得到甲鱼碎料液，调节所述甲鱼碎料液pH为7.0～9.0并加入复合蛋白酶A，以所述甲鱼碎料液中的蛋白质重量为100％计，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼碎料液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼酶解产物；
S2.过滤分离所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物离心得到甲鱼肉水相产物和甲鱼肉油相产物；
S3.于60～70℃条件下，对所述甲鱼肉水相产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼肉脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉；
S4.将所述步骤S2中得到的甲鱼碎骨与纯净水混合均匀并高压蒸煮1-5h后得到碎骨混合液，过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；
S5.调节所述甲鱼骨蛋白液的pH为7.0～9.0并向所述甲鱼骨蛋白液中加入复合蛋白酶B，以所述甲鱼骨蛋白液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶B的加入量为1.0～5.0％，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼骨蛋白液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；
S6.于60～70℃条件下，对所述甲鱼骨蛋白酶解产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲鱼骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨蛋白精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉；
S7.所述步骤S4中洗涤后的骨渣经漂洗、脱水、烘干、粉碎后得到甲鱼背甲粉；
S8.将所述步骤S2中的甲鱼肉油相产物和所述步骤S4中的甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
所述甲鱼油经过精制后可以得到饲料级别甲鱼油或者食用级别甲鱼油。
优选地，所述复合蛋白酶A至少包括AS1.398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶；使用所述几种蛋白酶复配得到的复合蛋白酶A能够将甲鱼碎料液中的甲鱼肉蛋白质酶解完全，并且复合蛋白酶A的加入量根据甲鱼碎料液中蛋白质重量变化，实现了复合蛋白酶A的精准投放，节约了成本。
优选地，所述AS1.398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的重量比为1：(0.3～3)：(0.15～2)：(0.08～1.5)，根据酶切位点的多少采用上述比例配置复合蛋白酶A能够提高酶切效率并且避免蛋白酶之间相互影响，几种蛋白酶之间的具体重量比可以根据各蛋白酶的酶活力进行调整。
优选地，步骤S5中以所述甲鱼骨蛋白液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶B的加入量为3.0～10.0％，所述复合蛋白酶B至少包括AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；复合蛋白酶B根据甲鱼骨蛋白液进行单酶筛选、优选组合后得到，提高了甲鱼骨中蛋白质的酶解效率并且酶解后低聚肽的含量更高。
优选地，所述AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为1：(0.25～1.5)：(0.08～0.7)；根据酶切位点的多少采用上述比例配置复合蛋白酶B能够提高酶切效率并且避免蛋白酶之间相互影响，几种蛋白酶之间的具体重量比可以根据各蛋白酶的酶活力进行调整。
优选地，步骤S3和S6中，所述脱腥处理包括向所述甲鱼肉水相产物或甲鱼骨蛋白酶解产物中加入脱腥剂并搅拌，所述脱腥剂选自β-环糊精、酵母粉中的至少一种；所述脱腥剂的用量可以根据脱腥剂的种类进行调整，优选所述脱腥剂为β-环糊精，β-环糊精的添加重量为甲鱼肉水相产物或甲鱼骨蛋白酶解产物中蛋白质重量的1.0～15.0％。
优选地，步骤S3和S6中，所述脱色处理包括使用活性炭柱过滤甲鱼肉水相产物或甲鱼骨蛋白酶解产物。
优选地，步骤S3和S6中，所述有机膜浓缩包括将所述甲鱼肉精滤液或甲鱼骨蛋白精滤液通过80Da有机膜过滤浓缩；所述减压蒸发包括将所述甲鱼肉精滤液或甲鱼骨蛋白精滤液在-0.08MPa～-0.09MPa、60℃～80℃条件下处理3～5h；采用有机膜过滤和减压蒸发的方法有助于精滤液中的酶解产物保持稳定，避免高温、高压使酶解产物变性。
优选地，步骤S3和S6中，所述陶瓷膜的孔径为40～60nm时能够进一步去除脱腥脱色液中的腥味物质和色素等杂质，进一步提高产品的质量。
优选地，步骤S3和S6中，所述干燥处理包括将所述甲鱼肉浓缩液或所述甲鱼骨蛋白浓缩液进行喷雾干燥处理。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
甲鱼的预处理：取100kg去内脏的洁净甲鱼在碎骨绞肉机中绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水至300L得到甲鱼碎料液，测定得到所述甲鱼碎料液中蛋白质的重量为15.85kg。
