CN111320671B - 一种p201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂 - Google Patents
一种p201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种P201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂。本发明筛选合成了在浓度为60μg/mL时对HegG2肝癌细胞即具有优异杀伤作用的多肽序列，为肿瘤靶向治疗药物的研究提供了重要的工作基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种P201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂。
背景技术
以肝癌、肺癌为代表的恶性肿瘤已成为人类死亡的主要杀手。随着组学与分子肿瘤学等基础研究的深入,将肿瘤发生、发展中的关键分子作为诊断标志和治疗靶点已成为肿瘤诊治的重要趋势。在与肿瘤密切相关的各类靶标蛋白中,叉头盒转录因子家族成员FoxM1(Fork-head transcription factor M1)已被证实在不同起源的肿瘤组织中普遍上调,其与肿瘤的发生发展、转移侵袭以及耐药等诸多病理、生理过程密切相关。FoxM1被认为是肿瘤的致命伤，并成为判断肿瘤发生发展的新的肿瘤标志物及抗肿瘤药物开发的重要靶标。目前国内外未见直接靶向FoxM1的抗肿瘤药物上市或应用于临床。噬菌体表面展示技术是一种基于定向进化的高通量筛选技术,主要应用于靶标结合肽的筛选和蛋白的展示,尤其在疾病的诊断和治疗领域应用广泛。目前，已有以重组表达的FoxM1的DNA结合区(FoxM1-DBD)蛋白作为靶标，从噬菌体随机十二肽库中筛选得到一条结合能力较高的多肽P201，并确认其抗肝癌等多种肿瘤细胞的作用与分子机制的相关报道。然而目前还未见对P201多肽进行优化的相关报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种P201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂，找到了P201与FoxM1-DBD结合的关键氨基酸位点，以此为基础构建了P201偏性肽库，从中筛选获得了11条多肽序列，然后合成了对HegG2肝癌细胞具有优异杀伤作用的多肽序列，具有进行后续研究的实际价值，为肿瘤靶向治疗药物的研究提供了重要的前期工作基础。
为了进一步优化P201多肽序列，寻求更高亲和力的多肽，达到更好的抗肿瘤作用效果，本申请我们首先对P201进行了丙氨酸扫描突变，确定其中对结合起关键作用的氨基酸位点，以此为基础构建偏性肽库并进行了筛选，对筛选得到的高亲和力序列进行了分子模拟与对接，验证了其与靶蛋白的相互作用。综合亲和力测定、分子模拟以及细胞活力抑制测定结果，最后筛选和确定四条优于P201的多肽，为后续分子靶向FoxM1抗肿瘤研究提供重要的前期工作基础。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种P201优化肽，该优化肽包括12个氨基酸，由关键氨基酸与随机氨基酸组成；关键氨基酸包括位于1号位点的色氨酸、2号位点的组氨酸、5号位点的酪氨酸、9号位点的色氨酸和10号位点的酪氨酸中的至少4个。
进一步地，关键氨基酸包括1号位点的色氨酸、2号位点的组氨酸、5号位点的酪氨酸、9号位点的色氨酸和10号位点的酪氨酸。
进一步地，多肽的氨基酸序列为WHDHYNLRWYSA。
进一步地，多肽的氨基酸序列为WHGFYENDWYML。
进一步地，多肽的氨基酸序列为WHQNYIERWYST。
进一步地，多肽的氨基酸序列为WHADYDFYWYED。
进一步地，随机氨酸为8种必需氨基酸和12种非必需氨基酸。
一种抗肿瘤多肽，该多肽序列由上述任一项所述的优化肽序列的N端添加8-9个精氨酸以及甘氨酸、丝氨酸连接氨基酸组成。
进一步地，精氨酸为D-型精氨酸。
一种抗肿瘤药物，包括上述任一项所述的多肽，以及其在药学上可接受的辅助成分。
进一步地，肿瘤为肝癌或肺癌。
一种FoxM1靶向抑制剂，包括上述任一项所述的作为活性成分的多肽。
本发明的有益效果为：
本发明筛选合成了在浓度为60μg/mL时对HegG2肝癌细胞具有优异杀伤作用的多肽序列，为肿瘤靶向治疗药物的研究提供了重要的工作基础。
附图说明
图1为丙氨酸突变噬菌体对FoxM1c-DBD的亲和力检测结果；
图2为载体双酶切电泳图；
图3为CDOCKER中筛选肽与FoxM1c-DBD的对接图；
图4为不同浓度多肽处理HepG2细胞后细胞形态图(100×)；
图5为不同浓度多肽处理对HepG2细胞的抑制作用检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
1、试剂
