CN113307877B - 一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用。该纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明所公开的纳米抗体可以应用于杀螟硫磷与甲基对硫磷残留的实际样品检测，该纳米抗体具有较高的热稳定性、较高的有机耐受性及耐弱酸性等特点，可提高杀螟硫磷与甲基对硫磷免疫检测的灵敏度，且操作简单、所耗时间较短。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的筛选和制备，具有很高的应用价值。

Description

一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用。
背景技术
杀螟硫磷(Fenitrothion)又称杀螟松，是一种广泛使用的有机磷农药。杀螟硫磷具有较好的触杀与胃毒作用，可防治半翅目、鞘翅目等害虫，常用于玉米、水稻、大豆及蔬菜上的害虫防治。杀螟硫磷具有中等毒性，不合理施用杀螟硫磷会导致杀螟硫磷在作物上残留积累，过量摄入对人畜具有一定毒害作用：导致神经系统中的单键积累，引发恶心、呕吐、腹痛、腹泻、昏迷等症状，急性中毒还可危及生命。
对农作物中残留的杀螟硫磷进行准确检测是避免杀螟硫磷对人畜健康造成损伤的重要手段。目前国家标准中对杀螟硫磷的检测方法仍为仪器分析方法，如色谱与质谱联用的检测方法等。此类检测方法灵敏度和准确度高，但是需要昂贵的设备和试剂以及专业的操作人员，此外还需要经过复杂的制样过程，其耗费的时间和成本远远无法满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要。
免疫分析方法是近年来发展起来的一种基于抗体特异性识别抗原分子并通过信号分子释放出的信号强度反映待测物含量的分析方法。免疫分析方法的特点是能够特异性的识别一种或一类目标分析物，灵敏度高，相较仪器分析方法而言所需设备简单，对操作人员专业要求低，检测时间短，有的免疫分析方法甚至能够在几分钟内对待测样品进行半定量或定量分析。常用的免疫分析方法有酶联免疫分析法、侧流免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学免疫分析法等。免疫分析方法成功的关键在于制备灵敏度高特异性强的抗体。由于抗体的本质是蛋白质，因此免疫分析法必须在温和的条件下(合适的浓度的盐离子溶液、接近37℃的环境、偏中性的pH值、低浓度的有机溶剂等)进行，且需要避免免疫制剂在保存和运输过程中失活，影响其检测活性。
纳米抗体是一种新型的抗体制剂。1993年比利时科学家在羊驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体。后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kD左右，仅为传统抗体的十分之一左右，其尺寸处于纳米级别，故又称为“纳米抗体”。
在纳米抗体应用的过程中，人们发现了纳米抗体具有一些有别于传统抗体的性质，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化，使得免疫分析法更加能满足市场对快检的需求。
中国专利：杀螟硫磷半抗原、人工抗原、特异性抗体及其用途 (CN101012239B)中提供了一种利用人工杀螟硫磷抗体，通过间接ELISA法、直接ELISA法用于检测杀螟硫磷的技术方案。由该中国专利的说明书可知，该专利在通过间接ELISA法检测杀螟硫磷时，IC50＝13μg/L，说明目前针对杀螟硫磷的超高灵敏度的检测方法还未被提供。并且现有技术中也未提供过同时检测杀螟硫磷和甲基对硫磷的高特异性、灵敏度的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种杀螟硫磷与甲基对硫磷的纳米抗体及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种抗杀螟硫磷与甲基对硫磷的纳米抗体sm5。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述纳米抗体sm5的基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。
本发明的第五个目的是提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体、或所述重组细胞中的一种或几种在检测杀螟硫磷与甲基对硫磷的免疫学检测分析中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种杀螟硫磷与甲基对硫磷的检测方法。
本发明的第七个目的是提供一种检测杀螟硫磷和/或甲基对硫磷的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过构建羊驼免疫抗体文库，用噬菌体展示技术，将检测抗原固相包被于酶标板上，投入羊驼免疫抗体文库进行亲和淘筛，获得一种抗杀螟硫磷与甲基对硫磷特异性结合的纳米抗体,其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。并应用于杀螟硫磷与甲基对硫磷的免疫学检测分析，通过此免疫检验分析建立了一种快速、灵敏并且稳定的杀螟硫磷与甲基对硫磷的检测方法。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种特异性识别杀螟硫磷与甲基对硫磷纳米抗体sm5，具有SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列；所述纳米抗体氨基酸序列的框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5；互补决定区(CDR1-CDR3) 分别选自SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8。
