CN104558174A - 一种针对睾酮的特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性针对睾酮的纳米抗体，公开了其VHH链的框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，同时还公布了编码该单域重链纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的单域重链纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，为睾酮检测试剂研发提供了新思路。

Description

一种针对睾酮的特异性纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学与分子生物学领域，具体涉及针对于睾酮的纳米抗体、其编码序列以及在医学检测和诊断试剂中的应用。

背景技术

睾酮（Testosterone）又称睾固酮、睾丸素、睾丸酮或睾甾酮、睾脂酮，是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮。它是主要的男性荷尔蒙及同化激素。不论是男性或女性，它对健康都有着重要的影响，包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功能与其他类固醇荷尔蒙一样。睾酮是经由血液中的性激素结合球蛋白运送至身体的目标组织。男性生殖腺内的塞尔托利氏细胞需要睾酮来生成精子。

睾酮对人类及其他脊椎动物通过两个方式来产生效用：1.直接或以血清双氢睾酮（DHT）形式使雄激素受体活跃。2.转化为雌二醇使某些雌激素受体活跃化。一方面，游离的睾酮会被运送至目标组织细胞的细胞质中，与雄激素受体结合，或被5α还原酶转为血清双氢睾酮（DHT）。DHT同样会与雄激素受体结合。此外，睾酮受体或血清双氢睾酮受体会进行结构性的转变，并让它们进入细胞核，与染色体DNA内特定的核苷酸结合。结合的区域称为激素反应元件（HRE），并影响某些基因的复制活动，产生男性激素效用。另一方面，睾酮芳构化成雌二醇会对脑及骨这两个人体重要的组织构成主要的影响。在骨中，雌二醇加速了软骨成长为骨的过程，使骨端接合及完成生长的程序。在中枢神经中，雌二醇是给予下视丘的主要回馈讯号，尤其在影响排卵素的分泌。在很多哺乳动物的脑部中，某些性别差异区域在出生前或产期的雄性化，都是受着睾酮所产生的雌二醇影响，决定将来的雄性性行为。

人体内睾酮含量对人类身体状态具有重要影响，不同发育时期影响各不相同。对幼婴的影响：现在对睾酮对幼婴的影响所知甚少。在男性幼婴出生后的头一个星期，睾酮的份量开始上升，并维持与青春期相约的份量数个月。在约4－6个月大，睾酮份量会下降至仅能测量的份量。这样的上升未有对身体上其他地方带来改变，其作用仍是未知的，但有学者认为是协助所谓的“脑部男性化”。 对青春期的影响：在青春期时，睾酮会使孩童出现第一种雄激素上升可见的征状。这些症状包括：产生成年人的体味；皮肤及头发加增油性，长出青春痘；长出阴毛及腋毛；整体成长剧增，加速骨骼成长；维持阴茎正常的发育；维持正常的性欲及性功能；声线变得低沉；面部皮下脂肪减少；长出喉核；肌肉强度及质量上升。对成人的影响：睾酮对成人的影响，对男性比较明显，但对男女两性都同样重要。随着年纪渐长，睾酮的份量下降，这些影响亦随之而减少。这些影响包括：维持肌肉强度及品量；维持骨质密度及强度；维持性欲及勃起次数；提神及提升体能。

此外，临床上对体内睾酮含量的测定也有重要意义。体内睾酮含量增高与特发性男性性早熟，家族性男性性早熟，肾上腺皮质增生，肾上腺皮质肿瘤（腺癌显著增高，腺瘤亦常增高），睾丸肿瘤，睾丸女性化，多囊卵巢综合征，卵巢雄性化肿瘤，松果体瘤，特发性多毛症，甲减，雄激素，HCG和雌激素治疗中等疾病发生和治疗后果相关。而体内睾酮含量降低则与尿毒症，21－三体综合征，肌强直营养不良征，肝功能不全，陷睾症，原发性或继发性性腺功能减退症，男性睾丸发育不全、类无睾综合征、下丘脑或垂体性性腺功能减低，雄激素治疗停药后等疾病和治疗有关。所以，针对人体睾酮含量的测量对疾病的判断和确诊以及后期的治疗都至关重要，并逐渐成为人们关注和研究的热点。

纳米抗体(nanobody，Nb)是近年来发现的一种新型抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区( variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHHs) 构成，又称为VHH抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低等特点，较常规抗体用途更广。纳米抗体作为一种新型抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景，已经成为一个重要研究热点。利用纳米抗体技术获得特异性针对睾酮抗原表位的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗具有广阔前景。

三、发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种针对睾酮的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的DNA编码序列以及该抗体在制备医学检测和诊断试剂中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种针对睾酮的纳米抗体，其VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1所示FR1，SEQ ID NO:2所示FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括 CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

上述氨基酸序列组合在一起构成针对睾酮的纳米抗体的VHH链氨基酸序列SEQ ID NO：8。

此外，还提供一种DNA分子，它用以编码上述针对睾酮的纳米抗体的VHH链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。以及一种表达载体，它包含上述DNA分子的核苷酸序列；一种宿主细胞，它可以表达针对睾酮的单域重链纳米抗体。

最后，本发明还提供一种用于检测睾酮的检测试剂盒，该试剂盒包括上述的针对睾酮的纳米抗体。

有益效果：

与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明使用纯净的睾酮免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对睾酮的纳米抗体噬菌体文库。随后试验中将睾酮偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体噬菌体文库，从而获得了针对睾酮的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。获得的纳米抗体可应用于临床诊断以及检测。