质粒提取试剂盒(Omega公司)，限制性内切酶Acc65 I、Eag I(NEB公司)，胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，T4连接酶(Takara公司)，同源重组试剂盒(UE公司)，超级感受态制备试剂盒(上海生工)，引物由擎科生物技术有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。
2、噬菌体M13KE、受体菌E.coli ER2738为本实验室保存。
实施例1丙氨酸点突变噬菌体克隆的构建与扩增
使用限制性内切酶Acc65 I、Eag I双酶切载体M13KE,并通过胶回收试剂盒回收载体片段。将其与合成单链(表1)的退火产物以1:5的摩尔比例加入到25μL体系中，16℃下通过T4连接酶作用过夜。将连接产物转化至受体菌ER2738中，涂于LB低盐平板(四环素20μg/mL，IPTG 50μg/mL，X-Gal 40μg/mL)之上，倒置培养12h后挑取蓝斑克隆测序。比对测序结果，将成功构建的点突变克隆加入到摇至对数期的ER2738菌液中，37℃200rpm继续培养4h，离心收集上清液，用PEG/NaCl沉淀噬菌体两次，最终用TBS溶解，测定滴度后保存于-20℃备用。
表1合成的插入片段单链序列
实施例2点突变噬菌体克隆的扩增与结合能力测定
在酶标板中分别加入150μL的靶分子溶液(FoxM1c靶标蛋白100μg/mL，NaHCO30.1M)，以及不含靶分子的0.1M NaHCO3溶液，在4℃条件下轻微震荡过夜。将包被液在干净的纸巾上拍甩干净后，加入5mg/mL BSA封阻1h。去除封阻液，用TBST(0.1％Tween 20)清洗六次后加入4×1010个噬菌体，放置于摇床上震荡孵育45min，TBST清洗10次之后加入100μL0.2M Glycine-HCl(pH＝2.2，1mg/mL BSA)，温和摇动30min后加入15μL 1M Tris-HCl(pH＝9.1)中和，即获得洗脱噬菌体，分别测定点突变组及P201对照组洗脱下来噬菌体的滴度。其结果见表2和图1，图1中1～12依次表示含有从1至12位丙氨酸突变的P201多肽的噬菌体克隆。
表2丙氨酸突变噬菌体的投入与产出量
由表2和图2的检测结果可知，1，2，5，9，10五个位点突变为丙氨酸后，对亲和力的影响最大(即在投入噬菌体量不变的条件下，经过淘选从板子上洗脱下来的噬菌体量减少)，可以认为这五个位点为关键氨基酸位点。
实施例3偏性肽库的构建与筛选
根据丙氨酸突变的结合能力测定，确定了P201与靶标蛋白结合的关键氨基酸位点，固定这5个氨基酸位点，将另外七个氨基酸以MNN的格式随机突变，合成一条两端带有同源臂的含随机序列的单链以及一条延伸引物，退火后用PCR进行延伸，补足双链。使用PCR方法扩增出带有同源臂的M13KE载体片段，切胶回收获得纯化后的线性化载体片段。其结果见图2，图2中条带M为DL 10,000DNA Marker；条带1为M13KE质粒；条带2为双酶切后的M13KE质粒(7.2kb)。
将扩增片段与插入片段进行同源重组，25μL反应体系：Super Fusion CloningMix(2×)12.5μL，载体片段10μL，插入片段2.5μL。将反应体系置于50℃反应30min，将其转化入制备好的超级感受态细胞中，共10个同源重组反应体系。留取一小部分转化产物用于测定库容，其余的转化产物进行噬菌体扩增。对扩增后的肽库进行三轮淘选(淘选步骤同实施例2)，从第三轮的平板上挑取31个克隆进行测序。
表3合成引物序列
由于插入片段中含有随机碱基，由公司合成一条单链及一条延伸引物，退火之后进行延伸反应，再通过同源重组的方式插入到载体片段上，转化入超级感受态细胞中，经测定，库容量为4×105pfu，扩增之后得到滴度为2.2×1010pfu/ul的二级肽库。
二级肽库经过三轮亲和淘选，包被有目的蛋白的板与对照板中洗脱下来的噬菌体比例(P/N值)大体呈现上升趋势，其结果见表4
表4噬菌体展示二级肽库的筛选
实施例4噬菌体克隆亲和力反筛测定
将三轮筛选得到的克隆扩增及测定滴度后，以FoxM1-DBD蛋白作为靶标，测定其亲和力(步骤同实施例2)。通过计算实验板与对照板滴度的比值(P/N值)，确定该条序列与靶标蛋白的亲和能力。
从第三轮滴度测定的平板上挑取31个噬菌体单克隆，进行测序，排除重复序列共得到11条多肽序列，扩增后测定每条序列对FoxM1-DBD的亲和力，2，3，6，11号多肽与靶标蛋白的结合能力较高(P/N值大于500)，并且均大于P201,其所包含结合肽序列及的蛋白结合能力测定结果见表5。
表5十一条结合肽噬菌体对FoxM1c-DBD亲和力测定
实施例5 Discovery Studio 2016分子模拟与对接
