CN103396482A - 一种前白蛋白纳米抗体、其编码序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种前白蛋白的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种前白蛋白纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的前白蛋白的纳米抗体的VHH链或本发明所述的前白蛋白纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达前白蛋白的纳米抗体。还公开了该前白蛋白纳米抗体用于检测前白蛋白的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于前白蛋白检测试剂的研发。

Description

一种前白蛋白纳米抗体、其编码序列及应用

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对于前白蛋白的纳米抗体。 

背景技术

前白蛋白(Prealbumin,PA)，分子量5.4万，由肝细胞合成，在电泳分离时，常显示在白蛋白的前方，其半衰期很短，仅约12小时。因此，测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性；除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降。与此同时，目前市场上用于检测前白蛋白的试剂盒的工作原理主要通过一种针对于前白蛋白的抗体来实现的，但是这种传统意义上的抗体稳定性差、灵敏度低、生产成本高，所有因素均限制了对于前白蛋白的检测。1993年比利时科学家首次在Nature报道：在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，而且更让人惊喜的是，这些缺失轻链的“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，另外不像scFv那样互相沾粘，甚至聚集成块。这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念，进行的抗体工程革命，而研发的最新和最小的抗体分子，分子量只是普通抗体的1/10，所以VHH也称Nanobody（纳米抗体）；与此同时纳米抗体化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，容易偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发前白蛋白检测试剂具有广阔的前景。 

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对前白蛋白表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。 

技术方案：为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种前白蛋白的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；或SEQ ID NO：5所示的FR1，SEQ ID NO：6所示的FR2，SEQ ID NO：7所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4； 

或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：9所示的FR2，SEQ ID NO：10所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4；或SEQ ID NO：12所示的FR1，SEQ ID NO：13所示的FR2，SEQ ID NO：14所示的FR3，SEQ ID NO：15所示的FR4；或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：16所示的FR2，SEQ ID NO：17所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4；或SEQ ID NO：18所示的FR1，SEQ ID NO：19所示的FR2，SEQ ID NO：20所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4；或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：21所示的FR2，SEQ ID NO：22所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4； 

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列： 

SEQ ID NO：23所示的CDR1，SEQ ID NO：24所示的CDR2，SEQ ID NO：25所示的CDR3；或SEQ ID NO：26所示的CDR1，SEQ ID NO：27所示的CDR2，SEQ ID NO：28所示的CDR3；或SEQ ID NO：29所示的CDR1，SEQ ID NO：30所示的CDR2，SEQ ID NO：31所示的CDR3；或SEQ ID NO：32所示的CDR1，SEQ ID NO：33所示的CDR2，SEQ ID NO：34所示的CDR3；或SEQ ID NO：35所示的CDR1，SEQ ID NO：36所示的CDR2，SEQ ID NO：37所示的CDR3；或SEQ ID NO：38所示的CDR1，SEQ ID NO：39所示的CDR2，SEQ ID NO：40所示的CDR3；或SEQ ID NO：41所示的CDR1，SEQ ID NO：42所示的CDR2，SEQ ID NO：43所示的CDR3。 

优选地，所述的前白蛋白的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或50所示的氨基酸序列。 

本发明第二方面，一种前白蛋白纳米抗体，它针对前白蛋白表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或50所示氨基酸序列的VHH链。 

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的前白蛋白的纳米抗体的VHH链，或本发明所述的前白蛋白纳米抗体。 

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56或57。 

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56或57所示的核苷酸序列。 

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体。 

本发明的第六方面，提供了本发明所述的前白蛋白纳米抗体用于检测前白蛋白的用途。 

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的前白蛋白免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于前白蛋白的纳米抗体基因库，试验中将前白蛋白偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对前白蛋白特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。 

附图说明

图1是前白蛋白抗原SDS-聚丙烯凝胶电泳图； 

1：为蛋白分子标准；2：前白蛋白10微升；3：BSA1微克；4：BSA2.5微克；5：BSA5微克；6：BSA7.5微克；7：BSA10微克；8：BSA12.5微克；9：BSA15微克 

图2是纳米抗体的基因电泳图；1、100bp的DNA分子标准2：纳米抗体基因电泳带 

图3是对于所构建的前白蛋白特异性的单域抗体文库进行的菌落PCR电泳图； 

1：DNA分子标准2～25：在所建的单域抗体文库中随机挑取的单克隆检测文库的插入率； 

图4是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图； 

1：前白蛋白偶联在酶标板上2：纳米抗体3：鼠抗HA抗体4：山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体5、碱性磷酸酶显色液 

