CN108659129A

CN108659129A - 一种抗gpc3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108659129A
Application number: CN201810476055.8A
Authority: CN
Inventors: 夏丽洁; 腾桥; 张富春; 李金耀
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108659129B

Abstract

本发明公开了一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，本发明利用原核表达的GPC3融合蛋白免疫骆驼，提取骆驼脾脏组织中的RNA，以其为模板反转成cDNA，构建到噬菌体外衣壳蛋白的载体上，构建噬菌体展示文库，并计算库容及滴度。然后利用抗原‑抗体亲和性原理，经三轮淘选，从该文库中筛选出与GPC3特异性结合的纳米抗体，进而获得该特异性抗体的基因，构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，即得到所需要的纳米抗体。

Description

一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，本发明还涉及该纳米抗体的制备方法和应用。

背景技术

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。由于肝癌特别是原发性肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。

早期诊断和治疗是提高原发性肝细胞癌疗效的关键因素之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3，GPC3)作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，它参与调控细胞增殖、调控、粘附和迁移等过程。有研究显示GPC3原发性肝癌中特异性高表达，而在成人正常肝组织低表达或不表达。从而提示GPC3对肝癌诊断具有显著的灵敏性和特异性，可作为识别原发性肝癌(HCC)特异性肿瘤标志物。

靶向治疗则使分子药物特异性结合到肿瘤细胞的某些特定的作用位点，选择性杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常组织与细胞，克服了传统治疗存在的弊端，因而肝癌的靶向治疗近年来成为研究的热点。目前肝癌靶向药物主要有两种类型：一种是激酶类抑制剂。如甲苯磺酸索拉非尼。第二种为一种重组的人源化、人鼠嵌合单克隆抗体，如贝伐单抗。这些单抗虽然在晚期肝癌的巩固治疗中显示了一定的作用，但效率低，费用昂贵，限制其广泛应用。

目前，研究获得的纳米抗体不仅具有完整功能，而且其与常规抗体相比具有水溶性好，分子量小，组织穿透力强，免疫原性弱，可优先识别受体与配体结合部位等优点。然而，目前尚没有抗GPC3蛋白的纳米抗体及高效的制备方法。

发明内容

为了解决上述技术问题的至少一个，本发明提供一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的实施方案中，所述纳米抗体仅由重链组成，

在本发明的实施方案中，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。

本发明的第二方面提供编码本发明第一方面所述纳米抗体的基因，该基因包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种重组质粒，该质粒包含本发明第二方面所述的基因。

在本发明的实施方案中，所述载体为表达载体，优选地，所述载体为pET28a载体。

本发明的第四方面提供一种重组细胞，所述细胞包含本发明第二方面所述的基因或本发明第三方面所述的质粒。

在本发明的实施方案中，所述重组细胞为大肠杆菌。

在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞为E.coli DH5α细胞。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述重组细胞为E.coli BL21细胞。

本发明的第五方面提供一种检测GPC3的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的纳米抗体。

本发明的第六方面提供一种本发明第一方面所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对GPC3基因进行原核表达，收集表达的融合蛋白His-GPC3并纯化；

(2)将纯化后的融合蛋白His-GPC3免疫骆驼；

(3)提取步骤(2)骆驼脾脏组织的RNA，以其为模板反转成cDNA，特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因；

(4)将步骤(3)扩增到的基因经酶切后与pCANTAB5E质粒连接，转化至大肠杆菌TG1，获得VHH抗体库。

(5)将辅助噬菌体M13KO7加入至上述VHH抗体库中，制备噬菌体展示文库，并对噬菌体展示文库进行滴度测定；

(6)利用融合蛋白His-GPC3从噬菌体展示文库筛选出能够与GPC3特异性结合的纳米抗体，测序鉴定所述特异性结合的纳米抗体，获得该纳米抗体的基因。

(7)构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定。

在本发明的实施方案中，在步骤(1)之前进一步包括扩增GPC3基因的步骤。在本发明的具体实施方案中，特异性扩增GPC3基因的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在本发明的具体实施方案中，步骤(2)中所述骆驼为新疆双峰驼。

在本发明的具体实施方案中，步骤(3)中特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在本发明的具体实施方案中，步骤(4)中所述转化为电转化。

本发明的第七方面提供本发明第一方面所述的纳米抗体或本发明第二方面所述的基因或本发明第三方面所述的质粒或本发明第四方面所述的细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。

在本发明的实施方案中，所述癌症为肝癌。

附图说明

图1示出了重组质粒pET28a-GPC3的菌液PCR和双酶切鉴定。A：M.DNA MarkerDL50001.重组质粒pET28a-GPC3菌液PCR鉴定；B：M.DNA Marker DL50001.重组质粒pET28a-GPC3的双酶切产物。

