CN116769038A - 一种mapk15纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种MAPK15纳米抗体及其应用，涉及纳米抗体筛选领域。所述MAPK15纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1。采用本发明提供的MAPK15纳米抗体能够特异性结合MAPK15蛋白，对MAPK15蛋白的灵敏度为1.25μg/mL。MAPK15纳米抗体的应用能够用于免疫组织化学和WesternBlotting法检测MAPK15在组织或细胞中的表达，为MAPK15基因功能的研究提供方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米抗体筛选领域，特别是涉及一种MAPK15纳米抗体及其应用。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，纳米抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体的优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面，纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面，纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单。
MAPK15是MAPKs家族的新成员，由于缺乏传统的“T-X-E”激活途径，被认为是非典型的MAPK蛋白。MAPK15在调节细胞增殖、迁移、刺激自噬进程和调控蛋白分泌等关键作用正逐渐被揭示。研发能够与MAPK15特异性结合的纳米抗体，对疾病发展、细胞自噬、蛋白分泌调节过程中MAPK15的表达鉴定、空间定位、组织成像以及新药研究提供重要的应用前景。MAPK15纳米抗体氨基酸序列较短，结构特殊，兼具靶向追踪和免疫疗法的共同特征，可以与细胞因子蛋白序列偶联表达，达到联合用药效果。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种MAPK15纳米抗体及其应用，本发明所述的MAPK15纳米抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和结构简单易于重组表达制备，能够穿过血脑屏障，在疾病的诊断与治疗中有较大的应用前景。采用本发明提供的MAPK15纳米抗体能够特异性结合MAPK15蛋白，灵敏度为1.25μg/mL，可用于免疫组织化学和Western Blotting法检测组织中MAPK15的表达。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种MAPK15纳米抗体，所述MAPK15纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
优选的，编码所述MAPK15纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的免疫组化试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的Western Blotting检测试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的MAPK15纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
本发明的有益效果为：
利用噬菌体展示技术进行淘筛，噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的噬菌体。本发明采用噬菌体展示实验技术研发的MAPK15纳米抗体能够特异性结合MAPK15蛋白，对MAPK15蛋白的灵敏度为1.25μg/mL，可用于免疫组织化学和Western Blotting检测组织中MAPK15的表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为His标签检测MAPK15纳米抗体。
图2为MAPK15纳米抗体应用于Western Blotting检测脑组织中MAPK15表达。
图3为MAPK15纳米抗体应用于免疫组织化学检测脑组织中MAPK15的定位。
图4为MAPK15纳米抗体对B16黑素瘤细胞增殖的影响。
图5为MAPK15纳米抗体对B16黑素瘤细胞自噬的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种MAPK15纳米抗体，所述MAPK15纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWLRQTPGKGLKWVSDINSS GDSTYYQDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARDGQLSGN YYLHDYWGQGTQVTVSS。
在本发明中，编码所述MAPK15纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGCTCCGCCAGACTCCAGGAAAGGGGCTCAAGTGGGTCTCAGATATTAATAGTAGTGGTGACAGCACGTACTATCAAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCAAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCAACTGAGTGGTAATTACTACTTACATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
在本发明中，所述MAPK15纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到MAPK15一级文库；
所述第一轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为20μg/mL；
2)将所述步骤1)得到的MAPK15一级文库依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL；
所述第三轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL；
所述第四轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为5μg/mL；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体溶液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一次离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二次离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同MAPK15蛋白的反应性，以确定所述菌株与MAPK15蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与MAPK15蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
CGGGATCCCG GAGTCAGGAGGAGGCTTGGT；
所述质粒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
CGGAATTCCG TGAGGAGACGGTGACCTGG；
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pET28a转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为MAPK15纳米抗体。
本发明对所述黑素瘤纳米库没有特殊限定，优选依据申请号为201910058785.0、发明名称为《一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法》的中国专利中公开的黑素瘤纳米库的构建方法构建得到即可。
本发明对所述黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到MAPK15一级文库，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/mL，包被体积2mL，用MAPK15蛋白包被免疫管。
淘洗方法优选如下：
