ES2715406T3 - Modulación de la especificidad polipeptídica estructurada - Google Patents

Abstract

Un ligando peptídico específico para calicreína humana que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un andamiaje molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de tal forma que al menos dos bucles polipeptídicos se forman en el andamiaje molecular, en el que los bucles del ligando peptídico comprenden cinco aminoácidos y un bucle comprende el motivo GrA(ΨCH2NH)HQ/TxLGr, donde Gr es un grupo reactivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de la especificidad polipeptídica estructurada

La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen covalentemente a andamiajes moleculares de tal forma que se delimitan dos o más bucles peptídicos entre puntos de unión al andamiaje. En particular, la invención describe péptidos que son específicos para la proteasa humana calicreína plasmática y se modifican en uno o dos bucles peptídicos para mejorar la potencia y/o la resistencia a la proteasa.

Los péptidos cíclicos son capaces de unirse con alta afinidad y especificidad de diana a dianas proteicas y, por lo tanto, son una clase de moléculas atractiva para el desarrollo de productos terapéuticos. De hecho, se usan ya exitosamente varios péptidos cíclicos en el campo clínico, como, por ejemplo, el péptido antibacteriano vancomicina, el fármaco inmunosupresor ciclosporina o el fármaco anticancerígeno ocreotide (Driggers, et al., Nat Rev Drug Discov 2008, 7 (7), 608-24). Las buenas propiedades de unión son el resultado de una superficie de interacción relativamente grande formada entre el péptido y la diana, así como de la flexibilidad conformacional reducida de las estructuras cíclicas. Típicamente, los macrociclos se unen a superficies de varios cientos de angstroms cuadrados, como por ejemplo el péptido cíclico CVX15 antagonista de CXCR4 (400 A² ; Wu, B., et al., Science 330 (6007), 1066-71), un péptido cíclico con el motivo Arg-Gly-Asp de unión a la integrina aVb3 (355 A²) (Xiong, J. P., et al., Science 2002, 296 (5565), 151-5) o el inhibidor peptídico cíclico upaína-1 de unión al activador de plasminógeno de tipo urocinasa (603 A² ; Zhao, G., et al., J Struct Biol 2007, 160 (1), 1-10).

Debido a su configuración cíclica, los macrociclos peptídicos son menos flexibles que los péptidos lineales, lo que conduce a una menor pérdida de entropía tras la unión a dianas y dando como resultado una mayor afinidad de unión. La flexibilidad reducida conduce también a conformaciones específicas de diana bloqueadas, aumentando la especificidad de unión en comparación con péptidos lineales. Este efecto se ha ilustrado por medio de un inhibidor potente y selectivo de la metaloproteinasa de matriz 8, (MMP-8), que perdió su selectividad frente a otras MMP cuando se abrió su anillo (Cherney, R. J., et al., J Med Chem 1998, 41 (11), 1749-51). Las propiedades de unión favorables conseguidas mediante la macrociclación son aún más pronunciadas en péptidos multicíclicos que tienen más de un anillo peptídico como, por ejemplo, en vancomicina, nisina o actinomicina.

Diferentes equipos de investigación han anclado anteriormente polipéptidos con residuos de cisteína a una estructura molecular sintética (Kemp, D. S. y McNamara, P. E., J. Org. Chem, 1985; Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Meloen y colaboradores han usado tris(bromometil)benceno y moléculas relacionadas para una ciclación rápida y cuantitativa de múltiples bucles peptídicos sobre andamiajes sintéticos para la mímesis estructural de superficies proteicas (Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Se describen procedimientos para la generación de compuestos farmacológicos candidatos donde dichos compuestos se generan uniendo polipéptidos que contienen cisteína con un andamiaje molecular, como por ejemplo tris(bromometil)benceno, en los documentos WO 2004/077062 y WO 2006/078161.

El documento WO2004/077062 describe un procedimiento de selección de un compuesto farmacológico candidato. En particular, este documento describe diversas moléculas de andamiaje que comprenden un primer y segundo grupos reactivos, y poner en contacto dicho andamiaje con una molécula adicional para formar al menos dos uniones entre el andamiaje y la molécula adicional en una reacción de acoplamiento.

El documento WO2006/078161 describe compuestos de unión, compuestos inmunógenos y peptidomiméticos. Este documento describe la síntesis artificial de diversas recopilaciones de péptidos que se toman de proteínas existentes. Se combinan entonces estos péptidos con un péptido sintético constante que tiene algunos cambios aminoacídicos introducidos para producir recopilaciones combinatorias. Al introducir esta diversidad mediante el enlace químico para separar péptidos que presentan diversos cambios aminoacídicos, se proporciona una oportunidad aumentada de encontrar la actividad de unión deseada. La figura 1 de este documento muestra una representación esquemática de la síntesis de diversas construcciones peptídicas de bucle. Las construcciones descritas en este documento se basan en péptidos funcionalizados con -SH, típicamente que comprenden residuos de cisteína, y grupos heteroaromáticos en el andamiaje, típicamente que comprenden sustituyentes halógeno bencílico tales como bis o trisbromofenilbenceno. Dichos grupos reaccionan para formar un enlace tioéter entre el péptido y el andamiaje.

Se ha desarrollado recientemente un enfoque combinatorio basado en presentación en fagos para generar y cribar grandes recopilaciones de péptidos bicíclicos en dianas de interés (Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7; véase la solicitud de patente internacional WO2009/098450). Brevemente, se presentaron en fago recopilaciones combinatorias de péptidos lineales que contenían tres residuos de cisteína y dos regiones de seis aminoácidos aleatorios (Cys-(Xaa)⁶-Cys-(Xaa)⁶-Cys) y se ciclaron uniendo covalentemente las cadenas laterales de cisteína con una molécula pequeña (tr¡s-(bromomet¡l)benceno). Los péptidos bicíclicos aislados en selecciones de afinidad con las proteasas humanas catepsina G y calicreína plasmática (PK) tenían constantes inhibidoras nanomolares. El mejor inhibidor, PK15, inhibe la PK humana (hPK) con una Kⁱ de 3 nM. Las similitudes en las secuencias aminoacídicas de varios péptidos bicíclicos aislados sugerían que ambos bucles peptídicos contribuyen a la unión. PK15 no inhibía PK de rata (81 % de identidad de secuencia) ni las serinproteasas humanas homólogas factor XIa (hfXIa; 69 % de identidad de secuencia) o trombina (36 % de identidad de secuencia) a la máxima concentración ensayada (10 pM) (Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7). Este hallazgo sugería que el inhibidor bicíclico es altamente específico y que no se inhibirán otras serina proteasas humanas de tipo tripsina. Un inhibidor peptídico pequeño sintético tal como PK15, que tiene la potencia y selectividad de diana anteriormente descritas, tiene aplicación potencial como producto terapéutico para controlar la actividad de PK en angioedema hereditario, una enfermedad potencialmente mortal que se caracteriza por episodios recurrentes de edema, ni para prevenir la activación por contacto en cirugía de derivación cardiopulmonar.

Se aisló el péptido PK15 de una genoteca basada en el péptido PK2, H-ACSDRFRNCPLWSGTCG-NH² , en el que se asignó al azar el segundo bucle de 6 aminoácidos. La secuencia de PK15 era H-ACSDRFRNCPADEALCG-NH² , y la constante de unión CI50 por calicreína humana era de 1,7 nM.

Resumen de la invención

Se han analizado los reactivos de unión a calicreína para optimizar la afinidad y la actividad de unión. En la solicitud de patente pendiente de publicación junto con la presente PCT/EP2012/069898, se han descrito ligandos peptídicos bicíclicos selectivos que son inhibidores de la calicreína plasmática humana.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un ligando peptídico específico para calicreína humana que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un andamiaje molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de tal forma que al menos dos bucles polipeptídicos se forman en el andamiaje molecular, en el que los bucles del ligando peptídico comprenden cinco aminoácidos y un bucle comprende el motivo G^rA(^CH² NH)H^Q/^r xLG^r, donde G^r es un grupo reactivo.

En una realización descrita en el mismo, los bucles del ligando peptídico comprenden cinco aminoácidos y un primer bucle comprende el motivo G^pX^w /^f P^xk /^r G^p, donde G^r es un grupo reactivo. En el presente contexto, la referencia a un "primer" bucle no representa necesariamente una posición particular del bucle en una secuencia. Sin embargo, en algunas realizaciones, el primer bucle puede ser un bucle proximal en una secuencia peptídica del extremo amino al extremo carboxilo. Por ejemplo, el polipéptido comprende además un segundo bucle distal que comprende el motivo G^rT/^LH^Q/^rxLG^r. Los ejemplos de secuencias del primer bucle incluyen G^rxWPARG^r, G^rxWPSRG^r, G^rxFPFRG^r y G^rxFPYRG^r. En estos ejemplos, x puede ser cualquier aminoácido, pero es, por ejemplo, S o R.

Por ejemplo, el polipéptido puede ser uno de los polipéptidos expuestos en la tabla 4, la tabla 5 o la tabla 6.

El grupo reactivo puede ser un aminoácido reactivo. Por ejemplo, el aminoácido reactivo es la cisteína.

Se pueden preparar variantes de los polipéptidos identificando aquellos residuos que están disponibles para la mutación y preparando bibliotecas que incluyen mutaciones en esas posiciones. Por ejemplo, el polipéptido 06-56 en la tabla 4, figuras 5, 6 puede mutarse sin pérdida de actividad en las posiciones Q4 y T10 (véanse los ejemplos a continuación). Pueden seleccionarse ligandos polipeptídicos que comprenden mutaciones en estas posiciones que tienen una actividad de unión mejorada en comparación con 06-56.

Para un biciclo inhibidor de calicreína, es pertinente obtener un perfil de estabilidad a proteasas adecuado, de tal modo que tenga un bajo aclaramiento impulsado por proteasa en plasma u otros entornos relevantes. En un ensayo de estabilidad plasmática comparativa rápido (procedimiento n.° 1) que observaba la desaparición progresiva del péptido original en plasma de rata, se encontró que la alanina N-terminal (que está presente en el momento de las selecciones y estaba incluida originalmente en péptidos sintéticos de secuencias de compuestos principales) se retira rápidamente de todas las secuencias bicíclicas ensayadas tanto por plasma de rata como humano. Esta degradación se evitaba sintetizando un candidato a compuesto principal que carecía de ambas alaninas N y C-terminales. Para eliminar los puntos de reconocimiento potenciales de aminopeptidasas y carboxipeptidasas, se cubre el extremo amino libre que reside ahora en Cys 1 del candidato a compuesto principal con anhídrido acético durante la síntesis peptídica, conduciendo a una molécula que está acetilada N-terminalmente. De igual forma, se sintetiza la cisteína C-terminal en forma de amida para retirar el punto de reconocimiento potencial de carboxipeptidasas.

Por lo tanto, en un ejemplo, los candidatos a compuestos principales bicíclicos tienen la siguiente secuencia genérica:

Ac-C^l AA lAA2AAnC2AAn+lAAn+2AAn+3C3 (T M B )-NH²

donde "Ac" se refiere a la acetilación N-terminal, "-NH²" se refiere a la amidación C-terminal, donde "C¹ , C² , C³" se refiere a la primera, segunda y tercera cisteína en la secuencia, donde "AAⁱ " a "AAⁿ" se refiere a la posición del aminoácido (cuya naturaleza "AA" se define mediante las selecciones descritas anteriormente), y donde "(TMB)" indica que la secuencia del péptido se ha ciclado con TBMB (trisbromometilbenceno) o cualquier otro andamiaje reactivo adecuado.

En este contexto, los péptidos del compuesto principal "Ac-(06-34-18)(TMB)" y "Ac-(06-34-18)(TMB) Phe2 Tyr4" tienen las secuencias Ac-c Sw PARCLHQDLC-NH y Ac-CSFPYRClHq DlC-Nh² , respectivamente. Estas pueden numerarse de acuerdo con el esquema anterior como

1) AC-C¹ S¹W²P³A⁴R⁵C²L⁶H⁷Q⁸D⁹L¹⁰C³-NH²

representada como as Ac-(06-34-18)(TMB)

2) AC-C¹ S¹ F² P³Y⁴R⁵C² L⁶H⁷Q⁸D⁹L¹⁰C³-NH²

representada como Ac-(06-34-18)(TMB) Phe2 Tyr4

donde las cisteínas invariantes están subrayadas. Estos péptidos se han caracterizado en detalle, y se ha demostrado que tienen una potencia sub-nanomolar contra la calicreína, con perfiles de selectividad muy favorables hacia proteínas homólogas a la calicreína, mientras que conservan una buena reactividad cruzada hacia la calicreína de rata. Esto último es valioso para establecer la farmacodinámica en modelos animales.

El péptido no modificado Ac-06-34-18(TMB)-NH² tiene una semivida de 2,3 en plasma de rata, mientras que la de Ac-06-34-18(TMB)-NH² Phe2 Tyr4 es ligeramente más corta, a 0,9 h (tabla 1) En un esfuerzo por identificar el sitio o sitios de reconocimiento proteolítico en Ac-06-34-18(TMB)-NH² , se muestreó el péptido en plasma de rata con el tiempo (procedimiento N.° 1) y se analizó en cada muestra la aparición progresiva de fragmentos peptídicos usando espectrometría de masas MALDI-TOF. Esto reveló que Arg5 en el bucle 1 es el sitio principal de reconocimiento de proteasas y la posterior degradación del péptido.

Se realizó un proceso de síntesis química para identificar los sustitutos de la Arginina5 que protegerían suficientemente el péptido de la degradación de la proteasa plasmática de rata. Se encontró que la eliminación de Arg 5 en el bucle 1, o el reemplazo de la cadena lateral de Arg con cualquier entidad química cargada o sin carga, mejora la estabilidad del ligando peptídico.

Además, la estabilidad proteolítica se ve reforzada por la modificación química de los enlaces peptídicos N o C-terminalmente adyacentes a Arg5. La modificación química es, por ejemplo, a-N-alquilación, o modificación del enlace peptídico con su forma amida reducida.

En una realización, la estabilidad proteolítica se ve aumentada por la obstrucción estérica de los aminoácidos cercanos a Arg5. Por ejemplo, la obstrucción estérica es resultado de la a-N-alquilación.

Estos candidatos a péptidos bicíclicos se evaluaron luego por las siguientes características:

1) mantenimiento de la potencia contra la calicreína humana (que busca una Ki de 10 nM o inferior)

2) mantenimiento de la potencia contra la calicreína de rata (que busca una Ki de 50 nM o inferior)

3) estabilidad mejorada en plasma de rata (mayor t^1/2 deseable en comparación con el péptido de tipo silvestre) 4) mantenimiento del perfil de selectividad frente a otras enzimas y proteínas relacionadas con la calicreína.

En el transcurso de las investigaciones, en el documento PCT/EP2012/069898, se determinó que las siguientes modificaciones o imitadores de arginina cumplían con los 4 criterios anteriores, siendo estos

a) 4-guanidilfenilalanina (4-GuanPhe: aumento de t^{1 /2} en plasma de rata: 1-5 veces);

b) homoarginina (HArg: aumento de t^1/2 en plasma de rata: ~2-5 veces); y

c) a-N-metilarginina (NMe-Arg: aumento de t^1/2 en plasma de rata: >10 veces

Se ha encontrado que ciertos aminoácidos no naturales permiten la unión a la calicreína plasmática con Ki nM, mientras se aumenta significativamente el tiempo de residencia en el plasma. Los datos se resumen en la tabla 1 y la figura 17.

Además, PCT/EP2012/069898 también describió una modificación adicional en la posición 3 en 06-34-18, donde la prolina se reemplazó por ácido azetidin-carboxílico (Aze3). Esta modificación, probablemente debido a su mayor restricción y reducida entropía, aumenta invariablemente la potencia de un péptido basado en 06-34-18 por un factor de 2 a 5 (tabla 1). En combinación con las modificaciones que aumentan la estabilidad en Arg 5 (específicamente, HArg, NMe-Arg y 4GuanPhe), se obtienen derivados de péptidos bicíclicos más potentes.

Los aminoácidos no naturales ejemplares se seleccionan de N-metil arginina, homo-arginina e hidroxiprolina. Los N-metil y los homo-derivados de Arginina se usan para reemplazar la Arginina, y la prolina 3 puede reemplazarse, por ejemplo, por hidroxiprolina, ácido azetidin-carboxílico o un aminoácido alfa-sustituido, tal como ácido aminoisobutírico. En otra realización, la arginina puede reemplazarse por guanidilfenilalanina.

En una realización, el polipéptido comprende un primer bucle que comprende el motivo G^rxWPARG^r, donde P se reemplaza con ácido azetidin-carboxílico; y/o R se reemplaza con N-metil arginina; y/o R se reemplaza con homoarginina; y/o R se reemplaza con guanidil-fenilalanina.

En una realización, el polipéptido comprende un primer bucle que comprende el motivo G^rxFPYRG^r, donde R se reemplaza con N-metil arginina; y/o R se reemplaza con homoarginina, y donde la prolina se reemplaza por ácido azetidin-carboxílico; y/o R se reemplaza con guanidil-fenilalanina.

Ahora se han desarrollado los enfoques utilizados en el documento PCT/EP2102/069898, y se exponen en el presente documento, de acuerdo con su aplicación a la optimización del segundo bucle. De acuerdo con la presente invención, se ha identificado un sitio de reconocimiento de proteasa adicional en el bucle 2, que se ubica en la Histidina 7 en la secuencia 06-34-18. Este residuo es reconocido en particular por las proteasas contenidas en plasma humano ex vivo. Además, este sitio también es reconocido por las proteasas unidas a membrana de rata como se determina en un estudio de farmacocinética de rata in vivo.

Por lo tanto, para que 06-34-18 logre un perfil de estabilidad farmacocinética adecuado como se requiere para fines terapéuticos, ambos sitios de reconocimiento de proteasa (Arg5 en el bucle 1 e His7 en el bucle 2) deben estar estabilizados de modo que el péptido sea resistente a las proteasas plasmáticas humanas, y el entorno proteolíticamente agresivo se ha encontrado in vivo tanto en ratas como en seres humanos.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente descripción, se proporciona un ligando peptídico específico para calicreína humana que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un andamiaje molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de modo que al menos dos bucles de polipéptidos se formen en el andamiaje molecular, donde los bucles del ligando peptídico comprenden cinco aminoácidos y un bucle comprende el motivo G^rT /ⁱ_H^Q/^TxLG^r.

En el contexto del péptido 06-34-18, este bucle es el segundo bucle, posicionado C-terminal a un primer bucle. Por ejemplo, el motivo es G^rxHxDLG^r, donde G^r es un grupo reactivo. Por ejemplo, el motivo es G^rTHxxLG^r.

En una realización, dos bucles adyacentes del polipéptido comprenden el motivo G^rx^W/^FPx^K/^RGr^T /ⁱ_H^Q/^T DLG^r.

Los ejemplos de dichos polipéptidos se exponen en la tabla 4, tabla 5 o la tabla 6.

En un segundo aspecto de la presente descripción, se proporciona un ligando peptídico como se describe en el primer aspecto de la presente descripción, en el que la eliminación de His 7 en el bucle 2, o el reemplazo de la cadena lateral de histidina por cualquier entidad química no cargada o cargada, mejora la estabilidad del ligando peptídico.

Por ejemplo, la estabilidad proteolítica se ve reforzada por la modificación química de los enlaces peptídicos N o C-terminalmente adyacentes a His7. La modificación química es, por ejemplo, a-N-alquilación, o modificación del enlace peptídico con su forma amida reducida.

En una realización, la estabilidad proteolítica se ve aumentada por la obstrucción estérica de los aminoácidos cercanos a His 7. Por ejemplo, la obstrucción estérica se debe al reemplazo de la posición 9 por su enantiómero D-aminoácido, o a-N-alquilación.

En otra realización, la estabilidad proteolítica se mejora mediante la introducción de aminoácidos estéricamente obstructivos en la posición 6. Por ejemplo, la estabilidad proteolítica se mejora mediante la introducción de aminoácidos derivados de Cp tal como fenilglicina o ciclohexilglicina en la posición 6, lo que aumenta la potencia de la secuencia del ligando peptídico hacia la calicreína plasmática humana y reduce la hidrólisis proteolítica del enlace peptídico C-terminal.

La enseñanza de la presente descripción puede combinarse con la enseñanza del documento PCT/EP2012/06989, de manera que el polipéptido de acuerdo con la descripción puede comprender un primer bucle que comprende el motivo G^rxWPARG^r o G^rxFPYRG^r y un segundo bucle que comprende el motivo G^rT / ⁱ_H^Q/^TxLG^r.

En un ejemplo, en el primer bucle, Pro 3 se reemplaza por ácido azetidin-carboxílico; y/o Arg 5 se reemplaza por N-metil arginina; y/o Arg 5 se reemplaza por homoarginina; y/o Arg 5 se reemplaza por guanidilfenilalanina.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Selección en fago de péptidos bicíclicos. (a) Colecciones en fago de péptidos bicíclicos. Se indican los aminoácidos aleatorios como "X", alanina como "A" y los tres residuos constantes de cisteína como "C". (b) Formato de las estructuras peptídicas bicíclicas sintetizadas químicamente que tienen bucles de 3, 5 o 6 aminoácidos. Se generan las estructuras ligando péptidos lineales a través de tres cadenas laterales de cisteína con tris-(bromometil)benceno (TBMB). Los aminoácidos que varían en los péptidos bicíclicos se indican con "Xaa". (c-e) Secuencias de péptidos bicíclicos aislados de la genoteca 5x5 (c), la genoteca 3x3 A (d) y la genoteca 3x3 B (e). Las similitudes en aminoácidos se resaltan por sombreado.

Figura 2 Comparación de los aminoácidos de superficie de hPK y serina proteasas homólogas. (a) Estructura de hPK (entrada de ^p D^b 2ANW) con representación superficial. Los átomos de aminoácidos que se exponen en la superficie y más cercanos que 4, 8 y 12 A a la benzamidina (en gris) unida al bolsillo S1 están teñidos más oscuros. (b) Estructura de hPK. Se resaltan las cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes en hfXIa. (c) Estructura de hPK. Se resaltan las cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes en rPK.

Figura 3 Representación gráfica del procedimiento usado para la determinación de los residuos preferidos para mutación en ligandos polipeptídicos.

Figura 4 Análisis de las sustituciones aminoacídicas en el péptido 06-34 (tabla 4) en la unión del péptido a calicreína plasmática a 2 nM. Para cada posición, se muestra el efecto de diversas mutaciones en esa posición, en comparación con la secuencia original.