图2示出了融合蛋白His-GPC3的诱导表达蛋白及Western-blot鉴定。A：M.170.0KD1.BL21-pET28a诱导前2.BL21-pET28a诱导后3.BL21-His-GPC3诱导前4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白5BL21-His-GPC3诱导后上清6.BL21-His-GPC3诱导后沉淀；B：M.170.0KD1.His-GPC3诱导前2.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白3.BL21-His-GPC3诱导后上清4.BL21-His-GPC3诱导后沉淀

图3示出了融合蛋白His-GPC3的不同温度的诱导表达。A：M.170.0KD 1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度20℃5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度25℃；B：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度28℃5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度32℃。

图4示出了融合蛋白His-GPC3的不同时间的诱导表达。A：M.170.0KD 1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间3h 5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间4h；B：M.170.0KD 1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间6h 5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间8h。

图5示出了融合蛋白His-GPC3的不同诱导剂IPTG浓度的诱导表达。A：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.3mmol/L 5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.5mmol/L；B：M.170.0KD 1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.8mmol/L 5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度1.0mmol/L

图6示出了新疆双峰驼抗GPC3血清滴度检测。

图7示出了新疆双峰驼脾脏组织总RNA。

图8示出了噬菌体展示文库的筛选。A：一轮淘选10μg抗原包被，B：一轮淘选5μg抗原包被；C：一轮淘选1μg抗原包被。

图9示出了VHH_GPC3阳性克隆菌液PCR鉴定。

图10示出了VHH_GPC3抗体表达及纯化。M.蛋白Marker(10-170KD)；A:1、2分别为pET28a空载体诱导前、诱导后；3-6分别为pET28a-VHH_GPC3转BL21诱前、诱后、上清、沉淀；B:1、2分别为pET28a-VHH_GPC3诱导前、诱导后,IPTG浓度为0.8mmol/L，诱导时间为5h；C：1.纯化的上清蛋白。

图11示出了VHH_GPC3纳米抗体亲和力的测定。

图12示出了HepG2细胞表面FITC强度。

图13示出了BEL-7404细胞表面荧光强度。

具体实施方式

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

术语

本发明所述GPC3基因是指磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3，GPC3)，其为作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，该基因编码580个氨基酸能够产生大约70kD的核心蛋白。核心蛋白由两个亚基构成，弗林蛋白在358-359氨基酸位置将该核心蛋白裂解为N端和C端两个亚基，N末端存在着一种分泌型信号蛋白，C末端通过与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价结合，从而使GPC3核心蛋白锚定于肝细胞膜上，且C端最末50个氨基酸决定两条硫酸乙酰肝素链(HS)插入点的位置，使该链靠近细胞膜。GPC3在胚胎及重要组织例如肝脏，肺，肾脏中大量表达，然而，在成人器官中的表达量较低。此外，有研究显示GPC3原发性肝癌中特异性高表达，而在成人正常肝组织低表达或不表达。从而提示GPC3对肝癌诊断具有显著的灵敏性和特异性，可作为识别原发性肝癌组织(HCC)特异性肿瘤标志物。

实施例1人GPC3基因的原核表达

1.原核表达细胞的构建

根据GenBank数据库提供的人GPC3cDNA的核苷酸序列设计扩增GPC3基因全长去信号肽的一对引物，所述引物的序列如下：

Primer1(SEQ ID NO:3):

5'-CGGAATTCATGCAGCCCCCGCCGCCGCCGCCGGACGCCACCTG-3

Primer2(SEQ ID NO:4):

5'-CCCTCGAGTCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC-3'

上下游分别带有EcoR I和Xho I酶切位点，利用上述引物进行PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段大小，利用PCR产物纯化回收试剂盒回收PCR产物，将回收的目的片段与pET28a质粒于37℃过夜双酶切后，通过切胶方法回收经双酶切的目的片段和pET28a载体，然后利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。挑取形态大小较好的单克隆先进行菌液PCR鉴定，再进行双酶切鉴定(图1)，最后将经测序鉴定正确单克隆的质粒转化入E.coli BL21表达菌株。

2.融合蛋白的诱导表达

将上述已转大肠杆菌BL21感受细胞的pET28a-GPC3菌液，按照总体积的3％用枪加入于10mL含卡纳青霉素(50mg/L)的LB的液体培养基中，培养条件为37℃恒温摇床振荡培养至对数期OD₆₀₀＝0.6～0.8即可取出。然后用移液枪向剩余的菌液中加入IPTG(200mmol/L)终浓度为0.5mmol/L，培养条件为37℃恒温摇床诱导表达4h。以10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白的表达，并通过Western-Blot进一步验证。