甲鱼肉的酶解：向所述甲鱼碎料液中加入CaO调节pH为8.0后加入400g复合蛋白酶A，于45℃条件下酶解3h后加入3M的HCl溶液调节酶解后甲鱼碎料液的pH为6.0，于80℃处理20min灭酶，得到甲鱼酶解产物；使用20目旋转筛过滤所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到下层甲鱼肉水相产物和上层甲鱼肉油相产物，将所述甲鱼肉水相产物与甲鱼肉油相产物分离；其中所述复合蛋白酶A中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、2709碱性蛋白酶(比活力2×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和菠萝蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：3：3：3。
甲鱼肉低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼肉水相产物中加入900g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼肉水相产物经活性炭柱过滤得到甲鱼肉脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉。
甲鱼骨的预处理：将甲鱼酶解产物中分离出来的甲鱼碎骨与40L纯净水混合均匀并于0.2MPa条件下蒸煮2h后得到碎骨混合液，使用20目旋转筛过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；测定所述甲鱼骨蛋白液中蛋白质的重量为5.85kg。
甲鱼骨蛋白的酶解；向所述甲鱼骨蛋白液中添加纯净水至100L，同时加入CaO使所述甲鱼骨蛋白液pH为8.0，然后向所述甲鱼骨蛋白液中加入140g复合蛋白酶B，于45℃条件下酶解3h，向所述酶解后甲鱼骨蛋白液中加入3M的HCl溶液调节pH为6.0，于80℃处理20min灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；其中，所述复合蛋白酶B中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和木瓜蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：0.2：0.05。
甲鱼骨蛋白低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼骨蛋白酶解产物中加入290g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼骨蛋白酶解产物经活性炭柱过滤得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉。
甲鱼背甲粉的制备：所述碎骨混合液中分离出的骨渣经漂洗、离心脱水、120℃烘干至含水量2％以下、粉碎后经150目筛分离得到甲鱼背甲粉。
甲鱼油的制备：将所述甲鱼肉油相产物和所述甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
经过上述步骤制备得到的甲鱼肉低聚肽粉13.47kg，收率为13.47％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼肉低聚肽含量的98.78％；甲鱼骨蛋白低聚肽粉4.38kg，收率为4.38％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼骨蛋白低聚肽含量的98.49％。
实施例2
甲鱼的预处理：取100kg去内脏的洁净甲鱼在碎骨绞肉机中绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水至300L得到甲鱼碎料液，测定得到所述甲鱼碎料液中蛋白质的重量为15.85kg。
甲鱼肉的酶解：向所述甲鱼碎料液中加入CaO调节pH为8.0后加入480g复合蛋白酶A，于45℃条件下酶解3h后加入3M的HCl溶液调节酶解后甲鱼碎料液的pH为6.0，于80℃处理20min灭酶，得到甲鱼酶解产物；使用20目旋转筛过滤所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到下层甲鱼肉水相产物和上层甲鱼肉油相产物，将所述甲鱼肉水相产物与甲鱼肉油相产物分离；其中所述复合蛋白酶A中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、2709碱性蛋白酶(比活力2×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和菠萝蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：0.3：0.15：0.08。
甲鱼肉低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼肉水相产物中加入900g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼肉水相产物经活性炭柱过滤得到甲鱼肉脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉。
甲鱼骨的预处理：将甲鱼酶解产物中分离出来的甲鱼碎骨与40L纯净水混合均匀并于0.2MPa条件下蒸煮2h后得到碎骨混合液，使用20目旋转筛过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；测定所述甲鱼碎料液中蛋白质的重量为5.85kg。
甲鱼骨蛋白的酶解；向所述甲鱼骨蛋白液中添加纯净水至100L，同时加入CaO使所述甲鱼骨蛋白液pH为8.0，然后向所述甲鱼骨蛋白液中加入140g复合蛋白酶B，于45℃条件下酶解3h，向所述酶解后甲鱼骨蛋白液中加入3M的HCl溶液调节pH为6.0，于80℃处理20min灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；其中，所述复合蛋白酶B中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和木瓜蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：0.25：0.08。