Figura 5 Análisis de las sustituciones aminoacídicas en el péptido 06-56 (tabla 4) en la unión del péptido a calicreína plasmática a 2 nM. Para cada posición, se muestra el efecto de diversas mutaciones en esa posición, en comparación con la secuencia original.

Figura 6 Análisis de las sustituciones aminoacídicas en el péptido 06-56 (tabla 4) en la unión del péptido a calicreína plasmática a 10 nM. Para cada posición, se muestra el efecto de diversas mutaciones en esa posición, en comparación con la secuencia original.

Figura 7 Resultado de la espectrometría de masas que muestra los espectros de masas de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 después de exposición a plasma de rata al 35 % en t0, 1 día, 2 días y 3 días (procedimiento N.° 1). Las precisiones de masa varían algo debido a iones interferentes y las bajas concentraciones de los fragmentos; sin embargo, es posible la identificación de fragmentos proteolíticos discretos.

Figura 8 Estructuras químicas de los metabolitos M1, M2 y M3 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 identificados después de exposición a plasma de rata.

Figura 9 Estructura química del compuesto principal Ac-06-34-18(TMB)-NH2

Figura 10 Ensayo de inhibición enzimática de calicreína por el compuesto principal Ac-06-34-18(TMB)-NH2 y sus derivados de primer bucle permutado. Se observa una drástica reducción de la afinidad, subrayando la importancia de la integridad del farmacóforo WPAR.

Figura 11 Estructuras químicas de la arginina y sus análogos.

Figura 12 Estructuras químicas del Trp y análogos hidrófobos potenciales.

Figura 13 Estructuras químicas de Pro y análogos restringidos potenciales.

Figura 14 Inhibición comparativa de calicreína por Aze3, NMeArg5 y Ac-06-34-18(TMB)-NH2 doblemente modificado.

Figura 15 Estructuras químicas de alanina y derivados de la misma.

Figura 16 Inhibición comparativa de calicreína por F2Y4, F2Y4 HR5 y Ac-06-34-18(TMB)-NH2 doblemente modificado.

Figura 17 Estructuras químicas de las modificaciones de bucle 1 en Ac-(06-34-18) que imparten un aumento de la estabilidad y/o la potencia favorable en plasma de rata (Aze3 en lugar de Pro3, 4GuanPhe en lugar de Arg5, HArg en lugar de Arg5, NMe-Arg5 en lugar de Arg5).

Figura 18a Un péptido de tipo silvestre se somete a plasma humano. Se debe tener en cuenta la aparición de fragmentos con His7-Gln8, Leu6 y Leu6-His7-Gln8 eliminados. Debido a la naturaleza de MALDI-TOF, la intensidad de las señales no es cuantitativa. Los posibles sitios de hidrólisis en la secuencia se indican con las flechas en el diagrama, con la dirección de la degradación posterior indicada por las flechas horizontales sobre la secuencia.

Figura 18b 06-34-18 N-metilado con Arg5 se somete a plasma humano. Este péptido ha mejorado la estabilidad en plasma de rata. Sin embargo, en el plasma humano, el péptido no es estable, como se ilustra por la aparición de fragmentos que carecen de His7-Gln8, Leu6 y Leu6-His7-Gln8 en el bucle 2. Debido a la naturaleza de MALDI-TOF, la intensidad de las señales no es cuantitativa.

Figura 19a Estructura química del bucle 2 de 06-34-18

Figura 19b Resumen de las estructuras empleadas en la posición 6 en el bucle 2. Los acrónimos de aminoácidos no estándar se definen en los procedimientos y en la tabla 7.

Figura 19c Resumen de las estructuras empleadas en la posición 7 en el bucle 2. Los acrónimos de aminoácidos no estándar se definen en los procedimientos y en la tabla 7.

Figura 19d Resumen de las estructuras empleadas en la posición 8 en el bucle 2. Los acrónimos de aminoácidos no estándar se definen en los procedimientos y en la tabla 7.

Figura 20a Estructura del Peptoide N-His en el bucle 2 de 06-34-18. Se introdujo una cadena lateral de homohistidina en el Na, mientras que Ca pierde su centro quiral.

Figura 20b Estructura de la amida reducida entre la posición 6 y 7 en el bucle 2 de 06-34-18. El metileno en lugar del carbonilo elimina el enlace peptídico escindible.

Figura 21a Estabilidad comparativa de (06-34-18) de tipo silvestre en t = 0, 21 y 46 h en plasma humano.

Figura 21 b Estabilidad comparativa de (06-34-18) de tipo silvestre en t = 0, 21 y 46 h en plasma de rata.

Figura 21c Estabilidad comparativa de (06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 en t = 0, 21 y 46 h en plasma humano.

Figura 21d Estabilidad comparativa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 en t = 0, 21 y 46 h en plasma humano.

Figura 21e Estabilidad comparativa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 en t = 0, 21 y 46 h en plasma de rata.

Figura 22 Estructura química completa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6. Todos los aminoácidos están en la forma L-enantiomérica.

Figura 23 Análisis farmacocinético en rata de los péptidos Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 y Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 en comparación con el enantiómero todo D proteolíticamente estable pero farmacológicamente inerte de Ac-(06-34-18). Se ha de tener en cuenta que la depuración de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 se parece bastante a la del péptido de control D-aminoacídico "Ac-(06-34-18) todo D". Las líneas de puntos horizontales indican el límite de cuantificación para cada uno de los péptidos respectivos.

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por los expertos en la técnica, tal como en las técnicas de química de péptidos, cultivo celular y presentación en fago, química de ácidos nucleicos y bioquímica. Se usan técnicas estándares de biología molecular, genética y procedimientos bioquímicos (véanse Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.). Un ligando peptídico, como se hace referencia en el presente documento, se refiere a un péptido unido covalentemente a un andamiaje molecular. Típicamente, dichos péptidos comprenden dos o más grupos reactivos que son capaces de formar enlaces covalentes con el andamiaje, y una secuencia delimitada entre dichos grupos reactivos a la que se hace referencia como la secuencia de bucle, dado que forma un bucle cuando el péptido se une al andamiaje. En el presente caso, los péptidos comprenden al menos tres grupos reactivos y forman al menos dos bucles en el andamiaje.

Los grupos reactivos son grupos capaces de formar un enlace covalente con el andamiaje molecular. Típicamente, los grupos reactivos están presentes en cadenas laterales aminoacídicas del péptido. Son ejemplos grupos que contienen amino tales como cisteína, lisina y selenocisteína.

Especificidad, en el contexto del presente documento, hace referencia a la capacidad de un ligando de unirse o interactuar de otro modo con su diana análoga con la exclusión de entidades que sean similares a la diana. Por ejemplo, especificidad puede hacer referencia a la capacidad de un ligando de inhibir la interacción de una enzima humana, pero no una enzima homóloga de una especie diferente. Usando el enfoque descrito en el presente documento, puede modularse la especificidad, es decir aumentarse o disminuirse, para hacer a los ligandos más o menos capaces de interaccionar con homólogos o parálogos de la diana pretendida. No se pretende que especificidad sea sinónimo de actividad, afinidad o avidez, y la potencia de la acción de un ligando sobre su diana (tal como, por ejemplo, afinidad de unión o nivel de inhibición) no está necesariamente relacionada con su especificidad.

Actividad de unión, como se usa en el presente documento, hace referencia a medidas de unión cuantitativas tomadas de ensayos de unión, por ejemplo, como se describen en el presente documento. Por lo tanto, actividad de unión hace referencia a la cantidad de ligando peptídico que está unida a una concentración de diana dada.

Multiespecificidad es la capacidad de unirse a dos o más dianas. Típicamente, los péptidos de unión son capaces de unirse a una sola diana, tal como un epítopo en el caso de un anticuerpo, debido a sus propiedades conformacionales. Sin embargo, pueden desarrollarse péptidos que pueden unirse a dos o más dianas; anticuerpos específicos duales, por ejemplo, como se conocen en la técnica a la que se hace referencia anteriormente. En la presente invención, los ligandos peptídicos pueden ser capaces de unirse a dos o más dianas y son por lo tanto multiespecíficos. Por ejemplo, se unen a dos dianas, y son específicos duales. La unión puede ser independiente, lo que significaría que los sitios de unión para las dianas en el péptido no están estructuralmente impedidos por la unión de una u otra de las dianas. En este caso, ambas dianas pueden unirse independientemente. Más generalmente, se espera que la unión de una diana impida al menos parcialmente la unión de la otra.

Hay una diferencia fundamental entre un ligando específico dual y un ligando con especificidad que engloba dos dianas relacionadas. En el primer caso, el ligando es específico de ambas dianas individualmente e interactúa con cada una de manera específica. Por ejemplo, un primer bucle en el ligando puede unirse a una primera diana, y un segundo bucle a una segunda diana. En el segundo caso, el ligando es no específico debido a que no se diferencia entre las dos dianas, por ejemplo, interactuando con un epítopo de las dianas que es común a ambas.

En el contexto de la presente invención, es posible que un ligando que tiene actividad con respecto, por ejemplo, a una diana y un ortólogo, pueda ser un ligando biespecífico. Sin embargo, en una realización, el ligando no es biespecífico, sino que tiene una especificidad menos precisa de tal modo que se une tanto a la diana como a uno o más ortólogos. En general, un ligando que no se ha seleccionado frente tanto a una diana como a su ortólogo es menos probable que sea biespecífico como resultado de la modulación de la longitud del bucle.

Si los ligandos son verdaderamente biespecíficos, en una realización, al menos una de las especificidades de diana de los ligandos será común entre los ligándose seleccionados, y el nivel de esa especificidad puede modularse por los procedimientos descritos en el presente documento. Una segunda o adicionales especificidades no tienen que ser compartidas, y no tienen que ser sujeto de los procedimientos expuestos en el presente documento.

Una diana es una molécula o parte de la misma con la que los ligandos peptídicos se unen o interaccionan de otro modo. Aunque se observa la unión como un prerrequisito para la actividad de la mayoría de las clases, y puede ser una actividad en sí misma, se prevén otras actividades. Por lo tanto, la presente invención no requiere la medida de la unión directa o indirectamente.

El andamiaje molecular es cualquier molécula que sea capaz de conectar el péptido en múltiples puntos para conferir uno o más rasgos estructurales al péptido. No es un reticulante, porque no reemplaza simplemente un enlace disulfuro; en su lugar, proporciona dos o más puntos de unión para el péptido. De forma adecuada, el andamiaje molecular comprende al menos tres puntos de unión para el péptido, a los que se hace referencia como grupos reactivos de andamiaje. Estos grupos son capaces de reaccionar con los grupos reactivos del péptido para formar un enlace covalente. Se describen a continuación estructuras preferidas para andamiajes moleculares.

Se realiza el cribado de la actividad de unión (o cualquier otra actividad deseada) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, de tecnología de presentación en fago. Por ejemplo, pueden usarse dianas inmovilizadas en una fase sólida para identificar y aislar los miembros de unión de un repertorio. El cribado permite la selección de los miembros de un repertorio de acuerdo con las características deseadas.

El término genoteca hace referencia a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La genoteca está compuesta por miembros que no son idénticos. En este sentido, genoteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los miembros de la genoteca son responsables de la diversidad presente en la genoteca. La genoteca puede adoptar la forma de una mezcla sencilla de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en forma de organismos o células, por ejemplo, bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con una genoteca de ácidos nucleicos. En algunas condiciones, cada organismo o célula individual contiene solo uno o un número limitado de miembros de la genoteca.

En una realización, se incorporan ácidos nucleicos a vectores de expresión para permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por lo tanto, una genoteca puede adoptar la forma de una población de organismos huésped, conteniendo cada organismo una o más copias de un vector de expresión que contiene un solo miembro de la genoteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su correspondiente miembro polipeptídico. Por lo tanto, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de variantes polipeptídicas genéticamente diversas.

En una realización, una genoteca de ácidos nucleicos codifica un repertorio de polipéptidos. Cada miembro ácido nucleico de la genoteca tiene típicamente una secuencia relacionada con uno o más de otros miembros de la genoteca. Se entiende por secuencia relacionada una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50 % de identidad, por ejemplo al menos un 60 % de identidad, por ejemplo al menos un 70 % de identidad, por ejemplo al menos un 80 % de identidad, por ejemplo al menos un 90 % de identidad, por ejemplo al menos un 95 % de identidad, por ejemplo al menos un 98 % de identidad, por ejemplo al menos un 99 % de identidad con al menos otro miembro de la genoteca. La identidad puede determinarse en un segmento continuo de al menos 3 aminoácidos, por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, por ejemplo, al menos 12 aminoácidos, por ejemplo, al menos 14 aminoácidos, por ejemplo, al menos 16 aminoácidos, por ejemplo, al menos 17 aminoácidos o la longitud completa de la secuencia de referencia.

Un repertorio es una recopilación de variantes, en este caso variantes polipeptídicas, que difieren en su secuencia. Típicamente, la localización y la naturaleza de los grupos reactivos no variará, pero las secuencias que forman los bucles entre ellos pueden asignarse al azar. Los repertorios difieren en tamaño, pero debería considerarse que comprenden al menos 102 miembros. Pueden construirse repertorios de 1011 o más miembros.

Un conjunto de ligandos polipeptídicos, como se usa en el presente documento, hace referencia a una pluralidad de ligandos polipeptídicos que pueden someterse a selección en los procedimientos descritos. Potencialmente, un conjunto puede ser un repertorio, pero puede ser también una recopilación pequeña de polipéptidos, de al menos 2 hasta 10, 20, 50, 100 o más.

Un grupo de ligandos polipeptídicos, como se usa en el presente documento, hace referencia a dos o más ligandos. En una realización, un grupo de ligandos comprende solo ligandos que comparten al menos una especificidad de diana. Típicamente, un grupo consistirá en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, 20, 50, 100 o más ligandos. En una realización, un grupo consiste en 2 ligandos.

(A) Construcción de ligandos peptídicos

(i) Andamiaje molecular

Se describen andamiajes moleculares en, por ejemplo, el documentoWO2009098450 y referencias citadas en el mismo, particularmente los documentos WO2004077062 y WO2006078161.

Como se señala en los documentos anteriores, el andamiaje molecular puede ser una molécula pequeña, tal como una molécula orgánica pequeña.

En una realización, el andamiaje molecular puede ser, o puede estar basado en, monómeros naturales tales como nucleósidos, azúcares o esteroides. Por ejemplo, el andamiaje molecular puede comprender un polímero corto de tales entidades, tales como un dímero o un trímero.

En una realización, el andamiaje molecular es un compuesto de toxicidad conocida, por ejemplo, de baja toxicidad. Los ejemplos de compuestos adecuados incluyen colesteroles, nucleótidos, esteroides o fármacos existentes tales como tamazepam.

En una realización, el andamiaje molecular puede ser una macromolécula. En una realización, el andamiaje molecular es una macromolécula compuesta por aminoácidos, nucleótidos o carbohidratos.

En una realización, el andamiaje molecular comprende grupos reactivos que son capaces de reaccionar con un grupo o grupos funcionales del polipéptido formando enlaces covalentes.

El andamiaje molecular puede comprender grupos químicos como aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anhídridos, succinimidas, maleimidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.

En una realización, el andamiaje molecular puede comprender o puede consistir en tris(bromometil)benceno, especialmente 1,3,5-tris(bromometil)benceno ("TBMB"), o un derivado del mismo.

En una realización, el andamiaje molecular es 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno. Es similar al 1,3,5­ tris(bromometil)benceno, pero contiene adicionalmente tres grupos metilo unidos con el anillo de benceno. Esto tiene la ventaja de que los grupos metilo adicionales pueden formar contactos adicionales con el polipéptido y, por lo tanto, añadir restricción estructural adicional.

El andamiaje molecular de la invención contiene grupos químicos que permiten a los grupos funcionales del polipéptido de la genoteca codificada de la invención formar enlaces covalentes con el andamiaje molecular. Dichos grupos químicos se seleccionan de una amplia variedad de funcionalidades incluyendo aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anhídridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.

(ii) Polipéptido

Los grupos reactivos de los polipéptidos pueden proporcionarse por cadenas laterales de aminoácidos naturales o no naturales. Los grupos reactivos de los polipéptidos pueden seleccionarse de entre grupos tiol, grupos amino, grupos carboxilo, grupos guanidinio, grupos fenólicos o grupos hidroxilo. Los grupos reactivos de los polipéptidos pueden seleccionarse de grupos azida, cetocarbonilo, alquino, vinilo o haluro de alquilo. Los grupos reactivos de los polipéptidos para ligar con un andamiaje molecular pueden ser los extremos amino o carboxi del polipéptido.

En algunas realizaciones, cada uno de los grupos reactivos del polipéptido para la unión a un andamiaje molecular son del mismo tipo. Por ejemplo, cada grupo reactivo puede ser un residuo de cisteína. Se proporcionan detalles adicionales en el documento WO2009098450.

En algunas realizaciones, los grupos reactivos para la unión a un andamiaje molecular pueden comprender dos o más tipos diferentes, o pueden comprender tres o más tipos diferentes. Por ejemplo, los grupos reactivos pueden comprender dos residuos de cisteína y un residuo de lisina, o pueden comprender un residuo de cisteína, un residuo de lisina y una amina N-terminal.

Puede emplearse cisteína porque tiene la ventaja de que su reactividad es la más diferente de todos los demás aminoácidos. Los grupos reactivos de andamiaje que podrían usarse en el andamiaje molecular para reaccionar con los grupos tiol de las cisteínas son haluros de alquilo (o también llamados halogenoalcanos o haloalcanos). Son ejemplos bromometilbenceno (el grupo reactivo de andamiaje ilustrado por TBMB) o yodoacetamida. Otros grupos reactivos de andamiaje que se usan para acoplar selectivamente compuestos a cisteínas en proteínas son las maleimidas. Los ejemplos de maleimidas que puede usarse como andamiajes moleculares en la invención incluyen: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimidoetil)benceno y tris-(maleimido)benceno. La selenocisteína es también un aminoácido natural que tiene una reactividad similar a la cisteína y puede usarse para las mismas reacciones. Por lo tanto, siempre que se mencione cisteína, es típicamente aceptable sustituir por selenocisteína a menos que el contexto sugiera otra cosa.

Las lisinas (y aminas primarias del extremo N de péptidos) son también adecuadas como grupos reactivos para modificar péptidos en fago por ligadura con un andamiaje molecular. Sin embargo, son más abundantes en proteínas de fago que las cisteínas y hay un mayor riesgo de que las partículas de fago puedan reticularse o que puedan perder su infectividad. No obstante, se ha encontrado que las lisinas son especialmente útiles en reacciones intramoleculares (por ejemplo, cuando un andamiaje molecular está ya unido al péptido de fago) para formar una segunda o consecutiva unión con el andamiaje molecular. En este caso, el andamiaje molecular reacciona preferiblemente con lisinas del péptido presentado (en particular lisinas que están en estrecha proximidad). Los grupos reactivos de andamiaje que reaccionan selectivamente con aminas primarias son las succinimidas, aldehídos o haluros de alquilo. En el grupo bromometilo que se usa en una serie de ejemplos adjuntos, los electrones del anillo de benceno pueden estabilizar el estado de transición catiónico. Este haluro de arilo particular es, por lo tanto, 100-1000 veces más reactivo que los haluros de alquilo. Los ejemplos de succinimidas para su uso como andamiaje molecular incluyen tris-(aminotriacetato de succinimidilo) y ácido 1,3,5-bencenotriacético. Los ejemplos de aldehídos para su uso como andamiaje molecular incluyen triformilmetano. Los ejemplos de haluros de alquilo para su uso como andamiaje molecular incluyen 1,3,5-tris(bromometil)-2,4,6-trimetilbenceno, 1,3,5-tris(bromometil)benceno y 1,3,5-tris(bromometil)-2,4,6-trietilbenceno. Los aminoácidos con grupos reactivos para la unión con un andamiaje molecular pueden localizarse en cualquier posición adecuada en el polipéptido. Para influir en las estructuras particulares o bucles creados, las posiciones de los aminoácidos que tienen los grupos reactivos pueden variarse por el operario especialista, por ejemplo, mediante manipulación del ácido nucleico que codifica el polipéptido, para mutar el polipéptido producido. Mediante tal medio, puede manipularse la longitud de bucle de acuerdo con la presente enseñanza.

Por ejemplo, el polipéptido puede comprender la secuencia AC(X)ⁿC(X)^mCG, donde X representa un aminoácido natural aleatorio, A alanina, C cisteína y G glicina, y n y m, que pueden ser iguales o diferentes, son números entre 3 y 6.

(iii) Grupos reactivos del polipéptido

El andamiaje molecular de la invención puede unirse al polipéptido a través de grupos funcionales o reactivos en el polipéptido. Estos se forman típicamente a partir de las cadenas laterales de aminoácidos particulares encontrados en el polímero polipeptídico. Dichos grupos reactivos pueden ser una cadena lateral de cisteína, una cadena lateral de lisina o un grupo amino N-terminal o cualquier otro grupo reactivo adecuado. De nuevo, pueden encontrarse detalles en el documento WO2009098450.

Son ejemplos de grupos reactivos de aminoácidos naturales el grupo tiol de cisteína, el grupo amino de lisina, el grupo carboxilo de aspartato o glutamato, el grupo guanidinio de arginina, el grupo fenólico de tirosina o el grupo hidroxilo de serina. Los aminoácidos no naturales pueden proporcionar un amplio intervalo de grupos reactivos incluyendo una azida, un cetocarbonilo, un alquino, un vinilo o un grupo haluro de alquilo. El grupo amino y carboxilo de los extremos del polipéptido pueden servir también como grupos reactivos para formar enlaces covalentes con un andamiaje molecular/núcleo molecular.

Los polipéptidos de la invención contienen al menos tres grupos reactivos. Dichos polipéptidos pueden contener también cuatro o más grupos reactivos. Cuantos más grupos reactivos se usen, más bucles pueden formarse en el andamiaje molecular.

En una realización preferida, se generan polipéptidos con tres grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un andamiaje molecular/núcleo molecular que tiene una simetría rotacional triple genera un solo isómero de producto. La generación de un solo isómero de producto es favorable por varias razones. Los ácidos nucleicos de las colecciones de compuestos codifican solo las secuencias primarias del polipéptido, pero no el estado isomérico de las moléculas que se forman tras reacción del polipéptido con el núcleo molecular. Si solo puede formarse un isómero de producto, la asignación del ácido nucleico al isómero de producto está claramente definida. Si se forman múltiples isómeros de producto, el ácido nucleico no puede dar información sobre la naturaleza del isómero de producto que se aisló en un cribado o proceso de selección. La formación de un solo isómero de producto es también ventajosa si se sintetiza un miembro específico de una genoteca de la invención. En este caso, la reacción química del polipéptido con el andamiaje molecular produce un solo isómero de producto en lugar de mezclas de isómeros.