3.结果

重组质粒经IPTG诱导后进行10％SDS-PAGE电泳检测，结果(图2A)显示获得70kD的蛋白条带，包含GPC3蛋白65kD及pET28a质粒自带的5kD His标签蛋白，重组蛋白表达与预期大小一致。

Western-Blot检测结果(图2B)显示经IPTG诱导表达后与诱导表达前相比，诱导表达后有一条约70kD明显的条带，说明融合蛋白His-GPC3表达正确。

由于融合蛋白His-GPC3表达量不高，因此设计实验将其优化表达，主要是优化温度，诱导时间以及诱导剂IPTG浓度，最终确定在温度为32℃，IPTG浓度为0.5mmol/L，诱导时间为6h的条件下融合蛋白表达量较高(图3、图4、图5)。

实施例2新疆双峰驼噬菌体展示文库的构建及筛选

1.融合蛋白His-GPC3免疫新疆双峰骆驼

将10mg的纯化的His-GPC3蛋白与等体积的弗氏佐剂混合均匀，免疫新疆双峰骆驼(颈部皮下注射3-5点)，每2周加强一次，共免疫注射5次(首次用完全弗氏佐剂，其余用不完全弗氏佐剂)。每次免疫前和终免14天后，颈静脉采血，分离血清，用于滴度检测，发现达到预期免疫效果，激起了免疫应答反应(图6)。终免14天后，取具有免疫应答反应骆驼的脾脏组织。

2.骆驼脾脏组织RNA的提取

取0.5g的脾脏组织样本置于预冷的研钵中，迅速并充分研磨至成细腻粉末；加入相应量的Trizol裂解样本，室温放置5min，加入氯仿(200μl氯仿/1ml Trizol)，剧烈振荡15s，室温放置10min，离心后收集上层水相加入异丙醇混匀，颠倒混匀，-20℃冰箱静置10min；离心去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。

提取组织总RNA，通过测定其浓度为291ng/μL，A260/A280为1.91，且经过琼脂糖凝胶电泳检测可见三条带，分别为28S，18S，5sRNA(图7)。

3.逆转录PCR

采用invitrogen公司的SuperScript 111First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒，将脾脏组织RNA逆转录成cDNA，通过PCR扩增得到骆驼重链抗体的VHH片段。

逆转录体系及条件如下：

反应条件：37℃1小时；95℃5分钟；灭活MMLV。

以cDNA为模板，在PCR管中加入以下组分，充分混匀，上游引物为VHH-P1(Sfi I)，下游引物为VHH-P2(IgG2a)(Not I)。

其中，VHH-P1和VHH-P2的序列分别如下：

VHH-P1(SEQ ID NO:5)

CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

VHH-P2(SEQ ID NO:6)

AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGTGCATTCTGGTTCAGGTTTTGGTTGTGG

扩增程序如下

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下两个VHH基因片段，用OMEGA切胶纯化试剂盒分别纯化两个目的片段。

4.VHH抗体库的制备

将噬菌粒载体pCANTAB 5E和上述回收片段分别用Not I和Sfi I进行酶切反应；用DNA回收试剂盒回收酶切片段，与酶切后的pCANTAB 5E载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接；连接产物电转化入感受态大肠杆菌TG1，转化后的菌液于LB液体培养基中在37℃，150r/min，培养1.5h。取上步转化后培养的菌液100μL，用LB培养液做梯度稀释，涂布于加有Amp抗性的平板，37℃过夜。计算平板上的单菌落数，用于计算库容。VHH抗体库的库容计算方法为：

VHH抗体库的库容＝单克隆菌落数×重组率×稀释倍数

次日固体培养板上单克隆数为268个，随机挑取而20个菌落进行PCR验证及酶切验证，共有12个阳性克隆，所以重组率为60％，因此抗体库的库容为。

5.噬菌体展示文库的制备

1)取5mL的上述VHH抗体库，加入50mlLB液体培养基，37℃振荡培养过夜，5000r/min离心10min，弃掉上清；

2)用5mL的LB培养基悬浮沉淀，加入10¹²pfu的辅助噬菌体M13K07，37℃轻轻振荡感染1h；

3)5000r/min 4℃离心10min，收集沉淀。150mL的LB液体培养基悬浮菌体，30℃振荡培养过夜；

4)5000r/min 4℃离心10min弃掉菌体沉淀，收集上清；在上清中加入1/5体积的20％PEG8000/NaCl，充分混匀后冰浴1.5h；12000r/min 4℃离心30min，弃掉上清。2mL无菌PBS悬浮沉淀，即为噬菌体展示文库。

