CN112410323B - 一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法经过石油醚脱脂，超声波辅助提取凝乳酶，脱盐，冷冻浓缩，饱和硫酸铵梯度沉淀，离心，透析袋脱盐，冷冻干燥，得到羔羊皱胃总凝乳酶；再经阴离子交换色谱柱用氯化钠溶液梯度洗脱获得两种离子强度的凝乳酶，经透析袋脱盐，冷冻干燥得精制凝乳酶。再将两种离子强度的凝乳酶部位B1和B2分别用HPLC凝胶柱分离，得到了B1‑P1,B2‑P1,P2等凝乳酶活性成分，其中B2‑P2电泳条带含杂质条带，因此只取B1‑P1和B2‑P1作为凝乳酶标准品。通过本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品，凝乳酶活性高，纯度高，电泳条带清晰；方法成熟，操作简单不繁琐，易于放大大量制备；获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品可以用于医药和食品领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法。
背景技术
蛋白质和多肽是人体生命功能承载体，从天然来源功能性新蛋白质和多肽是寻找新功能化合物的主要途径。我国民族医学的优良传统和实践应用的悠久历史，利用现代生物技术，从动植物中药材为代表的生物资源中大量筛选发掘生物活性成份，用于新药，保健品和化妆品的研发，并展现出强大的应用价值，经济前景和社会效益。动物药是传统中药的重要组成部分，与植物药相比，动物药基础理论研究相对较少，其活性组分的研究远远滞后于植物药的研究。动物的器官，组织或代谢产物等富含蛋白等生物信息大分子物质，这些成分往往对提取分离纯化操作条件严苛，通过有机溶剂提取，加热干燥的方法就可大量破坏，此外操作温度，pH等因素对活性影响导致传统的提取分离方法难以达到理想的结果。利用现代化分离纯化技术，超声波辅助提取可以大大缩短原料的提取时间，低温控制系统下的色谱分离纯化有利于控制操作温度，可以获得生物活性高的蛋白质和多肽成分。
凝乳酶(chymosin)，是新生哺乳动物胃黏膜以无活性的前体物—凝乳酶原形式分泌的一种具有催化凝乳作用的酸性蛋白酶，在胃液酸性环境中，凝乳酶原从N-端释放一部分肽段，形成不可逆的活性酶—凝乳酶。凝乳酶通过降解k-酪蛋白中的Phe-Met肽键形成para-k-酪蛋白和水溶性糖巨肽，使酪蛋白失去稳定性，在Ga2+的参与下形成凝乳。凝乳酶的凝乳作用在奶酪生产和消化不良引起的消化道疾病的治疗作用很大。在奶酪制备工业反刍动物来源的凝乳酶产生的奶酪风味，软硬程度，以及凝乳时间都优于单胃动物，植物和微生物来源的凝乳酶。目前应用最广泛的商业化动物凝乳酶有小牛皱胃酶，因为市场需求量庞大，水牛凝乳酶作为牛凝乳酶的替代品在印度应用广泛。羊是新疆畜牧业的主要组成部分，有大量羔羊皱胃资源，而且羊皱胃凝乳酶因为它的凝乳作用和奶酪品质与牛凝乳酶更为相似，并且有独特的风味，是替代牛凝乳酶，填补市场空缺的最佳选择。但羔羊皱胃凝乳酶目前没有系统的分离纯化方法可以制备纯度高，活性高的商品化凝乳酶，本发明可以填补食品工业中羔羊皱胃凝乳酶应用的技术和质量标准空缺。
羔羊胃提取物是以羔羊第四胃为原料提取的生物活性物质，主要含有蛋白酶，凝乳酶，粘多糖，胃膜素，双岐因子及多肽类等成分，该提取物最初被用来治疗胃功能低下和胃切除引起消化障碍。利用羔羊皱胃开发生化药物的相关报道较早出现在60年代的苏联，相继有日本，还有我国也上市了以绵羔羊第四胃提取物中凝乳酶制成治疗消化道疾病的药物。羔羊胃提取物复方胶囊1985年在我国成功上市，成为当时拥有我国独立知识产权的复方新药。该复方制剂经过多年的临床使用，被证实可用于治疗各种慢性胃炎，并且无任何毒副作用及耐药性。但是，随着科学技术的发展，此类药物已有的模糊的质量检测标准已经不能满足现代的药品生产要求。羔羊皱胃凝乳酶作为明确的药效成分尚没有标准品用以相关药品的质量控制评价。本发明制备的羔羊皱胃凝乳酶标准品填补了这一空缺。
羔羊皱胃是新疆羊肉产业的副产品，新疆本地企业以用羔羊皱胃为原料生产以凝乳酶为主要药效成分的生化药物。市面上有的动物来源凝乳酶标准品为牛凝乳酶，凝乳酶的分子量大小，理化性质与羊皱胃凝乳酶有所不同，因此不能用于羊皱胃凝乳酶的质量控制。本发明的创新点是利用羊皱胃原料药，用硫酸铵沉淀法富集凝乳酶后经过阴离子交换树脂分离纯化得到两种离子强度的凝乳酶部位B1和B2,再利用HPLC凝胶柱色谱分离纯化手段分离纯化得到准品B1-P1和B2-P1。这一发明为新疆当地以羔羊皱胃为原料生产生化药物的药企提供了纯度高，酶活力高，分子量范围明确的羊凝乳酶。本发明方法制备的凝乳酶标准品用于凝乳酶为主要药效成分的羔羊皱胃相关药品以及食品工业的质量控制。