CN1379090A

CN1379090A - 犊牛凝乳酶的制备方法

Info

Publication number: CN1379090A
Application number: CN 02115260
Authority: CN
Inventors: 陈燕娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2002-11-13
Anticipated expiration: 2022-05-23
Also published as: CN1169950C

Abstract

本发明涉及凝乳酶的制备技术领域。以犊牛皱胃为材料,经低温诱导,用NaCl和乙醇的水溶液提取凝乳酶。粗酶液经离子交换柱、分子筛凝胶纯化,得部分纯化酶。该酶反应最适温度为50℃,最适pH值为5.8,在pH3.0－6.0范围内酶活力稳定,Ca²⁺是酶的激活因子,牛乳总固形物含量9%以上时酶活力逐渐增加。本发明具有原料来源容易、价廉,省时经济、酶含量及活力回收高。工艺生产设备投资少,工艺简单易行,为我国凝乳酶的开发利用和新型乳制品市场开拓提供新的途径。

Description

犊牛凝乳酶的制备方法

本发明涉及凝乳酶的制备，尤其涉及犊牛凝乳酶的制备方法。

凝乳酶存在于动物、植物和微生物体内，其作用是使牛乳凝固。国外有关凝乳酶的报道甚多，而且有液体、胶状、粉剂和片剂等多种形式的凝乳酶商品。但我国目前所用的凝乳酶制剂，主要源于进口，应用于乳品中的凝乳酶的生产还是一项空白。

凝乳酶按其来源可分为动物凝乳酶、植物凝乳醇和微生物凝乳酶。动物凝乳酶是干酪生产中应用最早的一类酶，不论在风味、质地和产量方面都优于其它来源的凝乳酶。微生物和植物来源的凝乳酶蛋白水解性较差，能把K-酪蛋白水解成较小的多肽片段，而且在成熟过程中易产生苦味，限制了它们在生产中的应用。

动物来源的凝乳酶主要存在于犊牛和羔羊的胃蛋白里。1960年，美国为提取凝乳酶宰杀了800万头犊牛。我国幅员辽阔，并不匮乏犊牛和羔羊资源。用于制作血清、制药或肉用屠宰的犊牛胃，作为副产品进行废物利用，目前可收集应用的犊牛有1.8-2.5万头，而且仍在增加。

传统的犊牛凝乳酶的提取是将屠宰后的犊牛皱胃洗净，置于阴凉通风处，风干干燥，然后用粉碎机粉成粉末，粉末即为提取出来的粗酶。传统犊牛凝乳酶的提取方法不但提取时间长，而且在风干过程中酶很容易失活，活力回收率不高，酶含量低。

本发明的目的就在于寻找出一种简便易行、省时经济、酶含量及活力回收高的犊牛凝乳酶的制备方法。

本发明将新鲜或冷冻的犊牛皱胃清洗后用奶粉和CaCl₂抹于表面，经低温条件下诱导后，剔除胶原、脂肪，切碎，称重，加入预冷4℃的提取液，提取液内含有5％NaCl和10％无水乙醇的水溶液，提取液的容积与物料湿重比为3-5∶1；然后匀浆，搅拌浸提30-240min，离心后取上清液；残渣再加入预冷4℃的含有5％NaCl和10％无水乙醇的水溶液提取液，提取液的容积与物料湿重比为1-3∶1；然后匀浆，搅拌浸提180-240min，离心后取上清液；合并两次所得的上清液，于上清液中加入容积数为上清液5％的1mol/L的HCl，沉淀杂蛋白，离心，取上清液，于上清液中加入重量数为上清液5％的NaCl，溶解出酶蛋白；用1mol/L的NaOH调整pH值为微酸性后，即为液体粗酶。