En otra realización de la invención, se generan polipéptidos con cuatro grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un andamiaje molecular/núcleo molecular que tiene simetría tetraédrica genera dos isómeros de producto. Aunque los dos isómeros de producto diferentes están codificados por uno y el mismo ácido nucleico, la naturaleza isomérica del isómero aislado puede determinarse sintetizando químicamente ambos isómeros, separando los dos isómeros y sometiendo a ensayo ambos isómeros para la unión a un ligando diana.

En una realización de la invención, al menos uno de los grupos reactivos de los polipéptidos es ortogonal a los grupos reactivos restantes. El uso de grupos reactivos ortogonales permite dirigir tales grupos reactivos ortogonales a sitios específicos del núcleo molecular. Las estrategias de unión que implican grupos reactivos ortogonales pueden usarse para limitar el número de isómeros de producto formados. En otras palabras, al elegir grupos reactivos distintos o diferentes para uno o más de los al menos tres enlaces entre aquellos elegidos para el resto de los al menos tres enlaces, puede conseguirse útilmente un orden particular de unión o dirección de los grupos reactivos específicos del polipéptido a posiciones específicas en el andamiaje molecular-En otra realización, los grupos reactivos del polipéptido de la invención se hacen reaccionar con conectores moleculares, donde dichos conectores son capaces de reaccionar con un andamiaje molecular de modo que el conector se interponga entre el andamiaje molecular y el polipéptido en el estado unido final.

En algunas realizaciones, los aminoácidos de los miembros de las colecciones o conjuntos de polipéptidos pueden reemplazarse por cualquier aminoácido natural o no natural. Se excluyen de estos aminoácidos intercambiables aquellos que albergan grupos funcionales para reticular los polipéptidos con un núcleo molecular, de tal modo que solo las secuencias de bucle son intercambiables. Las secuencias polipeptídicas intercambiables tienen secuencias aleatorias, secuencias constantes o secuencias con aminoácidos aleatorios y constantes. Los aminoácidos con grupos reactivos están localizados en posiciones definidas en el polipéptido, puesto que la posición de estos aminoácidos determina el tamaño de bucle.

En una realización, un polipéptido con tres grupos reactivos tiene la secuencia (X)^lY(X)^mY(X)ⁿY(X)^o, donde Y representa un aminoácido con un grupo reactivo, X representa un aminoácido aleatorio, m y n son números entre 3 y 6 que definen la longitud de los segmentos polipeptídicos interpuestos, que pueden ser iguales o diferentes, y l y o son números entre 0 y 20 que definen la longitud de los segmentos polipeptídicos flanqueantes.

Pueden usarse alternativas a las conjugaciones mediadas por tiol para unir el andamiaje molecular con el péptido a través de interacciones covalentes. Como alternativa, estas técnicas pueden usarse en la modificación o unión de restos adicionales (tales como moléculas pequeñas de interés que son distintas del andamiaje molecular) con el polipéptido después de seleccionarse o aislarse de acuerdo con la presente invención- en esta realización entonces la unión claramente no tiene que ser covalente y puede abarcar unión no covalente. Estos procedimientos pueden usarse en lugar de (o en combinación con) los procedimientos mediados por tiol mediante producción de fago que presenta proteínas y péptidos portadores de aminoácidos no naturales con los grupos reactivos químicos necesarios, en combinación con moléculas pequeñas que llevan el grupo reactivo complementario, o mediante la incorporación de aminoácidos no naturales a un polipéptido sintetizado química o recombinantemente cuando la molécula se elabora después de la fase de selección/aislamiento. Pueden encontrarse detalles adicionales en el documento WO2009098450 o Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

(iv) Combinación de bucles para formar moléculas multiespecíficas

Los bucles de ligandos peptídicos, o repertorios de ligandos peptídicos, se combinan ventajosamente mediante secuenciación y síntesis de novo de un polipéptido que incorpora los bucles combinados. Como alternativa, pueden sintetizarse ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos.

Cuando se van a combinar repertorios, particularmente repertorios de bucle único, los ácidos nucleicos que codifican los repertorios se digieren y se vuelven a ligar ventajosamente formando un repertorio novedoso que tiene diferentes combinaciones de bucles a partir de los repertorios constituyentes. Los vectores de fago pueden incluir policonectores y otros sitios para enzimas de restricción que pueden proporcionar puntos únicos para el corte y la religadura de vectores, creando los ligandos peptídicos multiespecíficos deseados. Los procedimientos para manipular colecciones de fago se conocen bien con respecto a anticuerpos, y pueden aplicarse también en el presente caso.

(v) Unión de grupos efectores y grupos funcionales

Los grupos efectores y/o funcionales pueden unirse, por ejemplo, con los extremos N o C del polipéptido, o con el andamiaje molecular.

Los grupos efectores apropiados incluyen anticuerpos y partes o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, un grupo efector puede incluir una región constante de cadena ligera de anticuerpo (CL), un dominio de cadena pesada de anticuerpo CH1, un dominio de cadena pesada de anticuerpo CH2, un dominio de cadena pesada de anticuerpo CH3, o cualquier combinación de los mismos, además de uno o más dominios de región constante. Un grupo efector puede comprender también una región de bisagra de un anticuerpo (tal como una región que se encuentra normalmente entre los dominios CH1 y CH2 de una molécula de IgG).

En una realización preferida adicional de este aspecto de la invención, es un grupo efector de acuerdo con la presente invención una región Fc de una molécula de IgG. Ventajosamente, el grupo efector de ligando peptídico de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en una fusión de ligando peptídico-Fc que tiene una semivida tl3 de un día o más, dos días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más, 6 días o más o 7 días o más. Lo más ventajosamente, el ligando peptídico de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en una fusión de ligando peptídico-Fc que tiene una semivida tl3 de un día o más.

Los grupos funcionales incluyen, en general, grupos de unión, fármacos, grupos reactivos para la unión de otras entidades grupos funcionales que ayudan a la captación de los péptidos macrocíclicos en células y similares.

La capacidad de los péptidos de penetrar en células permitirá que los péptidos sean eficaces contra dianas intracelulares. Las dianas a las que pueden acceder los péptidos con la capacidad de penetrar en células incluyen factores de transcripción, moléculas de señalización intracelular tales como tirosina cinasas y moléculas implicadas en la ruta apoptótica. Los grupos funcionales que posibilitan la penetración de células incluyen péptidos o grupos químicos que se han añadido al péptido o al andamiaje molecular. Péptidos tales como los derivados de VP22, tat de VlH, una proteína de homeoseceuncia de Drosophila (Antennapedia), por ejemplo, como se describe en Chen y arrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volumen 35, parte 4, pág. 821 "Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets" e "Intracellular delivery of large molecules and small peptides by cell penetrating peptides" by Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 579637. Los ejemplos de péptidos cortos que se ha mostrado que son eficientes en la translocación a través de membranas plasmáticas incluyen el péptido penetratina de 16 aminoácidos de la proteína Antennapedia de Drosophila (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volumen 269 pág. 10444 "The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes"), el "péptido anfipático modelo" de 18 aminoácidos (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volumen 1414 pág. 127 "Cellular uptake of an alpha-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endocytically") y regiones ricas en arginina de la proteína TAT de VIH. Los enfoques no peptídicos incluyen el uso de miméticos de molécula pequeña o SMOC que pueden unirse fácilmente con biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volumen 4 pág. 153 "Small-molecule mimics of an a-helix for efficient transport of proteins into cells". Otras estrategias químicas para añadir grupos guanidinio a moléculas potencian también la penetración celular (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volumen 282 pág. 13585 "Guanidinylated Neomcyin Delivers Large Bioactive Cargo into cells through a heparin Sulphate Dependent Pathway"). Pueden añadirse moléculas de pequeño peso molecular, tales como esteroides, al andamiaje molecular para mejorar la captación en células.

Una clase de grupos funcionales que pueden unirse con ligandos peptídicos incluye anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos, tales como Fab, Fv o fragmentos de dominio único. En particular, pueden usarse anticuerpos capaces de aumentar la semivida de ligando peptídico in vivo.

Pueden incorporarse también péptidos RGD, que se unen a integrinas que están presentes en muchas células. En una realización, un grupo efector de ligando peptídico de acuerdo con la invención tiene una semivida tl3 seleccionada del grupo consistente en: 12 horas o más, 24 horas o más, 2 días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más, 6 días o más, 7 días o más, 8 días o más, 9 días o más, 10 días o más, 11 días o más, 12 días o más, 13 días o más, 14 días o más, 15 días o más o 20 días o más. Ventajosamente, un grupo efector de ligando peptídico o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida tl3 en el intervalo de 12 a 60 horas. En una realización adicional, tendrá una semivida tl3 de un día o más. En una realización adicional más, estará en el intervalo de 12 a 26 horas.

Los grupos funcionales incluyen fármacos, tales como agentes citotóxicos para terapia contra el cáncer. Estos incluyen agentes alquilantes tales como cisplatino y carboplatino, así como oxalilplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida; antimetabolitos (incluyendo los análogos de purina azatioprina y mercaptopurina) o análogos de pirimidina; alcaloides y terpenoides vegetales incluyendo alcaloides de vinca tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina; podofilotoxina y sus derivados etopósido y tenipósido; taxanos, incluyendo paclitaxel, originalmente conocido como Taxol; inhibidores de topoisomerasa incluyendo camptotecinas: irinotecán y topotecán, e inhibidores de tipo II incluyendo amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido. Agentes adicionales pueden incluir antibióticos antitumorales que incluyen el inmunosupresor dactinomicina (que se usa en trasplantes de riñón), doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina y otros.

Los posibles grupos efectores incluyen también enzimas, por ejemplo, tales como carboxipeptidasa G2, para su uso en terapia de enzimas/profármacos, donde el ligando peptídico reemplaza a anticuerpos en ADEPT.

(vi) Síntesis

Cabe apreciar que una vez se aísla o se identifica un polipéptido de interés de acuerdo con la presente invención, entonces su síntesis posterior puede simplificarse siempre que sea posible. Por lo tanto, no tienen que producirse grupos o conjuntos de polipéptidos por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, puede determinarse la secuencia de los polipéptidos de interés y pueden fabricarse sintéticamente mediante técnicas estándares seguidas de reacción con un andamiaje molecular in vitro. Cuando se realiza esto, puede usarse la química estándar puesto que no hay ya necesidad de conservar la funcionalidad o integridad de la partícula portadora codificada genéticamente, tal como un fago. Esto posibilita la preparación rápida a gran escala de material soluble para experimentos aguas abajo adicionales o validación. A este respecto, la preparación a gran escala de los candidatos o compuestos principales identificados por los procedimientos de la presente invención podría lograrse usando química convencional tal como se describe en Timmerman et al.

Por lo tanto, la invención se refiere también a la fabricación de polipéptidos o conjugados seleccionados como se expone en el presente documento, donde la fabricación comprende etapas adicionales opcionales como se explican a continuación. En una realización, estas etapas se realizan en el producto final polipéptido/conjugado mediante síntesis química, en lugar de en el fago.

Opcionalmente, los residuos aminoacídicos en el polipéptido de interés pueden sustituirse cuando se fabrica un conjugado o complejo, por ejemplo, después de la etapa de aislamiento/identificación inicial.

También pueden extenderse los péptidos, para incorporar por ejemplo otro bucle y por lo tanto introducir múltiples especificidades.

Para extender el péptido, puede extenderse químicamente sencillamente en su extremo N o extremo C o dentro de los bucles usando lisinas protegidas ortogonalmente (y análogos) usando la química en fase sólida o fase de solución estándar. Puede usarse la química de proteínas estándar para introducir un extremo N o C activable. Como alternativa, pueden realizarse adiciones mediante condensación de fragmentos o ligadura química nativa, por ejemplo, como se describe en (Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), o por enzimas, por ejemplo usando subtiligasa como se describe en (Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins Chang TK, Jackson DY, Burnier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12544-8 o en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Tags for labelling protein N-termini with subtiligase for proteomics Volumen 18, Edición 22, 15 de noviembre de 2008, Páginas 6000-6003 Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics; Hikari A.I. Yoshihara, Sami Mahrus y James A. Wells).

Como alternativa, los péptidos pueden extenderse o modificarse mediante conjugación adicional mediante enlaces disulfuro. Esto tiene la ventaja adicional de permitir que el primer y segundo péptidos se disocien entre sí una vez en el entorno reductor de la célula. En este caso, podría añadirse el andamiaje molecular (por ejemplo, TBMB) durante la síntesis química del primer péptido para reaccionar con los tres grupos cisteína; podría adjuntarse una cisteína adicional al extremo N del primer péptido, de modo que esta cisteína reaccionara solamente con una cisteína libre del segundo péptido.

Se aplican igualmente técnicas similares a la síntesis/acoplamiento de dos macrociclos bicíclicos y biespecíficos, creando potencialmente una molécula tetraespecífica.

Además, la adición de otros grupos funcionales o grupos efectores puede lograrse de la misma manera, usando la química apropiada, el acoplamiento a los extremos N o C o a través de cadenas laterales. En una realización, el acoplamiento se realiza de tal manera que no bloquee la actividad de ninguna entidad.

(vii) Modificación peptídica

Para desarrollar los péptidos bicíclicos (biciclos; péptidos conjugados con andamiajes moleculares) hasta una molécula similar a fármaco adecuada, tanto para inyección inhalación, administración nasal, ocular, oral o tópica, tienen que considerarse una serie de propiedades. Tienen que diseñarse al menos las siguientes para un compuesto principal bicíclico dado:

● estabilidad a proteasas, tanto si esto se refiere a estabilidad del biciclo ante proteasas plasmáticas, proteasas epiteliales ("ancladas a membrana"), proteasas gástricas e intestinales, proteasas de superficie pulmonar, proteasas intracelulares y similares. La estabilidad a proteasas debería mantenerse entre diferentes especies de tal modo que pueda desarrollarse un candidato a compuesto principal bicíclico en modelos animales, así como administrarse con confianza a seres humanos.

● reemplazo de residuos sensibles a la oxidación, tales como triptófano y metionina, por análogos resistentes a la oxidación para mejorar el perfil de estabilidad farmacéutica de la molécula.

● un perfil de solubilidad deseable, que es una función de la proporción de residuos cargados e hidrófilos frente a hidrófobos, lo que es importante con fines de formulación y absorción.

● un equilibrio correcto de residuos cargados frente a hidrófobos, ya que los residuos hidrófobos influyen en el grado de unión a proteína plasmática y, por lo tanto, la concentración de la fracción disponible libre en plasma, mientras que los residuos cargados (en particular argininas) pueden influir en la interacción del péptido con las membranas fosfolipídicas en superficies celulares. Los dos en combinación pueden influir en la semivida, volumen de distribución y exposición del fármaco peptídico, y pueden adaptarse de acuerdo con el criterio de valoración clínico. Además, la correcta combinación y número de residuos cargados frente a hidrófobos puede reducir la irritación en el sitio de inyección (cuando se administra por vía subcutánea el fármaco peptídico).

● una semivida adaptada, dependiendo de la indicación clínica y el régimen de tratamiento. Puede ser prudente desarrollar una molécula no modificada para exposición corta en un entorno de gestión de enfermedad aguda, o desarrollar un péptido bicíclico con modificaciones químicas que potencie la semivida plasmática, y, por lo tanto, sea óptimo para la gestión de patologías más crónicas.

Los enfoques para estabilizar los candidatos a péptidos terapéuticos frente a la degradación proteolítica son numerosos, y se superponen con el campo de los peptidomiméticos (para revisiones, véanse Gentilucci et al, Curr.

Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, y Néstor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Estos incluyen

● Ciclación de péptido

● Cobertura N-terminal y C-terminal, habitualmente acetilación N-terminal y amidación C-terminal.

● Barridos de alanina para revelar y eliminar potencialmente el sitio o sitios de ataque proteolítico.

● Reemplazo por D-aminoácidos, para sondear los requisitos estéricos de la cadena lateral aminoacídica, para aumentar la estabilidad proteolítica por impedimento estérico y por la tendencia de los D-aminoácidos a estabilizar las conformaciones de giro 13 (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).

● Reemplazo por N-metil/N-alquilaminoácidos para conferir protección proteolítica por modificación directa del enlace amida escindible (Fiacco et al, Chembiochem. (2008), 9(14), 2200-3). La N-metilación tiene también un fuerte efecto sobre los ángulos de torsión del enlace peptídico, y se cree que ayuda a la penetración celular y la disponibilidad oral (Biron et al (2008), Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2595 -99)

● Incorporación de aminoácidos no naturales, es decir, empleando

◦ Cadenas laterales isoestéricas/isoeléctricas que no son reconocidas por proteasas, pero no tienen efecto sobre la potencia de diana.

◦ Cadenas laterales aminoacídicas restringidas, de tal modo que se impida conformacional y estéricamente la hidrólisis proteolítica del enlace peptídico cercano. En particular, esto se refiere a análogos de prolina, cadenas laterales voluminosas, derivados sustituidos en Ca (donde el derivado más sencillo es Aib, H²N-C(CH³)²-COOH), y cicloaminoácidos, siendo un derivado sencillo el ácido amino-ciclopropilcarboxílico).

● Sustitutos de enlace peptídico, y los ejemplos incluyen

◦ N-alquilación (véase anteriormente, es decir CO-NR)

◦ Enlaces peptídicos reducidos (CH²-NH-)

◦ Peptoides (N-alquilaminoácidos, NR-CH²-CO)

◦ Tio-amidas (CS-NH)

◦ Azapéptidos (CO-NH-NR)

◦ Trans-alqueno (RHC=C-)

◦ Retro-inversos (NH-CO)

◦ Sustitutos de urea (NH-CO-NHR)

● Modulación de la longitud del esqueleto peptídico

◦ es decir, p^2/3- aminoácidos, (NH-CR-CH²-CO, NH-CH²-CHR-CO),

● Sustituciones en el carbono alfa en los aminoácidos, lo que restringe las conformaciones de esqueleto, siendo el derivado más sencillo el ácido aminoisobutírico (Aib).

Debería señalarse explícitamente que algunas de etas modificaciones pueden servir también para mejorar deliberadamente la potencia del péptido frente a la diana o, por ejemplo, para identificar sustitutos potentes para los aminoácidos sensibles a la oxidación (Trp y Met). Debería señalarse también que el compuesto principal bicíclico Ac-06-34-18(TMB)-NH2 alberga ya dos modificaciones que confieren resistencia a la degradación proteolítica, siendo estas cobertura N/C-terminal y bi(ciclación).

(B) Repertorios, conjuntos y grupos de ligandos polipeptídicos

(i) Construcción de colecciones

Las colecciones pretendidas para selección pueden construirse usando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, como se expone en el documento WO2004/077062, o sistemas biológicos, incluyendo sistemas de vector de fago como se describen en el presente documento. Se conocen en la técnica otros sistemas de vector, e incluyen otros fagos (por ejemplo, fago lambda), vectores de expresión de plásmido bacteriano, vectores de expresión basados en células eucariotas, incluyendo vectores de levadura, y similares. Por ejemplo, véanse WO2009098450 o Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

Los sistemas no biológicos, tales como aquellos expuestos en el documento WO2004/077062 están basados en enfoques de cribado químico convencionales. Son sencillos, pero carecen de la potencia de los sistemas biológicos, puesto que es imposible, o al menos impracticablemente costoso, cribar grandes colecciones de ligandos peptídicos. Sin embargo, son útiles cuando, por ejemplo, tienen que cribarse solo un número pequeño de ligandos peptídicos. El cribado mediante dichos ensayos individuales, sin embargo, puede ser prolongado y el número de moléculas únicas que puede someterse a ensayo para determinar la unión a una diana específica generalmente no supera las 106 entidades químicas

En contraposición, los procedimientos de cribado o selección biológicos permiten generalmente el muestreo de un número mucho mayor de moléculas diferentes. Por lo tanto, los procedimientos biológicos pueden usarse en la aplicación de la invención. En procedimientos biológicos, se ensayan las moléculas en un solo recipiente de reacción y aquellas con propiedades favorables (es decir, unión) se separan físicamente de las moléculas inactivas. Están disponibles estrategias de selección que permiten generar y ensayar simultáneamente más de 1013 compuestos individuales. Son ejemplos de técnicas de selección por afinidad potentes la presentación en fago, presentación en ribosoma, presentación en ARNm, presentación en levadura, presentación bacteriana o procedimientos de aptámeros de ARN/ADN. Estos procedimientos de selección biológica in vitro tienen en común que los repertorios de ligando están codificados por ADN o ARN. Permiten la propagación e identificación de ligandos seleccionados por secuenciación. La tecnología de presentación en fago se ha usado, por ejemplo, para el aislamiento de anticuerpos con muy altas afinidades por virtualmente cualquier diana.

Cuando se usa un sistema biológico, una vez se elige un sistema de vector y se clonan una o más secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de interés en el vector de genoteca, puede generarse diversidad en las moléculas clonadas experimentando mutagénesis antes de la expresión; como alternativa, las proteínas codificadas pueden expresarse y seleccionarse antes de la mutagénesis y practicarse rondas adicionales de selección.

La mutagénesis de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos estructuralmente optimizados se realiza por procedimientos moleculares estándares. Es de particular uso la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335, incorporado en el presente documento por referencia). La PCR, que usa múltiples ciclos de replicación de ADN catalizados por una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN para amplificar la secuencia diana de interés, es bien conocida en la técnica. Se ha analizado la construcción de diversas colecciones de anticuerpos en Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, y referencias en el mismo.

Como alternativa, dadas las longitudes de cadena corta de los polipéptidos de acuerdo con la invención, las variantes pueden sintetizarse de novo e insertarse en vectores de expresión adecuados.

La síntesis peptídica puede realizarse mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, como se describe anteriormente. Están ampliamente disponibles sintetizadores peptídicos automatizados, tales como el Applied Biosystems ABI 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.^u U.)

(ii) Diversidad codificada genéticamente

En una realización, los polipéptidos de interés están codificados genéticamente. Esto ofrece la ventaja de una diversidad potenciada junto con facilidad de manejo. Es un ejemplo de una genoteca polipeptídica genética una genoteca de presentación en ARNm. Es otro ejemplo una genoteca de paquetes de presentación genética replicable (rgdp) tal como una genoteca de presentación en fago. En una realización, los polipéptidos de interés están codificados genéticamente como una genoteca de presentación en fago.

Por lo tanto, en una realización el complejo de la invención comprende un paquete de exhibición genética replicable (rgdp) tal como una partícula de fago. En estas realizaciones, el ácido nucleico puede estar comprendido en el genoma de fago. En estas realizaciones, el polipéptido puede estar comprendido por la cubierta de fago.