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种提高羔羊皱胃凝乳酶标准品纯度的方法，该方法经过石油醚脱脂，超声波辅助提取凝乳酶，脱盐，冷冻浓缩，饱和硫酸铵梯度沉淀，离心，透析袋脱盐，冷冻干燥，得到羔羊皱胃总凝乳酶；再经阴离子交换色谱柱用氯化钠溶液梯度洗脱获得两种离子强度的凝乳酶，经透析袋脱盐，冷冻干燥得精制凝乳酶。再将两种离子强度的凝乳酶部位B1和B2分别用HPLC凝胶柱分离，得到了B1-P1,B2-P1,P2等凝乳酶活性成分，其中B2-P2电泳条带含杂质条带，因此只取B1-P1和B2-P1作为凝乳酶标准品。通过本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品，凝乳酶活性高，纯度高，电泳条带清晰；方法成熟，操作简单不繁琐，易于放大大量制备；获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品可以用于医药和食品领域。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，按下列步骤进行：
提取凝乳酶：
a、将已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度4-10℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；
b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的0.5％～5％氯化钠溶液以料液比1:18-1:25g/ml，在温度4-10℃，超声功率400瓦下，超声30分钟，提取2次，在温度4℃，8000转/分钟下离心10分钟，取上清液；
c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至1/5体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；
总凝乳酶制备：
d、将步骤c得到的脱盐后凝乳酶提取液冷冻浓缩至提取液的1/4～1/6体积，用0.5mol的氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶，备用；
e、将步骤d得到的溶液体积，称取30％饱和度的硫酸铵搅拌溶解，在温度4-10℃下静止12小时后，在温度4℃，5000转/min条件下离心10分钟，取上清液，用50％饱和硫酸铵继续沉淀后，5000转/min条件下离心10分钟，将上清液用90％饱和硫酸铵沉淀4h后，离心弃去上清液，得到沉淀物；
f、将步骤e得到的90％饱和硫酸铵沉淀物用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥得到羔羊皱胃总凝乳酶粉末，得到总凝乳酶；
凝乳酶部位：
g、将步骤f得到的总凝乳酶用0.05摩尔pH 5.8的磷酸盐缓冲液溶解配置浓度为15mg/ml的样品溶液；用0.05摩尔pH 5.8的磷酸盐缓冲液平衡DEAE阴离子交换树脂，将样品溶液以0.6ml/min的流速依次用pH 5.8的磷酸盐缓冲液，0.1-0.5摩尔的氯化钠溶液梯度洗脱；
h、分别收集0.3，0.4摩尔氯化钠洗脱部位，用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析4次后，每4个小时换1次水，透析7次后冷冻干燥，得到代号分别为B1,B2的凝乳酶部位；
羔羊皱胃凝乳酶标准品：
i、将步骤g中获得的凝乳酶部位B1,B2，分别用氯化钠溶液溶解，配置成10mg/ml的B1,B2的样品溶液，再用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：氯化钠溶液，上样量：30μL，洗脱液流速：0.4ml/min，再用透析袋脱盐，开始2个小时换1次水，透析2次后，每4个小时换1次水，透析4次，即获得羔羊皱胃凝乳酶标准品。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法包括羔羊皱胃原料药的脱脂，羔羊皱胃凝乳酶的提取，富集凝乳酶制备羔羊皱胃总凝乳酶后利用阴离子交换柱色谱分离纯化得凝乳酶部位，以及高效液相凝胶色谱仪分离纯化凝乳酶标准品。原料药经过石油醚脱脂，氯化钠溶液超声波辅助提取后透析袋脱盐，冷冻浓缩，硫酸铵梯度沉淀法依次用30％，50％，90％饱和硫酸铵梯度沉淀法沉淀，90％沉淀部位透析袋脱盐，冷冻干燥制备羔羊皱胃总凝乳酶；羔羊皱胃总凝乳酶经过DEAE阴离子交换色谱柱和高效液相凝胶色谱柱分离纯化得到两种凝乳酶部位B1,B2；两种凝乳酶经HPLC凝胶色谱仪分离纯化得凝乳酶标准品B1-P1和B2-P1。