CN112226426A - 一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法，该方法通过提取前皱胃的撕碎粒度，浸泡等处理方法使羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，再结合超声波协助提取方法显著提高了凝乳酶的提取率,大大缩短了提取时间，降低了凝乳酶制备的成本，为相关企业的羔羊胃提取物的规范化生产提供了技术支撑。同时，系统研究羔羊胃中凝乳酶的溶解性，选择了最佳的溶剂和提取pH值，为凝乳酶提取的放大生产提供了可靠，可行的方法。该方法得到的羔羊皱胃凝乳酶纯度高，生物活性强，而且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，更好的保留了羔羊胃凝乳酶的活性，获得的凝乳酶可应用于干酪生产中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法。
背景技术
凝乳酶(chymosin)，是新生哺乳动物胃黏膜以无活性的前体物—凝乳酶原形式分泌的一种具有催化凝乳作用的酸性蛋白酶，在胃液酸性环境中，凝乳酶原从N-端释放一部分肽段，形成不可逆的活性酶—凝乳酶。凝乳酶是干酪生产中主要的凝乳剂，具有高的凝乳活性和低的蛋白水解活性，特别适用于干酪的生产，其主要作用是分解乳中к-酪蛋白(к-casein)Phe105-Met106肽键，形成副-к-酪蛋白(Para-к-casein)和糖巨肽(glycomarcopeptide)，使酪蛋白胶粒失去稳定性，在Ca2+参与下使乳凝固，形成凝乳(Curd)；同时凝乳酶也参与干酪的成熟过程，对干酪质地和风味的形成有重要的作用。
全世界许多干酪品种使用最广泛的凝乳酶是从小牛皱胃中提取的小牛皱胃酶，它具有良好的加工特性，并用其生产的干酪在风味，质地和产量方面都优于其它酶类。因此，人们就大量屠宰小牛获得小牛皱胃酶，以满足干酪生产的需要。随着干酪产量的增加，对凝乳酶的需求量不断增大，小牛皱胃酶供应短缺，价格上涨，而成年牛胃中皱胃酶的含量又较少，这就迫使科学家们千方百计地寻找小牛皱胃酶的代用品。目前干酪生产所用的凝乳酶大致可分为四大类动物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。
动物凝乳酶是干酪生产中使用最早的一类酶，传统干酪生产中应用的凝乳酶是小牛皱胃酶。目前商品化凝乳酶的来源有动物，植物和微生物，但是植物和微生物来源的凝乳酶因为因凝乳时间长，所形成的凝乳较软，易产生苦味，因此选择牛凝乳酶的替代品非常困难。其他可提取凝乳酶的反刍动物有，，水牛，绵羊，山羊，骆驼，驯鹿等；也可从单胃动物如鸡，猪，兔，猴子胃中提取，还有从生长在大西洋和地中海中的甲壳动物Munida中提取。但是单胃动动物和提取的凝乳酶与植物和卫生来源凝乳酶相同，凝乳效果差，奶酪产品带苦味，影响口感。因此，幼小哺乳动物如绵羊和山羊是较好的凝乳酶来源。在地中海地区国家，生产干酪所用的凝乳酶都是从绵羊或山羊皱胃中提取的皱胃酶。其凝乳酶与胃蛋白酶的比率和小牛皱胃酶的相近，凝乳活性相同，用其生产的干酪还具有绵羊和山羊特有的感官特性，受到消费者的普遍欢迎。羔羊皱胃中含有大量的皱胃酶，具有很高的凝乳活性，因此羔羊皱胃酶可能是最适宜的代用品，这样不但可以缓解小牛皱胃酶的供应紧张，还可提高奶山羊业深加工产品的附加值，变废为宝，同时解决环境污染问题。其采用超声提取技术从生物组织中提取酶，卫生条件较好，可缩短提取时间从而避免由于提取时间较长导致的微生物污染而影响其品质，还可以提高酶的活性和提取率。但纯的皱胃酶经超声处理后，热稳定性降低，活性中心的氨基酸发生了改变使其活性部位失活，活性降低了近乎两倍。但在有外来蛋白质存在下，蛋白质的保护性作用可使皱胃酶的组成和结构不受超声的影响，有助于保存甚至提高酶活性。
本发明为充分利用当地动物资源，以羔羊皱胃作为生产原料，实现资源充分利用，为了使变废为宝，研制了利用超声波辅助的方法提取羔羊皱胃凝乳酶，该方法适合工业大量生产，带动地方经济的可持续发展；对提高新疆的优势自然资源综合利用率，推动无公害特色农业生产发展，使农民增收，增加企业的经济效益，建设和谐社会，促进新农村建设等方面都具有极大的促进作用。
发明内容
本发明目的在于，提供一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法，该方法通过提取前皱胃的撕碎粒度，浸泡等处理方法使羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，再结合超声波协助提取方法显著提高了凝乳酶的提取率，大大缩短了提取时间，降低了凝乳酶制备的成本，为相关企业的羔羊胃提取物的规范化生产提供了技术支撑。同时，系统研究羔羊胃中凝乳酶的溶解性，选择了最佳的溶剂和提取pH值，为凝乳酶提取的放大生产提供了可靠，可行的方法。该方法得到的羔羊皱胃凝乳酶纯度高，生物活性强，而且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，更好的保留了羔羊胃凝乳酶的活性，获得的凝乳酶可应用于干酪生产中的用途。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法，按下列步骤进行：
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成5-8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡10-60min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1-10％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备干酪生产中的用途。
所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备治疗慢性胃炎、腹胀以及腹泻的药物中的用途。
所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备食品中的用途。
本发明所述的一种羔羊皱胃凝乳酶的分离方法。该方法通过优化羔羊皱胃撕碎程度，提取温度，pH值，料液比以及超声提取时间研究了羔羊皱胃凝乳酶的提取工艺。最终确定了最佳提取工艺参数及提取介质的性质：羔羊皱胃条撕碎宽度为7mm，提取前原料浸泡时间为30分钟，超声功率为200瓦，超声时间为20min，提取温度为15℃，氯化钠溶液的浓度为5％，料液比为(原料与氯化钠溶液比例m/v)1:18，提取液pH值为4.2-4.3，凝乳酶提取物活化时间为7个小时，在此最佳条件下凝乳酶的活力为3500(U/g)。