En algunas realizaciones, la invención puede usarse para producir una genoteca combinatoria codificada genéticamente de polipéptidos que se generan traduciendo una serie de ácidos nucleicos a los correspondientes polipéptidos y ligando moléculas de dicho andamiaje molecular con dichos polipéptidos.

La genoteca combinatoria codificada genéticamente de polipéptidos puede generarse por presentación en fago, presentación en levadura, presentación en ribosoma, presentación bacteriana o presentación en ARNm.

Las técnicas y metodología para realizar la presentación en fago pueden encontrarse en el documento WO2009098450.

En una realización, puede practicarse el cribado poniendo en contacto una genoteca, conjunto o grupo de ligandos polipeptídicos con una diana y aislando uno o más miembros que se unen a dicha diana.

En otra realización, se ponen en contacto los miembros individuales de dicha genoteca, conjunto o grupo con una diana en un cribado y se identifican los miembros de dicha genoteca que se unen a dicha diana.

En otra realización, se ponen en contacto simultáneamente los miembros de dicha genoteca, conjunto o grupo con una diana y se seleccionan los miembros que se unen a dicha diana.

La diana o dianas pueden ser un péptido, una proteína, un polisacárido, un lípido un ADN o un ARN.

La diana puede ser un receptor, un ligando de receptor, una enzima, una hormona o una citocina.

La diana puede ser una proteína procariota, una proteína eucariota o una proteína arqueal. Más específicamente, el ligando diana puede ser una proteína de mamífero o una proteína de insecto o una proteína bacteriana o una proteína fúngica o una proteína vírica.

El ligando diana puede ser una enzima, tal como una proteasa.

Cabe apreciar que la invención abarca también ligandos polipeptídicos aislados de un cribado de acuerdo con la divulgación. En una realización, el procedimiento o procedimientos de cribado de la divulgación comprenden además la etapa de: fabricar una cantidad del polipéptido aislado capaz de unirse a dichas dianas.

La invención se refiere también a ligandos peptídicos que tienen más de dos bucles. Por ejemplo, pueden crearse polipéptidos tricíclicos unidos a un andamiaje molecular uniendo los extremos N y C de un polipéptido bicíclico unido a un andamiaje molecular de acuerdo con la presente invención. De esta manera, los extremos N y C unidos crean un tercer bucle, haciendo un polipéptido tricíclico. Esta realización no tiene que realizarse en fago, sino que puede realizarse en un conjugado de polipéptido-andamiaje molecular como se describe en el presente documento. Unir los extremos N y C es un asunto de química peptídica rutinaria. En caso de necesitar alguna orientación, el extremo C puede activarse y/o los extremos N y C pueden extenderse, por ejemplo, añadiendo una cisteína a cada extremo y uniéndolos entonces por enlace disulfuro. Como alternativa, la unión puede lograrse mediante el uso de una región conectora incorporada a los extremos N/C. Como alternativa, los extremos N y C pueden unirse mediante un enlace peptídico convencional. Como alternativa, puede emplearse cualquier medio adecuado para unir los extremos N y C, por ejemplo, podría realizarse la N-C-ciclación mediante técnicas estándares, por ejemplo, como se divulga en Linde et al. Peptide Science 90, 671-682 (2008) "Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides", o como en Hess et al. J. Med. Chem. 51, 1026-1034 (2008) "backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity". Una ventaja de dichas moléculas tricíclicas es evitar la degradación proteolítica de los extremos libres, en particular por la acción de exoproteasa. Otra ventaja de un polipéptido tricíclico de esta naturaleza es que el tercer bucle puede utilizarse para funciones generalmente aplicables tales como unión a BSA, entrada celular o efectos de transporte, marcaje o cualquier otro uso. Se señalará que este tercer bucle no estará típicamente disponible para selección (porque no se produce en el fago, sino solo en el conjugado de polipéptido-andamiaje molecular) y así su uso para otras de tales funciones biológicas deja todavía ventajosamente ambos bucles 1 y 2 para la selección/creación de especificidad.

(iii) Purificación de fago

Puede usarse cualquier medio para la purificación del fago. Pueden aplicarse técnicas estándares en la presente invención. Por ejemplo, puede purificarse el fago por filtración o por precipitación, tal como precipitación con PEG; las partículas de fago pueden producirse y purificarse por precipitación con polietilenglicol (PEG) como se describe anteriormente. Pueden encontrarse los detalles en el documento WO2009098450.

En caso de necesitar orientaciones adicionales, se hace referencia a Jespers et al (Protein Engineering Design and Selection 2004 17(10):709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries.) En una realización, puede purificarse el fago como se enseña en la misma. El texto de esta publicación se incorpora específicamente en el presente documento como referencia para el procedimiento de purificación de fago; en particular, se hace referencia a la sección de materiales y procedimientos que empieza en la parte inferior de la columna derecha en la página 709 de Jespers et al.

Además, el fago puede purificarse como se publica por Marks et al J.Mol.Biol vol 222 págs.581-597.

(iv) Química de reacción

La presente invención hace uso de las condiciones químicas para la modificación de polipéptidos que retienen ventajosamente la función e integridad del elemento codificado genéticamente del producto. Específicamente, cuando el elemento codificado genéticamente es un polipéptido exhibido sobre la superficie de un fago que lo codifica, la química ventajosamente no compromete la integridad biológica del fago. En general, se exponen las condiciones en el documento WO2009098450.

(C) Uso de ligandos polipeptídicos de acuerdo con la invención

Los ligandos polipeptídicos seleccionados de acuerdo con el procedimiento de la presente invención pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, y en aplicaciones de diagnóstico in vitro e in vivo, ensayo in vitro y aplicaciones de reactivo y similares. Los ligandos que tienen niveles seleccionados de especificidad son útiles en aplicaciones que implican ensayar en animales no humanos, donde es deseable la reactividad cruzada, o en aplicaciones de diagnóstico, donde tiene que controlarse cuidadosamente la reactividad cruzada con homólogos o parálogos. En algunas aplicaciones, tales como aplicaciones de vacuna, puede aprovecharse la capacidad de desencadenar una respuesta inmunitaria ante intervalos predeterminados de antígenos para adaptar una vacuna de enfermedades y patógenos específicos.

Se prefieren los ligandos peptídicos sustancialmente puros de al menos un 90 al 95 % de homogeneidad para administración a un mamífero, y es más preferido del 98 al 99 % o más de homogeneidad para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, pueden usarse los péptidos seleccionados para diagnóstico o terapia (incluyendo extracorpórea) o en el desarrollo y práctica de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares (Lefkovite y Pernis, (1979 y 1981) Immunological Methods, Volúmenes I e II, Academic Press, NY).

Los ligandos peptídicos de la presente invención encontrarán típicamente uso en la prevención, supresión o tratamiento de estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o vírica y trastornos autoinmunitarios (que incluyen, pero sin limitación, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn y miastenia grave).

En la presente solicitud, el término "prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un evento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de que los síntomas patológicos se pongan de manifiesto.

Están disponibles sistemas de modelo animal que pueden usarse para cribar la efectividad de los ligandos peptídicos en la protección ante o el tratamiento de la enfermedad. El uso de los sistemas de modelo animal se facilita por la presente invención, que permite el desarrollo de ligandos polipeptídicos que pueden reaccionar de forma cruzada con dianas humanas y animales, permitiendo el uso de modelos animales.

Los procedimientos para el ensayo de lupus eritematoso sistémico (SLE) en ratones sensibles son conocidos en la técnica (Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J : Med., 299: 515). Se ensaya la miastenia grave (MG) en ratones SJL/J hembra mediante la inducción de la enfermedad con proteína AchR soluble de otra especie (Lindstrom et al. (1988) Adv. Inzn7unol., 42: 233). Se induce la artritis en una cepa sensible de ratones mediante la inyección de colágeno de tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante el que se induce artritis por adyuvante en ratas sensibles mediante la inyección de proteína de choque térmico micobacteriana (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Se induce la tiroiditis en ratones mediante la administración de tiroglobulina como se describe (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) aparece naturalmente o puede inducirse en ciertas cepas de ratones tales como aquellas descritas por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. La EAE en ratón y rata sirve como modelo para EM en seres humanos. En este modelo, se induce la enfermedad desmielinizante mediante la administración de proteína básica de mielina (véanse Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune y Stratton, Nueva York, págs. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: y Satoh et al. (1987) J ; Immunol., 138: 179).

Generalmente, se utilizarán los presentes ligandos peptídicos en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, cualquiera que incluya suero salino y/o medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer lactato.

Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden elegirse de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes y reponedores de electrolitos tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Pueden estar también presentes conservantes y otros aditivos tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición).

Los ligandos peptídicos de la presente invención pueden usarse como composiciones administradas separadamente o junto con otros agentes. Estos pueden incluir anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y diversos fármacos inmunoterapéuticos tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos agentes citotóxicos u otros junto con anticuerpos seleccionados, receptores o proteínas de unión a los mismos de la presente invención, o incluso combinaciones de polipéptidos seleccionados de acuerdo con la presente invención que tienen diferentes especificidades, tales como polipéptidos seleccionados usando diferentes ligandos peptídicos, estén o no combinados antes de la administración.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de aquellas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Para terapia, incluyendo, sin limitación, inmunoterapia, pueden administrarse los anticuerpos seleccionados, receptores o proteínas de unión a los mismos de la invención a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándares. La administración puede ser de cualquier modo apropiado, incluyendo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, pulmonar o también apropiadamente, por infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerán de la edad, sexo y condición del paciente, la administración simultánea de otros fármacos, las contraindicaciones y otros parámetros para tener en cuenta por el médico clínico.

Los ligandos peptídicos de esta invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes del uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Se apreciará por los expertos en la técnica que la liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse positivamente para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos peptídicos o un cóctel de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, se define una cantidad adecuada para lograr al menos una inhibición parcial, supresión, modulación, muerte o algún otro parámetro mensurable de una población de células seleccionadas como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para conseguir esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmunitario propio del paciente, pero varían generalmente de 0,005 a 5,0 mg de ligando peptídico seleccionado por kilogramo de peso corporal, usándose más comúnmente las dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. Para aplicaciones profilácticas, pueden administrarse también composiciones que contienen los presentes ligandos peptídicos o cócteles de los mismos a dosificaciones similares o ligeramente menores.

Puede utilizarse una composición que contiene un ligando peptídico de acuerdo con la presente invención en entornos profilácticos y terapéuticos para ayudar a la alteración, inactivación, muerte o retirada de una población de células diana seleccionada en un mamífero. Además, pueden usarse los repertorios de polipéptidos seleccionados descritos en el presente documento de forma extracorpórea o in vitro selectivamente para matar, agotar o retirar eficazmente de otro modo una población de células diana de una recopilación heterogénea de células. Puede combinarse de modo extracorpóreo sangre de un mamífero con los ligandos peptídicos seleccionados, con lo que se matan las células indeseadas o se retiran de otro modo de la sangre para devolver al mamífero de acuerdo con técnicas estándares.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para prevenir, suprimir o tratar estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o vírica, trastornos oftálmicos y trastornos autoinmunes que comprenden administrar a un paciente que lo necesite un ligando peptídico, como se define en el presente documento.

Los ejemplos de "trastornos oftálmicos" adecuados (incluidos trastornos oftálmicos exudativos y/o inflamatorios, trastornos relacionados con la alteración de la permeabilidad y/o integridad de los vasos retinianos, trastornos relacionados con la rotura de microvasos retinianos que conduce a hemorragias focales, enfermedades del fondo del ojo, enfermedades de la retina y enfermedades del frente del ojo incluyen, pero sin limitación: degeneración macular relacionada con la edad (ARMD), degeneración macular exudativa (también conocida como degeneración macular relacionada con la edad "húmeda" o neovascular (DMRE húmeda), edema macular, degeneración macular disciforme envejecida, edema macular cistoide, edema palpebral, edema retiniano, retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda, coriorretinopatía serosa central, coriorretinopatía, neovascularización coroidea, maculopatía neovascular, glaucoma neovascular, retinopatías arteriales y venosas obstructivas (por ejemplo, oclusión venosa retiniana u oclusión arterial retiniana), oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de rama venosa de la retina, cambios de fondo hipertensivo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales retinianas, enfermedad de Coats, telangiectasia parafoveal, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria retiniana central, oclusión de la rama arterial retiniana, enfermedad de la arteria carótida (EAC), angitis de rama helada, retinopatía de células falciformes y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, edema macular que se produce como resultado de etiologías tal como una enfermedad (por ejemplo, edema macular diabético), lesión ocular o cirugía ocular; isquemia o degeneración de la retina producida, por ejemplo, por una lesión, traumatismo o tumores, uveítis, iritis, vasculitis retiniana, endoftalmitis, panoftalmitis, oftalmia metastásica, coroiditis, epitelitis pigmentaria de la retina, conjuntivitis, ciclitis, escleritis, episcleritis, neuritis óptica, neuritis óptica retrobulbar, queratitis, blefaritis, desprendimiento de retina exudativo, úlcera corneal, úlcera conjuntival, queratitis numular crónica, queratitis de thygeson, úlcera de mooren progresiva, una enfermedad inflamatoria ocular causada por una infección bacteriana o viral, y por una operación oftalmológica, una enfermedad inflamatoria ocular causada por una lesión física en el ojo, un síntoma causado por una enfermedad inflamatoria ocular que incluye picazón, brote, edema y úlcera, eritema, eritema exudativo multiforme, eritema nodoso, eritema anular, esclerodermia, dermatitis, edema angioneurótico, edema laríngeo, edema glótico, laringitis subglótica, bronquitis, rinitis, faringitis, sinusitis, laringitis u otitis media.

Las referencias en el presente documento a "enfermedades del fondo del ojo" incluyen enfermedades que afectan, entre otras, a la retina, mácula, fóvea en la región posterior del ojo. Los ejemplos de "enfermedades del fondo del ojo" adecuadas incluyen, pero sin limitación: edema macular tal como el edema macular clínico o edema macular cistoide angiográfico que surge de diversas etiologías tal como diabetes, degeneración macular exudativa y edema macular derivado del tratamiento con láser de la retina, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía del prematuro (también conocida como fibroplasia retrolental), isquemia retiniana y neovascularización coroidea, enfermedades de la retina (retinopatía diabética, edema diabético de la retina, desprendimiento de retina, degeneración macular senil debido a neovascularización subretiniana, retinopatía miope); enfermedades inflamatorias; uveítis asociada con neoplasias, tal como retinoblastoma o pseudoglioma; neovascularización después de vitrectomía; enfermedades vasculares (isquemia retiniana, insuficiencia vascular coroidea, trombosis coroidea, retinopatías resultantes de isquemia de la arteria carótida); y neovascularización del nervio óptico.

Las referencias en el presente documento a "enfermedades del frente del ojo" se refieren a enfermedades que afectan predominantemente a los tejidos en el frente del ojo, tal como la córnea, iris, cuerpo ciliar, conjuntiva, etc. Los ejemplos de "enfermedades del frente del ojo" adecuadas incluyen, pero sin limitación: neovascularización corneal (debido a la inflamación, trasplante, hipoplasia del desarrollo del iris, enfermedades de la córnea u opacificaciones con un componente exudativo o inflamatorio, neovascularización debida a la penetración del ojo o lesión ocular contusiva; uveítis crónica; uveítis anterior; afecciones inflamatorias resultantes de cirugías tales como LASIK, LASEK, cirugía refractaria, implante de LIO; edema corneal irreversible como complicación de la cirugía de cataratas; edema como resultado de insulto o trauma (físico, químico, farmacológico, etc); inflamación; conjuntivitis (por ejemplo, conjuntivitis alérgica persistente, papilar gigante, alérgica intermitente estacional, alérgica perenne, tóxica, causada por infección por bacterias, virus o clamidia); queratoconjuntivitis (vernal, atópica, sicca); iridociclitis; iritis; escleritis; epiescleritis; queratitis infecciosa; queratitis puntual superficial; queratocono; distrofia polimórfica posterior; distrofias de Fuch (corneal y endotelial); queratopatía bullosa afáquica y pseudofáquica; edema corneal; enfermedad escleral; penfigoide cicatricial ocular; pars planitis; Síndrome de Posner Schlossman; enfermedad de Behcet; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; reacciones hipersensibles; trastornos de la superficie ocular; edema conjuntival; coriorretinitis por toxoplasmosis; pseudotumor inflamatorio de la órbita; quemosis; congestión venosa conjuntival; celulitis periorbitaria; dacriocistitis aguda; vasculitis inespecífica; sarcoidosis; e infección por citomegalovirus.

Los ejemplos de "trastornos asociados con excesiva permeabilidad vascular y/o edema en el ojo", por ejemplo, en la retina o vítreo, incluyen, pero sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), edema retiniano, hemorragia retiniana, hemorragia vítrea, edema macular (EM), edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR) y retinopatía diabética no proliferativa (DR), retinopatía de radiación, telangiectasia, retinopatía serosa central, y oclusiones de la vena retiniana. El edema retiniano es la acumulación de líquido en el espacio intrarretiniano. DME es el resultado de los cambios microvasculares de la retina que se producen en pacientes con diabetes. Este compromiso de la barrera de la retina en la sangre conduce a la fuga de los componentes del plasma hacia la retina circundante, dando como resultado edema retiniano. Otros trastornos de la retina incluyen oclusiones de la vena retiniana (por ejemplo, oclusiones de la ramificación venosa o la vena central), retinopatía de radiación, retinopatía de células falciformes, retinopatía del prematuro, enfermedad de Von Hippie Lindau, uveítis posterior, desprendimiento de retina crónico, síndrome de Irvine Gass, enfermedad de Eals, retinitis, y/o coroiditis.

(D) Mutación de polipéptidos

Se genera típicamente la diversidad deseada variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Se seleccionan las posiciones a cambiar de tal modo que se construyan colecciones para cada posición individual en las secuencias de bucle. Cuando sea apropiado, pueden omitirse una o más posiciones del procedimiento de selección, por ejemplo, si resulta evidente que esas posiciones no están disponibles para mutación sin pérdida de actividad. La variación puede conseguirse entonces por aleatorización, durante la cual se reemplaza el aminoácido residente por cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un muy gran número de variantes, o reemplazando el aminoácido residente por uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes.

Se han reseñado diversos procedimientos para introducir dicha diversidad. Los procedimientos para mutar posiciones seleccionadas son también bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de oligonucleótidos desapareados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado varias colecciones de anticuerpos sintéticos orientando las mutaciones a los bucles de unión a antígeno. Podrían usarse las mismas técnicas en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, se ha asignado al azar la región H3 de un Fab de unión a toxoide del tétanos para crear un intervalo de nuevas especificidades de unión (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Se han adjuntado regiones H3 y L3 aleatorias o semialeatorias a segmentos del gen V de línea germinal para producir grandes colecciones con regiones estructurales mutadas (Hoogenboom- & Winter (1992) R Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Dicha diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos de los otros bucles de unión a antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) BiolTechnology, 13: 475; Morphosys, documento WO97/08320, anteriormente).

Sin embargo, puesto que los polipéptidos usados en la presente invención son mucho menores que los anticuerpos, el procedimiento preferido es sintetizar polipéptidos mutantes de novo. Se describe anteriormente la mutagénesis de polipéptidos estructurados, con relación a la construcción de colecciones.

Se describe adicionalmente la invención a continuación con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos

Clonación de colecciones de fago

Se generaron colecciones de fago de acuerdo con Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7). En Heinis et al, se clonaron los genes que codificaban un péptido semialeatorio con la secuencia Xaa-Cys-(Xaa)³-Cys-(Xaa)³-, el conector Gly-Gly-Ser-Gly y los dos dominios libres de disulfuro D1 y D2 (Kather, et al., J Mol Biol 2005, 354 (3), 666­ 78) en la orientación correcta en el vector de fago fd0D12 para obtener la "genoteca 3x3". Los genes que codificaban el repertorio peptídico y los dos genes de 3 dominios se crearon por etapas en dos reacciones PCR consecutivas. En primer lugar, se amplificaron por PCR los genes de D1 y D2 con los dos cebadores prepcr (5'-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3') y sfi2fo (5'-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCÁTTGACAGG-3': el sitio de restricción está subrayado) usando el vector fdg3p0ss21 (Kather, et al., J Mol Biol 2005, 354 (3), 666-78) como plantilla. En segundo lugar, se adjuntó el ADN que codificaba los péptidos aleatorios a una reacción PCR usando el cebador sficx3ba: 5'-T ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCANNKTGTNNKNNKNNKT GCNNKNNKNNKNNKTGTNNKG GGCGGTTCTGGCGCTG-3' (el sitio de restricción está subrayado) y sfi2fo. La ligadura de 55 y 11 pg de plásmido fd0D12 digerido con Sfil y el producto de PCR produjo 5,6 x 10⁸ colonias en colonias en 10 placas 2YT de 20x20 cm con cloranfenicol (30 pg/ml). Se rasparon las colonas de las placas con medios 2YT, se complementaron con glicerol al 15 % y se almacenaron a -80 °C. La construcción de las colecciones descritas en el presente documento empleaba la misma técnica para generar el péptido semialeatorio Pro-Ala-Met-Ala-Cys-(Xaa)³-Cys-(Xaa)³-Cys para una genoteca 3x3, por ejemplo, y, por lo tanto, reemplazaban la secuencia del cebador sficx3ba con: 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATGTNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTG GCGCTG-3'. Se generaron colecciones con otras longitudes de bucle siguiendo la misma metodología.

