CN101974069A - FoxM1c的DNA结合区蛋白高效结合肽及多肽结构序列的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种FoxM1c的DNA结合区蛋白的高效结合肽及多肽结构序列的获取方法和目标物的用途。以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库筛选和获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽。包括：FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒的构建，诱导表达和蛋白纯化制备；基于FoxM1c的DNA结合区蛋白的噬菌体随机肽库筛选与分析。经4轮筛选，获得富集靶向FoxM1c的结合肽噬菌体和多肽结构序列。目标物作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术制药领域。尤其是FoxM1c的DNA结合区蛋白的制备、高效结合肽结构序列的确认以及其作为先导分子可望在肿瘤等相关疾病治疗药物研发和诊断中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的重大疾病。在与肿瘤相关的各类转录因子中，Fox家族蛋白成员众多。根据DNA结合区的同源性，已在不同种属中证实了100多个Fox家族成员，分属于17个亚族。Fox家族蛋白生物学功能广泛，涉及胚胎发育、细胞周期调控、糖和脂类代谢、衰老、免疫调节等多种生物学过程，其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生等多种疾病有关。
FoxM1作为Forkhead家族的一个特殊成员在肿瘤等活跃的分裂细胞中大量表达，是控制包括增殖、成熟、死亡在内的整个细胞生命周期的重要基因之一，与肿瘤生长和转移密切相关。目前，国内外对FoxM1的研究尚处于起步阶段。本发明在原核重组表达和分离纯化制备FoxM1c的DNA结合区蛋白的基础上，利用噬菌体随机肽库筛选和获得靶向FoxM1c的高效结合肽分子及结构序列，对于进一步开展靶向FoxM1c小分子多肽先导药物的发现与利用具有重要的意义和价值。本发明国内外未见相关报道与专利。
发明内容
鉴于现有技术的如上缺点或不足，本发明的目的在于创建一种FoxM1c的DNA结合蛋白原核表达与制备、高效结合肽及多肽结构序列的获取途径，采用如下的方法：
FoxM1c的DNA结合区蛋白高效结合肽及多肽结构序列的获取方法，包含（1）、利用pQE30原核高效表达系统，将编码FoxM1c的DNA结合区蛋白的DNA片段与pQE30质粒重组，构建重组表达质粒pQE-D并转化原核宿主菌M15，所得宿主菌经诱导表达并通过亲和层析纯化及BCA法定量，制备获得FoxM1c的DNA结合区蛋白；
（2）、以FoxM1c的DNA结合区蛋白为筛选靶标，利用噬菌体随机十二肽库筛选技术，通过“吸附－洗脱－扩增”的循环筛选获得富集噬菌体，经4轮筛选，将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板获得靶向FoxM1c的DNA结合区蛋白的结合肽及多肽结构序列；
所述靶向FoxM1c的DNA结合区蛋白的富集噬菌体至少含有以下一种多肽结构序列：第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS；所述结合肽多肽结构序列分子对接在FoxM1上的结合结构域预测主要是Arg-Arg(R-R, aa：254，256) 和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys(E-T- S-A-N-G-K，aa：298-304)。
本发明的目的还在于，所述结合肽及多肽结构序列作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断。
采用本发明的技术内容，以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库中筛选和获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽。所获多肽含以下结构序列：第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS。并与FoxM1蛋白的重要结构域Arg-Arg(R-R, aa：254，256) 和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys(E-T-S- A
-N-G-K，aa：298-304)良好对接。本发明所获得的全序列或多肽结构序列可望作为先导分子用于肿瘤治疗药物的研发和用于肿瘤等疾病的诊断。
附图说明：
图1：噬菌体随机肽库筛选所获序列汇总表。
图2：单克隆结合肽噬菌体针对FoxM1c蛋白的亲和力测定表。
图3多肽结构序列与FoxM1c 的DNA结合区位点的分子对接预测表。
图4：FoxM1c的DNA结合区蛋白亲和纯化咪唑洗脱数据图。
图5：FoxM1c结合肽结构序列的Clustal W分析图。
具体实施方式
本发明建立了FoxM1c的DNA结合区目的蛋白的原核重组诱导表达质粒系统构建、蛋白诱导表达、亲和层析分离纯化的制备方法，并以其为靶标，利用噬菌体随机肽库筛选、亲和力测定以及计算机模拟分子对接等技术获得了一组与目的蛋白FoxM1c的DNA结合区蛋白的高效结合多肽和多肽结构序列，同时预测了其在FoxM1上的分子对接靶点。本发明通过如下思路和途径实现了FoxM1c的DNA结合区蛋白的高效结合肽及多肽结构序列的获得及用途：1）构建FoxM1c的DNA结合区蛋白原核重组诱导表达系统；2）宿主菌M15的转化和大量诱导表达以获得FoxM1c的DNA结合区目的蛋白；3）利用亲和层析技术，通过与Ni-NTA高结合力的蛋白吸附并洗脱，获得高纯度目的蛋白，并通过BCA法定量；4）以FoxM1c的DNA结合区蛋白为靶标，进行噬菌体随机十二肽库的筛选和小分子高效结合多肽的获得，共获得18条不同序列；5）通过生物信息分析、多重序列比对以及模拟分子对接等方法确认筛选获得的序列的原始创新性以及重要多肽结构序列，并预测了其在FoxM1上分子对接的目标靶点，确认以下多肽结构序列：第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS。发现其在FoxM1上的分子对接可能靶点是Arg-Arg(R-R, aa：254，256) 和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys(E-T-S-A-N-G-K，aa