6.噬菌体展示文库的滴度测定

制备LB固体平板5个；将噬菌体展示文库原液用LB液体培养基按1:10、1:100、1:1000倍比稀释；取过夜培养的TG1菌液，分装于1.5mL EP管中，每管1mL。取稀释度为10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10的噬菌体100μL，加入1mL的TG1菌液，充分混匀，37℃轻轻振荡30min，使其感染。取100μL感染液涂布于LB固体平板上，30℃培养箱过夜培养；次日计数固体平板上的菌落，按照相同的步骤分别制作不含噬菌体或不含宿主菌TG1的阴性对照培养板。

结果显示，随着噬菌体展示文库稀释倍数的增加，单克隆的数目逐渐减少。当噬菌体展示文库稀释度为10^-10时，单克隆数目为65个，因此噬菌体展示文库滴度为。此外阴性对照板(仅含噬菌体或者TG1菌)均无单克隆菌落生长。

6.噬菌体展示文库的筛选

根据蛋白定量结果，将纯化的His-GPC3蛋白用碳酸盐包被缓冲液稀释成不同浓度10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL，每孔加100μL于96孔板中，最好4℃过夜。

次日，倒掉酶标板中的液体，用PBST洗涤数次后，拍板结束加入200μL的用PBS溶解5％的脱脂奶粉液，然后置于37℃恒温箱2h。PBST洗涤已经倒掉封闭液的酶标板，然后每孔加入100μL 10⁵pfu VHH噬菌体展示文库，然后置于37℃恒温箱2h。

PBST洗涤已经倒掉废液的酶标板数次，拍板结束后，每孔加入50μL洗脱缓冲液，用低速酶标板震荡器1分钟后，于室温孵育10分钟。加入6-7μL的中和缓冲液使其混合液PH值达到与LB液体培养基相当。用低速酶标板震荡器1分钟后，将每个孔中的液体收集于50mL的摇菌管中，并加入10mL新鲜培养的TG1液体。于摇床震荡感染30min。用移液枪分别吸取不同体积的感染液20μL，40μL，60μL，80μL，100μL涂布于预先倒好的LB固体Amp+培养板上，30℃恒温箱过夜培养。

在不同涂布体积的固体培养基，单克隆随机挑取10个形态大小良好的，先菌液PCR初步鉴定后送测序，进行序列分析。将剩余感染液4℃，3500r/min离心10min，收集菌体，重悬于LB液体Amp+培养基中，加入20％甘油充分混匀，冻存于-80℃冰箱，以备下次筛选。

重复步骤，完成第二轮和第三轮淘选。每轮的抗原包被量依次递减，分别为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL。但每轮的噬菌体展示文库的孵育都来源于上一轮剩余的感染液进行扩繁得到的。三轮淘选不同浓度抗原包被筛选结果如图8所示，各轮生物淘选富集情况如表1所示。

表1各轮生物亲和淘选的富集情况

在第三轮筛选后，随机挑取10个形态大小良好的单克隆，先菌液PCR初步鉴定正确(如图9)后送测序，进行序列分析，得到编码针对GPC3的单域重链抗体，具体如下(SEQ IDNO:2)：

ATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGTGGTGGGGCTGGGGGCGGGACACCGAGCTTTCGAGCTTAAAACAGAGATCACACTCCACCGAAGACAGACAAGCAAAGGACTGTCATGTAAGAGGTTCACATGGTGAAAGCTGTCCACGGAAAGAGAGCAGGGGCAGAGTGATGGTGGCTAAA

依据测序结果及密码子表可获得针对GPC3的单域重链抗体的氨基酸序列氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

IRNSFSCSFLCGPAGRPGCSSTRWWGWGRDTELSSLKQRSHSTEDRQAKDCHVRGSHGESCPRKESRGRVMVAK

实施例3pET28a-VHH_GPC3原核表达载体的构建

1.pET28a-VHH_GPC3原核表达载体的构建

参照实施例1方法，将编码VHH_GPC3的基因连接到原核表达载体pET28a质粒上。

2.VHH_GPC3纳米抗体的原核表达

经鉴定正确的pET28a-VHH_GPC3原核质粒转化于大肠杆菌BL21表达菌株，其为可溶性表达，使用亲和层析纯化后，SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定其分子量大小为13kD(图10)。