Selecciones de fago

Se diluyeron soluciones madre en glicerol de colecciones de fago hasta DO⁶⁰⁰ = 0,1 en 500 ml de cultivos de 2YT/cloranfenicol (30 pg/ml) y se produjo fago a 30 °C durante una noche (15-16 h) Se purificó el fago y se modificó químicamente como se describe en Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7. Se incubó hPK biotinilado (3 pg) (IHPKA, de plasma humano, Innovative Research, Novi, MI, EE.UU.) con 50 pl de perlas magnéticas de estreptavidina prelavadas (Dynal, M-280 de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 10 minutos a TA. Se lavaron las perlas 3 veces antes de bloquear con 0,5 ml de tampón de lavado (Tris-Cl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl²10 mM, CaCl²1 mM) que contenía el 1 % de BSA y el 0,1 % de Tween 20 durante 30 minutos a TA con rotación. Se bloquearon simultáneamente fagos modificados químicamente (típicamente 10¹⁰-10¹¹ t.u. disueltos en 2 ml de tampón de lavado) mediante la adición de 1 ml de tampón de lavado que contenía el 3 % de BSA y el 0,3 % de Tween 20. Se mezclaron entonces las perlas bloqueadas con el fago modificado químicamente bloqueado y se incubaron durante 30 minutos en una rueda giratoria a TA. Se lavaron las perlas 8 veces con tampón de lavado que contenía el 0,1 % de Tween 20 y dos veces con tampón de lavado antes de incubación con 100 pl de glicina 50 mM, pH 2,2 durante 5 minutos. Se transfirieron los fagos eluídos a 50 pl de T ris-Cl 1 M, pH 8 para neutralización, se incubaron con 30 ml de células TG1 a DO⁶⁰⁰ = 0,4 durante 90 minutos a 37 °C y se sembraron las células en placas grandes de 2YT/cloranfenicol. Se realizaron una o dos rondas adicionales de adsorción usando los mismos procedimientos. En la segunda ronda de selección, se usaron perlas magnéticas recubiertas con neutravidina para prevenir el enriquecimiento de péptidos específicos de estreptavidina. Se prepararon las perlas de neutravidina haciendo reaccionar 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) con 0,5 ml de perlas magnéticas activadas por tosilo (Dynal, M-280 de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Clonación y expresión de PK humana, de mono y de rata

Se expresó el dominio catalítico de PK humana, de mono y de rata en células de mamífero como precursor inactivo que tiene un propéptido conectado de forma N-terminal a través de un sitio de escisión proTEV con el dominio catalítico. Se clonó el vector de expresión y se expresó la proteína, se activó y se purificó como se describe a continuación. Se adquirieron los genes sintéticos que codifican una secuencia señal de PK, un marcador de polihistidina, un sitio de escisión proTEV, el dominio catalítico maduro de PK y un codón de terminación en Geneart (Regensburg, Alemania) (Materiales suplementarios). Se preparó el ADN de plásmido que contenía los genes sintéticos de PK humana, de mono (Macaca mulatta) y de rata y se transfirió el gen al vector de expresión de mamífero pEXPR-IBA42 (IBA Biotechnology, Gottingen, Alemania) usando el par de enzimas de restricción Xhol y HindIII (Fermentas, Vilnius, Letonia) y ADN ligasa T4 (Fermentas). Se transformaron los plásmidos ligados en células electrocompetentes XL-1 blue (Stratagene, Santa Clara, EE.UU.) y se sembraron en placas de agar 2YT que contenían ampicilina (10 pg/ml). Se produjo ADN de los tres vectores de expresión (llamados mPK, rPK y hPK) y se confirmaron las secuencias correctas por secuenciación de ADN (Macrogen, Seúl, Corea del Sur).

Se expresaron las tres calicreínas plasmáticas ortólogas en células de mamífero como se indica a continuación. Se hicieron crecer 50 ml de células HEK-293 adaptadas a suspensión en medio ExCell 293 libre de suero (SAFC Biosciences, St. Louis, MO) en presencia de glutamina 4 mM y el inhibidor de histona desacetilasa ácido valproico (3,75 mM) en un matraz de 100 ml agitado orbitalmente a 180 rpm en una incubadora ISF-4-W (Kühner AG, Birsfelden, Suiza) a 37 °C en presencia de CO² al 5 %. Las células de riñón embrionarias (HEK-293) a alta densidad celular (20 x 10⁶ células/ml) (Backliwal, et al/. Biotechnol Bioeng 2008, 99 (3), 721-7) se transfectaron con los tres plásmidos (300 pg/ml) usando polietilenimina lineal (PEI, Polysciences, Eppenheim, Alemania). Al final de la fase de producción de 7 días, se recolectaron las células por centrifugación a 2500 rpm durante 15 min a 4 °C. Se eliminó cualquier desecho celular adicional del medio mediante filtración a través de membranas PES de 0,45 pm (TPP de 250 ml de baja unión a proteína Filter-top). Se purificó la proteína marcada con polihistidina por cromatografía de afinidad de Ni usando resina Ni-NTA, tampón de lavado (NaCl 500 mM, Na²HPO⁴ 25 mM, pH 7,4) y tampón de elución (NaCl 500 mM, Na²HPO⁴ 25 mM, pH 7, 4, imidazol 500 mM). Se activó parcialmente la proteína con (50 unidades) de proTEV (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU. y se purificó adicionalmente por cromatografía de afinidad de Ni y filtración en gel (columna PD10, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, HEPES 50 mM, pH 7).

Desarrollo de polipéptidos con actividad de unión mejorada

Asignación al azar de posiciones individuales

Construcción de genoteca: Para cartografiar los aminoácidos en los péptidos bicíclicos de unión a calicreína, se construyó un conjunto de colecciones pequeñas. Para un biciclo que comprende 2 bucles de 5 residuos, se generaron 10 colecciones separadas cada una con aleatorización en un codón particular de la secuencia peptídica. Se diseñaron los oligonucleótidos para cada genoteca para mutar el ADN de genoma de fago mediante mutagénesis dirigida a sitio. La mutagénesis incorporaba la asignación al azar del codón de interés (cambio a NNS), y la eliminación de un sitio de restricción ApaL1 único de la secuencia de genoma plantilla. Se purificó el producto de mutagénesis usando el kit de purificación por PCR QIAgen QIAquick con elución en agua ultrapura. Se usó cada genoteca para transformar separadamente TG1 de E coli por electroporación con una máquina BioRad Micropulser (programa Ec1) y cubeta BioRad de 1 mm. Después de 1 hora de recuperación a 37 °C en 1 ml de medio SOC, se hicieron crecer los transformantes de la genoteca durante una noche en 25 ml de caldo 2TY que contenía antibiótico para hacer crecer selectivamente los transformantes de la genoteca solamente. Se recolectaron las bacterias por centrifugación, se purificó el ADN de fago de genoteca de E coli usando un kit QIAgen Plasmid Plus Midi y se eluyó en agua destilada. Se digirió el ADN purificado con ApaLI durante 2 horas en tampón 4 de New England Biolabs para eliminar el material original. Después de la digestión, se purificó de nuevo el ADN usando el kit de purificación por PCR de QIAgen (como anteriormente) y se usó para transformar TG1 (electroporación, como se describe anteriormente). Después de la recuperación de 1 hora en SOC, se sembraron los transformantes en placas de LB-agar que contenían antibióticos selectivos y se permitieron crecer las colonias durante una noche a 37 °C.

Ensayo de unión de clones individuales: Se escogieron las colonias transformantes de la genoteca aleatoriamente y se hicieron crecer como cultivos individuales en caldo 2TY que contenía antibiótico selectivo. Se secuenció el ADN de las colonias escogidas usando un secuenciador de a Dn QIAgen PyroMark Q96 para revelar la sustitución aminoacídica presente en cada clon. Cuando se aisló, se ensayó en un clon de cada sustitución única la unión a calicreína plasmática humana como se indica a continuación. Se recolectó el sobrenadante que contiene fago del cultivo y se ciclaron los fagos con trisbromometilbenceno (TBMB) basándose en los procedimientos de Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 págs. 502-507 (2009)). Se ensayó en los fagos purificados de este proceso la unión a calicreína plasmática humana biotinilada usando un ensayo de unión basado en placa homogénea; se midió la lectura de ensayo en un lector de placas BMG Labtech Pherastar FS. Se promediaron los datos de unión cuantitativos de muestras de ensayo por triplicado (media) y se expresaron como señal:fondo (en que el fondo era una muestra ensayada sin material diana). Se expresó la señal:fondo como un % de la muestra original paralela. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Los ensayos mostrados son representativos de al menos 2 experimentos independientes. Se correlacionaron los datos de ensayo con las secuencias peptídicas. Las sustituciones marcadas en gris no se ensayaron (no se aisló un clon del muestreo de genoteca aleatorio). Se ensayó en paralelo una muestra de biciclo sin unión (arbitrario) para ilustrar el valor inicial del ensayo.

Asignación al azar de dominios peptídicos

Construcción de genoteca: Se generaron colecciones de fago pequeñas de acuerdo con los procedimientos de Heinis et al. cómo se describen anteriormente en "Clonación de colecciones de fago". Se modificó el cebador sficx3ba de tal modo que la porción que codifica el biciclo estuviera basada en la secuencia de ADN del biciclo 5x5 original (5x5: dos bucles de 5 residuos) con solo 4-6 codones aleatorizados a NNS. Los codones aleatorizados eran aquellos que codifican el dominio peptídico/motivo de interés.

Ensayo de unión de clones individuales: Se escogieron colonias de transformantes de la genoteca, o colonias del resultado de la selección, y se hicieron crecer como cultivos individuales en caldo 2TY que contenía antibiótico selectivo. Se secuenció el ADN de las colonias escogidas usando un secuenciador de ADN QIAgen PyroMark Q96 para revelar la sustitución aminoacídica presente en cada clon, y se ensayó la unión a calicreína plasmática humana como se indica a continuación. Se recolectó el sobrenadante que contiene fago del cultivo y se ciclaron los fagos con trisbromometilbenceno (TBMB) basándose en los procedimientos de Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 págs.

502-507 (2009)). Se ensayó en los fagos purificados de este proceso la unión a calicreína plasmática humana biotinilada usando un ensayo de unión basado en placa homogénea; se midió la lectura de ensayo en un lector de placas BMG Labtech Pherastar FS. Se promediaron los datos de unión cuantitativos de muestras de ensayo por duplicado (media) y se expresaron como señal:fondo. Los datos de ensayo mostrados son representativos de al menos 2 experimentos independientes. Se correlacionaron los datos de ensayo con las secuencias peptídicas.

Síntesis y purificación de péptidos bicíclicos

Se muestran las secuencias peptídicas en las tablas 4 a 6. Las secuencias peptídicas centrales fueron Ac-C¹ S¹W² P³A⁴R⁵C² L⁶H⁷Q⁸D⁹L¹⁰C³-NH² (representada como Ac-(06-34-18)(TMB)-NH2) y Ac-C¹ S¹ F² P³Y⁴R⁵C² L⁶H⁷Q⁸D⁹L¹⁰C³-NH² (representada como Ac-(06-34-18)(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4).

La síntesis peptídica se basaba en la química de Fmoc, usando un sintetizador peptídico Symphony fabricado por Peptide Instruments. Se emplearon Fmoc-aminoácidos estándares (Sigma, Merck), con los siguientes grupos protectores de cadena lateral: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); Glu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc), Tyr(tBu) (Sigma). El reactivo de acoplamiento era HCTU (Pepceuticals), se empleó diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma) como base y se consiguió la desprotección con piperidina al 20 % en DMF (AGTC). Se realizaron las síntesis a escala de 100 umol usando resina Fmoc-Rink amida AM 0,37 mmol/g (AGTC), se utilizaron Fmoc-aminoácidos con un exceso de 4 veces y la base estaba a un exceso de 4 veces con respecto a los aminoácidos. Se disolvieron los aminoácidos a 0,2 M en DMF, HCTU a 0,4 M en DMF y DIPEA a 1,6 M en N-metilpirrolidona (Alfa Aesar). Los tiempos de acoplamiento eran generalmente de 30 minutos, y los tiempos de desprotección de 2 x 2,5 minutos. Se acopló Fmoc-N-metilglicina (Fmoc-Sar-OH, Merck) durante 1 h y los tiempos de desprotección y acoplamiento para el siguiente residuo eran de 20 min y 1 h, respectivamente. Después de la síntesis, se lavó la resina con diclorometano y se secó. Se efectuó la escisión de los grupos protectores de cadena lateral y del soporte usando 10 ml de 95:2.5:2.5:2.5 v/v/v/p de TFA/H²O/iPr3SiH/ditiotreitol durante 3 horas. Después de la escisión, se retiró la resina gastada por filtración y se añadió el filtrado a 35 ml de dietiléter que se había enfriado a -80 °C. Se centrifugó el sedimento peptídico, se desechó el sobrenadante etérico y se lavó el sedimento peptídico con éter frío dos veces más. Se resolubilizaron entonces los péptidos en 5-10 ml de acetonitrilo-agua y se liofilizaron. Se retiró una muestra pequeña para análisis de la pureza del producto bruto por espectrometría de masas (MALDI-TOF, Voyager DE Applied Biosystems). Después de la liofilización, se tomaron los polvos peptídicos en 10 ml de clorhidrato de guanidinio 6 M en H²O, se complementaron con 0,5 ml de ditiotreitol 1 M y se cargaron en una columna de HPLC preparativo C8 Luna (Phenomenex). Se acidificaron los disolventes (H²O, acetonitrilo) con ácido hetapfluorobutírico al 0,1 %. El gradiente oscilaba de 30-70 % de acetonitrilo en 15 minutos a un caudal de 15/20 ml/min, usando un sistema de HPLC preparativo Gilson. Se combinaron las fracciones que contienen material peptídico lineal puro (como se identifica por MALDI) y se modificaron con trisbromometilbenceno (TBMB, Sigma). Para esto, se diluyó el péptido lineal con H²O hasta ~35 mL, se añadieron ~500 ul de TBMB 100 mM en acetonitrilo, y se inició la reacción con 5 ml de NH4HCO3 1 M en H²O (pH 8). Se dejó avanzar la reacción durante ~30-60 min a TA y se liofilizó una vez se completó la reacción (determinado por MALDI). Después de la liofilización, se purificó el péptido modificado como anteriormente, reemplazando la columna Luna C8 por una Gemini C18 (Phenomenex), y cambiando el ácido a ácido trifluoroacético al 0,1 %. Se combinaron las fracciones puras que contenían el material modificado con TMB correcto, se liofilizaron y se mantuvieron a -20 °C para almacenamiento.

Se adquirieron los aminoácidos no naturales de las fuentes expuestas en la tabla 7.

Se acoplaron habitualmente los aminoácidos voluminosos o impedidos (NMe-Ser, NMe-Trp, NorHar, 4PhenylPro, Agb, Agp, NMe-Arg, Pen, Tic, Aib, Hyp, NMe-Ala, NMe-Cys, 4,4-BPAl, 3,3-DPA, Dpg, 1NAl, 2ⁿAI, Aze, 4BenzylPro, Ind) durante 1 horas (20 min de desprotección), y 6 h para el residuo siguiente (20 min de desprotección). Se usó HCTU como reactivo de acoplamiento como anteriormente. La escala era habitualmente de 50 umol.

Síntesis de peptoides, enlaces amida reducidos y péptidos a-N-metilados

Los peptoides (es decir, N-His7) se sintetizaron de acuerdo con el esquema desarrollado por Zuckermann et al. (Ronald N. Zuckermann, Janice M. Kerr, Stephen B. H. Kent, Walter H. Moos, Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis Journal of the American Chemical Society, (1992), 114(26), 10646-10647).

Los enlaces pseudopeptídicos de amida reducidos se sintetizaron de acuerdo con el esquema en Sasaki Y, Coy DH., Solid phase synthesis of peptides containing the CH2NH peptide bond isostere, Peptides. 1987 Jan-Feb;8(1):119-21. Los péptidos N-metilados (NMe-His, NMe-GIn) se sintetizaron utilizando una forma modificada de la reacción de Mitsunobu, de acuerdo con un esquema descrito en Nature Protocols, "Synthesis of N-methylated cyclic peptides", de Chatterjee et al, 7(3) 2012, págs. 432. Todos los demás aminoácidos N-metilados (NMe-Leu, NMe-Asp) se obtuvieron como precursores de Fmoc a partir de fuentes comerciales.

Ensayos enzimáticos

Se realizaron los ensayos enzimáticos funcionales en Tris-HCl 10 mM, NaCI 150 mM, MgCl2 10 mM, CaCl21 mM y BSA 1 mg/ml (todos de Sigma Reino Unido) pH 7,4 a 25 °C en placas de 96 pocilios negros sólidos. Brevemente, se incubaron calicreína plasmática humana 26,5 pM (adquirida en Stratech, Reino Unido) o calicreína plasmática de rata 500 pM (expresada y purificada internamente) en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de péptido de prueba durante 15 minutos antes de la adición del sustrato fluorogénico Z-PheArg-AMC (Enzo Lifesciences UK) hasta una concentración de ensayo final de 100 pM en DMSO al 4 %. Se midió la liberación de AMC usando un Pherastar FS (BMG Labtech), excitación a 360 nm, emisión a 460 nm. Se calculó la tasa de la fase lineal de la reacción, típicamente de 5 a 45 minutos, con el software de análisis de datos MARS (BMG labtech). Se usó entonces la tasa para calcular CI50 y Ki en Prism (GraphPad). Se usó una ecuación de regresión no lineal de inhibición de cuatro parámetros para calcular la CI50. Se usó la ecuación de Ki de ajuste de un sitio para calcular la Ki, restringiendo la Ki a la Km del sustrato, que es de 150 pM. Todos los valores de Ki/CI50 son la media de al menos dos experimentos independientes, y al menos tres para los péptidos con valores de Ki menores de 1 nM.

Se disolvieron los péptidos en forma de sales de TFA en su forma en polvo y se prepararon habitualmente soluciones madre en agua. Se centrifugaron y se filtraron todas las soluciones (filtros de jeringa de 20 pm) antes de la medida de absorción a 280 nm. Se calcularon los coeficientes de extinción basándose en el contenido de Trp/Tyr del péptido y del de TMB (el núcleo de TMB, cuando está contenido en un péptido, tiene un £ de ~300 M^{' 1}cirr¹). Para péptidos que contienen aminoácidos no naturales como propiedades cromofóricas sospechadas (es decir, NorHar, 4phenylPro, 3Pal, 4Pal, Tic, 4GuanPhe, 4,4-BPAl, 3,3-DPA, 1NAl, 2NAl, 4BenzylPro, Ind), se determinaron las concentraciones pesando el polvo y disolviendo el péptido en una cantidad definida de agua. Se prepararon estos independientemente dos veces, para péptidos con una Ki de calicreína de 1 nM o menos.

Elaboración de perfiles de estabilidad plasmática

Se emplearon tres procedimientos para valorar la estabilidad de biciclos (péptidos conjugados con andamiajes moleculares) en plasma.

Procedimiento N.° 1:

Se desarrolló un ensayo de elaboración de perfiles de estabilidad plasmática que empleaba detección espectrométrica de masas (MALDI-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems) de la masa original, hasta el momento en que la masa del péptido original ya no era observable. Específicamente, se incubaron 200 uM de péptido en presencia de plasma de rata o humano al 35 % (Sera labs, usando citrato como anticoagulante) a 37 °C, que se complementó con 1 x PBS (derivado de una solución madre 10 xPBS, Sigma). En diversos puntos temporales (es decir, t = 0, 3, 24 h, después de ello diariamente hasta 10 días), se añadieron 2 ul de muestra a 18 ul de bicarbonato de amonio 30 mM en una mezcla 1:1 de acetonitrilo:H²O. Se congelaron las muestras a -80 °C hasta el momento del análisis. Para el análisis espectrométrico de masas que determina la ventana de detección aproximada del péptido, se punteó la muestra de acetonitrilo:H² O diluida de un punto temporal dado directamente (0,7 ul) sobre la placa de MALDI. Se recubrió la matriz (ácido alfa-cianocinámico, Sigma, preparado en forma de una solución saturada en 1:1 de acetonitrilo:agua que contenía un 0,1 % de ácido trifluoroacético) sobre la muestra (1 ul). En un entorno de intensidad láser similar en MALDI TOF, pudo determinarse entonces el tiempo hasta que el péptido original no era ya detectable. Debería señalarse que este es un ensayo cualitativo que sirve para detectar cambios relativos en la estabilidad plasmática.

Procedimiento N.° 2:

Para obtener los datos de estabilidad más rápidamente, se valoraron también los péptidos en plasma al 95 %. Aquí se omitió el PBS y se diluyó directamente una solución madre de péptido 1 mM (en DMSO) en plasma (es decir, 2,5 ul de solución madre en 47,5 ul de plasma), dando una concentración final de 50 uM. Se tomaron muestras de 5 ul en los puntos temporales apropiados y se congelaron a -80 °C. Para el análisis, se descongelaron las muestras, se mezclaron con 15 ul de 1:1 de acetonitrilo:metanol y se centrifugaron a 13 k durante 5 min. Se aspiraron 5 ul del sobrenadante que contiene péptido y se mezclaron con bicarbonato de amonio 30 mM en una mezcla 1:1 de acetonitrilo:H² O. Se manchó puntualmente entonces 1 ul de esta en la placa de MALDI y se analizó como se describe anteriormente. Como anteriormente, debería señalarse que este es un ensayo cualitativo que sirve para detectar cambios relativos en la estabilidad plasmática.

Procedimiento N.° 3:

Para obtener la estabilidad plasmática cuantitativamente, se enviaron soluciones madre peptídicas (1 mM en DMSO) a Biofocus, Reino Unido, quienes realizaron el análisis. Se diluyeron los péptidos a 100 uM con agua y se diluyeron 1:20 en plasma (concentración final 5 uM, con plasma al 95 %), se muestrearon según fuera apropiado, se precipitaron como anteriormente y se cuantificaron usando un Waters Xevo TQ-MS.

Ejemplo 1: Identificación de residuos preferidos para la actividad de unión

A partir de los ejemplos de péptidos 5x5 mostrados en la tabla 4, es posible identificar los aminoácidos que están conservados entre péptidos con afinidad de unión. Para determinar cuáles residuos se prefieren para actividad de unión, se estudiaron adicionalmente representantes de dos de las familias de péptidos identificadas. Estos eran el péptido 06-34, que comprende un motivo CXWPARC en el primer bucle del biciclo, y el péptido 06-56, que comprende un motivo CGGxxNCR entre ambos bucles del biciclo. Para cada secuencia peptídica, se creó un conjunto de 10 colecciones de fago en el que 9 de los residuos de bucle se mantenían constantes y el otro residuo se asignaba al azar de modo que pudiera expresarse cualquier aminoácido en la genoteca en esa posición. (Véase "Asignación al azar de posiciones individuales - Construcción de genoteca" en procedimientos anteriormente). Para cada genoteca, se cribó en un conjunto de 20 clones de fago seleccionados aleatoriamente la unión a calicreína humana en un ensayo de unión a fago para identificar los residuos críticos para la unión a diana. (Véase, "Asignación al azar de posiciones individuales - Ensayo de unión de clones individuales" en los procedimientos anteriores). Se muestran los datos de este experimento en las figuras 4-6.