甲鱼骨蛋白低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼骨蛋白酶解产物中加入290g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼骨蛋白酶解产物经活性炭柱过滤得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉。
甲鱼背甲粉的制备：所述碎骨混合液中分离出的骨渣经漂洗、离心脱水、120℃烘干至含水量2％以下、粉碎后经150目筛分离得到甲鱼背甲粉。
甲鱼油的制备：将所述甲鱼肉油相产物和所述甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
经过上述步骤制备得到的甲鱼肉低聚肽粉14.25kg，收率为14.25％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼肉低聚肽含量的98.82％；甲鱼骨蛋白低聚肽粉4.69kg，收率为4.69％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼骨蛋白低聚肽含量的98.53％。
实施例3
甲鱼的预处理：取100kg去内脏的洁净甲鱼在碎骨绞肉机中绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水至300L得到甲鱼碎料液，测定得到所述甲鱼碎料液中蛋白质的重量为15.85kg。
甲鱼肉的酶解：向所述甲鱼碎料液中加入CaO调节pH为8.0后加入480g复合蛋白酶A，于45℃条件下酶解3h后加入3M的HCl溶液调节酶解后甲鱼碎料液的pH为6.0，于80℃处理20min灭酶，得到甲鱼酶解产物；使用20目旋转筛过滤所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到下层甲鱼肉水相产物和上层甲鱼肉油相产物，将所述甲鱼肉水相产物与甲鱼肉油相产物分离；其中所述复合蛋白酶A中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、2709碱性蛋白酶(比活力2×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和菠萝蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：3：2：1.5。
甲鱼肉低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼肉水相产物中加入900g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼肉水相产物经活性炭柱过滤得到甲鱼肉脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉。
甲鱼骨的预处理：将甲鱼酶解产物中分离出来的甲鱼碎骨与40L纯净水混合均匀并于0.2MPa条件下蒸煮2h后得到碎骨混合液，使用20目旋转筛过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物加入管式离心机中，以10000r/min离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；测定所述甲鱼碎料液中蛋白质的重量为5.85kg。
甲鱼骨蛋白的酶解；向所述甲鱼骨蛋白液中添加纯净水至100L，同时加入CaO使所述甲鱼骨蛋白液pH为8.0，然后向所述甲鱼骨蛋白液中加入140g复合蛋白酶B，于45℃条件下酶解3h，向所述酶解后甲鱼骨蛋白液中加入3M的HCl溶液调节pH为6.0，于80℃处理20min灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；其中，所述复合蛋白酶B中AS1.398中性蛋白酶(比活力1×105U/g)、胰蛋白酶(比活力1×105U/g)和木瓜蛋白酶(比活力6×105U/g)的重量比为1：1.5：0.7。
甲鱼骨蛋白低聚肽粉的制备：于65℃条件下，向所述甲鱼骨蛋白酶解产物中加入290g的β-环糊精，搅拌20min脱腥，脱腥后的甲鱼骨蛋白酶解产物经活性炭柱过滤得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液；使用50nm孔径的陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨精滤液通过截留孔径80Da的有机膜进行浓缩至固含量达到15％，然后于-0.085MPa、70℃条件下处理4h减压蒸发至固含量达到40％得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液喷雾干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉。
甲鱼背甲粉的制备：所述碎骨混合液中分离出的骨渣经漂洗、离心脱水、120℃烘干至含水量2％以下、粉碎后经150目筛分离得到甲鱼背甲粉。
甲鱼油的制备：将所述甲鱼肉油相产物和所述甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
经过上述步骤制备得到的甲鱼肉低聚肽粉14.37kg，收率为14.37％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼肉低聚肽含量的98.79％；甲鱼骨蛋白低聚肽粉4.66kg，收率为4.66％，产品中分子量小于1kDa的低聚肽占甲鱼骨蛋白低聚肽含量的98.93％。
通过实施例1～3可以看出,本发明提供的集成提取方法具有如下所述的优点：
