CN112625133A - 一种cdk2纳米抗体及其应用 - Google Patents

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CN112625133A CN202110048381.0A CN202110048381A CN112625133A CN 112625133 A CN112625133 A CN 112625133A CN 202110048381 A CN202110048381 A CN 202110048381A CN 112625133 A CN112625133 A CN 112625133A
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Abstract

本发明提供了一种CDK2纳米抗体及其应用，所述CDK2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。采用本发明提供的CDK2纳米抗体能够特异性结合CDK2蛋白，对CDK2蛋白的灵敏度为0.0325μg/ml。

Description

一种CDK2纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种CDK2纳米抗体及其应用。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，纳米抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体的优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面，纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面，纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单。
目前普遍观点认为，肿瘤产生的本质是细胞增殖调节失控，而细胞增殖需要细胞周期来调控，CDK2是细胞周期中重要激酶。正常情况下，CDK2在细胞周期的表达水平基本保持不变，但在细胞周期的驱动力失控或监控机制受损时，CDK2会异常表达，进而引起细胞周期紊乱导致细胞异常增殖，最终导致癌症发生。大量文献报道，CDK2在肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病等肿瘤中高度表达，并发现CDK2异常表达是癌变过程中的早期事件，并在癌症的形成、发展过程中起着重要作用。因此，CDK2在早期肿瘤检测、患者预后负向预测指标以及抗癌药物中具有巨大作用。
目前，还没有特异性结合CDK2蛋白的纳米抗体的报道。
发明内容
纳米抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和结构简单易于重组表达制备，能够穿过血脑屏障，在疾病的诊断与治疗中有较大的应用前景。鉴于此，本发明的目的在于提供一种CDK2纳米抗体及其应用，采用本发明提供的CDK2纳米抗体能够特异性结合CDK2蛋白，灵敏度为0.0325μg/ml。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种CDK2纳米抗体，所述CDK2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
优选的，编码CDK2纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述CDK2纳米抗体的分子量为18KD。
本发明还提供了上述技术方案所述的CDK2纳米抗体在制备结合CDK2蛋白的药物中的应用。
本发明提供了一种CDK2纳米抗体及其应用，所述CDK2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的CDK2纳米抗体能够特异性结合CDK2蛋白，对CDK2蛋白的灵敏度为0.0325μg/ml。
附图说明
图1为CDK2-VHH-His检测，将纯化的纳米抗体作为待检蛋白进行wester-blot鉴定，使用HRP Anti His-Tag Mouse抗体检测鉴定纯化的纳米抗体。
图2为CDK2-VHH-CDK2纳米抗体检测，选取组织中蛋白样品，将CDK2纳米抗体用作一抗，HRP Anti His-Tag Mouse用作二抗。
图3为脑-CDK2-VHH-纳米抗体免疫组化检测，选取组织中蛋白样品，将CDK2纳米抗体用作一抗，HRP Anti His-Tag Mouse用作二抗。
具体实施方式
本发明提供了一种CDK2纳米抗体，所述CDK2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLASGFSFDSYAMSWYRQAPGKEREWVAHITSGGSTNYSDSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMDNLKPEDTAVYYCNEVSTSLDDYDYWGKGTQVTVSAAHH。
在本发明中，编码CDK2纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGATTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTTTAGCCTCTGGATTCAGCTTCGATAGTTATGCCATGAGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGCGAGTGGGTCGCGCATATTACTTCTGGTGGTAGTACAAACTATTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACGCGGTGTATCTGCAAATGGACAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTATTGTAATGAGGTATCAACTAGTCTGGATGACTATGACTACTGGGGCAAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGCAGCGCACCAC。
在本发明中，所述CDK2纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-CDK2-VHH1；
所述第一轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为20μg/ml；
2)将所述步骤1)得到的B16-CDK2-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml；
所述第三轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml；
所述第四轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体溶液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一次离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二次离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同CDK2蛋白的反应性，以确定所述菌株与CDK2蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与CDK2蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
所述质粒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
GACCSASGTCAYCGTCTCCTCAGTCGACTCAGA；
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为CDK2纳米抗体(图1)。
本发明对所述黑素瘤纳米库没有特殊限定，优选依据申请号为201910058785.0、发明名称为《一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法》的中国专利中公开的黑素瘤纳米库的构建方法构建得到即可。
本发明对所述黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-CDK2-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，用CDK2蛋白包被免疫管。
淘洗方法优选如下：
(1)将500μl黑素瘤纳米文库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30min，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为SR-B16-CDK2-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的CDK2-VHH1)，待用。