经凝乳酶活力测定：本发明得到的羔羊皱胃总凝乳酶酶活力18341.6U/g，每100原料平均可以获得0.9克总凝乳，产率为0.9％；总凝乳酶经离子交换色谱柱分离纯化获得两种离子强度的凝乳酶部位B1和B2，凝乳酶活力分别为15716.8U/g和25557.1U/g，每100mg原料药可以获得0.23克纯凝乳酶，产率为0.23％；两个凝乳酶活性部位经HPLC凝胶柱分析和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以及凝乳酶活力测定结果显示，凝乳酶标准品B1-P1和B2-P1为两种离子强度不同，分子量相似的两种凝乳酶。本发明方法制备的羔羊皱胃总凝乳酶与市面上已有的凝乳酶国家标准品相比具有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带清晰，分子量范围明确，凝乳酶活力高，纯度高的特点，凝乳酶活力是国家标准品的20.8倍。现有的凝乳酶国家标准品为牛凝乳酶，不同来源的凝乳酶理化性质以及分子量有所区别因此现有的凝乳酶标准品无法作为羊来源凝乳酶产品的标准品使用。该方法首次制备了羔羊皱胃凝乳酶标准品，填补了羔羊皱胃凝乳酶没有标准品评价产品质量的先前空缺，为羔羊皱胃产品建立了质量标准。该分离纯化方法在工业上具有操作方便，易于放大，酶活力回收率高等特点。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法采用了以凝乳酶活性和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及高效液相色谱特征为导向的羔羊皱胃凝乳酶的分离纯化方法，提高了分离纯化方法的有效性和目的性；利用饱和硫酸铵梯度沉淀有效富集凝乳酶成分，同时除去杂质蛋白提高凝乳酶纯度；利用阴离子交换色谱柱根据蛋白质离子强度的不同分离纯化，得到两种不同离子强度的凝乳酶部位，利用高效液相凝胶柱色谱分离进一步分离纯化凝乳酶部位，获得两种不同的离子强度及分子量相近的高纯度的凝乳酶标准品；
通过本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品，其中羔羊皱胃总凝乳酶活力18340U/g；凝乳酶部位B1和B2凝乳酶活力分别为15940U/g和25557U/g，将其HPLC凝胶柱分离纯化得到的两种标准品为B1-P1和B2-P1。
通过本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品，精制凝乳酶或凝乳酶部位B1,B2和标准品B1-P1和B2-P1纯度高，凝乳酶活性高，而且分离纯化方法简单可行，分离纯化的全过程在低温，避光条件下操作，更好的保留了凝乳酶的活性，可用于治疗或预防消化不良引起的胃肠道疾病药物或食品工业中奶酪的生产中的用途。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法中羔羊皱胃凝乳酶是从羔羊的皱胃或第四胃得到的酸性消化酶，在消化系统中和胃蛋白酶共同参与食物的化学消化；凝乳酶的主要作用是通过降解k-酪蛋白中的Phe-Met肽键形成para-k-酪蛋白和水溶性糖巨肽，使酪蛋白失去稳定性，在Ga2+的参与下形成凝乳；凝乳酶稳定性差，对温度，pH敏感，容易失活，容易被微生物污染；操作时间，温度，pH以及分离纯化方法是提高凝乳酶回收率，酶活力和纯度的重要因素。本发明的优点是在低温，避光条件下，利用石油醚脱脂，氯化钠溶液提取，饱和硫酸铵盐析和阴离子交换柱色谱等方法快速，大量制备总凝乳以及高纯度，高活性的精致凝乳酶，利用高效液相色谱仪等现代化分离技术纯化凝乳酶标准品。整套分离纯化操作具有操作简便，易放大，回收率高等特点，弥补了羔羊皱胃凝乳酶没有相应的现代化分离纯化工艺的欠缺，建立了凝乳质量标准。
附图说明
图1为本发明二喹啉甲酸法测定蛋白含量的标准曲线，其中方程式为：y＝-299.1266X+2114.976，相关系数为0.999蛋白含量对比图；
图2为本发明30％，50％，90％饱和硫酸铵梯度沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶酶活力对比图；其中30％，50％，90％分别为饱和硫酸铵梯度沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶；