Para el péptido 06-34 (figura 4), resulta evidente que la Arg1 del biciclo puede reemplazarse por una diversidad de aminoácidos diferentes y la unión a calicreína plasmática humana se retiene o potencia. Por el contrario, el reemplazo de los residuos 2, 3, 4, 5 (Trp2, Pro3, Ala4, Arg5) por la mayoría de aminoácidos reducía en gran medida la señal observada en un ensayo que se estableció con un corte riguroso para productos de unión de alta afinidad. La Val6 puede reemplazarse por muchos aminoácidos diferentes y la actividad de unión de retiene o potencia. El reemplazo de los demás residuos del segundo bucle indicaba que solo la Leu10 podía reemplazarse por una diversidad de diferentes aminoácidos reteniendo actividad. Las posiciones 7, 8 y 9 tienen una capacidad limitada de sustitución y no se identificaron sustituciones que potenciaran la unión.

Para el péptido 06-56 (figuras 5 y 6), resulta evidente que las glicinas en la posición 1 o 2 son los residuos más preferidos para unión a calicreína plasmática, como la arginina, triptófano y treonina en las posiciones 6, 8 y 9. La glutamina en la posición 4 y la treonina en la posición 10 pueden reemplazarse por una variedad de residuos reteniendo una buena actividad de unión. Los tres residuos restantes, prolina en la posición 1, asparagina en la posición 5 y treonina en la posición 7, tienen una capacidad limitada de sustitución.

Análisis de reemplazos de aminoácidos

A partir del análisis precedente, resulta evidente que, para 06-34, la posición 1 y la posición 6 pueden reemplazarse por una diversidad de aminoácidos y seguir reteniendo una actividad mayor o igual a la del péptido original. Para evaluar si estas observaciones se mantendrían con péptidos sintéticos aislados, se diseñó un conjunto de péptidos de acuerdo con los hallazgos de la figura 4, donde se reemplazó la Arg1 por serina y donde se sustituyó la Val6 por treonina, metionina o leucina. Se sintetizaron también péptidos que emplean diversas combinaciones de estas sustituciones. Estas sustituciones producían una mayor señal de unión en el ensayo (tabla 5).

Todos los péptidos sintéticos variantes tenían una actividad aproximadamente equivalente o una actividad potenciada frente a la calicreína plasmática humana en ensayos de inhibición enzimática en comparación con el péptido original 06-34, indicando que este tipo de análisis podía usarse para ajuste fino de las afinidades de unión a diana, y sugiriendo una vía para identificar los candidatos peptídicos a compuestos principales de muy altas potencias.

Se ensayaron también los péptidos frente a calicreína plasmática de rata en ensayos de enzimas aisladas. La sustitución de Arg1 por Ser1 tenía un impacto marginal sobre la actividad frente a calicreína de rata, mientras que las sustituciones de Val6 por treonina, metionina o leucina generaban péptidos con potencia notablemente aumentada frente a calicreína plasmática de rata. La actividad de calicreína humana se retenía completamente. Por lo tanto, al determinar las posiciones susceptibles de sustituciones, pueden identificarse péptidos con propiedades deseables, tales como reactividad cruzada por ortólogo de diana.

Para demostrar la posibilidad de reemplazar estas dos posiciones por aminoácidos no naturales para tener la capacidad de introducir funcionalidades o propiedades que no estén presentes en el péptido original, se reemplazaron Arg1 y Val6 en 06-34-03 por alanina o N-metilglicina (sarcosina), o por N-metilserina en la posición 1, y se evaluó la unión. Notablemente, como se muestra en la tabla 6, las posiciones 1/6 son susceptibles de retirada de la cadena lateral totalmente, ya que los péptidos R1A/V6A (06-34-03 Ala1,6) retenían toda la potencia en comparación con el original. El reemplazo de los residuos 1,6 por N-metilglicina (06-34-03 NMeGly1, 6) causaba una reducción de la potencia, sin embargo, la afinidad de unión permanecía en el intervalo nanomolar bajo. La introducción de una N-metilserina en la posición 1 causa una pérdida de diez veces de potencia, pero la unión permanece en el intervalo picomolar. Por lo tanto, pueden identificarse ciertas posiciones en el biciclo que permiten cambios en la estructura del esqueleto peptídico o las cadenas laterales que podrían permitir una mejora potenciada de la estabilidad a proteasas, una solubilidad potenciada, un potencial de agregación reducido y la introducción de grupos funcionales ortólogos.

Ejemplo 2: Análisis detallado del dominio WPAR

Se analizó el motivo WPAR identificado en el ejemplo 1 en el contexto del péptido 06-34-03, para identificar alternativas o mejoras del motivo WPAR. Se construyó una genoteca donde las posiciones 1, 6, 7, 8, 9 y 10 de 06-34-03 estaban fijadas y las posiciones 2, 3, 4 y 5 estaban asignadas al azar (véase "Asignación al azar de dominios peptídicos -construcción de colecciones" en los procedimientos anteriores). Se realizaron las selecciones frente a calicreína plasmática humana a una diversidad de restricciones (véase "Selecciones de fago" en los procedimientos anteriores).

Se identificaron todas las secuencias de resultado y se analizó la unión a diana (véase "Asignación al azar de dominios peptídicos - Ensayo de unión de clones individuales" en los procedimientos anteriores). La tabla 17 enumera cada secuencia única, su abundancia relativa en el resultado de selección (frecuencia) y un número de rango de acuerdo con la fuerza de la unión a diana.

La tabla 17 muestra que el motivo WPAR confiere la mejor unión a calicreína plasmática humana, aunque se recuperan otras secuencias de unión a calicreína de selecciones con alta abundancia. Estas incluyen, pero sin limitación: WPSR, WPAR, WSAR, WPFR, WPYR, FPFR, y FPFR. Los motivos más eficaces y abundantes en las posiciones 2, 3, 4 y 5 pueden resumirse como: ^w /^f P x ^k /^r

La tabla 18(A) muestra que WPAR y WPSR eran los más abundantes en los resultados de selección más rigurosos;

FPFR y FPYR eran abundantes en los resultados de selección menos rigurosos. Esto indicaría que las secuencias similares a WPAR son productos de unión más fuerte que las secuencias similares a FPFR. El análisis de cada motivo (en el contexto de 06-34-03) en el ensayo de unión a diana (tabla 18(B)), revela que WPAR en las posiciones 2, 3, 4 y 5 de la secuencia de 06-34-03 es la secuencia óptima para unión a calicreína.

Ejemplo 3: Optimización de la secuencia fuera del farmacóforo WPAR

Se han estudiado el motivo WPAR y sus variantes en el contexto del péptido 06-34-03. La figura 1 demuestra que algunas posiciones fuera del motivo WPAR pueden mantener la unión a calicreína cuando se sustituyen por otros residuos. Para estudiar los determinantes no WPAR de la unión a calicreína, se generó una genoteca de fago con una secuencia de WPAR fija y todas las demás posiciones asignadas al azar (CxWPARCxxxxxC) como se describe en "Asignación al azar de dominios peptídicos - Construcción de colecciones" en los procedimientos anteriores.

Se aislaron 80 miembros de genoteca aleatorios directamente del agrupamiento de genoteca (no selección) y se ensayó la unión a calicreína tanto a alta como a baja restricción (Véase "Asignación al azar de dominios peptídicos -Ensayo de unión de clones individuales" en los Procedimientos anteriores Estos miembros de genoteca, que contienen secuencias aleatorias fuera de WPAR, mostraban poca o ninguna unión a calicreína plasmática humana (datos no mostrados) , indicando que el motivo WPAR solo no es suficiente para retener una unión a calicreína mensurable: el resto de la secuencia bicíclica debe contribuir también o influir en la interacción.

Se realizaron las selecciones frente a calicreína plasmática humana con esta genoteca para estudiar los determinantes diferentes de WPAR de la unión a calicreína, y para aislar la secuencia peptídica que contenía WPAR óptima. Se aislaron sobre 150 secuencias de salida de selección y se cribó la unión a calicreína plasmática humana (como se describe en los procedimientos anteriores). Se clasificaron las secuencias en orden de unión a calicreína y se alinearon las 50 secuencias superiores en la tabla 19. La tabla 19 muestra que el residuo en la posición 1 no afecta a la unión a calicreína, pero se observa un fuerte consenso por histidina en la posición 7 (lo que apoya los hallazgos del ejemplo 1 anteriores El péptido 06-34-03, derivado del trabajo del ejemplo 1, es una de las mejores secuencias. La composición del segundo bucle muestra claras tendencias que confieren una fuerte unión a calicreína cuando está con un motivo WPAR.

Los mejores productos que contienen WPAR de unión a calicreína plasmática humana tienen la tendencia:

C X W P A R C ^t /^l H ^q /^t D L C

H7, D9 y L10 están fuertemente conservados en las secuencias de unión a calicreína que contienen WPAR.

Se identificaron dos motivos en el segundo bucle bicíclico (posiciones 6-10):

1. C X W P A R C T H ^q /^t D L C (posiciones 6, 7 y 10: "THxxL")

2. C X W P A R C ^t /^l H ^q /^t D_L C (posiciones 7, 8, y 10: "xHxDL")

Se agruparon sobre 120 productos de unión a calicreína plasmática humana (secuencias de resultado de selección) identificados de 2 formas diferentes, de acuerdo con su derivación de los motivos "THxxL" o "xHxDL". Para todos los grupos, la señal de ensayo de unión a calicreína media para las secuencias de resultado se señaló como medida de la unión a calicreína para un grupo dado (tabla 20).

Los datos del ensayo de unión a calicreína mostrados en la tabla 20 demuestran que los motivos "THxxL" y "xHxDL" dan como resultado la mejor unión a calicreína cuando están en un péptido bicíclico con un motivo WPAR. La combinación de los 2 motivos "THxDL" da la unión máxima con la calicreína plasmática humana e incluye la secuencia del segundo bucle "THQDL" del péptido 06-34-03.

Ejemplo 4: Análisis sistemático de la estabilidad plasmática

Para un biciclo inhibidor de calicreína, es pertinente obtener un perfil de estabilidad a proteasas adecuado, de tal modo que tenga un bajo aclaramiento impulsado por proteasa en plasma u otros entornos relevantes. En un ensayo de estabilidad plasmática comparativa rápido (sección de procedimientos, procedimiento n.° 1) que observaba la desaparición progresiva del péptido original en plasma de rata, se encontró que la alanina N-terminal (que está presente en el momento de las selecciones y estaba incluida originalmente en péptidos sintéticos de secuencias de compuestos principales) se retira rápidamente de todas las secuencias bicíclicas ensayadas tanto por plasma de rata como humano. Esta degradación se evitaba sintetizando un candidato a compuesto principal que carecía de ambas alaninas N y C-terminales. Para eliminar los puntos de reconocimiento potenciales de aminopeptidasas y carboxipeptidasas, se cubre el extremo amino libre que reside ahora en Cys 1 del candidato a compuesto principal con anhídrido acético durante la síntesis peptídica, conduciendo a una molécula que está acetilada N-terminalmente. De igual forma, se sintetiza la cisteína C-terminal en forma de amida para retirar el punto de reconocimiento potencial de carboxipeptidasas. Por lo tanto, los candidatos a compuestos principales bicíclicos tienen la siguiente secuencia genérica: Ac-CiAA ⁱ AA2AAⁿC2AA^{n i}AAⁿ⁺²AAⁿ⁺³C3(TMB)-NH2, donde "Ac" se refiere a acetilación N-terminal, "-NH2" se refiere a amidación C-terminal, donde "Cⁱ , C² , C³" se refieren a la primera, segunda y tercera cisteínas en la secuencia, donde "AA 1" a "AAn" hacen referencia a la posición del aminoácido (cuya naturaleza "AA" se define por las selecciones descritas anteriormente), y donde "(TMB)" indica que la secuencia peptídica se ha ciclado con TBMB o cualquier otro andamiaje reactivo adecuado.

Debido a la alta afinidad de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 tanto por calicreína humana (Ki= 0,17 nM) como de rata (CI50 = 1,7 nM), se eligió este biciclo para el desarrollo del compuesto principal (figura 9, tabla 1, tabla 5). Usando el mismo ensayo de elaboración del perfil de estabilidad plasmática rápido descrito anteriormente, Ac-06-34-18(TMB)-NH2 tenía una ventana de observabilidad de aproximadamente 2 días (sección de procedimientos, procedimiento N.° 1) que es igual a una semivida plasmática en rata de ~2 h (determinada cuantitativamente por LC/MS, véase a continuación, tabla 23, procedimiento N.° 3).

En un esfuerzo por identificar el sitio o sitios de reconocimiento proteolítico en Ac-06-34-18(TMB)-NH2, se muestreó el péptido en plasma de rata al 35 % con el tiempo (procedimiento N.° 1) y se analizó en cada muestra la aparición progresiva de fragmentos peptídicos usando espectrometría de masas ^mA^lDI-TOF. La masa original de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 es de 1687 Da. Con el tiempo (figura 7, 8), aparecen fragmentos de las masas 1548,6 (M1), 1194,5 (M2) y 1107,2 (M3). A partir de la secuencia de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 (Ac-C¹S¹W²P³A⁴R⁵C²L⁶H⁷Q^s D⁹L¹⁰C³-NH2), puede calcularse que el pico de M1 corresponde a Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que carece de Arg5 (-R5). Este parece ser el evento proteolítico inicial, que es seguido por la retirada del segmento de 4 aminoácidos WPAR en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 (M2, -WPAR), y finalmente se escinde el primer bucle completo de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 (M3, -SWPAR) (figura 8). A partir de estos datos, resulta evidente que la Arg5 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 es el sitio de reconocimiento de proteasa plasmática de rata principal que es responsable de la degradación del biciclo.

Sustituciones de alanina y permutación del primer bucle:

Habiendo identificado a Arg5 en la constitución del sitio de reconocimiento de proteasas plasmáticas de rata, se emprendió una campaña de síntesis química de derivados de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 con el objetivo de identificar candidatos con la mayor estabilidad proteolítica plasmática. De forma crucial, tales modificaciones no deberían afectar a la potencia contra calicreína humana o de rata. Se realizó una exploración inicial respecto al papel de la secuencia/farmacóforo WPAR (figura 9, 10) reemplazando W² P³ por A²A³ o A²Q³ y permutando partes o todo el primer bucle del biciclo. La tabla 8 siguiente muestra las secuencias y afinidades respectivas frente a calicreína.

A partir de estos datos, resulta evidente que la retirada simultánea de W² P³ reduce radicalmente la unión a calicreína por un factor de ~100000, volviendo efectivamente la molécula farmacológicamente inerte. La importancia de la secuencia correcta de aminoácidos está subrayada por los cuatro péptidos permutados (Scram 1-4), ya que todos ellos exhiben una reducción sustancial de afinidad hacia calicreína (figura 10). Curiosamente, todos los péptidos tienen un perfil de estabilidad en plasma de rata aproximadamente idéntico (entre 1 y 2 días, procedimiento N.° 1), indicando que el reconocimiento de proteasa plasmática se basa en la presencia de la arginina (figura 7) y no en su posición en la secuencia.

A continuación, se generaron cinco derivados de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 donde W² , P³ , A⁴ , R⁵ , y C² se reemplazaron por sus respectivos homólogos D-enantioméricos (tabla 9).

A partir de los datos, resulta evidente que el reemplazo por D-aminoácido de A⁴ , R⁵ , y C² aumenta la estabilidad peptídica frente a proteasas plasmáticas. Dado que la escisión de Arg5 por proteasas plasmáticas de rata parece ser el primer evento en la degradación peptídica, ocurrirá la hidrólisis inicial de enlaces peptídicos en el lado N- y/o C-terminal de Arg5. Es plausible que reemplazar los aminoácidos en cualquier lado de Arg5 por sus D-enantiómeros bloquee la hidrólisis del enlace peptídico adyacente por impedimento estérico. De hecho, este es un efecto que se ha observado previamente (Tugyi et al (2005) PⁿAS, 102(2), 413-418).

El efecto perjudicial de la sustitución con D-aminoácidos sobre las afinidades por calicreína es llamativo en todos los casos; las pérdidas de potencias varían de 300 (D-Arg5) a 45000 veces (D-T rp2). Esto subraya la importancia de una presentación tridimensional correcta de estas cadenas laterales al bolsillo de unión a biciclo de calicreína. Es igualmente llamativo el efecto de D-Ala4: aquí, cambiar la orientación de un solo grupo metilo (que es la cadena lateral de Ala) reduce la afinidad 7000 veces.

N-metilaciones:

A continuación, se reemplazaron sistemáticamente los residuos en el primer bucle por sus homólogos N-metilo. La N-metilación sirve como protección directa del enlace peptídico mismo; sin embargo, debido a la ausencia de hidrógeno de amida, la adición de volumen estérico (el grupo metilo) y los cambios en los ángulos torsionales preferidos, se esperan pérdidas de potencias.

La tabla 10 resume los datos.

La N-metilación de aminoácidos en el bucle 1 presenta un efecto perjudicial menos drástico en conjunto sobre la potencia. En particular, la N-metilación de Arg5 sigue procurando un producto de unión nanomolar de un dígito (reducción de 20 veces de afinidad en comparación con el péptido de tipo silvestre) y su estabilidad en plasma de rata supera el tiempo de ensayo (no era observable fragmentación del péptido en MS), haciendo de este un candidato a compuesto principal mejorado atractivo. Como con las sustituciones con D-aminoácidos, la N-metilación de residuos adyacentes a Arg5 confiere una estabilidad potenciada al péptido, presuntamente mediante interferencia estérica que afecta a la hidrólisis catalizada por proteasa de enlaces peptídicos N y/o C-terminales de Arg5. Es notable que la Ser1 puede estar N-metilada sin una pérdida significativa de potencia, indicando que la integridad del esqueleto peptídico en esta posición no es esencial para la unión.

Sustituciones de arginina:

Dada la importancia de la Arg5 en el reconocimiento por proteasas plasmáticas de rata, se ensayó un conjunto de análogos de arginina en el compuesto principal Ac-06-34-18(TMB)-NH2. Se muestran las estructuras químicas en la figura 11 y se muestran los datos de potencia frente a estabilidad en la tabla 11.

De forma llamativa, todos los análogos de arginina aumentan la estabilidad del péptido más allá del tiempo de la ventana de ensayo, confirmando la importancia de la integridad de Arg5 en el reconocimiento de proteasa plasmática. Aumentar (HomoArg) o disminuir la longitud de la cadena lateral (Agb, Agp) disminuye en ambos casos la afinidad, sin embargo, el análogo HomoArg sigue produciendo un producto de unión muy bueno (Ki = 2,1 nM) de estabilidad potenciada. El alargamiento del esqueleto aminoacídico con un grupo metileno en Arg5 (un denominado betaaminoácido) con retención de la misma cadena lateral (IJ-homoArg5), produce también un producto de unión de estabilidad potenciada, sin embargo, al precio de una reducción más significativa de la afinidad (Ki = 8,2 nM). Reemplazar la parte alifática de la cadena lateral de Arg por un anillo fenilo procura una cadena lateral de resonancia estabilizada, más voluminosa y rigidizada que contiene guanidilo (4GuanPhe). De todos los análogos de Arg sometidos a ensayo, 4GuanPhe tenía la máxima afinidad (reducción de 2 veces en comparación con el tipo silvestre) con una estabilidad plasmática potenciada. De forma interesante, el grupo guanidilfenilo es estructuralmente cercano al inhibidor de calicreína de molécula pequeña benzamidina conocido (Stürzebecher et al (1994), Novel plasma Kallikrein inhibitors of the benzamidine type. Braz J Med Biol Res. 27(8):1929-34; Tang et al (2005), Expression, crystallization, and three-dimensional structure of the catalytic domain of human plasma Kallikrein. J. Biol. Chem. 280: 41077-89). Además, se han empleado fenilguanidinas derivatizadas como inhibidores selectivos de otra serina proteasa, uPA (Sperl et al, (4-aminomethyl)phenylguanidine derivatives as nonpeptidic highly selective inhibitors of human urokinase (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(10):5113-8.). Por lo tanto, el Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que contiene 4GuanPhe5 puede verse como un inhibidor de molécula pequeña cuya selectividad está conferida por el péptido bicíclico circundante. Esto puede comprender un principio para otros inhibidores basados en biciclo, donde se "injerta" un inhibidor de molécula pequeña conocido de baja selectividad en un biciclo en la posición correcta, conduciendo a una molécula de potencia y selectividad superior.

La modificación del grupo guanidilo de Arg mismo, por metilación (SDMA, NDMA), eliminación de la carga positiva (Cit, donde el grupo guanidilo se reemplaza por el grupo urea isoestérico, pero no cargado) o la deleción de la Arg en conjunto (A Arg) tiene efectos fuertemente perjudiciales sobre la potencia de unión a calicreína. Por lo tanto, la integridad y presencia del grupo guanidilo es crucial, mientras que la naturaleza de la cadena lateral que conecta con el grupo guanidilo o esqueleto en Arg5 no lo es. Es notable que la Arg5 pueda reemplazarse también por lisina, sin embargo, de nuevo con afinidades reducidas (véase el péptido WPAK).

En resumen, los datos hasta ahora indican que Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que emplean HomoArg, NMeArg o 4GuanPhe como reemplazos de arginina podrían constituir candidatos de estabilidad plasmática potenciada con altas afinidades.

Ejemplo 5: Mejora de la potencia de un candidato a compuesto principal mediante modificaciones no naturales y combinación con modificaciones potenciadoras de la estabilidad plasmática.

Puede conseguirse viablemente mejorar la potencia de un candidato bicíclico dado mediante varios mecanismos. Estos se han abordado parcialmente en el ejemplo 4, y pueden reescribirse como se indica a continuación:

1. Incorporar restos hidrófobos que aprovechan el efecto hidrófobo y conducen a menores tasas de disociación, de tal modo que se consigan mayores afinidades.

2. Incorporar grupos cargados que aprovechan las interacciones iónicas de largo alcance, conduciendo a tasas de asociación más rápidas y mayores afinidades (véase, por ejemplo, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31)

3. Incorporar restricciones adicionales al péptido, es decir,

- restringir las cadenas laterales de aminoácidos correctamente de tal modo que la pérdida de entropía sea mínima tras unión a diana

- restringir los ángulos de torsión del esqueleto de tal modo que la pérdida de entropía sea mínima tras la unión a diana

- introducir ciclaciones adicionales en la molécula por razones idénticas.

(para revisiones véanse Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, y Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Triptófano y sustituciones análogas hidrófobas:

Inicialmente, se sustituyeron una serie de aminoácidos hidrófobos en el sitio Trp2 para identificar candidatos que podrían reemplazar al triptófano sensible a oxidación e identificar candidatos que podrían aumentar la potencia (abordando el primer punto anterior). Se muestran las cadenas laterales de estos aminoácidos en la figura 12 y se resumen los datos de afinidad en la tabla 12 a continuación.