包被蛋白处理优选如下：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为SC-B16-CDK2-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-CDK2-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：SR-B16-CDK2-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SR-B16-CDK2-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SC-B16-CDK2-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗，所述第二轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml，所述第三轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml，所述第四轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为5μg/ml。
在本发明中，所述步骤3)培养的温度优选为25～35℃，所述步骤4)感染的时间优选为25～35min，所述步骤4)孵育的时间优选为50～70min。
在本发明中，所述CDK2纳米抗体的分子量为18KD。
本发明还提供了上述技术方案所述的CDK2纳米抗体在制备结合CDK2蛋白的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CDK2纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库(根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到B16-CDK2-VHH1；
第一轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为20μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-CDK2-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第四轮淘洗的CDK2蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同CDK2蛋白的反应性，以确定所述菌株与CDK2蛋白具有反应性；
第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；
第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与CDK2蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID No.3)和质粒下游引物(SEQ ID No.4)；
6)将步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为CDK2纳米抗体(图1)。
从已制备的黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-CDK2-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以CDK2蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
1)将500μl黑素瘤纳米库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10min；
7)回收上清，命名为SR-B16-CDK2-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的CDK2-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为SC-B16-CDK2-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)。
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-CDK2-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：SR-B16-CDK2-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SR-B16-CDK2-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SC-B16-CDK2-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：CDK2蛋白包被浓度分别为10μg/ml、10μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-CDK2的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取96个单克隆菌株共接种1块96孔深孔培养板，每孔中均含1ml 2×YTAG培养基，培养板分别标记为CDK2文库菌株，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取50μl菌液接种于500ul 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板于37℃振荡培养1h后，在每孔中加入50μl KM13(60μlKM13+12ml2*YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同CDK2蛋白的反应性，具体方法如下：设计实验组、阴性对照组和BSA对照组，实验组与阴性对照组使用CDK2蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，BSA对照组使用BSA蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2ug/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，实验组和BSA对照组在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，阴性对照加入等量PBS，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板6次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13Antibody，稀释度1:6000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板8次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5～15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性菌株。
将阳性孔对应的甘油菌接种于5ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养后将菌液送测序公司测序。待测序结果返回后，对测序结果进行分析，选择测序正确的菌株再次重复上述实验，验证阳性菌株，根据CDK2单克隆阳性菌株ELISA鉴定结果(见表1)确定重组质粒构建菌株。
CDK2纳米抗体活性和亲和性：
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入BamHⅠ和SalI酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pQE30原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的CDK2特异性鉴定。
原核表达的引物：
F(SEQ ID No.3):GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
R(SEQ ID No.4):GACCSASGTCAYCGTCTCCTCAGTCGACTCAGA；
筛选步骤如下：
将重组质粒和pBAD18空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.4mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗CDK2中和活性的纳米抗体的筛选：将筛选出的纳米抗体对应甘油菌株接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500ml Amp抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度0.4mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述纳米抗体进行小量纯化。
纯化产物的鉴定：经ELISA鉴定，筛选出亲和性最好的CDK2纳米抗体，并对该抗体用Western Blotting法进行his标签鉴定：经SDS-PAGE电泳后，转到NC膜，直接用his二抗进行标记，经显影术显示抗体。
CDK2纳米抗体在Westren blotting的应用：提取小鼠脑组织总蛋白，制备westernblotting蛋白样品，将蛋白样品100℃水浴变性，随后进行电泳、转膜，5％脱脂奶粉37℃封闭1h，将CDK2纳米抗体作为一抗4℃过夜孵育，次日室温孵育30min，TBST洗膜，37℃孵育HRPAnti His-Tag Mouse二抗1h。使用成像仪显色曝光观察结果(图2)