本发明的优点是：现有的提取方法不能充分提取羔羊皱胃中的凝乳酶，由于其稳定性较低，提取时间过长，凝乳酶会部分失活，会影响凝乳酶的活力和微生物污染。从羊皱胃中充分的提取活性凝乳酶，保持活性，提高产率是一个非常重要的问题。超声波辅助，原料撕碎程度及提取前原料溶胀时间可以大大缩短了提取过程所需的时间，可导致羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，颗粒分离以及增加羔羊皱胃提取介质，并且。本发明的创新点是在传统的提取分离方法基础上，通过提取前皱胃的撕碎粒度，浸泡等处理方法使羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，再结合超声波协助提取方法显著提高了凝乳酶的提取率,大大缩短了提取时间，降低了凝乳酶制备的成本，为相关企业的羔羊胃提取物的规范化生产提供了技术支撑。同时，系统研究羔羊胃中凝乳酶的溶解性，选择了最佳的溶剂和提取pH值，为凝乳酶提取的放大生产提供了可靠，可行的方法。
本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶不但可以缓解小牛皱胃酶的供应紧张,这样还可提高羊业深加工产品的附加值,变废为宝,同时解决环境污染问题。
动物组织的破坏取决于其结构和组成，而结构和组成又影响凝乳酶的提取程度。同时，超声波对动物组织有选择性作用，它在破坏组织过程中，使蛋白质，矿物质和其他物质的迁移，从而增加了扩散和渗透过程，使细胞膜软化。本发明所述的方法是以羔羊皱胃为原料，经研磨粉碎，脱脂，浸泡，重传统的氯化钠缓冲溶液提取得到的。超声波辅助，原料撕碎粒度及提取前原料浸泡时间可以大大缩短了提取过程所需的时间，可导致羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，颗粒分离以及增加羔羊皱胃提取介质，并且显著提高了凝乳酶的产率和活力。
皱胃酶是干酪生产中起凝乳作用的关键性酶,其作用是水解乳中к-酪蛋白的Phe-Met肽键，形成para-к-酪蛋白和水溶性糖巨肽，使酪蛋白胶粒失去稳定性，在Ca2+的参与下形成凝乳。凝乳酶主要是从羊胃中提取的，现有的提取方法不能充分提取羊皱胃中的凝乳酶，由于其稳定性较低，提取时间过长，导致凝乳酶会部分失活，和微生物污染。从羊皱胃中充分的提取活性凝乳酶，保持活性，提高产率是一个非常重要的问题。原料颗粒的大小和几何形状是影响凝乳酶的提取率和活力的很重要因素之一。本发明优点是，超声波辅助可以大大缩短提取过程所需的时间；原料撕碎和取前浸泡使羔羊皱胃组织分散，细胞破坏，强化混合，颗粒分离以及增加羔羊皱胃与提取介质的相互作用，显著提高了凝乳酶的产率和活力。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成5mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡10min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例2
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成7mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡10min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例3
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡60min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例4
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成5mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例5
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成7mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例6
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例7
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成5mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为5％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例8
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成7mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为5％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例9
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡30min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为5％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例10
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150×150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡60min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为10％氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
实施例11
凝乳酶活力的测定：
对实施1-3所得羔羊皱胃凝乳酶进行活力测定；
底物溶液的制备：
取全脂奶粉(选用酸度稳定的牛奶，由同一头奶牛挤奶)12g，加入氯化钙溶液(取醋酸钠1.25g，氯化钙0.55g，加水定容至500ml，调节ph值至6.3±0.1)，研磨均匀后用氯化钙溶液定容至100ml，摇匀，本溶液现用现配；
标准品溶液的制备：
