CN114671949A - 一种igf1纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种IGF1纳米抗体及其应用，涉及生物工程技术领域。本发明所述IGF1纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明所述IGF1纳米抗体能够特异性结合IGF1蛋白，具有用免疫组织化学方法对组织中IGF1进行定位，以及WesternBlotting法检测组织中IGF1表达水平的作用。此外，IGF1纳米抗体具有抑制黑色素瘤细胞迁移和增殖的功能，可应用于黑色素瘤的诊断和治疗。

Description

一种IGF1纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种IGF1纳米抗体及其应用。
背景技术
在肿瘤细胞的发生、发展及其转化过程中胰岛素样生长因子家族正日益受到重视。一些研究表明，血清中IGF-1的含量升高与肿瘤的发生相关。大量研究证实IGF1在许多肿瘤细胞中表达上调，参与肿瘤发生和发展，通过与其受体IGF1R结合而参与转导多种信号途径如JNK、MAPK、PI3K/Akt途径发挥作用。此外，IGF-1可以通过上调组织蛋白酶B的表达促进HCC细胞系的生长和转移。
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，又称为纳米抗体。纳米抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。纳米抗体分子量小，结构简单，理化性质稳定，能够穿过动物机体内的一些保护性生理屏障进入发病部位发挥作用，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点。
目前，还没有特异性结合IGF1蛋白的纳米抗体的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种IGF1纳米抗体及其应用，所述IGF1纳米抗体可特异性识别并结合IGF1蛋白，并具有抑制黑色素瘤细胞迁移和增殖的功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种IGF1纳米抗体，所述IGF1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种编码上述IGF1纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备检测机体IGF1蛋白含量的试剂中的应用。
优选的，所述试剂包括基于免疫组织化学方法对组织中IGF1进行定位的试剂，和/或基于Western Blotting法检测组织中IGF1表达水平的试剂。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备预防和/治疗或黑色素瘤的药物中的应用。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移和/或增殖的药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种IGF1纳米抗体，所述IGF1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实施例中，利用噬菌体展示技术进行淘筛，噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的噬菌体。本发明采用噬菌体展示技术提供的IGF1纳米抗体能够特异性结合IGF1蛋白，具有用免疫组织化学方法对组织中IGF1进行定位，以及WesternBlotting法检测组织中IGF1表达水平的作用。此外，IGF1纳米抗体具有抑制黑色素瘤细胞迁移和增殖的功能，可应用于黑色素瘤的诊断和治疗。
附图说明
图1为IGF1-VHH-His检测结果图；
图2为IGF1-VHH-IGF1纳米抗体检测结果图；
图3为睾丸-IGF1-VHH-纳米抗体免疫组化检测结果图；
图4为添加IGF1纳米抗体对B16细胞划痕实验的影响；
图5为添加IGF1纳米抗体对B16细胞增殖实验的影响；其中A：试验空白组，B：IGF1纳米抗体实验组；
图6为添加IGF1纳米抗体对B16细胞增殖迁移相关蛋白表达量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种IGF1纳米抗体，所述IGF1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：ESGGGLVQPGGSLRLSCDETSSRTLDYYKIGWFRRAPGKEREGVSCTESNNGSTTYADSVKGRFTVSRDIAENKVYLQMKNLKPEDTGIYYCGADLEVFRRCSFVSNEYDYWGQGTQVTV SS。
本发明对所述IGF1纳米抗体的获得方法并没有特殊限定，实施例中优选利用噬菌体展示技术进行淘筛，噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的噬菌体。本发明采用噬菌体展示技术提供的IGF1纳米抗体能够特异性结合IGF1蛋白，分子量约为16kD。在本发明实施例中，所述IGF1纳米抗体的筛选方法除淘洗时的IGF1蛋白的包被浓度以及PCR扩增时所用的引物不同外，其余均与中国专利CN109678962A(一种Cdk5纳米抗体和筛选方法)相同，本发明实施例中同样进行四轮淘洗，第一轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为20μg/ml，第二轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为10μg/ml，第三轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为10μg/ml，第四轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为5μg/ml；且在进行PCR扩增时，所使用的引物优选如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示：
质粒上游引物(SEQ ID NO.3)：GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
质粒下游引物(SEQ ID NO.4)：GACCSASGTCAYCGTCTCCTCAGTCGACTCAGA。
本发明对上述淘洗时所应用的黑素瘤纳米库的构建方法并没有特殊限定，优选依据中国专利CN109722716A(一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法)所公开的构建方法构建得到即可。