Como se esperaba, ninguna de las modificaciones aumenta la estabilidad plasmática. La 2-naftilalanina está muy estrechamente relacionada con Trp2 y exhibe una potencia ligeramente más débil que el tipo silvestre, haciendo de este un buen reemplazo resistente a la oxidación para Trp2. De forma interesante, 3,3-DPA2 tiene una estructura que es muy diferente de Trp, aunque el péptido correspondiente conserva una alta potencia. Esto puede indicar que el bolsillo de contacto de Trp con calicreína podría aprovecharse para una mayor afinidad de unión identificando una entidad hidrófoba diseñada correctamente.

Análogos de prolina:

A continuación, interesaba determinar el papel de Pro3 en el farmacóforo WPAR en Ac-06-34-18(TMB)-NH2. Se eligieron 4-hidroxi- o 4-fluoro-trans (L)-prolina (HyP3, 4FluoPro3) por su propiedad conocida de inducción de rigidez y helicidad adicionales en el esqueleto peptídico (figura 13, tabla 13). Adicionalmente, la presencia del hidroxilo en HyP prueba la accesibilidad al disolvente de la cadena lateral de prolina. Las Ki de los derivados respectivos eran casi idénticas a la del tipo silvestre, indicando que los efectos sobre el esqueleto peptídico son despreciables, pero demostrando también que la cadena lateral es accesible. Para elaborar esto adicionalmente, se sometieron a ensayo dos derivados adicionales de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que contenían una extensión voluminosa en el Y-carbono de la cadena lateral de Pro3 (4Phenyl-Pro, 4BenzylPro). El primero presentaba una conservación sorprendente de potencia, mientras que la del segundo estaba fuertemente afectada, demostrando que la cadena lateral de Pro es accesible, pero limitado a solo distintas modificaciones. A pesar del volumen estérico en estas modificaciones, la estabilidad plasmática era idéntica a la de tipo silvestre. Por lo tanto, estas modificaciones no mejoran la selectividad frente a otras proteasas.

Para probar el efecto del tamaño del anillo de prolina sobre la unión, el análogo de Pro de 4 miembros altamente restringido ácido azetidincarboxílico (Aze), y el anillo de 6 miembros más flexible (ácido pipecólico, Pip) se sustituyeron por Pro3. El Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Aze3 se une a calicreína con la máxima afinidad de todos los derivados hasta ahora, superando la del tipo silvestre por un factor de 3 (figura 14, tabla 13). Parece haber una relación inversa entre el tamaño de anillo y Ki, lo que sugeriría que la restricción conformacional en la posición 3 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 es clave para una molécula de unión fuerte.

La flexibilidad de la cadena lateral de prolina para tolerar grupos voluminosos grandes se subraya por los análogos de prolina bi/tricíclicos Tic, NorHar e Ind (figura 13). Particularmente para los dos últimos casos, las afinidades están todavía dentro del intervalo nanomolar de un dígito.

Finalmente, se buscó probar el requisito de estructura de anillo en Pro3 en conjunto. Con este fin, se eligió ácido aminoisobutírico (Aib, figura 15, tabla 13) que, debido a su doble sustitución de metilo en el carbono alfa, tiene un fuerte efecto estructural sobre los aminoácidos vecinos en la inducción de helicidad a o 310 (Toniolo et al (1993), Biopolymers 33, 1061-72; Karle et al (1990), Biochemistry 29, 6747-56). Notablemente, este aminoácido no cíclico no natural es bien tolerado en lugar de Pro3, a una Ki de 1,2 nM. Por lo tanto, el papel de Pro3 en el farmacóforo WPAR es introducir una restricción en el esqueleto peptídico. Esta restricción puede potenciarse empleando un análogo de prolina con tamaño de anillo reducido (véase Aze3). A la inversa, el anillo de prolina puede reemplazarse con relativa eficiencia por aminoácidos no cíclicos pero inductores de estructura, tales como Aib.

Análogos diversos:

En la tabla 10, se mostraba que la Ser1 en el bucle 1 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 podía N-metilarse con un impacto muy pequeño sobre la potencia (Ki de 0,5 frente a 0,17 nM en WT). Se buscó determinar si esta localización toleraba una sustitución doble grande en el Ca en la posición 1. Con este fin, se reemplazó la Ser1 por Dpg (dipropilglicina) (figura 15). La afinidad de este péptido por calicreína es de 1,1 nM, indicando que la posición 1 es muy flexible para alojar virtualmente cualquier residuo voluminoso. Por lo tanto, esta posición en el bucle 1 podía aprovecharse para la inclusión deliberada de funcionalidades o grupos químicos deseables, incluyendo aminoácidos solubilizantes, radiomarcajes, marcajes de tinte, conectores, sitios de conjugación, etc.

Se ensayaron también varios análogos de alanina en la posición 4. Como ya se ha observado con las N-metil y D-alaninas (tabla 10, 9), la Ala4 es altamente sensible a la orientación estérica en Ca, o a la modificación en el propio esqueleto. Dos derivados más de esta clase subrayan esto, ya que la elongación del esqueleto peptídico en Ala4 (13-Ala4) reduce drásticamente la afinidad (~20 pM). Como se esperaba por D-Ala4, Aib4 reduce la afinidad en casi la misma medida (289 nM, figura 15 y tabla 14). Notablemente, la extensión de la cadena lateral de Ala por un metileno (Aba4) parece mejorar la afinidad por calicreína.

Finalmente, se reemplazó la cisteína central (Cys2) por un análogo más voluminoso y más restringido, penicilamina (Pen, figura 15) con la esperanza de aumentar la estabilidad proteolítica debida al acceso espacial reducido al punto de reconocimiento de proteasa Arg5 vecino. De hecho, la estabilidad en plasma de rata se mejoró ligeramente, sin embargo, la potencia caía significativamente, subrayando la importancia de la integridad completa de este residuo conector del andamiaje estructural.

Combinación de potenciación de la estabilidad plasmática y potenciación de la potencia de aminoácidos no naturales en un compuesto principal bicíclico único

Las sustituciones no naturales en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que retenían una potencia apreciable y la máxima estabilidad en plasma de rata (determinada por el procedimiento N.° 1) eran las variantes de Arg5 homoarginina (HomoArg5), 4-guanidilfenilalanina (4GuanPhe5) y N-metilarginina (NMeArg5). Las sustituciones no naturales en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que aumentaban la potencia en comparación con el péptido de tipo silvestre eran el análogo de Pro3 ácido azetidincarboxílico (Aze3) y el análogo de Ala4 ácido 2-aminobutírico (Aba4). Por lo tanto, se combinaron Aze3 y Aba4 con los promotores de estabilidad a proteasas HomoArg5, 4GuanPhe5 y NMeArg5 para determinar si esto produciría candidatos peptídicos con alta estabilidad plasmática y potencia aumentada.

Las tablas 15 y 16 presentan las afinidades de las diversas construcciones, junto con las estabilidades plasmáticas. En primer lugar, la determinación cuantitativa de las semividas en plasma de rata (4a columna, tabla 15) de péptidos que contienen análogos de arginina reveló que la N-metilación de Arg5 era la más potente en la protección del péptido (t^{i / 2} >20 h), seguida de HomoArg5 y GuanPhe5. El fuerte efecto protector de la N-metilación de Arg no es quizás sorprendente, ya que previene directamente la hidrólisis del enlace peptídico. Tras la inclusión de Aze3 en estos compuestos, podía potenciarse la afinidad de estos péptidos en todos los casos, haciendo a Ac-(06-34-18) Aze3 HomoArg5 y Ac-(06-34-18) Aze3 NMeArg5 candidatos atractivos para desarrollo posterior (tabla 15, figura 16). El efecto potenciador de la afinidad de Aba4 no pudo reproducirse en el contexto de Aze3 ni ninguno de los análogos de arginina, ya que los valores de Ki eran mayores que los observados sin Aba4. Por lo tanto, los efectos potenciadores de la potencia de Aze3 son independientes del tipo de sustitución de arginina, mientras que aquellos de Aba4 probablemente no.

Finalmente, se reduce significativamente la actividad hacia calicreína de rata de estos péptidos (tabla 15). Sin embargo, estos valores son relativos y no cuantitativos en esta etapa, ya que la preparación de proteína calicreína de rata no es trivial y contenía impurezas.

Ejemplo 6: Potenciación de la estabilidad plasmática del compuesto principal bicíclico de calicreína FPYR libre de Trp y potenciación de la afinidad por Aze3

A partir del resultado de selección de los ejemplos 1-4, se descubrieron varias secuencias semejantes a Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que tenían una alta abundancia, pero contenían motivos WPAR alterados. Estos eran WPSR y FPYR. El último en particular es interesante ya que carece de triptófano sensible a la oxidación.

Se sintetizaron los biciclos que contenían WPSR, FPYR, WPYR y FPAR y se compararon con el péptido original WPAR (tabla 21).

Como se esperaba, ninguno de los péptidos presentaba una estabilidad plasmática significativamente diferente. El reemplazo de Trp2 por Phe2 provoca una reducción de 40 veces de Ki, subrayando el requisito de la cadena lateral de Trp2 más voluminosa. Sin embargo, esta reducción puede compensarse reemplazando Ala4 por Tyr4 (dando el motivo FPYR), de modo que la afinidad aumenta de nuevo a casi la de la secuencia WPAR de tipo silvestre (Ki = 0,46 nM). Por lo tanto, existe una interacción cooperativa entre los residuos en la posición 2 y posición 4 del biciclo Ac-06-34-18(TMB)-NH2. Dada la alta afinidad de unión a diana y la falta de Trp2 en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4, se investigó este candidato para aumentar la semivida en plasma de rata empleando el enfoque descrito en el ejemplo anterior. Además, se investigó la interacción entre Phe2 y Tyr4 al sustituir estos residuos por análogos aminoacídicos no naturales.

Sustituciones no naturales de Phe2ITvr4 en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4

Se realizó un conjunto no exhaustivo de síntesis que incorporan reemplazos en Phe2 o Tyr4 en el compuesto principal Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4. Se eligieron aminoácidos no naturales del mismo conjunto que en la figura 12, y se resumen los datos de afinidad en la tabla 22.

Aquí, la sustitución con cualquiera de los aminoácidos sometidos a ensayo es generalmente bien tolerada, independientemente de si la cadena lateral es una entidad heteroaromática (3Pal, 4Pal), aromática y voluminosa (1Nal, 2Nal, 4, 4-BPal) o cicloalifática (Cha). 3Pal es bien tolerado en la posición 2 (Ki = 0,91), lo que es interesante ya que Pal contiene un grupo ionizable (es decir, que podría aprovecharse para formulación). Sin embargo, parece que la combinación Phe2/Tyr4 original sigue siendo la más potente.

Estabilización de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4 en plasma de rata y efecto de la sustitución de ácido azetidin-carboxílico 3

Se preparó Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4 con sustituciones de homoarginina, 4-guanidilfenilalanina y N-metilarginina, en ausencia y presencia de Aze3. HomoArg/4Guanphe son bien tolerados, con valores de Ki casi idénticos al péptido Phe2Tyr2 original (tabla 23), y se potenció la estabilidad en plasma de rata por un factor de 13 (t^1/2 = 12,2 h, tabla 23, figura 16). Además, los valores de CI50 para calicreína de rata son similares a los del original, indicando que este es un candidato atractivo para estudios in vivo.

La sustitución de Pro3 por Aze3 en el contexto de FPYR produjo de nuevo candidatos peptídicos con afinidad mejorada, de hecho, se generó un péptido con una Ki menor de 1 nM que tendría probablemente una semivida mayor de 20 h en rata (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3Tyr4 NMeArg5).

Ejemplo 7: Mejora de la estabilidad del plasma humano del candidato a compuesto principal biciclo 06-34-18 a través de sustituciones de aminoácidos individuales en el bucle 2

Identificación de His7 como un sitio de reconocimiento importante de proteasas plasmáticas

La estabilidad en plasma de rata y humano de los siguientes péptidos 06-34-18 modificados por el bucle 1 se determinó cuantitativamente usando LC-MS (procedimiento N.° 3, tabla 2). Está claro que las modificaciones químicas (HArg5, 4GuanPhe5, NMe-Arg5) que imparten estabilidad a las proteasas plasmáticas de rata no son eficaces en el contexto proteolítico del plasma humano.

Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4 (denominado péptido de tipo silvestre) se sometió posteriormente a plasma humano, y se analizó la presencia de fragmentos a lo largo del tiempo. Esto se comparó con el perfil de degradación observado en plasma humano utilizando el derivado NMe-Arg5 de 06-34-18 (figuras 18a y 18b). La fragmentación se determinó de acuerdo con el procedimiento N.° 2.

De acuerdo con la información de espectrometría de masas, la hidrólisis endo-proteolítica tiene lugar en el lado N y/o C-terminal de His7 en la secuencia 06-34-18, y posteriormente extrae Leu6 (a través de una actividad exo-proteolítica) o His7-Gln8 (a través de una actividad exo-proteolítica) o los tres residuos juntos. A partir de la naturaleza de los fragmentos observados, es probable que el evento de hidrólisis endoproteolítica inicial tenga lugar en el enlace peptídico entre Leu6 y His7, en lugar de entre His7 y Gln8. Además, se observa el mismo patrón de fragmentación si el punto de reconocimiento de la proteasa plasmática de rata en Arg5 se bloquea con N-metilación (figura 18b), lo que indica que la especificidad proteolítica del plasma humano es distinta a la de la rata.

Evaluación sistemática del papel de los residuos del bucle 2 y estabilización contra las proteasas plasmáticas.

Posteriormente, se evaluó el papel de cada uno de los residuos del bucle 2 en términos de sus efectos sobre la estabilidad del plasma humano y la potencia de la calicreína humana.

Utilizando enfoques experimentales resumidos parcialmente en la sección de antecedentes de la invención, se realizó un barrido completo de 2 aminoácidos en el bucle mediante

1) reemplazo de cada uno de los aminoácidos del bucle 2 con alanina para eliminar la cadena lateral que sirve como punto de reconocimiento para la proteasa o las proteasas

2) reemplazo de cada uno de los aminoácidos del bucle 2 con sus homólogos enantioméricas D-aminoacídicas para oponerse estéricamente al acceso por la proteasa o proteasas degradativas

3) reemplazo de algunos de los aminoácidos del bucle 2 por D-alanina, para oponerse estéricamente al acceso a los enlaces peptídicos por la proteasa o proteasas

Los datos de potencia para cada variante se resumen en las tablas 3a, 3b y 3c, respectivamente.

1) Barrido de alanina de los residuos del bucle 2

La tabla 3a muestra que la modificación de His7 con Ala7 parece reducir la degradación proteolítica en el segundo bucle, ya que los fragmentos -L, -HQ, -LHQ no fueron detectables. Sin embargo, la actividad proteolítica en el bucle 1 en Arg5 (que se observó previamente solo con plasma de rata) ahora se vuelve detectable. Por lo tanto, está claro que las proteasas plasmáticas humanas son capaces de atacar ambos puntos de reconocimiento proteolítico (Arg5 y His7). Aunque Ala7 parece mejorar la estabilidad en comparación con His7 (como en el péptido de tipo silvestre), su potencia se reduce significativamente (56 veces), lo que lleva a la Kd a 23 nM, que no es lo suficientemente potente para una molécula terapéutica. Sin embargo, los reemplazos restantes de Ala reducen las potencias en grados variables, sin aumentar la estabilidad plasmática (según se determina por la aparición de fragmentos peptídicos biciclo degradados del bucle 2, tabla 3a, cuarta columna). En conjunto, esto subraya el descubrimiento de que la cadena lateral de His7 es el punto de reconocimiento de la proteasa.

2) Barrido de D-aminoácido de residuos del bucle 2

La tabla 3b muestra el efecto de reemplazar cada uno de los aminoácidos por sus homólogos D-enantioméricos. Esta modificación deja intacta la cadena lateral, pero la proyecta en la configuración alternativa en Ca. Los D-aminoácidos en cualquier posición dentro del bucle 2 parecen estabilizar el bucle 2 del péptido a partir de la degradación proteolítica; sin embargo, como se ve con la variante Ala7 anterior, la especificidad cambia ahora al sitio lábil en el bucle 1 (Arg5). El cambio de la hidrólisis a Arg5 dificultó la cuantificación del efecto de la estabilización inducida por D-aminoácidos en el bucle 2, ya que este proceso independiente afecta a la cantidad de material original restante (abordado más adelante). El efecto protector distal de la sustitución D-aminoacídica se ha reconocido en la bibliografía y es probable que funcione reduciendo o impidiendo estéricamente el acceso al enlace hidrolizable (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418). Sin embargo, los D-aminoácidos que se alejan progresivamente del supuesto sitio de reconocimiento de la proteasa His7 (es decir, D-Asp9, D-Leu10) también muestran una menor cantidad de fragmentos correspondientes a una Leucina 6 extraída, que es adyacente a His7.

En particular, la mayoría de las variantes de D-aminoácidos muestran potencias muy reducidas (entre 130 a 9000 veces la reducción de potencia), subrayando la naturaleza tridimensional y estérica de la interacción del péptido con la proteína de calicreína. D-Asp9 parece ser la excepción, ya que se observa un aumento en la estabilidad, mientras que se mantiene la potencia 4 nM (reducción de 9 veces en comparación con WT). Esta modificación podría ser potencialmente una sustitución estabilizadora útil en una molécula terapéutica candidata.

3) Barrido de D-alanina de los residuos del bucle 2

La tabla 3c muestra el efecto de reemplazar unos pocos aminoácidos del bucle 2 seleccionados por D-alaninas. La eliminación de las cadenas laterales y la introducción del bloqueo estérico en Ca debido al grupo metilo actualmente introducido tienen efectos muy perjudiciales en las potencias. No obstante, en dos casos se mantienen las afinidades nanomolares bajas (Ac-(06-34-18) D-Ala9, y Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 D-Ala9). Al igual que con D-Asp9, estas modificaciones podrían ser una sustitución estabilizadora útil en una molécula terapéutica candidata.

Reemplazo de cadenas laterales de aminoácidos en Leu6, His7 y Gln8 con miméticos de aminoácidos Posteriormente, se realizó una campaña de sustitución de aminoácidos de Leu6, His7 y Gln8 para evaluar los requisitos estéricos, de carga y estructurales de estos residuos, y para evaluar su efecto en la reducción del reconocimiento del sitio His7 por las proteasas plasmáticas (se presenta una estructura de bucle 2 en la figura 19a). Los enfoques generales que son adecuados se analizaron previamente en la sección de introducción.

● Sustituciones en la posición 6 en el bucle 2 de 06-34-18

En el residuo Leu6, se buscó introducir una masa voluminosa estérica en Cp del aminoácido, con el objetivo de reducir el acceso de proteasas al enlace escindible entre Leu6 e His7. Las estructuras sometidas a ensayo se muestran en la figura 19b. El efecto sobre la potencia se resume en la tabla 24a. Algunas de las modificaciones muestran una mejora de las afinidades en comparación con el péptido de tipo silvestre, particularmente en el contexto de Ac-(06-34-18) (menos en el contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4). Específicamente, estos son los aminoácidos no naturales fenilglicina (Phg) y ciclohexilglicina (Chg). Todas estas modificaciones parecieron reducir en cierto modo la escisión proteolítica en el segundo bucle, pero el estabilizador más potente demostró ser la terc-butilglicina (tBuGly). Este péptido, Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 tBuGly6, mostró solo la eliminación de Arg5 en el primer bucle cuando se sometió a plasma humano. En conjunto, cualquiera de las modificaciones de Chg, Phg y tBuGly podrían servir para mejorar la estabilidad plasmática en el segundo ciclo. Además, se identificaron dos modificaciones (Chg, Phg) que mejoraban la potencia hacia la calicreína.

● Sustituciones en la posición 7 en el bucle 2 de 06-34-18

En el residuo 7, se estudió el efecto sobre la estabilidad plasmática y la potencia al reemplazar la cadena lateral de histidina empleando los siguientes imitadores: Las piridilalaninas 2Pal, 3Pal, 4Pal son imitadores heteroaromáticos ionizables básicos de la cadena lateral de imidazol. Tienilalanina (Thi), furilalanina (FuAla), ThiAz, 1,2,4 triazolalanina (1,2,4 Triaz), tiazolilalanina (ThiAz) son imitadores heteroaromáticos no cargados de 5 miembros de la cadena lateral de imidazol. His1 Me/His3Me son derivados sustituidos con N-metilo de la cadena lateral de imidazol. Dap, Agb y Agp representan reemplazos de carga positiva de la cadena lateral de imidazol, sin embargo, carecen de una cadena lateral aromática (figura 19c). La tabla 24b resume los datos de potencia. Sorprendentemente, todos los péptidos muestran una estabilidad mejorada hacia las proteasas plasmáticas en el bucle 2, y la degradación visible tuvo lugar solo en el bucle 1 en Arg5. Claramente, una carga positiva en la posición 7 no es suficiente para proporcionar un punto de reconocimiento para las proteasas plasmáticas (Dap, Agp, Agb). Por el contrario, la eliminación de la carga positiva al mismo tiempo que conserva el mimetismo de la cadena lateral del imidazol original también elimina el sitio de reconocimiento proteolítico. A pesar de la imitación muy parecida de algunas de las estructuras al anillo de imidazol original, todos los derivados peptídicos muestran una afinidad significativamente reducida a la calicreína plasmática. Esto indica que la estructura intacta de His 7 es necesaria para unirse a la calicreína con toda su potencia. Los candidatos interesantes que conservaron la baja unión nanomolar fueron la tiazolilalanina, la furilalanina e His1Me.

Los candidatos putativos interesantes podrían ser homohistidina e imidazolilglicina.

● Sustituciones en la posición 8 en el bucle 2 de 06-34-18

El residuo ⁸ (Gln⁸ ) es más distal al sitio de escisión que reside entre Leu⁶ y His7. Se sometieron a ensayo algunas sustituciones (figura 19d y tabla 24c). Los aminoácidos con carga negativa se introdujeron en esta posición para fomentar un puente salino hacia el His7 vecino, lo que podría reducir el reconocimiento de His7 por las proteasas plasmáticas. Se sometió a ensayo una secuencia de bucle 2 adicional que estaba presente en las salidas de selección de fagos, que también carecían de histidina 7. Esta secuencia de bucle 2 era LTTEL (denominada Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Thr7 Thr⁸ Glu9). Adicionalmente, se sometió a ensayo un beta aminoácido en la posición ⁸ (bHGln⁸ , figura 19d). También se sometió a ensayo un aminoácido de carga positiva en esta posición para frustrar potencialmente el reconocimiento proteolítico de His7 y la posterior degradación. Mientras que las potencias de estas moléculas a menudo eran <10 nanomolar, el efecto sobre la estabilización del plasma fue menor. Estas moléculas pueden justificar un estudio cuantitativo adicional para determinar sus efectos precisos sobre la estabilidad del plasma.