CDK2纳米抗体在免疫组化的应用：取健康小鼠脑组织固定，制作石蜡切片，将石蜡切片进行脱蜡，PBS冲洗后，3％H2O2于37℃反应30min，阻断内源性过氧化物的活性，PBS冲洗，使用5％BSA蛋白封闭，封闭结束后进行一抗孵育，阳性实验组加入CDK2纳米抗体，阴性对照组加入等量的PBS缓冲液，4℃过夜。次日室温反应30min后，PBS冲洗后二抗孵育1h，随后DAB显色，苏木精进行复染，观察染色效果，梯度酒精进行透明封片。切片干燥后观察免疫组化结果(图3)
CDK2纳米抗体的亲和性：用5μg/ml得CDK2包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的CDK2纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml，进行ELISA鉴定。
结果：
测序和特异性单克隆噬菌体ELISA筛选结果
通过测序公司进行测序，选择能够正确表达VHH片段克隆菌株的进行间接ELISA方法检测单克隆对应的噬菌体上清同CDK2蛋白的反应性，这些单克隆均同CDK2蛋白有不同程度的反应性(表1)。
测序正确并预测的氨基酸序列为：
SEQ ID No.5(CDK2-VHH1)：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSSAHH；
SEQ ID No.6(CDK2-VHH2)：
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHH；
SEQ ID No.7(CDK2-VHH3)：
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVS SAHH；
SEQ ID No.8(CDK2-VHH4)：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSSAHH；
SEQ ID No.1(CDK2-VHH5)：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLASGFSFDSYAMSWYRQAPGKEREWVAHITSGGSTNYSDSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMDNLKPEDTAVYYCNEVSTSLDDYDYWGKGTQVTVSAAHH；
SEQ ID No.9(CDK2-VHH6)：
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPENPAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHH；
SEQ ID No.10(CDK2-VHH7)：
VQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGEEPEWVTFITNDGSGVRYADSVKGRFTVSRNNVENTVYLRMDNLQPNDTARYYCVRGRLTATSPLIPDDSWGQGTQVTVSSAHH；
表1 CDK2单克隆ELISA筛选结果
Figure BDA0002898288610000121
Figure BDA0002898288610000131
CDK2纳米抗体亲和性检测：
ELISA检测后，将选择阳性较强的四个克隆CDK2-VHH1(SEQ ID No.5)、CDK2-VHH2(SEQ ID No.6)、CDK2-VHH5(SEQ ID No.1)CDK2-VHH7(SEQ ID No.10)做为特异性单克隆阳性菌株，进行后续试验。
对特异性单克隆进行后续原核表达载体的构建，成功构建CDK2-VHH5蛋白表达菌株，CDK2纳米抗体诱导表达并纯化后，亲和性检测结果为：CDK2-VHH5对CDK2蛋白的灵敏度为0.0325μg/ml；His标签检测：用Western Blotting法对纯化的抗体进行His标签检测，结果发现分子量大小约为18KD，符合纳米抗体大小(图1)。CDK2纳米抗体的应用：CDK2纳米抗体均可应用于westernblotting(图2)和免疫组化(图3)反应中的一抗，且实验效果理想。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种CDK2纳米抗体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala
35 40 45
His Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu
85 90 95
Val Ser Thr Ser Leu Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala His His
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcagctcg tggagtcagg gggaggattg gtgcagcctg gggggtctct gagactctcc 60
tgtttagcct ctggattcag cttcgatagt tatgccatga gctggtaccg ccaggctcca 120
ggaaaggagc gcgagtgggt cgcgcatatt acttctggtg gtagtacaaa ctattcagac 180
tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgcca agaacgcggt gtatctgcaa 240
atggacaacc tgaaacctga ggacacggcc gtctattatt gtaatgaggt atcaactagt 300
ctggatgact atgactactg gggcaagggg acccaggtca ccgtctccgc agcgcaccac 360
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaggatcc gagtctggag grrgcttggt gca 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccsasgtc aycgtctcct cagtcgactc aga 33
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Ser Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Asn Arg Ala Gly Leu Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ile Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys
35 40 45
Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala
85 90 95
Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys
35 40 45
Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala
85 90 95
Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Ser Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Asn Arg Ala Gly Leu Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ile Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys
35 40 45
Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asn Pro Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala
85 90 95
Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Pro Glu Trp Val Thr
35 40 45
Phe Ile Thr Asn Asp Gly Ser Gly Val Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asn Asn Val Glu Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Met Asp Asn Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Arg Leu Thr Ala Thr Ser Pro Leu Ile Pro Asp Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120 125

Claims (4)

1.一种CDK2纳米抗体，其特征在于，所述CDK2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的CDK2纳米抗体，其特征在于，编码CDK2纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的CDK2纳米抗体，其特征在于，所述CDK2纳米抗体的分子量为18KD。
4.权利要求1～3任一项所述的CDK2纳米抗体在制备结合CDK2蛋白的药物中的应用。
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