本发明还提供了一种编码上述IGF1纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：GAGTCTGGTGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGATGAAACCTCAAGTCGCACTTTGGATTATTATAAAATAGGCTGGTTCCGCCGGGCCCCGGGAAAGGAACGTGAGGGGGTCTCATGTACTGAAAGTAATAACGGTAGTACAACTTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACATCGCCGAGAACAAGGTGTACCTGCAAATGAAAAACCTGAAACCTGAGGATACAGGAATTTATTATTGTGGAGCAGATCTGGAAGTATTCAGGCGATGTAGTTTTGTGTCAAACGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备检测机体IGF1蛋白含量的试剂中的应用。
本发明所述IGF1纳米抗体可特异性识别并结合组织中IGF1蛋白，可将所述IGF1纳米抗体应用于检测IGF1蛋白含量，具体的如基于免疫组织化学方法对组织中IGF1进行定位的试剂，和/或基于Western Blotting法检测组织中IGF1表达水平。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药物中的应用。
在本发明实施例中，IGF1被证实在黑色素瘤细胞中高表达且与细胞增殖迁移有重要联系，如IGF1纳米抗体添加B16细胞后，随着时间的增长起到了抑制B16细胞迁移的作用，并抑制B16细胞的增殖迁移相关蛋白的表达；IGF1纳米抗体可较强的抑制B16细胞的增殖。
本发明所述药物优选以所述IGF1纳米抗体为唯一活性成分，且对所述药物中活性成分的含量并没有特殊限定，采用药物中活性物质的常规用量即可。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，采用IGF1纳米抗体在医学上可接受的剂型即可。
本发明还提供了上述IGF1纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移和/或增殖的药物中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种IGF1纳米抗体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
IGF1纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库(根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到B16-IGF1-VHH1；
第一轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为20μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-IGF1-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第四轮淘洗的IGF1蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同IGF1蛋白的反应性，以确定所述菌株与IGF1蛋白具有反应性；
第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；
第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与IGF1蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID No.3)和质粒下游引物(SEQ ID No.4)；
6)将步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为IGF1纳米抗体。
从已制备的黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-IGF1-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以IGF1蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
1)将500μl黑素瘤纳米库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10min；
7)回收上清，命名为IN-B16-IGF1-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的IGF1-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为OUT-B16-IGF1-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)。
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-IGF1-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：IN-B16-IGF1-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算IN-B16-IGF1-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算OUT-B16-IGF1-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：IGF1蛋白包被浓度分别为10μg/ml、10μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-IGF1的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取96个单克隆菌株共接种1块96孔深孔培养板，每孔中均含1ml 2×YTAG培养基，培养板分别标记为IGF1文库菌株，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取50μl菌液接种于500μl 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板于37℃振荡培养1h后，在每孔中加入50μl