1)将500μL黑素瘤纳米文库接种于100mL 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100mL菌液加100μLKM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100mL 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20mL PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30min，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3mL PBS缓冲液重悬沉淀，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为MAPK15拯救噬菌体，取100μL待用于滴度测定，剩余同1.2mLMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的噬菌体上清)，待用。
包被蛋白处理优选如下：
1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
3)在免疫管中加入2mL上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
4)在每管中加入2mL 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2mL Tris-HCl溶液中和。
5)将洗脱的噬菌体(命名为MAPK15洗脱噬菌体)转至50mL离心管，并加入16mLOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4mL的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24mL的体积)
6)取100μL菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
7)使用1mL 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为MAPK15一级文库，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：MAPK15拯救噬菌体进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μL噬菌体感染190μL OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μL菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算MAPK15拯救噬菌体滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μL菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算MAPK15洗脱噬菌体滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗，所述第二轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL，所述第三轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL，所述第四轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为5μg/mL。
在本发明中，所述步骤3)培养的温度优选为25～35℃，所述步骤4)感染的时间优选为25～35min，所述步骤4)孵育的时间优选为50～70min。
在本发明中，所述MAPK15纳米抗体的分子量为15KD。
本发明还提供了上述技术方案所述的MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的免疫组化试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的Western Blotting检测试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的MAPK15纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
MAPK15纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库(根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到MAPK15一级文库；
第一轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为20μg/mL；
2)将步骤1)得到的MAPK15一级文库依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL；
第三轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为10μg/mL；
第四轮淘洗的MAPK15蛋白的包被浓度为5μg/mL；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同MAPK15蛋白的反应性，以确定所述菌株与MAPK15蛋白具有反应性；
第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；
第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与MAPK15蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID No.3)和质粒下游引物(SEQ IDNo.4)；
6)将步骤5)得到的重组质粒、pET28a转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和WesternBlotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为MAPK15纳米抗体。
从已制备的黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到MAPK15一级文库，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/mL，包被体积2mL，以MAPK15蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
1)将500μL黑素瘤纳米库接种于100mL 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100mL菌液加100μLKM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100mL 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20mL PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3mL PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5mL离心管中，11600×g离心10min；
7)回收上清，命名为MAPK15拯救噬菌体，取100μL待用于滴度测定，剩余同1.2mLMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的噬菌体上清)，待用。
包被蛋白处理：
1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
3)在免疫管中加入2mL上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
4)在每管中加入2mL 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2mL Tris-HCl溶液中和。
5)将洗脱的噬菌体(命名为MAPK15洗脱噬菌体)转至50mL离心管，并加入16mLOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4mL的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24mL的体积)。