：298-304)；6）采用亲和力反筛测定等方法确认筛选得到的多肽对FoM1的较高亲和力和专一性；7)所述结合肽及所含多肽结构序列作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断以及其它用途：A：如同现行的多肽药物，用于肿瘤等疾病治疗；B：如同现有商品化的HA、6×组氨酸等分子标签方式，将其构建于蛋白质表达载体中，通过Western等免疫检测方法，用于蛋白质表达的分子检测等。
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但其不代表为本发明的唯一实施方式。为了实现以上目的，本发明以下的技术步骤。1）FoxM1c的DNA结合区蛋白原核重组诱导表达系统的构建；2）蛋白诱导表达、亲和层析与纯化；3）靶向目的蛋白的噬菌体随机肽库筛选和小分子结合多肽的获得；4）靶向目的蛋白的结合肽结构序列的确定、亲和力测定及模拟分子对接。以下予以详述。
（一） FoxM1c的DNA结合区蛋白原核重组诱导表达系统的构建
1、人类FoxM1c转录因子的克隆
根据人FoxM1c全长cDNA序列特征，设计DNA结合区的PCR引物并进行PCR扩增。上、下游引物分别为： D1: 5′-AGATCTAAGATGAGTTCTGATGGACTGGGC-3′，D2: 5′-CTCGAGGAGCTCTGGATTCGGTCGTTTC-3′。将扩增的DNA结合区片段连接pMD19-T，电转化宿主菌DH5α并酶切鉴定。
2、人类FoxM1c的DNA结合区蛋白原核重组诱导表达系统的构建
①经质粒提取，利用BamH I及Bgl II将DNA结合区片段从克隆载体pMD19-T上双酶切下，琼脂糖凝胶电泳确定，利用胶回收试剂盒回收相应片段。将回收片段与同样双酶切并回收的表达载体pQE30相连接，电转化宿主菌M15。
②提取重组质粒，酶切并琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定，重组菌种冻存于-70℃。
（二）蛋白诱导表达、亲和层析与纯化
1、重组宿主菌的诱导表达、细胞破碎与蛋白获得
① 将5 ml LB培养基过夜培养的重组菌接种到含抗生素（50 mg／L）LB的500 ml培养瓶中，诱导表达并收集菌液200ml；
② 4℃，7000-8000g离心10分钟，收集沉淀菌体；
③ 菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液，含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF。其中溶菌酶、PMSF现加）；
④ 混合菌体在冰水浴中超声破碎4秒×99次，检测pH，并用0.5M NaOH调节并稳定pH在7-8；
⑤ 破碎菌液4℃，12000g离心15分钟，上清和沉淀分别留样，PAGE电泳初步检测蛋白存在与含量。
2、重组蛋白的亲和纯化
① 1.6×20cm的Ni-NTA Agarose FF装柱，柱床体积为10ml；
② 用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min；
③ 将全部细胞破碎液(50 mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)用0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
④ 用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min；
⑤ 分别用含50、100、200、400mM 咪唑的缓冲液3进行梯度洗脱，流速为2ml/min，确定亲和纯化梯度洗脱的最佳咪唑浓度为200mM，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度，见图4；
⑥ 用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4~8℃保存。
附：
缓冲液1：50mM，pH7.4的PBS缓冲液；
缓冲液2：0.5M咪唑的50mM，pH7.4的PBS缓冲液。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液配制：
| 咪唑浓度（mM） | 缓冲液1用量(ml) | 缓冲液2用量(ml) |
| 50 | 90 | 10 |
| 100 | 80 | 20 |
| 200 | 60 | 40 |
| 400 | 20 | 80 |
3、纯化蛋白的BCA定量
参照BCA试剂盒手册方法进行蛋白定量，主要包括：
① 根据样品数量，按试剂盒要求A：B=50：1比例配制适量BCA工作液A和B，充分混匀；
② 完全溶解蛋白标准品（5mg/ml BSA），使终浓度为0.5mg/ml；
③ 将稀释后标准品（0.5mg/mlBSA）按0，1，2，4，8，16，20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足至20μl；
④ 加适当体积样品到96孔的样品孔中，加标准品稀释液至20μl；
⑤ 各孔加入200μl BCA工作液，混匀，37℃ 孵育30-60分钟；
⑥ A562nm酶标仪测定吸光度值；