图3为本发明30％，50％，90％的饱和硫酸铵梯度沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶的SDS-PAGE电泳对比图。其中P：胃蛋白酶标准品，35kDa；N：凝乳酶国家标准品；原：羔羊皱胃原料药；NaCl：羔羊皱胃凝乳酶提取物30％，50％，90％分别代表30％，50％，90％的饱和硫酸铵沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶电泳泳道；
图4为本发明DEAE阴离子交换树脂分离纯化羔羊皱胃总凝乳酶的色谱图；
图5为本发明DEAE阴离子交换树脂分离纯化羔羊皱胃总凝乳酶的SDS-PAGE电泳分析图，其中M：标准蛋白分子量marker；N：凝乳酶国家标准品，B1：凝乳酶部位B1；B2：凝乳酶部位B2；
图6为本发明羔羊皱胃凝乳酶部位B1的高效液相凝胶色谱图；
图7为本发明凝乳酶部位B1通过高效液相凝胶色谱柱分离的三个洗脱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M：标准蛋白分子量marker；P1，P2，P3分别对应色谱图中的P1，P2，P3；
图8为本发明凝乳酶部位B2通过高效液相凝胶色谱图；
图9为本发明凝乳酶部位B2通过高效液相凝胶色谱柱分离的三个洗脱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M：标准蛋白分子量marker；P1，P2，P3分别对应色谱图中的P1，P2，P3；
图10为本发明羔羊皱胃凝乳酶部位B1、B2、羔羊皱胃总凝乳酶与凝乳酶国家标准品HPLC凝胶柱色谱柱纯度比较图；其中GB：凝乳酶国家标准品；B1：羔羊皱胃凝乳酶部位B1；B2:羔羊皱胃凝乳酶部位B2；总：羔羊皱胃总凝乳酶；
图11为本发明羔羊皱胃总凝乳酶的制备方法工艺图；
图12为本发明羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法工艺图。
具体实施方式
实施例1
a、将按常规方法已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度4℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；
b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的0.5％氯化钠溶液以料液比1:18g/ml，在温度4℃，超声功率400瓦下，超声30分钟，提取2次，在温度4℃，8000转/分钟下离心10分钟，取上清液；
c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至1/5体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的羔羊皱胃凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；
总凝乳酶制备：
d、步骤c所得羔羊皱胃凝乳酶提取液冷冻浓缩至洗脱液的1/4，用0.5M氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶；
e、按步骤d测量的体积计算，称取30％，50％，90％饱和硫酸铵，在温度4℃下梯度沉淀，30％的饱和硫酸铵沉淀12h,5000rpm/min离心10min，上清液用50％度的饱硫酸铵沉淀12h后离心，取上清液继续用90％的饱和硫酸铵沉淀4h，离心；
f、将步骤所得30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀，离心得到的沉淀物，透析脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥，得到30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀的羔羊皱胃总凝乳酶粉末，测定凝乳酶活力，低温保存；
所得90％饱和硫酸铵沉淀的总凝乳酶干粉为0.155克，凝乳酶活力为13961U/g；30％浓度饱和硫酸铵沉淀沉淀部位0.018g，凝乳酶活力为3548U/g；50％饱和硫酸铵沉淀部位0.012克，凝乳酶活力为1127U/g；选择90％饱和硫酸铵沉淀部位为羔羊皱胃总凝乳酶，得率为0.775％，蛋白含量63.7％；
凝乳酶部位的制备：
g、将步骤f所得羔羊皱胃总凝乳酶用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液配置成浓度15mg/mL，上样于用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-52阴离子交换树脂，以0.6mL/min的流速，依次0.05mol pH 5.8的用磷酸盐缓冲液以及0.1-0.5M的氯化钠溶液梯度洗脱，测定洗脱液的凝乳酶活力；