从PDB数据库中下载FoxM1-DBD的三维结构，将其导入DS中，删除DNA双链，进行去水加氢等处理，并使其仅保留一个受体结构，然后将其定义为受体，选择合适的结合位点范围。利用DS中的Protein Building功能，构建筛选所的多肽序列的三维结构，添加CHARMm力场，并将其能量最小化。将构建的多肽与受体FoxM1-DBD对接，使用CDOCKER Energy和CDOCKER Interaction Energy两种能量打分函数进行评价。
在Discovery Studio 2016中模拟出11条筛选肽小分子，进行能量最小化等预处理之后，使用CDOCKER将其与从PDB数据库中下载的FoxM1-DBD蛋白进行对接分析，对接分析结果见图3和表6。
表6 P201及11条筛选肽与FoxM1c的CDOCKER对接打分
图3中由左至右依次为表5中P201、1～11号多肽分别与FoxM1c-DBD的对接结果图。
根据表6的检测结果可可知，CDOCKER Energy为分子对接时的总能量，数值越大，对接体系越稳定；CDOCKER Interaction Energy为分子对接时受体-配体相互作用的能量，数值越大，配体和受体结合得越好。综合这两项指标来看，2号和11号与靶标蛋白FoxM1-DBD结合得最佳。
实施例7合成多肽对肝癌HepG2细胞的抑制作用
综合反筛测定与分子模拟结果最佳的多肽序列及原始序列P201，在序列的N端加上包含九个精氨酸和甘氨酸-丝氨酸连接氨基酸的跨膜肽序列，交由上海强耀生物公司合成(纯度＞98％)。合成的四条优化多肽具体序列为：
P202:RRRRRRRRRGSGSWHDHYNLRWYSA；(SEQ ID NO.41)
P203:RRRRRRRRRGSGSWHGFYENDWYML；(SEQ ID NO.42)
P204:RRRRRRRRRGSGSWHQNYIERWYST；(SEQ ID NO.43)
P205:RRRRRRRRRGSGSWHADYDFYWYED；(SEQ ID NO.44)
其中r为D-型精氨酸。
在96孔板中每孔加入5000个HepG2细胞，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后加药，培养24h后在倒置显微镜下观察细胞状态。加入CCK-8检测液，孵育1.5h后，用酶标仪测定450nm波长下的OD值。计算细胞抑制率＝(1-加药组OD450/对照组OD450)×100％。其结果见图4和图5。
图5每组数据中柱状图由左至右依次表示P201、P2、P6和P11，其中，P2、P6和P11即为表5中2、6、11号多肽的N端加上9个精氨酸和甘氨酸-丝氨酸连接氨基酸后形成的多肽序列。
由图4和图5的检测结果可知，从细胞形态来看，随着多肽浓度的增加，细胞逐渐皱缩变圆，开始产生细胞碎片。在40μg/mL与60μg/mL处理下，三条多肽均表现出比P201更好的抑制效果。在60μg/mL处理条件下，P2和P6的细胞抑制率均达到70％。
序列表
<110> 西南交通大学
<120> 一种P201优化肽、抗肿瘤多肽及其制备得到的药物和靶向抑制剂
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Ser Trp His Gln
1 5 10 15
Asn Tyr Ile Glu Arg Trp Tyr Ser Thr
20 25
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Ser Trp His Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Asp Phe Tyr Trp Tyr Glu Asp
20 25
Claims (4)
1.一种P201优化肽，其特征在于，所述优化肽包括12个氨基酸，由关键氨基酸与随机氨基酸组成；所述关键氨基酸包括位于1号位点的色氨酸、2号位点的组氨酸、5号位点的酪氨酸、9号位点的色氨酸和10号位点的酪氨酸；
所述优化肽的氨基酸序列为WHDHYNLRWYSA、WHGFYENDWYML、WHQNYIERWYST或WHADYDFYWYED。
2.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述多肽序列由权利要求1所述的序列的N端添加8-9个精氨酸以及甘氨酸、丝氨酸连接氨基酸组成，具体序列如SEQ ID NO.41~44所示。
3.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求1所述的优化肽，或权利要求2所述的多肽，以及其在药学上可接受的辅助成分。
4.一种FoxM1靶向抑制剂，其特征在于，其以权利要求1所述的优化肽，或权利要求2所述的多肽作为活性成分。
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Applications Claiming Priority (1)
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