图5是表达的前白蛋白的纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图 

1：蛋白分子标准2：破菌后蛋白总的粗提液样品3：总的蛋白粗提液过镍柱后的样品4：含有50毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品5：含有100毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品6～7：含有250毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品8～10：含有500毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品 

具体实施方式

本发明首先将人血液中提取的前白蛋白免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了前白蛋白特异的单域重链抗体文库。将前白蛋白偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得前白蛋白的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选前白蛋白免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

实施例1：针对于前白蛋白的纳米抗体文库的构建： 

（1）由人血液中提取的前白蛋白利用SDS-PAGE电泳胶检测该蛋白的纯度并利用BSA法对前白蛋白定量，图1从左到右各蛋白带分别是：第一为蛋白分子标准，第二为样品前白蛋白，第三至第九为浓度梯度变化的BSA，梯度变化的BSA用于前白蛋白的定量；图1显示前白蛋白的纯度达到了99%以上，同时用于免疫的前白蛋白的浓度为500微克每毫升，每次免疫将20mg前白蛋白与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA。（3）将提取的 RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链，结果如图2显示，该片段的大小约为500bP。通过数次免疫新疆双峰驼，我们提取骆驼外周血淋巴细胞总RNA，并反转录合成cDNA，经过两步PCR成功的获得编码纳米抗体的基因，从左到右的DNA条带分别是：第一为100bP的分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μgVHH并连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建前白蛋白的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1.85*10⁸；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率约95%，图3显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：只有1颗为空载体，即我们的插入率已达到95%以上。 

实施例2：针对前白蛋白的纳米抗体筛选过程： 

（1）将溶解在100毫摩pH8.2NaHCO₃中的前白蛋白200微克偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入100微升0.1%酪蛋白，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μl噬菌体（8*10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与前白蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中前白蛋白特异抗体的目的。该实验的原理模式图如图4所示。 

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆： 

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse  alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。 

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有7株不同的抗体。其抗体的VHH链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或50所示。 

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化： 

（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有100微克每毫升氨苄青霉素和2%葡萄糖LB固体培养基的板上，37℃过夜，（2）挑选单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，（3）接种1ml的过夜菌种至330mlTB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，（4）第二天，离心收菌，（5）将菌体利用渗透法使菌体蛋白释放出来以获得抗体粗提液，（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250毫摩尔，500毫摩尔）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图5所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二为破菌后蛋白总的粗提液样品，第三为总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，第四为含有50毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第五为含有100毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第六，七为含有250毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品，第八、九、十为含有500毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (8)

1.一种前白蛋白的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列： 

SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4； 

或SEQ ID NO：5所示的FR1，SEQ ID NO：6所示的FR2，SEQ ID NO：7所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4； 

或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：9所示的FR2，SEQ ID NO：10所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4； 

或SEQ ID NO：12所示的FR1，SEQ ID NO：13所示的FR2，SEQ ID NO：14所示的FR3，SEQ ID NO：15所示的FR4； 

或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：16所示的FR2，SEQ ID NO：17所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4； 

或SEQ ID NO：18所示的FR1，SEQ ID NO：19所示的FR2，SEQ ID NO：20所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4； 

或SEQ ID NO：8所示的FR1，SEQ ID NO：21所示的FR2，SEQ ID NO：22所示的FR3，SEQ ID NO：11所示的FR4； 

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列： 

SEQ ID NO：23所示的CDR1，SEQ ID NO：24所示的CDR2，SEQ ID NO：25所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：26所示的CDR1，SEQ ID NO：27所示的CDR2，SEQ ID NO：28所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：29所示的CDR1，SEQ ID NO：30所示的CDR2，SEQ ID NO：31所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：32所示的CDR1，SEQ ID NO：33所示的CDR2，SEQ ID NO：34所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：35所示的CDR1，SEQ ID NO：36所示的CDR2，SEQ ID NO：37所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：38所示的CDR1，SEQ ID NO：39所示的CDR2，SEQ ID NO：40所示的CDR3； 

或SEQ ID NO：41所示的CDR1，SEQ ID NO：42所示的CDR2，SEQ ID NO：43所示的CDR3。 

2.根据权利要求1所述的前白蛋白的纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或50所示的氨基酸序列。 

3.一种前白蛋白纳米抗体，其特征在于，它针对前白蛋白表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或50所示氨基酸序列的VHH链。 

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的前白蛋白的纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的前白蛋白纳米抗体。 

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56或57。 

6.一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56或57所示的核苷酸序列。 

7.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达前白蛋白的纳米抗体。 

8.权利要求3所述的前白蛋白纳米抗体用于检测前白蛋白的用途。 

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