h、分别收集步骤g中获得的0.3M，0.4M氯化钠溶液洗脱部位，透析脱盐，冷冻干燥，分别得代号为B1,B2的凝乳酶部位或精制凝乳酶；
B1和B2部位总得率为0.18％，酶活力分别为12872U/g和16531U/g,蛋白含量分别为87％和82％；
凝乳酶标准品的制备：
i、将步骤h所得凝乳酶部位B1,B2用1％氯化钠溶解配置成10mg/mL，用0.45μm滤头过滤，分别用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：1％氯化钠溶液，上样量：30μL，洗脱液流速：0.4ml/min，收集凝乳酶活性部位，分离纯化得高纯度的凝乳酶标准品。
实施例2
a、将按常规方法已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度8℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；
b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的2.5％氯化钠溶液以料液比1:22g/ml，在温度8℃，超声功率400瓦下，超声30分钟，提取2次，在温度4℃，8000转/分钟下离心10分钟，取上清液；
c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至1/5体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的羔羊皱胃凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；
总凝乳酶制备：
d、步骤c所得羔羊皱胃凝乳酶提取液冷冻浓缩至洗脱液的1/5，用0.5M氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶；
e、按步骤d测量体的积计算，称取饱和硫酸铵，在温度8℃下，用30，50％，90％饱和度硫酸铵梯度沉淀：30％的饱和硫酸铵沉淀12h,5000rpm/min离心10min，上清液用50％的饱硫酸铵沉淀12h后离心，取上清液继续用90％的饱和硫酸铵沉淀4h，离心；
f、将步骤所得30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀，离心得到的沉淀物透析脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥，得到30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀的羔羊皱胃总凝乳酶粉末，测定凝乳酶活力，低温保存；
所得90％饱和硫酸铵沉淀的总凝乳酶干粉为0.169克，凝乳酶活力为15961U/g；30％饱和硫酸铵沉淀沉淀部位0.019g，凝乳酶活力为3978U/g；50％饱和硫酸铵沉淀部位0.012克，凝乳酶活力为1327U/g；选择90％饱和硫酸铵沉淀部位为羔羊皱胃总凝乳酶，得率为0.845％，蛋白含量69.9％；
凝乳酶部位的制备：
g、步骤f所得羔羊皱胃总凝乳酶用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液配置成浓度15mg/mL，上样于用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-52阴离子交换树脂，以0.6mL/min的流速，依次0.05mol pH 5.8的用磷酸盐缓冲液以及0.1-0.5M的氯化钠溶液梯度洗脱，测定洗脱液的凝乳酶活力；
h、分别收集步骤g中获得的0.3M，0.4M氯化钠溶液洗脱部位，透析脱盐，冷冻干燥，分别得代号为B1,B2的凝乳酶部位或精制凝乳酶；
B1和B2部位总得率为0.21％，酶活力分别为14871U/g和18539U/g，蛋白含量分别为88％和81％；
凝乳酶标准品的制备：
i、将步骤h所得凝乳酶部位B1，B2用1％氯化钠溶解配置成10mg/mL，用0.45μm滤头过滤，分别用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：1％氯化钠溶液，上样量：30μL，洗脱液流速：0.4ml/min，收集凝乳酶活性部位，分离纯化得高纯度的凝乳酶标准品。
实施例3
a、将按常规方法已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度10℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；