Ejemplo 8: Mejora de la estabilidad del plasma humano del candidato a compuesto principal biciclo 06-34-18 a través de modificaciones del esqueleto de aminoácido en el bucle 2

La modificación del esqueleto de aminoácido presenta un medio ampliamente reconocido por el cual el esqueleto peptídico puede protegerse de la hidrólisis de proteasas (para las revisiones, véanse Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, y Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Un procedimiento bien establecido en la técnica es el N-alquilato, por ejemplo, N-metilato, el Na de los aminoácidos. La tabla 25a muestra el efecto del reemplazo sistemático de los esqueletos de amida de bucle dos con sus homólogos metilados en Na. En principio, esta es una modificación protectora de la hidrólisis muy eficaz, ya que no solo el propio enlace peptídico está protegido de la hidrólisis proteolítica, sino también porque la mayor parte del grupo metilo en el Na tiene efectos protectores sobre los enlaces peptídicos vecinos. De hecho, pueden observarse efectos fuertemente protectores sobre la proteólisis del bucle ² , sin embargo, las potencias disminuyen invariablemente en un factor de 100 o más. Al igual que con el reemplazo D-aminoacídico, la N-alquilación protege el sitio de escisión en His7 incluso cuando está presente en Asp9 o Leu10.

Otro medio por el cual se puede modificar el esqueleto peptídico es mediante la N-alquilación del Na con una cadena lateral aminoacídica apropiada (denominada peptoide). La cadena lateral de homohistidina se introdujo en el Na de His7, mientras que al mismo tiempo eliminaba la cadena lateral en Ca de His7, produciendo una N-alquilglicina. La estructura de este derivado se muestra en la figura 20a (denominada N-His7), dentro del contexto del segundo bucle completo de 06-34-18.

En un intento por modificar la estructura del propio esqueleto peptídico, se introdujo una forma reducida del enlace peptídico entre Leu⁶ y His7 (figura 20b). Aquí, Leu⁶ se reemplazó por Ala⁶ , y el carbonilo de este residuo se redujo a metileno, produciendo un enlace que carece por completo del enlace peptídico nativo. Este derivado se denomina "amida reducida" o "enlace pseudopeptídico" y se denomina YCH²NH. Debido a la ausencia del carbonilo en esta posición, el péptido no puede hidrolizarse en esta posición y debe inferir características de estabilidad de proteasas favorables al péptido.

En el ensayo de plasma, ambos derivados peptídicos (Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 N-His y Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Ala(^CH²NH)⁶ ) mostraron una estabilidad significativamente mejorada en el bucle 2. Los fragmentos observados correspondieron únicamente a la degradación en el bucle 1, en Arg5. Los datos de potencia se resumen en la tabla 25b. Como se esperaba, el derivado de N-His mostró una unión fuertemente reducida. Sin embargo, el péptido de pseudo amida Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Ala(^CH2NH)6) conservó una potencia muy buena a una Kd de 1,5 nM. Ejemplo 9: Generación de compuestos principales de péptidos bicíclicos de reactividad cruzada potentes, de rata y humanos estables en plasma mediante modificación química selectiva tanto en el bucle 1 como en el bucle 2

A partir de los dos ejemplos anteriores, se identificaron varias modificaciones del bucle 2 que mejoraron la estabilidad de la proteasa en el bucle 2, mientras mostraban una buena potencia. La retención de una potencia apropiada hacia la calicreína plasmática de rata es deseable para establecer PK/PD en modelos animales. La potencia de rata comparativa se resume para los candidatos adecuados con estabilidad mejorada en bucle 2 en la tabla 26a. La mayoría de las moléculas muestran potencias <100 nM hacia la calicreína plasmática de rata.

En los ejemplos 1-6, se han descrito procedimientos por los cuales el bucle 1 de 06-34-18 puede estabilizarse contra las proteasas plasmáticas. Estas modificaciones ventajosas se combinan con las modificaciones que mejoran la estabilidad plasmática en el bucle 2 (ejemplos 7, 8). Se prepararon y se evaluaron varios candidatos representativos para determinar la estabilidad en plasma humano/rata, así como la potencia hacia la calicreína plasmática humana/rata (tabla 26b).

En particular, la mayoría de los péptidos muestran, cuando se combinan con los modificadores del bucle 1, mejores potencias hacia la calicreína humana y de rata que los péptidos con los modificadores del bucle 2 en solitario (tabla 26a). La mayoría de las potencias se encuentran en un intervalo aceptable para fines terapéuticos y de PK/PD (véanse los datos de calicreína humana y de rata, tabla 26b).

Debido a la introducción de HArg5 en lugar de Arg5 en el bucle 1, y debido a la introducción de modificaciones en el bucle 2 que redujeron la proteólisis en el sitio de His 7, los péptidos que se muestran en la tabla 26a y 26b deberían mostrar una estabilidad mejorada en plasma humano y de rata.

La estabilidad plasmática se evaluó comparativamente como anteriormente utilizando el ensayo MALDI TOF (procedimientos N.° 1 y N.° 2), y se observó la formación de fragmentos hidrolizados peptídicos a lo largo del tiempo (para la estabilidad de tipo silvestre, véanse las figuras 18a, 21a, 21b). En comparación con el péptido de tipo silvestre, los péptidos multivariantes Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala (^CH2NH) 6 (estabilidad en plasma humano: figura 21d, estabilidad en plasma de rata: figura 21 e) y Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 (estabilidad en plasma humano: figura 21c) muestra una estabilidad notablemente mejorada tanto en plasma humano como de rata. En conjunto, esto muestra que las modificaciones adecuadas tanto en el bucle 1 como en el bucle 2 de 06-34-18 se pueden combinar para producir péptidos bicíclicos altamente potentes, con reactividad cruzada y estables en plasma, que presentan un perfil adecuado para fines terapéuticos.

Ejemplo 10: Propiedades farmacocinéticas in vivo ventajosas de dos péptidos del compuesto principal. Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArq5 Ala(^CH2NH)6 y Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9

Los péptidos Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 (que contiene las modificaciones de mejora de la afinidad Aze3 y la estabilidad de la proteasa en plasma HArg5 y la estabilidad de la proteasa en plasma que redujo el enlace amida entre Ala6 y His 7 en el bucle 2) y Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 (que contiene la modificación de mejora de afinidad Aze3 y las modificaciones de mejora de la estabilidad de la proteasa en plasma HArg5 y D-Asp9 en el bucle 2) se seleccionaron para la evaluación farmacocinética en ratas. La estructura química completa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 se muestra en la figura 22.

Las tasas de depuración de la circulación de rata para ambos péptidos se evaluaron y se compararon con un péptido de control que estaba compuesto por la secuencia Ac-(06-34-18) (TMB) cuyos aminoácidos se reemplazaron por cada uno de los respectivos D-enantiómeros (siendo de este modo la secuencia "(Ac-cswparclhqdlc-NH2(TMB)). Este péptido de control tiene una composición atómica y de secuencia idéntica, conserva propiedades fisicoquímicas similares, carece de cualquier potencia hacia la diana de calicreína y, lo que es más importante, es completamente resistente a actividades proteolíticas. Por lo tanto, la depuración de la circulación de rata del péptido de control todo D Ac-06-34-18 se realiza principalmente en forma renal, ya que la depuración impulsada proteolíticamente está ausente. Cualquier biciclo optimizado de inhibición de la calicreína estabilizado por proteasa y potente que se basa en la secuencia 06-34-18, por lo tanto, debe depurarse de la circulación de la rata a una velocidad similar a la del péptido de control todo D 06-34-18.

Los péptidos se aplicaron como bolos intravenosos en solución tamponada con PBS a 1,02 mg/ml (que contenía DMSO al 2,9%) a 5,2 mg/kg a ratas Sprague Dawley, y se tomaron muestras de sangre de cada animal a través de cánulas de vena alta permanentes temporales a los 5, 10, 20, 30, 60, 120 y 240 minutos después de la dosis, y se transfirió a tubos con EDTA para la generación de plasma. Los datos se adquirieron para el péptido "Ac-06-34-18 todo D" de 3 ratas, para "Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6" de dos ratas, y para "Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9" de dos ratas.

Las muestras de plasma se trataron luego con 3 volúmenes de una mezcla 1:1 de acetonitrilo y metanol, las proteínas precipitadas se eliminaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se analizó mediante UpLC-MS/MS.

La cuantificación del contenido de péptidos en las muestras se realizó mediante referencia a una línea de calibración preparada en el plasma de rata de control. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron mediante análisis no compartimental utilizando el paquete de software PK Solutions 2.0 de Summit Research Services.

El péptido (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 mostró una semivida de eliminación de 48 minutos, mientras que el péptido de control todo D 06-34-18 se depuró en una semivida de 54 minutos. Los volúmenes de distribución para los dos péptidos fueron comparables (tabla 27, figura 23). Por lo tanto, el péptido farmacológicamente activo (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 es tan estable como el péptido de control todo D 06-34­ 18 estable a la proteasa farmacológicamente inerte, lo que indica que (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 tiene propiedades favorables para su desarrollo adicionalmente como producto terapéutico (figura 23). Sin embargo, el péptido Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 se eliminó más rápidamente, con una semivida de eliminación de ~27 minutos.

Los parámetros farmacocinéticos intravenosos para los 3 péptidos se resumen en la tabla 27.

Los resultados subrayan la estabilidad proteolítica mejorada del péptido Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 en la circulación in vivo de la rata. La depuración a 5,8 ml/min/kg está muy cerca de la tasa de filtración renal publicada en ratas (~8-9 ml/min/kg), lo que indica que la depuración impulsada por proteasa plasmática de este péptido bicíclico está prácticamente ausente [Jobin J, Bonjour JP, (1985) Am J Physiol.;248(5 Pt 2):F734-8].

A menos que se indique de otro modo, pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Los procedimientos, dispositivos y materiales adecuados para dichos usos se describen anteriormente.

Tablas

Tabla 1:

Potencias, estabilidad en plasma de rata y reactividad cruzada de especies de Ac-06-34-18 como se describe en el documento PCT/EP2012/069898. ''Determinado de acuerdo con el procedimiento N.° 1. 2Determinado de acuerdo con el procedimiento N.° 3. Tabla reproducida del documento PCT/EP2012/069898.

Péptido Ki (nM) (calicreína Observable t^{1 /2}(h) Ki (nM)

humana) en plasma en (calicreína

de rata, en plasma de rata) días¹ de

rata²

Ac-(06-34-18) tipo silvestre 0,17 2,0 2,3 1,8

Ac-(06-34-18) HomoArg5 2,1 >10 10,7 101

Ac-(06-34-18) 4GuanPhe5 0,34 >10 2,8 3,0

Ac-(06-34-18) NMeArg5 3,5 >10 >20 119,7

Ac-(06-34-18) Aze3 0,14 >10 nd 14,8 HomoArg5

Ac-(06-34-18) Aze3 0,17 >10 nd nd

4GuanPhe5

Ac-(06-34-18) Aze3 NMeArg5 1,3 >10 nd 70,2

Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 tipo 0,46 2 0,9 7,6

silvestre

Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 0,77 >10 12,2 16,2 HomoArg5

Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 0,40 >10 5,0 0,6 4GuanPhe5

Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 3,56 >10 >20 64,3

NMeArg5

Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 0,12 nd nd 3,0

Tyr4 HomoArg5

Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3Tyr4 0,36 nd nd 1,2 4GuanPhe5

Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3Tyr4 0,97 nd nd 31,4

NMeArg5

Tabla 2:

Resumen de las estabilidades en plasma ex vivo de rata y humano de diferentes derivados peptídicos 06-34-18 modificados con el bucle 1, según se determina por el procedimiento N.° 3.

Tabla 3a:

Barrido de alanina en el bucle 2. Las potencias resultantes se comparan con WT, y se observan

^

Tabla 3b:

Barrido de D-aminoácidos en el bucle 2. Las potencias resultantes se comparan con WT, y se

Tabla 3c:

Barrido de D-alanina en el bucle 2. Las potencias resultantes se comparan con WT. Los fragmentos fueron similares a los observados con los reemplazos completos de D-aminoácidos (tabla 3b). Cabe apreciar que también se evaluaron tanto Ac-(06-34-18) como Ac-(06-34-18) Phe2 T r4.

Tabla 4: Pé tidos 5x5

Tabla 5: 06-34 - Sustituciones basadas en la identificación de residuos no críticos con aminoácidos naturales.

*: La numeración de los residuos es de izquierda a derecha, donde los residuos 1-5 están en el bucle 1, y los residuos 6-10 están en el bucle 2.

Tabla 6: 06-34 - Sustituciones basadas en la identificación de residuos no críticos con aminoácidos N- m il .

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

Efectos comparativos de la sustitución de D-aminoácidos en la potencia y la estabilidad en plasma de rata Péptido Ki (nM) (calicreína Observable en plasma de rata, en

Ac- 06-34-18 tipo 0,17 2

silvestre

Ac-(06-34-18) D-Trp2 7558 2

Ac-(06-34-18) D-Pro3 680 3

Ac-(06-34-18) D-Ala4 1203 >10

Ac-(06-34-18) D-Arg5 52 >10

Ac-(06-34-18) D-Cys2 234 >10

Tabla 10

Efectos comparativos de la N-metilación de los residuos del bucle 1 y Cys2 en la potencia y la estabilidad en plasma de rata.

h í

( ) y

Tabla 11

Efectos comparativos de los análogos de arginina en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 sobre la potencia y la estabilidad. Obsérvese que la modificación A Arg no mostró ninguna inhibición hasta el péptido 100 pM.

Pé tid Ki ( M) ( li í Ob bl l d t

Tabla 12

Efectos de afinidad comparativos de aminoácidos hidrófobos que sustituyen a Trp2 en Ac-06-34-18(TMB)-NH2

Tabla 13

Afinidades comparativas obtenidas para derivados de prolina con sustituyentes gamma-carbono, análogos de diferentes tamaños de anillos, derivados bi/tricíclicos y aminoácidos restringidos tales como Aib

Tabla 14

Efectos comparativos de sustituciones varias de Ser1, Ala4 y Cys2

y

Tabla 15

Mejora comparativa en la potencia inducida por la incorporación de Aze3 en candidatos estabilizados por plasma. 1 estabilidades comparativas estimadas según el procedimiento N.° 1. 2 la verdadera semivida de las estabilidades de los péptidos en plasma de rata se determinó de acuerdo con el procedimiento N.° 3.3 los valores de CI50 son relativos, no absolutos.

Tabla 16

Efecto sobre la potencia de la inclusión de Aba4 en péptidos que contienen Aze3 y las modificaciones de estabilización en plasma NMeArg5, HomoArg5 y 4GuanPhe5.

Tabla 17

Se identificaron 42 aglutinantes de calicreína únicos a partir de selecciones utilizando un motivo WPAR aleatorio en las posiciones 2, 3, 4 y 5 dentro de la secuencia 06-34-03. Las secuencias se clasificaron según la unión a calicreína y se anotó la abundancia relativa en las salidas de selección totales.

Tabla 19

Los 50 mejores aglutinantes de calicreína que contienen un motivo WPAR fijo. La secuencia WPAR se fijó en una genoteca de biciclos con las posiciones 1, 6, 7, 8, 9 y 10 al azar. Las secuencias de salida de selección de calicreína se aislaron y se ensayaron para determinar la unión a calicreína. Las secuencias se clasificaron de acuerdo con la unión a calicreína. La secuencia del péptido 06-34-03 se aisló de la selección y se resalta en rojo. Las tendencias son visibles en el segundo bucle de péptidos de unión a calicreína que contienen WPAR.

Tabla 20

Las secuencias de salida de las selecciones de calicreina con WPAR fijo en el primer bucle, y sus señales asociadas de ensayo de unión a calicreina, se agruparon de acuerdo con su derivación del motivo "THxxL" (A), o el motivo "xHxDL" (B). Se calculó la señal de ensayo de unión promedio para todos los miembros de un grupo dado. Los grupos que contienen precisamente el motivo dado se resaltan en verde; también se muestran ejemplos de grupos con un cambio más o menos alejado del motivo.

Tabla 21

Afinidades y estabilidades de las variantes de motivo WPAR.

( ) ,

Tabla 22

Efecto de las sustituciones en Phe2/Tyr4 con análogos hidrófobos

( ) y ,

Ac-(06-34-18) Cha2 Tyr4 | 1,87

Tabla 23

Resumen del efecto de las sustituciones de Arg5 y Aze3 en Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4. 1 estabilidades comparativas estimadas según el procedimiento N.° 1.2 la verdadera semivida de las estabilidades de los péptidos en plasma de rata se determinó de acuerdo con el procedimiento N.° 3. 3 los valores de CI50 son relativos, no absolutos.

Tabla 24a:

Efecto de las sustituciones de aminoácidos individuales en la posición 6. Las modificaciones se sometieron a ensayo en el contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 (columna izquierda) y Ac-(06-34-18) (columna derecha).

Tabla 24b:

Efecto de las sustituciones de aminoácidos individuales en la posición 7. Las modificaciones se sometieron a ensayo solo en el contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4.

Tabla 24c:

Efecto de las sustituciones de aminoácidos individuales en la posición 8. Las modificaciones se sometieron a ensayo solo en el contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4.

Tabla 25a:

Barrido de a-N-metil aminoácido en el bucle 2. Las potencias resultantes se comparan con WT, y se observan los fragmentos de péptidos observados después de la incubación en plasma humano.

Tabla 25b:

Modificaciones del esqueleto peptídico en el bucle 2.

Tabla 26a:

Las potencias comparativas de la estabilidad de la proteasa plasmática del bucle 2 mejoraron a los candidatos con respecto a la calicreína plasmática humana y de rata.

Tabla 26b:

Potencias comparativas de los derivados de 06-34-18 modificados en el bucle 1 y el bucle 2. Cabe apreciar la inclusión de las modificaciones de Aze3 (mejora de la afinidad) y HArg5 (mejora de la estabilidad en plasma) en el bucle 1, y las modificaciones de la mejora de la estabilidad en el bucle 2.

Tabla 27:

Parámetros farmacodinámicos de (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6, Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9, y Ac-(06-34-18) todo D de control en rata. Debido a las concentraciones de péptidos divergentes de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 en dos ratas individuales, las tasas de depuración y los volúmenes de distribución no se pudieron calcular con confianza.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un ligando peptídico específico para calicreína humana que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un andamiaje molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de tal forma que al menos dos bucles polipeptídicos se forman en el andamiaje molecular, en el que los bucles del ligando peptídico comprenden cinco aminoácidos y un bucle comprende el motivo G^rA(^CH² NH)H^Q/^TxLG^r, donde G^r es un grupo reactivo.

2. El ligando peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polipéptido comprende un primer bucle que comprende el motivo G^rxWPARG^r o G^rxFPYRG^r y un segundo bucle que comprende el motivo G^rA(YCH² NH)H^Q/^r xLG^r.

3. Un ligando peptídico de acuerdo con la reivindicación 2, donde, en el primer bucle, P se reemplaza con ácido azetidin carboxílico; y/o en el primer bucle, R se reemplaza con N-metil arginina u homoarginina o guanidilfenilalanina.

4. Un ligando peptídico de acuerdo con la reivindicación 3, donde el polipéptido comprende un primer bucle que comprende el motivo G^rxFPYRG^r, donde P se reemplaza con ácido azetidin carboxílico y/o R se reemplaza con N-metil arginina u homoarginina o guanidilfenilalanina.

5. El ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde G^r es cisteína.

6. El ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende: Cys Ser1 Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Cys Ala(^CH² NH⁾⁶ His7 Gln8 Asp9 Leu10 Cys.

7. El ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

8. El ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que está unido a un anticuerpo o un fragmento del mismo.

9. Una composición que comprende el ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 junto con un vehículo farmacológicamente apropiado.

10. El ligando peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la prevención, supresión o tratamiento de estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o viral, trastornos oftálmicos y trastornos autoinmunes.

11. El ligando peptídico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, que se usa para prevenir, suprimir o tratar trastornos oftálmicos.

12. El ligando peptídico para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde los trastornos oftálmicos incluyen trastornos oftálmicos exudativos y/o inflamatorios, trastornos relacionados con la alteración de la permeabilidad y/o integridad de los vasos retinianos, trastornos relacionados con la rotura de microvasos retinianos que conduce a hemorragias focales, enfermedades del fondo del ojo, enfermedades de la retina y las enfermedades del frente del ojo, y se seleccionan de: degeneración macular relacionada con la edad (ARMD), degeneración macular exudativa (también conocida como degeneración macular relacionada con la edad "húmeda" o neovascular (DMRE húmeda), edema macular, degeneración macular disciforme envejecida, edema macular cistoide, edema palpebral, edema retiniano, retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda, coriorretinopatía serosa central, coriorretinopatía, neovascularización coroidea, maculopatía neovascular, glaucoma neovascular, retinopatías arteriales y venosas obstructivas (por ejemplo, oclusión venosa retiniana u oclusión arterial retiniana), oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de rama venosa de la retina, cambios de fondo hipertensivo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales retinianas, enfermedad de Coats, telangiectasia parafoveal, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria retiniana central, oclusión de la rama arterial retiniana, enfermedad de la arteria carótida (EAC), angitis de rama helada, retinopatía de células falciformes y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, edema macular que se produce como resultado de etiologías tal como una enfermedad (por ejemplo, edema macular diabético), lesión ocular o cirugía ocular; isquemia o degeneración de la retina producida, por ejemplo, por una lesión, traumatismo o tumores, uveítis, iritis, vasculitis retiniana, endoftalmitis, panoftalmitis, oftalmia metastásica, coroiditis, epitelitis pigmentaria de la retina, conjuntivitis, ciclitis, escleritis, episcleritis, neuritis óptica, neuritis óptica retrobulbar, queratitis, blefaritis, desprendimiento de retina exudativo, úlcera corneal, úlcera conjuntival, queratitis numular crónica, queratitis de thygeson, úlcera de mooren progresiva, una enfermedad inflamatoria ocular causada por una infección bacteriana o viral, y por una operación oftalmológica, una enfermedad inflamatoria ocular causada por una lesión física en el ojo, un síntoma causado por una enfermedad inflamatoria ocular que incluye picazón, brote, edema y úlcera, eritema, eritema exudativo multiforme, eritema nodoso, eritema anular, esclerodermia, dermatitis, edema angioneurótico, edema laríngeo, edema glótico, laringitis subglótica, bronquitis, rinitis, faringitis, sinusitis, laringitis u otitis media.