KM13(60μl KM13+12ml 2×YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020×g离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同IGF1蛋白的反应性，具体方法如下：设计实验组、阴性对照组和BSA对照组，实验组与阴性对照组使用IGF1蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，BSA对照组使用BSA蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，实验组和BSA对照组在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，阴性对照加入等量PBS，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板6次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1:6000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板8次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5～15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性菌株。
将阳性孔对应的甘油菌接种于5ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养后将菌液送测序公司测序。待测序结果返回后，对测序结果进行分析，选择测序正确的菌株再次重复上述实验，验证阳性菌株，根据IGF1单克隆阳性菌株ELISA鉴定结果(见表1)确定重组质粒构建菌株。
IGF1纳米抗体活性和亲和性：
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，并在引物的5’端和3’端分别引入BamHⅠ和SalI酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pQE30原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的IGF1特异性鉴定。
筛选步骤如下：
将重组质粒和pBAD18空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.2mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗IGF1中和活性的纳米抗体的筛选：将筛选出的纳米抗体对应甘油菌株接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500mlAmp抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度0.2mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述纳米抗体进行小量纯化。
IGF1纳米抗体的亲和性：用5μg/ml得IGF1包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的IGF1纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释1:10、1:100、1:200，进行ELISA鉴定。
纯化产物的鉴定：经ELISA鉴定，筛选出亲和性最好的IGF1纳米抗体，并对该抗体用Western Blotting法进行his标签鉴定：将用于免疫印迹的蛋白样品与Buffer混匀，沸水加热变性，将变性后的样品进行80V恒压电泳，待样品跑出浓缩胶切换为120V，待蛋白完全分离结束电泳，将电泳后的凝胶选取合适范围进行转膜，转膜使用200mA恒流，时间大约为1KD蛋白转膜1min，随后5％脱脂奶粉室温封闭1h，弃去封闭液，使用抗His标签的抗体37℃条件下，80rpm孵育1h，随后PBST溶液清洗多余的抗体，将发光液涂抹目的条带相应位置，观察结果。
在WesternBlot中的应用：提取小鼠肺脏组织蛋白，将蛋白样品与Buffer混匀，沸水加热变性，将变性后的样品进行80V恒压电泳，待样品跑出浓缩胶切换为120V，待蛋白完全分离结束电泳，将电泳后的凝胶选取合适范围进行转膜，转膜使用200mA恒流，时间大约为1KD蛋白转膜1min，随后5％脱脂奶粉室温封闭1h，弃去封闭液，使用纯化后的IGF1纳米抗体作为一抗，4℃过夜孵育，PBST溶液清洗多余的抗体，使用抗His标签的抗体37℃条件下，80rpm孵育1h，随后PBST溶液清洗多余的抗体，将发光液涂抹目的条带相应位置，观察结果。
在免疫组织化学中的应用：将制备的石蜡切片置于二甲苯与梯度酒精进行脱蜡，并按以下步骤进行免疫组织化学分析：PBS冲洗，3min×3次，湿盒中加入蒸馏水，将组织切片放中，滴加TritionX-100，反应15min，反应结束后PBS冲洗，3min×3次，柠檬酸钠抗原修复液高温修复10min，用PBS冲洗3min×3次，3％H2O2溶液，滴加到组织上，37℃反应30min，PBS冲洗，3min×3次，配置封闭液，滴加到组织上组织，37℃封闭1h，弃去封闭液，实验组滴加IGF1纳米抗体，对照性滴加PBS，4℃过夜，次日，复温30min后PBS冲洗，3min×3次，加入含HRP的抗His标签抗体，37℃孵育1h，PBS溶液冲洗3min×3次，DAB显色液，显色，随时观察，待显色结束后水洗，停止显色，苏木精复染，脱水透明并封片。
结果：
测序和特异性单克隆噬菌体ELISA筛选结果
通过测序公司进行测序，选择能够正确表达VHH片段克隆菌株的进行间接ELISA方法检测单克隆对应的噬菌体上清同IGF1蛋白的反应性，这些单克隆均同IGF1蛋白有不同程度的反应性(表1)。
表1 IGF1单克隆ELISA筛选结果
阳性克隆编号 实验组 阴性对照
IGF1-VHH1 0.833 0.101
对特异性单克隆进行后续原核表达载体的构建，成功构建IGF1-VHH1蛋白表达菌株，IGF1纳米抗体诱导表达并纯化后，亲和性检测结果如表2。
表2纳米抗体结合力结果
抗体稀释比 1:10 1:100 1:200
实验组 0.7408 0.2912 0.1509
PBS阴性对照 0.1503 0.1494 0.1390
IGF1纳米抗体亲和性检测ELISA检测后，进行后续试验。
His标签检测：用Western Blotting法对纯化的抗体进行His标签检测，结果发现分子量大小约为16KD，符合纳米抗体大小，实验结果如图1。