精密称取12mg凝乳酶标准品，滴入几滴pH＝6.3磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，磷酸二氢钠2.7g，加水溶解定容至1000ml，调节pH值为6.3±0.5)，润湿研磨后加入缓冲液定容至10ml，即得到每1ml约含1.06个活力单位(约在240秒内凝结)的标准品溶液，温度4℃保存，在配置2小时后使用；
样品溶液的制备：
将实施1-3所得羔羊皱胃凝乳酶分别精密称取10mg，照标准品溶液制备方法配置5ml，既浓度为2mg/ml的样品溶液；
样品测定：
精密量取底物溶液10ml，置于试管中，在温度30±0.5℃恒温水浴中温预10min，精密加入标准品溶液1ml，摇匀并立即计时，用玻璃棒不蘸取溶液沿管壁留下，使成均匀薄层，当薄层出现片状凝结时，截止计时，记录下时间，重复测定3次，3次测定值得相对标准偏差不得大于5％，取3次的平均值作为标准品溶液的凝结时间，取样品溶液1ml，分别按上述方法操作，按下式计算：
每1mg含凝乳酶活力单位数
式中S为标准品的活力，Ru/mg；
TS为标准品溶液的平均凝结时间，s；
T为样品溶液的平均凝结时间，s；
WS为标准品溶液每1ml中含凝乳酶标准品的量，g；
W为样品取样量，g；
N为样品稀释倍数。
实验结果：
本发明利用实验和计算结果，建立了提取工艺参数。通过优化超声提取参数，可显著提高羔羊皱胃凝乳酶的提取率和酶活力。最终确定了最佳提取条件为羔羊皱胃剪碎度为7毫米，提取前原料浸泡时间为30分钟，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，氯化钠(NaCl)溶液的浓度为5％，料液比为(原料与氯化钠溶液比例m/v)1:18，提取液pH值为4.2-4.3，凝乳酶提取物活化时间为7个小时，在此最佳条件下凝乳酶的提取率为6.8(克)，凝乳酶的活力为3500(U/g)。
Claims (4)
1.一种羔羊皱胃凝乳酶的提取分离方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、选用羔羊，屠宰后取出皱胃，用预冷蒸馏水流水冲洗除去皱胃中的杂物，置于温度-20℃冰箱保存备用；
b、将步骤a中清洗过的羔羊皱胃，剥除脂肪及结缔组织，切成150 x 150mm的正方形，在温度-80℃下冷冻12个小时，然后冷冻干燥，再用粉碎机粉碎成5-8mm的羊皱胃粉末状，置于-20℃冰箱保存备用；
c、将步骤b中的羊皱胃粉末，温度4℃下加入石油醚，并机械搅拌进行脱脂，脱脂2次，加入20倍体积的蒸馏水，在温度18℃浸泡10-60min；
d、将步骤c中所得到的浸泡液体用氯化钠调至终浓度为1-10%氯化钠溶液，用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为5.6，并用超声波辅助搅拌提取，超声功率为200瓦，超声时间为20分钟，提取温度为15℃，得到羊皱胃提取液，采用制冷机对羊皱胃提取液进行冷却，保持提取液的稳定温度4℃；
e、将步骤d所得提取液用1 moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下进行活化，时间7小时；
f、将步骤e中活化后的提取液用1 moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，液浓缩、冷冻干燥，即得到羔羊皱胃凝乳酶，以干粉重量g为单位测定羔羊皱胃凝乳酶的产率，并进行酶活力测定。
2.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备干酪生产中的用途。
3.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备治疗慢性胃炎、腹胀以及腹泻的药物中的用途。
4.根据权利要求1所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶在制备食品中的用途。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113444141A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-09-28 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种羔羊第四胃糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999021974A1 (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Dsm N.V. | Milk clotting enzymes recovery |
| CN1546659A (zh) * | 2003-12-10 | 2004-11-17 | 陕西师范大学 | 羔羊皱胃酶超声提取方法 |
| CN106511383A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-03-22 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种超声波辅助提取羔羊第四胃有效成分的快速制备方法 |
-
2020
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Patent Citations (3)
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| WO1999021974A1 (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Dsm N.V. | Milk clotting enzymes recovery |
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| 甘伯中等: "尕里巴小牛皱胃酶的制备及其部分性质的探讨" * |
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| CN113444141A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-09-28 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种羔羊第四胃糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途 |
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