(1)以液体中蛋白质为指标进行复合蛋白酶的精准投放，保证酶解条件最适，降低运行成本、保证工艺的稳定；
(2)甲鱼肉不经蒸煮直接酶解，保留甲鱼肉中原有蛋白酶的活性，可以减少用酶量，降低生产成本，同时避免高温蒸煮影响甲鱼肉口感，提高产品质量；
(3)复合蛋白酶A、B经单酶筛选和优化组合，提高了酶解的效率，低聚肽产品收率超过15％，产品分子量小于1kDa的低聚肽占总蛋白比例超过98％；
(4)产品均通过脱色、脱腥处理，口感好，不腥不苦；
(5)将甲鱼肉、甲鱼骨中活性成分甲鱼肉低聚肽、甲鱼骨蛋白低聚肽、甲鱼油和甲鱼背甲粉全部分离，使甲鱼肉、骨资源得到充分利用，降低了这些产品的原料成本，大大提高了企业经济效益，同时又做到除清洗设备的少量废水外无废物排放，减轻了环境污染。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将甲鱼去内脏后绞碎得到甲鱼碎，向所述甲鱼碎中加入纯净水得到甲鱼碎料液，调节所述甲鱼碎料液pH为7.0～9.0并加入复合蛋白酶A，以所述甲鱼碎料液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶A的加入量为1.0～5.0％，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼碎料液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼酶解产物；
S2.过滤分离所述甲鱼酶解产物得到甲鱼碎骨和甲鱼肉液体产物，将所述甲鱼肉液体产物离心得到甲鱼肉水相产物和甲鱼肉油相产物；
S3.于60～70℃条件下，对所述甲鱼肉水相产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼肉脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼肉脱腥脱色液得到甲鱼肉精滤液，将所述甲鱼肉精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼肉浓缩液，将所述甲鱼肉浓缩液干燥后得到甲鱼肉低聚肽粉；
S4.将所述步骤S2中得到的甲鱼碎骨与纯净水混合均匀并蒸煮1～5h后得到碎骨混合液，过滤所述碎骨混合液得到骨渣和碎骨液体产物，使用纯水洗涤所述骨渣得到骨渣洗液，将所述骨渣洗液加入所述碎骨液体产物中，将所述碎骨液体产物离心得到甲鱼骨蛋白液和甲鱼骨油相产物；
S5.调节所述甲鱼骨蛋白液的pH为7.0～9.0并向所述甲鱼骨蛋白液中加入复合蛋白酶B，以所述甲鱼骨蛋白液中的蛋白质重量为100％计，所述复合蛋白酶B的加入量为1.0～5.0％，于40～50℃条件下酶解2～5h，调节所述酶解后甲鱼骨蛋白液的pH为5.5～6.5，于70～90℃灭酶得到甲鱼骨蛋白酶解产物；
S6.于60～70℃条件下，对所述甲鱼骨蛋白酶解产物进行脱腥和脱色处理得到甲鱼骨蛋白脱腥脱色液，使用陶瓷膜过滤所述甲鱼骨蛋白脱腥脱色液得到甲鱼骨蛋白精滤液，将所述甲鱼骨蛋白精滤液通过有机膜浓缩、减压蒸发得到甲鱼骨蛋白浓缩液，将所述甲鱼骨蛋白浓缩液干燥后得到甲鱼骨蛋白低聚肽粉；
S7.所述步骤S4中洗涤后的骨渣经漂洗、脱水、烘干、粉碎后得到甲鱼背甲粉；
S8.将所述步骤S2中的甲鱼肉油相产物和所述步骤S4中的甲鱼骨油相产物混合后得到甲鱼油。
2.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶A至少包括AS1.398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶。
3.根据权利要求2中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，所述AS1.398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的重量比为1：(0.3～3)：(0.15～2)：(0.08～1.5)。
4.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶B至少包括AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求4中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，所述AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为1：(0.25～1.5)：(0.08～0.7)。
6.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，步骤S3和S6中，所述脱腥处理包括向所述甲鱼肉水相产物或甲鱼骨蛋白酶解产物中加入脱腥剂并搅拌，所述脱腥剂选自β-环糊精、酵母粉中的至少一种。
7.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，步骤S3和S6中，所述脱色处理包括使用活性炭柱过滤甲鱼肉水相产物或甲鱼骨蛋白酶解产物。
8.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，步骤S3和S6中，所述有机膜浓缩包括将所述甲鱼肉精滤液或甲鱼骨蛋白精滤液通过80Da有机膜过滤浓缩；所述减压蒸发包括将所述甲鱼肉精滤液或甲鱼骨蛋白精滤液在-0.08MPa～-0.09MPa、60℃～80℃条件下处理3～5h。
9.根据权利要求1中所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，步骤S3和S6中，所述陶瓷膜的孔径为40～60nm。
10.根据权利要求1所述的一种甲鱼中多种生物活性成分集成提取的方法，其特征在于，步骤S3和S6中，所述干燥处理包括将所述甲鱼肉浓缩液或所述甲鱼骨蛋白浓缩液进行喷雾干燥处理。
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