6)取100μL菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
7)使用1mL 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为MAPK15一级文库，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：MAPK15拯救噬菌体进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μL噬菌体感染190μL OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μL菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算MAPK15拯救噬菌体滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μL菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算MAPK15洗脱噬菌体滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：MAPK15蛋白包被浓度分别为10μg/mL、10μg/mL、5μg/mL；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-1～10-6；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μL噬菌体感染800μL OD600为0.4的TG1菌液(取100μL进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μL菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取96个单克隆菌株共接种2块96孔深孔培养板，每孔中均含1mL 2×YTAG培养基，培养板分别标记为MAPK15-1、MAPK15-2文库菌株，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取50μL菌液接种于500μL 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μL 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板于37℃振荡培养1h后，在每孔中加入50μL KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μL 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μL噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μL封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1h，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同MAPK15蛋白的反应性，具体方法如下：设计实验组、阴性对照组和BSA对照组，实验组与阴性对照组使用MAPK15蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/mL，BSA对照组使用BSA蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/mL，每孔100μL，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μL封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，实验组和BSA对照组在每孔分别中加入100μL封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，阴性对照加入等量PBS，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板6次。在每孔中加入100μL二抗(HRP-M13Antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板8次。在每孔中加入100μL显色底物，避光反应5～15min，而后在每孔中加入50μL终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性菌株。
将阳性孔对应的甘油菌接种于5mL 2×YTAG培养基，37℃振荡培养后将菌液送测序公司测序。待测序结果返回后，对测序结果进行分析，选择测序正确的菌株再次重复上述实验，验证阳性菌株，根据MAPK15单克隆阳性菌株ELISA鉴定结果(见表1)确定重组质粒构建菌株。
MAPK15纳米抗体活性和亲和性：
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5mL 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入BamHⅠ和EcoR I酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pET28a原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的MAPK15特异性鉴定。
原核表达的引物：
F(SEQ ID No.3):CGGGATCCCG GAGTCAGGAGGAGGCTTGGT；
R(SEQ ID No.4):CGGAATTCCG TGAGGAGACGGTGACCTGG；
筛选步骤如下：
将重组质粒和pET28a空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μL甘油菌接种于5mLKan抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μL菌液接种5mL Kan抗性的LB培养，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度1mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，37℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1mL菌液于1.5mL离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μLPBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μL 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗MAPK15中和活性的纳米抗体的筛选：将筛选出的纳米抗体对应甘油菌株接种于5mL Kan抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500mL Kan抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导表达，28℃振荡培养过夜。次日，对上述纳米抗体进行小量纯化。
MAPK15纳米抗体的亲和性：用5μg/mL的MAPK15包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的MAPK15纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL，进行ELISA鉴定。
纯化产物的鉴定：经ELISA鉴定，筛选出亲和性最好的MAPK15纳米抗体，并对该抗体用Western Blotting法进行his标签鉴定：经SDS-PAGE电泳后，转到NC膜，直接用his二抗进行标记，经显影术显示抗体。
纳米抗体的应用：通过免疫组织化学、Western Blotting等技术，以纯化后的MAPK15纳米抗体作为一抗，HRP-His抗体作为二抗，对不同组织中MAPK15的表达进行检测。
结果：
ELISA筛选结果
通过间接ELISA方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同MAPK15蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了5个单克隆，这些单克隆均同MAPK15蛋白有较好的反应性(表1)。将5个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