b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的5％氯化钠溶液以料液比1:25g/ml，在温度10℃，超声功率400瓦下，超声30分钟，提取2次，在温度10℃，8000转/分钟下离心10分钟，取上清液；
c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至1/5体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的羔羊皱胃凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；
总凝乳酶制备：
d、步骤c所得羔羊皱胃凝乳酶提取液冷冻浓缩至洗脱液的1/6，用0.5M氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶；
e、按步骤d测量体的积计算，称取饱和硫酸铵，在温度8℃下，用30，50％，90％饱和度硫酸铵梯度沉淀，30％的饱和硫酸铵沉淀12h，5000rpm/min离心10min，上清液用50％的饱硫酸铵沉淀12h后离心，取上清液继续用90％的饱和硫酸铵沉淀4h，离心；
f、将步骤所得30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀，离心得到的沉淀物，透析脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥，得到30％，50％，90％饱和硫酸铵沉淀的羔羊皱胃总凝乳酶粉末，测定凝乳酶活力，低温保存；
得到90％饱和硫酸铵沉淀的总凝乳酶干粉为0.189克，凝乳酶活力为18964U/g；30％饱和硫酸铵沉淀沉淀部位0.026g，凝乳酶活力为4748U/g；50％饱和硫酸铵沉淀部位0.019克，凝乳酶活力为1627U/g；选择90％饱和硫酸铵沉淀部位为羔羊皱胃总凝乳酶，得率为0.945％，蛋白含量71.2％；
凝乳酶部位的制备：
g、步骤f所得羔羊皱胃总凝乳酶用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液配置成浓度15mg/mL，上样于用0.05mol pH 5.8的磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-52阴离子交换树脂，以0.6mL/min的流速，依次0.05mol pH 5.8的用磷酸盐缓冲液以及0.1-0.5M的氯化钠溶液梯度洗脱，测定洗脱液的凝乳酶活力；
h、分别收集步骤f中获得的0.3M，0.4M氯化钠溶液洗脱部位，透析脱盐，冷冻干燥，分别得代号为B1,B2的凝乳酶部位或精制凝乳酶；
B1和B2部位的总得率为0.23％，酶活力分别为1587U/g和25553U/g，蛋白含量分别为92％和83％；
凝乳酶标准品的制备：
i、将步骤h所得凝乳酶部位B1，B2用1％氯化钠溶解配置成10mg/mL，用0.45μm滤头过滤，分别用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：1％氯化钠溶液，上样量：30μL，洗脱液流速：0.4ml/min，收集凝乳酶活性部位，分离纯化得高纯度的凝乳酶标准品。
实施例4
羔羊皱胃凝乳酶标准品的纯度分析：
利用进行HPLC凝胶柱色谱法对羔羊皱胃凝乳酶部位B1，B2羔羊皱胃总凝乳酶与凝乳酶国家标准品进行纯度比较：用1％氯化钠将上述四个样品溶解配置成5mg/mL，0.45μm滤头过滤，分别用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分析，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：1％氯化钠溶液，上样量：10μL，洗脱液流速：0.4ml/min，收集凝乳酶活性部位，分离纯化得高纯度的凝乳酶标准品。
凝乳酶标准品活力测定：
按照Arima等(1970)的方法，对原料药以及原料药提取物进行凝乳酶活力测定：
底物溶液的制备：取全脂奶粉12g，加入氯化钙溶液(取醋酸钠1.25g，氯化钙0.55g，加水至400mL，调节pH至6.3，定容至500mL)，定容至100ml摇匀，此溶液现用现配；
标准品溶液的制备：精密称取凝乳酶标准品4mg，滴入几滴pH 6.3磷酸盐缓冲液研磨，使分散均匀，加入缓冲液定容至10ml，即得到每1mL约含0.4个活力单位(约在240S内凝结)的标准品溶液，4℃保存，在配置2h后使用；
样品溶液的制备：将精密称取10mg原料药及原料药提取物提取物，照标准品溶液制备方法配置5mL，即浓度为2mg/mL的样品溶液；