将液体粗酶用DEAE离子交换柱层析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱，洗脱液的流速为1.25ml/min，收集器收集洗脱液，每管装5ml，洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，洗脱液在280nm波长下出现6个蛋白峰，收集的第12-16管为峰I、21-25管为峰II、30-34管为峰III。实验证明：其中峰I、峰II、峰III与酶活性峰重叠，其余的是没有酶活性的蛋白液，而峰I的酶活性最高。取峰I酶液，经透析、聚乙二醇浓缩到原体积的1/3后，再用Sephadex层析柱层析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱，洗脱液的流速为5ml/min，收集器收集洗脱液，每管装5ml，洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，洗脱液在280nm波长下出现3个蛋白峰，其中峰III与酶活性峰重叠，所收集的第19-26管的蛋白液便是纯化的凝乳酶，其余的是不具有酶活性的蛋白液。纯化的凝乳酶，其比活力为171.43U/mg蛋白，蛋白浓度为0.007mg/ml。其主要的酶学性质如下：凝乳酶的反应最适的温度为55℃，当温度低于25℃时，凝乳很慢，从30℃开始，随着温度的升高，活力也随之增大，但高于55℃时，活力迅速下降；凝乳酶在40℃处理90min，酶活力很稳定，但随着温度的升高，酶的活力发生变化，在55℃处理90min，有36.7％的活力丧失；凝乳酶作用的最适pH值为5.8，在pH值5.8以下和以上，酶的活力都有所下降，在pH3.0-6.0之间是稳定的；原料乳干物质含量小于8％时，30min内不凝固，从9％开始，随干物质的增加，其活力也增高；Ca²⁺浓度在0.025-0.125％范围内，随加入量的增加，凝乳酶的活力也增加，Ca²⁺浓度在0.125％以上，酶活力增加缓慢。

本发明优点：一.提取方法简便易行、省时经济、酶含量及活力回收高。二.原料来源容易、价廉，适应产品的综合开发利用。三.工艺生产设备投资少，工艺简单易行，为我国凝乳酶的开发利用和新型乳制品市场开拓提供新的途径。

实例：将2个新鲜或冷冻的犊牛皱胃清洗后用20g奶粉和2g CaCl₂抹于表面，在4℃的低温条件下诱导2-3天，切碎、去杂，称取100g，加入预冷4℃的提取液400ml，提取液为含5％NaCl和10％无水乙醇的水溶液，匀浆，搅拌提取45min，3000r/min离心10min，取上清液；残渣再加入预冷4℃的提取液200ml，提取液为含5％NaCl和10％无水乙醇的水溶液，匀浆，搅拌提取240min，3000r/min离心10min，取上清液；合并两次所得的上清液，加入30ml 1mol/L HCl，搅拌，沉淀杂蛋白，3000r/min离心10min，取上清液；然后再加入60g的NaCl，搅拌溶解，用1mol/L NaOH调整pH值为6.0，得液体粗酶约600ml。

取液体粗酶8ml用DEAE 23离子交换柱层析，0.05mol/L、pH5.4柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱，洗脱液的流速为1.25ml/min，收集器收集洗脱液，每管装5ml，洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，洗脱液在280nm波长下出现6个蛋白峰，收集的第12-16管为峰I、21-25管为峰II、30-34管为峰III。取峰I酶液25ml，经透析、聚乙二醇6000浓缩到8ml后，再用Sephadex G-75层析柱层析，0.05mol/L、pH5.6柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱，洗脱液的流速为5ml/min，收集器收洗脱液，每管装5ml，洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，所收集的第19-26管酶液40ml，为纯化的凝乳酶，其比活力为171.43U/mg蛋白，蛋白浓度为0.007mg/ml。

Claims

1.犊牛凝乳酶的制备方法，其特征在于：将新鲜或冷冻的犊牛皱胃清洗后用奶粉和CaCl₂抹于表面，经低温条件下诱导后剔除胶原和脂肪，切碎，加入预冷4℃的提取液，提取液为含5％的NaCl和10％无水乙醇的水溶液，提取液的容积与物料湿重比为3-5∶1，匀浆，搅拌浸提30-240min，离心，取上清液，重复1-3次，合并几次所得的上清液，于上清液中加入容积数为上清液5％的1mol/L的HCl沉淀杂蛋白，离心，取上清液，于上清液中加入重量数为上清液5％的NaCl溶解出酶蛋白，再用1mol/L NaOH调整pH值为微酸性后，即为液体粗酶，将液体粗酶用DEAE离子交换柱层析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱，洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，洗脱液的流速为1.25ml/min，收集器收集洗脱液，每管装5ml，取收集的第12-16管酶液，经透析、聚乙二醇浓缩到原体积的1/3后，再用Sephadex层析柱层析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液进行pH线性梯度洗脱至洗脱液在280nm波长下无吸收，洗脱液的流速为5ml/min，收集器收集洗脱液，每管装5ml，收集第19-26管即为纯化的凝乳酶。