表1MAPK15单克隆ELISA筛选结果
测序正确并预测的氨基酸序列为：
MAPK15-VHH1(SEQ ID No.1)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWLRQTPGKGLKWVSDINSS GDSTYYQDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARDGQLSGN YYLHDYWGQGTQVTVSS；
MAPK15-VHH2(SEQ ID No.5)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYFMSWVRQAPGKGPEWVSDINM AGSMTRYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKPEDTGLYYCARRNVGWD GTAGEEWDFRGQGTQVTVSS；
MAPK15-VHH3(SEQ ID No.6)：
ESGGGLVEPGGSLKLSCTASGDMQGLYSHGWFRQIPGQQRERVATYTNL RTTDYADSVKGRFTITRDNAKNTIYLQMNNLTSDDTAVYYCHLRTRGMRASV YWGQGTQVTVSS；
MAPK15-VHH4(SEQ ID No.7)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGRFKIYRVDWYRRVEGGQRELVASISDG YNTDYADFVKGRFTISRYNAGNTLSLQMNNLEVDDTAVYYCHADERESDTV VKSHWGQGTQVTVYS；
MAPK15-VHH5(SEQ ID No.8)：
ESGGDSVHAGGSLRLSCAASGEIYAFYRMGWYRQATGKQRELVGEIISG GIINYADSVKGRFSISKDNAKKTLALEMNNLKPEDTATYYCMWNMTSGVYW GQGTQVTVSS。
MAPK15纳米抗体亲和性检测：
将上述5个克隆进行表达后，亲和性检测结果为：MAPK15-VHH1对MAPK15蛋白的灵敏度为1.25μg/ml；MAPK15-VHH2和MAPK15-VHH3对MAPK15蛋白的灵敏度为2.5μg/ml；MAPK15-VHH4和MAPK15-VHH5对MAPK15蛋白的灵敏度较弱，只有5μg/ml。His标签检测：用Western Blotting法对纯化的抗体(MAPK15-VHH1)进行His标签检测，结果出现His阳性印迹条带，且分子量大小约为15KD，符合纳米抗体大小。
MAPK15纳米抗体(MAPK15-VHH1)的应用：
MAPK15纳米抗体通过Western blotting检测脑组织蛋白中的MAPK15含量，条带清晰单一(图2)；通过免疫组织化学可以清楚的显示MAPK15在组织中的定位情况(图3)。综上所述，MAPK15纳米抗体可以很好的应用于免疫组织化学和Westernblotting检测。
实施例2
(1)细胞培养及MAPK15纳米抗体(MAPK15-VHH1)最佳作用浓度的确定：
研究发现MAPK15与黑色素瘤细胞的增殖有重要的联系，通过CCK8实验和增殖相关信号通路基因的检测来研究MAPK15纳米抗体功能。用含有10％FBS的DMEM高糖培养基培养B16-F10细胞，待细胞长至对数生长期后过表达MAPK15，12h后将细胞消化离心重新接种于96孔板内2000个/孔，待细胞贴壁后向细胞内分别添加不同浓度(0、20、40、60、80、100μg/mL)的MAPK15-VHH，每孔添加CCK810μL，从而确定MAPK15-VHH最佳作用浓度。
(2)MAPK15纳米抗体(MAPK15-VHH1)对B16黑素瘤增殖的影响
在过表达MAPK15的细胞中添加最佳浓度的MAPK15-VHH作用24h后收集细胞分别提取RNA和蛋白进行后续检测，以RNA逆转录的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(qPCR),检测CREB、ERK、MEK1、MNK1的表达量。同时通过western blotting检测以上基因在蛋白水平的表达量，以确定MAPK15-VHH对B16-F10细胞增殖的影响。
(3)MAPK15纳米抗体(MAPK15-VHH1)对B16黑素瘤自噬的影响
利用(2)中提取的RNA和蛋白分别检测自噬相关基因PI3K、AKT、mTOR和LC3B的表达情况，以确定MAPK15-VHH对B16-F10细胞自噬的影响。
结果：
细胞培养及MAPK15纳米抗体最佳作用浓度的确定
在过表达MAPK15的B16-F10细胞中添加不同浓度的MAPK15-VHH，通过CCK8检测，结果表明添加浓度为80μg/mL和100μg/mLMAPK15-VHH对B16-F10细胞增殖的影响效果最佳，而添加浓度80μg/mL和100μg/mL的MAPK15-VHH对细胞增殖的影响没有明显差异，因此将80μg/mL视为最佳添加浓度(图4中A)。
MAPK15纳米抗体对B16黑素瘤增殖的影响
对未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10细胞中CREB、ERK、MEK1、MNK1等增殖相关基因在mRNA水平的表达量进行检测，结果显示，与正常细胞相比，过表达MAPK15后CREB、ERK、MEK1、MNK1表达量显著增加(P<0.001)；在过表达MAPK15的细胞中添加MAPK15-VHH后，CREB、ERK、MEK1、MNK1的表达量均有一定程度的下调，且显差异极显著(P<0.001)(图4中B)。
同样过表达MAPK15后对p-CREB、CREB、p-ERK、ERK、p-MEK1、MEK1、MNK1蛋白表达量检测，结果发现，与正常细胞相比，这些增殖相关基因的蛋白表达量显著增加(P<0.001)，但是在添加MAPK15-VHH后，这些增殖相关基因蛋白表达量显著下调(P<0.001)(图4中C、D)。实验结果表明，MAPK15纳米抗体对MAPK15的表达具有拮抗作用，并能够在一定程度上抑制黑色素瘤细胞的增殖。
MAPK15纳米抗体对B16黑素瘤自噬的影响
为探究MAPK15-VHH对B16-F10细胞自噬的影响，对未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10细胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3B等自噬相关基因在mRNA水平表达量检测，结果显示，与正常细胞相比，过表达MAPK15后PI3K、AKT、mTOR的表达量显著降低(P<0.001)，但是LC3B的表达量显著升高(P<0.001)；添加MAPK15-VHH后，PI3K、AKT、mTOR表达量有不同程度的升高，LC3B的表达量却降低(图5中A)。
过表达MAPK15后对PI3K、p-AKT、AKT、mTOR蛋白表达量检测，结果发现，与正常细胞相比，这些自噬相关基因的蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.001)，但LC3B的表达量显著增加(P<0.001)；添加MAPK15-VHH后，这些自噬相关基因蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.001)，而LC3B的表达量显著减少(P<0.01)(图5中B、C)。实验结果表明，该MAPK15纳米抗体可以在一定程度上抑制MAPK15的功能，进而抑制黑色素瘤自噬进程。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种MAPK15纳米抗体，其特征在于，所述MAPK15纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的MAPK15纳米抗体，其特征在于，编码所述MAPK15纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1或2所述MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的免疫组化试剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的MAPK15纳米抗体在制备结合MAPK15蛋白的WesternBlotting检测试剂中的应用。
6.权利要求1或2所述的MAPK15纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
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