在WesternBlot中的应用：使用纯化的IGF1纳米抗体作为Western Blot试验中的一抗，选取IGF1中表达的组织如肺，检测小鼠肺组织中IGF1的表达，验证IGF1纳米抗体能否可作为一抗在Western Blot中使用。结果表明，制备的IGF1纳米抗体可作为一抗，与抗原IGF1结合，可检测到特异性的免疫阳性条带，实验结果如图2。
在免疫组织化学中的应用：选取小鼠睾丸组织，使用IGF1纳米抗体作为免疫组织化学实验中的一抗，结果显示与对照组相比，在睾丸生精细胞可见免疫阳性信号，实验结果如图3。
实施例2
细胞培养及IGF1纳米抗体功能：研究发现IGF1在黑色素瘤细胞中高表达且与细胞增殖迁移有重要联系。通过细胞划痕实验、细胞增殖实验、迁移增殖相关蛋白表达来鉴定IGF1纳米抗体。用DMEM高糖培养基培养B16细胞，待细胞长至6孔板80％时消化传代，将细胞1:2传至新的6孔板中，摇匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
细胞划痕实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长满一层后，用消毒的直尺和中枪头在培养孔中划1条直线，划时枪头保持竖直。PBS冲洗3次，去除掉落的细胞，重新加入无血清的DMEM高糖培养基置于培养箱中培养。每6个小时在同一位置记录一次并拍照。
细胞增殖实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长满一层后，消化传代，细胞计数，在96孔板中每孔加入2000个细胞待细胞贴壁后加入CCK-8工作液，每隔3小时用酶标仪测定450nm波长的吸光度。
细胞增殖迁移相关蛋白表达量的鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长满一层后，消化传代，将细胞1:2传至新的6孔板中，摇匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，提取细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后，转到PVDF膜，对应抗体4℃过夜，隔日室温复温一小时，二抗标记，显影。
结果：
1.添加IGF1纳米抗体对B16细胞划痕实验的影响。对照组添加的是等量的PBS，实验组添加IGF1纳米抗体。根据结果发现：添加PBS的组在48小时内，划痕基本长满细胞。实验组在12小时处最明显，结果说明IGF1纳米抗体添加B16细胞后，随着时间的增长起到了抑制B16细胞迁移的过程。实验结果如图4。
2.添加IGF1纳米抗体对B16细胞增殖实验的影响。对照组添加的是等量的PBS，实验组添加IGF1纳米抗体。根据结果发现：实验组从12小时开始对细胞增殖有较明显的抑制作用，结果说明IGF1纳米抗体可较强的抑制B16细胞的增殖。实验结果如图5。
3.添加IGF1纳米抗体对B16细胞增殖迁移相关蛋白表达量的影响。根据结果发现：实验组相关蛋白表达量明显低于对照组，结果说明IGF1纳米抗体可抑制B16细胞的增殖迁移相关蛋白的表达。实验结果如图6。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
山西纳安生物科技股份有限公司
<120> 一种IGF1纳米抗体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asp Glu Thr Ser Ser Arg Thr Leu Asp Tyr Tyr Lys Ile Gly Trp
20 25 30
Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Thr Glu
35 40 45
Ser Asn Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Glu Asn Lys Val Tyr Leu Gln Met Lys
65 70 75 80
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Leu
85 90 95
Glu Val Phe Arg Arg Cys Ser Phe Val Ser Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagtctggtg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgatgaaacc 60
tcaagtcgca ctttggatta ttataaaata ggctggttcc gccgggcccc gggaaaggaa 120
cgtgaggggg tctcatgtac tgaaagtaat aacggtagta caacttatgc agactccgtg 180
aagggccgat tcaccgtctc cagagacatc gccgagaaca aggtgtacct gcaaatgaaa 240
aacctgaaac ctgaggatac aggaatttat tattgtggag cagatctgga agtattcagg 300
cgatgtagtt ttgtgtcaaa cgagtatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaggatcc gagtctggag grrgcttggt gca 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccsasgtc aycgtctcct cagtcgactc aga 33

Claims (6)

1.一种IGF1纳米抗体，其特征在于，所述IGF1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述IGF1纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述IGF1纳米抗体在制备检测机体IGF1蛋白含量的试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述试剂包括基于免疫组织化学方法对组织中IGF1进行定位的试剂，和/或基于Western Blotting法检测组织中IGF1表达水平的试剂。
5.权利要求1所述IGF1纳米抗体在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药物中的应用。
6.权利要求1所述IGF1纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移和/或增殖的药物中的应用。
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