样品测定：精密量取底物溶液10mL，置于试管中，在温度30±0.5℃恒温水浴中预热10min，然后加入标准品溶液1mL，混匀后马上开始计时，并用玻璃棒蘸取混合液，使其沿管壁不断的留下形成均匀的薄层，当肉眼可见片状的凝结块时，立即记录时间。此操作重复测定3次，保证其相对标准偏差值小于5％，所得平均值即为标准品溶液的凝结时间。样品溶液同样按上述方法测定，按下式计算：
式中S为标准品的活力，Ru/mg；TS为标准品溶液的平均凝结时间，S；T为样品溶液的平均凝结时间，S；WS为1mL标准品溶液中含凝乳酶标准品的量，g；W为样品取样量，g；N为样品稀释倍数；
蛋白质种类和分子量测定：
参照Laemmli(1970)报道的方法，利用SDS-PAGE法对原料药以及分离纯化的部位进行蛋白和多肽成分分析；
试剂配制及样品处理：
样品的处理：称取5mg样品溶于500μL蒸馏水中，加入1/4体积样品缓冲液，摇匀，95℃下加热10min，10,000rpm下离心2min；
15％分离胶配制：2.3mL的H2O，5mL的30％(W/V)丙烯酰胺(凝胶贮液)，2.5mL的1.5moL/L的Tris-HCL(pH 8.8)，0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1mL的10％(W/V)过硫酸铵，0.006mL的四甲基乙二胺；
5％积层胶配制：0.68mL的H2O，0.17mL的30％(W/V)丙烯酰胺(凝胶贮液)，0.13mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH＝6.8)，0.01mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)，0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵，0.001mL的四甲基乙二胺；
电泳条件：恒压75V，40min，然后恒压150V，90min；
考马斯亮蓝固定液：25％异丙醇，10％的冰醋酸，65％水；
考马斯亮蓝染色液：将0.6g的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤，棕色瓶储存；
考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇，7％的冰醋酸，88％水；
电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2h，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止；
蛋白含量测定方法：
利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定实施1-3所得的羔羊皱胃凝乳酶样品中的蛋白含量；
标准曲线的绘制：根据BCA蛋白含量测定试剂盒说明书操作配置工作液，酶50倍提体积的BCA试剂A溶液加1倍体积的BCA试剂B溶液，充分混匀备用；根据表1吸取试剂盒中蛋白标准品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀，各管分别取25μL于九十六孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微震荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30分钟，取96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长562nm，每个做三个平行，以吸光度为坐标，蛋白含量为横坐标进行回归运算；
表1、系列稀释牛血清蛋白(BSA)标准品
样品测定：
精密称取2.5毫克样品，加入1毫升0.9％氯化钠溶液溶解，10000转离心2分钟，按照标准曲线操作法，取25μL样品溶液与96孔板，各加入175μL BCA工作液，轻微震荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30分钟，取96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长562nm。每个做三个平行，按照标准曲线测定蛋白含量。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法图2中30％，50％，90％饱和硫酸铵梯度沉淀得到的30％，50％，90％羔羊皱胃总凝乳酶的酶活力比较可以看出，90％浓度的饱和硫酸铵沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶的酶活力最高；由图3中SDS-PAGE电泳条带以及得率的比较可以得出，30％和50％的饱和硫酸铵沉淀在羔羊皱胃总凝乳酶制备过程中起了除去杂质的作用，提高了90％饱和硫酸铵沉淀得到的羔羊皱胃总凝乳酶的纯度，因此90&饱和硫酸铵沉淀得到的总凝乳酶为本发明制备的羔羊皱胃总凝乳酶；