3.VHH_GPC3纳米抗体亲和力的测定

3.1夹心ELISA法

抗原的包被：将购买的不带任何标签的真核蛋白GPC3用碳酸盐包被缓冲液稀释成浓度为2μg/mL，每孔加100μL于96孔板中，10μg/mLBSA包被ELISA板作阴性对照，4℃过夜。

次日，倒掉酶标板中的液体，用PBST洗涤数次后，拍板结束加入200μL的用PBS溶解5％的脱脂奶粉液，然后置于37℃恒温箱封闭2h。根据蛋白定量结果，将纯化的His-GPC3蛋白用5％脱脂奶粉稀释成不同浓度，

每孔加入100μL样品，37℃恒温箱孵育2h。PBST洗涤5次，加入100μL抗His标签鼠单克隆抗体，37℃孵育2h。PBST洗涤5次，每孔加入100μLHRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育1h。

PBST洗涤5次，PBS洗涤2次，每孔加入100μL新鲜配制的TMB显色液，显色10min。

每孔加入50μL终止液，使用酶标仪于450nm处测量OD值。采用GraphPad Prism5.0进行分析，实验数据用表示

3.2细胞流式检测

1)先将冻存的肝癌两种细胞株进行复苏，传代培养。

2)当细胞传到第三代时进行细胞计数，细胞数至少达到10⁵个。

3)收集细胞，先用PBS洗涤离心后重悬细胞，然后加入预先用PBS稀释的不同浓度his-GPC3蛋白，放置冰上孵育2h。

4)设置离心机1200r/min离心5min，用PBS洗涤离心后重悬细胞，加入带绿色荧光染料FITC抗his标签的抗体，避光孵育半小时。

5)设置离心机1200r/min离心5min，用PBS洗涤离心后重悬细胞，将细胞滤过灭菌的铜网于流式管中，然后调试流式机子进行检测即可。

通过竞争ELISA，实验中阴性对照为BSA，阳性对照为商品化的真核GPC3蛋白，从图中初步可见与阴性对照及阳性对照相比，实验组与商品化的真核GPC3蛋白有一定的亲和力(图11)。为了进一步验证其能否与人肝癌细胞表面GPC3蛋白结合，因此进行细胞流式检测实验。结果表明VHH_GPC3纳米抗体与人肝癌HepG2细胞有一定亲和力，实验组与阴性对照组FITC荧光强度相比，具有极显著差异(图12)。纳米抗体与人肝癌BEL-7404细胞也有一定亲和力，且FITC荧光强度与阴性对照组相比具有极显著差异(图13)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 新疆大学

<120> 一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用

<130> XY-2018-1-W-001

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Arg Asn Ser Phe Ser Cys Ser Phe Leu Cys Gly Pro Ala Gly Arg

1 5 10 15

Pro Gly Cys Ser Ser Thr Arg Trp Trp Gly Trp Gly Arg Asp Thr Glu

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Lys Gln Arg Ser His Ser Thr Glu Asp Arg Gln Ala

35 40 45

Lys Asp Cys His Val Arg Gly Ser His Gly Glu Ser Cys Pro Arg Lys

50 55 60

Glu Ser Arg Gly Arg Val Met Val Ala Lys

65 70

<210> 3

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attcgcaatt cctttagttg ttcctttcta tgcggcccag ccggccgtcc tggctgctct 60

tctacaaggt ggtggggctg ggggcgggac accgagcttt cgagcttaaa acagagatca 120

cactccaccg aagacagaca agcaaaggac tgtcatgtaa gaggttcaca tggtgaaagc 180

tgtccacgga aagagagcag gggcagagtg atggtggcta aa 222

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattcat gcagcccccg ccgccgccgc cggacgccac ctg 43

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccctcgagtc agtgcaccag gaagaagaag cac 33

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgccatga ctcgcggccc agccggccgt cctggctgct cttctacaag g 51

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgcac gtgcattctg gttcaggttt tggttgtgg 49

Claims

1.一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，

优选地，所述纳米抗体仅由重链组成，

优选地，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。

2.编码如权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求2所述的基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒。

5.一种检测GPC3的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的抗体。

6.权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将纯化后的融合蛋白His-GPC3免疫骆驼；

(4)将步骤(3)扩增到的基因经酶切后与pCANTAB 5E质粒连接，转化至大肠杆菌TG1，获得VHH抗体库。

(7)构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定。

7.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述骆驼为新疆双峰驼。

8.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

9.根据权利要求5所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转化为电转化。

10.脾脏权利要求1所述的纳米抗体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒或权利要求4所述的细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，优选地，所述癌症为肝癌。