⑦ 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。确定纯化的目标蛋白含量为：1mg/ml。
附：BCA试剂盒组成：
| 成分 | 保存 | 200次 | 500次 | 2500次 |
| 蛋白标准（5mg/mlBSA） | -20℃ | 0.2ml | 0.5ml | 3ml |
| Solution A | 室温 | 40ml | 100ml | 500ml |
| Solution B | 室温 | 1.2ml | 2.5ml | 12ml |
购自北京百泰克生物技术有限公司
（三）靶向目的蛋白的噬菌体随机肽库筛选和多肽序列的获得
主要包括：
① 96孔板分别包被 200μg/ml目的蛋白和0.1M碳酸氢钠（对照孔BSA蛋白包被）100μl，4℃，保湿孵育过夜；
② 移去包被液，4℃ BSA封闭1h；
③ 移去封闭液，1%TBST快速清洗6次，倒置除去残液；
④ 孔中加入100μl TBST稀释的2×1011噬菌体十二随机肽库(购自NEB公司)，室温摇床孵育45min；
⑤ 移去未结合噬菌体，倒置在干净的纸上，拍甩去残液；
⑥ TBST 200μl洗各孔10次；
⑦ 0.2M Gly-HCl（pH 2.2），1mg/ml BSA洗脱噬菌体，重复一次，合并洗脱噬菌体，测定噬菌体滴度，计算P/N值（P：噬菌体与目的蛋白结合的洗脱噬菌体滴度，N：噬菌体与对照结合的洗脱噬菌体滴度，P/N值越高则亲和力越强）。保存1/5体积的噬菌体，扩增剩余噬菌体并测定扩增噬菌体滴度，进入下一轮筛选，共进行4轮筛选，获得高度富集的噬菌体；
⑧ 将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板，共挑取26个单克隆噬菌体，制备ssDNA并送公司测序。获得18条不同的多肽序列，见图4。
（四）靶向目的蛋白的结合肽结构序列的确定、亲和力测定及模拟分子对接。
1．FoxM1c结合肽噬菌体的亲和力反筛测定
将步骤（三）筛选获得的含结合肽序列的单克隆噬菌体扩增后，按类似步骤（三）的方法测定各单克隆噬菌体的P/N值。与步骤（三）方法不同的是加入的不是噬菌体随机肽库，而是各筛选获得的单克隆噬菌体扩增物，亲和力测定结果见图2。
2．筛选获得的结合肽的生物信息分析与序列比对与结合肽结构序列的确定
对筛选得到的结合肽序列进行文献检索和和分析，未发现与已知蛋白质或多肽完全相同的序列，NCBI GeneBank Blastp搜索，也未发现与其他生物体存在同源序列，说明本发明筛选获得的18条序列均为新序列。对所获结合肽序列进行经验分析并结合ClustalX1.81多重序列比对，结果发现存在多组多肽结构序列：第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS。见图5。
3．多肽结构序列的计算机模拟分子对接与多肽-FoxM1结合区位点预测
本发明为了确定多肽结构序列对FoxM1的靶向特性，并预测其结合位点，利用Molegro Virtual Docker分子对接软件和Swiss-PDB Viewer对确认的多条多肽结构序列（第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS）与FoxM1的DNA结合区（aa. 220-360）进行计算机模拟分子对接分析，结果确认各多肽结构序列与DNA结合区良好对接，见表3。预测可能的结合位点在DNA结合区（aa. 222-360）的保守结构域Arg-Arg(R-R, aa：254，256) 和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn
-Gly-Lys(E-T-S-A-N-G-K，aa：298-304)，该位点有可能成为FoxM1抑制剂筛选的一个重要靶向结构域。
Claims (3)
1.FoxM1c的DNA结合区蛋白高效结合肽及多肽结构序列的获取方法，包含（1）、利用pQE30原核高效表达系统，将编码FoxM1c的DNA结合区蛋白的DNA片段与pQE30质粒重组，构建重组表达质粒pQE-D并转化原核宿主菌M15，所得宿主菌经诱导表达并通过亲和层析纯化及BCA法定量，制备获得FoxM1c的DNA结合区蛋白；
（2）、以FoxM1c的DNA结合区蛋白为筛选靶标，利用噬菌体随机十二肽库筛选技术，通过“吸附－洗脱－扩增”的循环筛选获得富集噬菌体，经4轮筛选，将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板获得靶向FoxM1c的DNA结合区蛋白的结合肽及多肽结构序列；
所述靶向FoxM1c的DNA结合区蛋白的富集噬菌体至少含有以下一种多肽结构序列：第一组：WHL/Q/D/N ；第二组：DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三组：SSLWN/E ；第四组：HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五组：FYNL，NYFL；第六组：YPH，YPL，YPS；所述结合肽多肽结构序列分子对接在FoxM1上的结合结构域预测主要是Arg-Arg(R-R, aa：254，256) 和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys(E-T- S-A-N-G-K，aa：298-304)。
2.根据权利要求1所述之FoxM1c的DNA结合区蛋白高效结合肽及多肽结构序列的获取方法，其特征在于，所述亲和层析技术通过与Ni-NTA高结合力的蛋白吸附并洗脱，获得高纯度目的蛋白，梯度洗脱的最佳咪唑浓度200mM。
3.由权利要求1或2所得结合肽及多肽结构序列的用途，其特征在于，所述结合肽及多肽结构序列作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断。
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