图4中羔羊皱胃凝乳酶部位B1和B2是两种离子强度的氯化钠溶液脱下来的，说明离子强度不同；由图5可以看出通过DEAE-52阴离子交换树脂分离纯化凝乳酶是有效且可行的；由图6和8羔羊皱胃凝乳酶标准品B1-P1和B2-P1的HPLC凝胶色谱图，凝胶柱的原理是按分子量大小达到分离效果，出峰时间和分子量分为相对应，图中B1-P1和B2-P1的出峰时间相近，因此B1-P1和B2-P是分子量相近两种凝乳酶；结合凝乳酶活力结果可得B1-P1和B2-P1是离子强度不同、分子量相近、凝乳酶活力不同的两种凝乳酶；
图7，图9的SDS-PAGE电泳可以看出：羔羊皱胃凝乳酶标准品B1-P1和B2-P1条带为单一条带，而凝乳酶国家标准品含其他杂质条带；图10中羔羊皱胃凝乳酶部位B1、B2羔羊皱胃总凝乳酶与凝乳酶国家标准品进行纯度和酶活力比较可以看出：本发明制备的羔羊皱胃凝乳酶标准品的酶活力，以及纯度都比凝乳酶国家标准品的高。本发明不仅首次制备了羔羊皱胃凝乳酶而且纯度比现有的牛来源的凝乳酶国家标准品高。
Claims (1)
1.一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
提取凝乳酶：
a、将已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度4-10℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；
b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的0.5%-5%氯化钠溶液以料液比1:18-1:25g/ml，在温度4-10℃，超声功率400瓦下，超声 30分钟，提取2次，在温度4℃，8000转/分钟下离心10分钟，取上清液；
c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至1/5体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；
总凝乳酶制备：
d、将步骤c得到的脱盐后凝乳酶提取液冷冻浓缩至提取液的1/4-1/6体积，用0.5mol的氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶，备用；
e、将步骤d得到的溶液体积，称取30% 饱和度的硫酸铵搅拌溶解，在温度4-10℃下静止12小时后，在温度4℃，5000转/min条件下离心10分钟，取上清液，用50%饱和硫酸铵继续沉淀后，5000转/min条件下离心10分钟，将上清液用90%饱和硫酸铵沉淀4h后，离心弃去上清液，得到沉淀物；
f、将步骤e得到的90%饱和硫酸铵沉淀物用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥得到羔羊皱胃总凝乳酶粉末，得到总凝乳酶；
凝乳酶部位：
g、将步骤f得到的总凝乳酶用0.05摩尔pH 5.8 的磷酸盐缓冲液溶解配置浓度为15mg/ml的样品溶液；用0.05摩尔pH 5.8的磷酸盐缓冲液平衡DEAE阴离子交换树脂，将样品溶液以0.6ml/min的流速依次用0.05摩尔pH 5.8的磷酸盐缓冲液，0.1-0.5摩尔的氯化钠溶液梯度洗脱；
h、分别收集0.3，0.4摩尔氯化钠洗脱部位，用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析4次后，每4个小时换1次水，透析7次后冷冻干燥，得到代号分别为B1,B2的凝乳酶部位，
羔羊皱胃凝乳酶标准品：
i、将步骤g 中获得的凝乳酶部位B1,B2，分别用氯化钠溶液溶解，配置成10 mg/ml的B1,B2的样品溶液，再用TSKgel 高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgel G300PWxL 7.8×30mm，7μm，流动相：氯化钠溶液，上样量：30µL，洗脱液流速：0.4ml/min，再用透析袋脱盐，开始2个小时换1次水，透析2次后，每4个小时换1次水，透析4次，即获得羔羊皱胃凝乳酶标准品。
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