附图说明

图1是睾酮纳米抗体的基因琼脂糖凝胶电泳图，第一泳道为DNA分子标记，第二泳道为纳米抗体DNA片段，大小约为500bp；

图2是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率为100％；

图3是经镍柱纯化后得到的睾酮纳米抗体SDS-PAGE电泳图；

图4利用电阻抗技术通过睾酮纳米抗体检测睾酮的方法的原理图；

图5利用电阻抗技术通过睾酮纳米抗体检测睾酮方法的灵敏度和检测线性。

五、具体实施方式

本发明首先用纯净的睾酮抗原免疫一只双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了睾酮特异的纳米抗体文库。将睾酮偶联在酶标板上，使睾酮表面的抗原表位得以暴露，利用噬菌体展示技术从文库中筛选睾酮免疫性的纳米抗体基因，之后构建到大肠杆菌表达载体，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1： 针对睾酮的重链抗体VHH文库的构建：

（1）用睾酮（购自Sigma公司）免疫双峰驼，每次将睾酮与弗氏佐剂按1：1体积混合，每周一次，共免疫7次，第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余六次全部使用弗式不完全佐剂，在免疫过程中抗原睾酮刺激B细胞表达特异针对睾酮的纳米抗体。（2）7次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100 ml并提取总RNA。（3）将提取的RNA反转录成cDNA并利用巢式PCR扩增针对睾酮的纳米抗体的基因片段，结果如图1显示，该片段的大小约为500 bp。（4）使用限制性的内切酶PstI及Not I（购自NEB）酶切20 μg pComb3噬菌体展示载体（购自Biovector）及10 μg 针对睾酮的纳米抗体的基因片段的PCR纯化产物，并连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（购自北京神州红叶科技有限公司）中，构建睾酮的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1×10⁸；如图2所示，文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：文库插入率已达到100％。

实施例2：针对睾酮的纳米抗体筛选过程：

（1）取200微升构建文库转化到100毫升TG1细胞加入（2×TY培养基），37℃培养3小时。（2）加入40 微升 VCSM13辅助噬菌体，室温静置30分钟。（3）离心10分钟，将离心沉淀下来的细胞重悬接入250 毫升 2×TY培养基，37℃培养过夜；（4）将培养液8000 rpm离心30分钟，取上清液，用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并将沉淀后的噬菌体溶解在PBS溶液中。（5）将溶解在100 mM pH 8.2的 NaHCO₃ 中的200 μg睾酮偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照包被-BSA。（6）第二天两个孔中分别加入100 μg 1%脱脂牛奶，室温封闭2小时。（7）2小时后，加入100 μl上述步骤（4）中收集的噬菌体，在室温下作用1小时。(8）用 PBST（PBS中含有0.05% Tween 20）洗5遍，以洗掉不能抗原结合的噬菌体。(9）用100 mM三乙醇胺将与睾酮特异性结合的噬菌体洗脱下，并侵染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性克隆将不断被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取特异性针对睾酮噬菌体的目的。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并分别接种于含有100 μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3 g磷酸二氢钾，12.52 g磷酸氢二钾，12 g蛋白胨，24 g酵母提取物，4 mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1 mM的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透压法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（鼠源抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，使用酶标仪在405 nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100 μg/mL的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQ ID NO：8所示的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4区，构成针对睾酮的纳米抗体的整个VHH链。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.6~1.0时，加入终浓度为1 mM IPTG，28 ℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90%以上的蛋白，如图3所示。

实施例5：生物素化纳米抗体及其纯化方法：

（1）将针对睾酮的纳米抗体基因片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37 ℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330 μl 50 mM 的D-生物素（D-biotion）溶液，37 ℃慢摇30 min；（4）加入终浓度为1 mM IPTG，28 ℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。

实施例6：利用电阻抗检测睾酮

(1)将玻碳电极先后用0.3和0.05 μm的氧化铝打磨，超声，待用；（2） 运用传统的三电极系统，首先将电极放置在0.5 M的H₂SO4中反应，使之修饰带有羧基官能团；之后用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）处理电极表面，使其在电极表面形成酰胺键。（3）在电极上滴加20 μL溶解在pH 7.4 PBS中(100 μg/mL)链霉亲和素，室温放置1 h，在电极上修饰链霉亲和素。（4）在电极上孵育0.5%的BSA，室温放置0.5 h。（5）在电极表面修饰20 μL上述添加生物素的纳米抗体（100 μg/mL），室温放置1 h。（6）在不同电极上分别滴加20 μL梯度稀释的睾酮（抗原浓度为0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、100 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL），室温孵育1小时；（6）通过电化学工作站，测量不同浓度抗原所对应的循环伏安（CV）和电阻抗值（EIS）。对电阻抗数据进行拟合，得到睾酮的检测线性，结果如图5所示。基于本实验，本发明所制备的纳米抗体可以应用于制备医学检测和诊断试剂用于定性或定量的检测睾酮含量。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种针对睾酮的纳米抗体，其VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1所示FR1，SEQ ID NO:2所示FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括 CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的针对睾酮的纳米抗体，其特征在于所述纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

3.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1或2所述的针对睾酮的纳米抗体的VHH链。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

5.一种表达载体，其特征在于，它包含权利要求4所述DNA分子的核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达权利要求1所述针对睾酮的纳米抗体。

7.权利要求1所述的针对睾酮的纳米抗体用于制备检测睾酮试剂中的用途。

8.一种用于检测睾酮的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括如权利要求1所述的针对睾酮的纳米抗体。