一种编码所述特异性识别杀螟硫磷及甲基对硫磷纳米抗体的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
一种重组载体，此重组载体含有本发明第二个目的所述基因的核苷酸序列。
优选地，所述载体为表达载体。
优选地，所述表达载体为携带纳米抗体sm5基因的pCom3X噬菌粒载体。
一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明第三个目的所述重组载体。
优选地，所述细胞为大肠杆菌细胞。
所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体、或所述重组细胞中的一种或几种在检测杀螟硫磷和/或甲基对硫磷的免疫学检测分析中的应用。
一种杀螟硫磷和/或甲基对硫磷检测方法，利用所述抗杀螟硫磷及甲基对硫磷纳米抗体。
优选地，所述检测方法基于间接ELISA方法进行检测，用式(Ⅰ)所述杀螟硫磷完全抗原作为检测抗原，
Figure 1
优选地，所述杀螟硫磷完全抗原的载体蛋白选自牛血清白蛋白、或匙孔血蓝蛋白、乳铁蛋白的一种或几种。
更优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bovine serμm albμmin，BSA)。
一种检测杀螟硫磷和/或甲基对硫磷的试剂盒，利用所述抗杀螟硫磷及甲基对硫磷纳米抗体。
优选地，该检测试剂盒基于间接ELISA方法进行检测，还包括式(Ⅰ)所述杀螟硫磷完全抗原做检测抗原，
Figure 2
优选地，所述杀螟硫磷完全抗原的载体蛋白选自牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、或乳铁蛋白的一种或几种。
最优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bovine serμm albμmin，BSA)。
优选地，所述检测试剂盒还包括酶标抗体、显色剂和终止液。
酶标抗体：HRP标记anti-HA二抗，显色剂：TMB显色液，终止液：10％H2SO4 (v/v)。
更优选地，所述检测试剂盒的使用方法为：
S1用PBS将检测抗原B-BSA稀释至0.5μg/ml，加入酶标板每孔加0.1ml， 4℃过夜，第二天用PBST洗涤两次后，用PBS现配2％的脱脂奶粉(w/v)作为封闭液，每孔加入150μL，37℃封闭1h，弃去封闭液，用PBST洗涤两次。37℃烘干30min，存放于4℃待用；
S2将待测样品(同时做空白、阴性及阳性孔对照)加入上述酶标板中，每孔加入量50μL，用PBS将所述抗杀螟硫磷及甲基对硫磷纳米抗体稀释至工作浓度(90ng/mL)，每孔加入50μL抗体稀释液，37℃孵育30min，PBST洗板5 次；
S3在吸水纸上拍干后每孔加入100μL用PBST稀释5000倍的HRP标记 anti-HA二抗，37℃孵育30min，PBST洗板5次，拍干孔内液体；
S4每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光孵育10min；
S5每孔加入50μL 10％H2SO4(v/v)终止液，在酶标仪上读450nm OD值。
本发明提及的纳米抗体可通过基因工程重组表达的方式进行大量制备，基因工程重组表达的方式是将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
本发明所述纳米抗体为将纳米抗体经过原核生物表达后，以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过免疫羊驼，利用免疫后的羊驼淋巴细胞建立抗体基因文库，此抗体基因文库纳米抗体基因多样性好，通过对此抗体基因文库的筛选，本发明得到一种针对杀螟硫磷及其结构类似物甲基对硫磷的纳米抗体，该纳米抗体可以应用于杀螟硫磷与甲基对硫磷残留的实际样品检测。该纳米抗体具有较高的热稳定性、较高的有机耐受性及耐弱酸性等特点，可提高杀螟硫磷与甲基对硫磷免疫检测的灵敏度，且操作简单、所耗时间较短。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的筛选和制备，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为杀螟硫磷与甲基对硫磷纳米抗体半抗原及完全抗原结构图。
图2为纳米抗体sm5 SDS-PAGE示意图。
图3为基于纳米抗体sm5建立的抗杀螟硫磷/甲基对硫磷间接竞争ELISA标准曲线。
图4为纳米抗体sm5在不同浓度的丙酮和乙腈溶液下的活性示意图。
图5为纳米抗体sm5在不同温度下的活性示意图。
图6为纳米抗体sm5在不同pH PBS中的活性示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1羊驼免疫抗体文库的构建
1、免疫抗原和检测抗原的制备
杀螟硫磷半抗原的设计与合成由实验室前期工作完成，本实验一共用到两种结构的半抗原。半抗原结构A用于人工免疫抗原的制备，半抗原结构B用于人工检测抗原的制备。上述半抗原及人工抗原结构如图1所示。
半抗原A与乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)通过活泼酯法偶联形成免疫抗原。具体操作方法如下：称取7.3mg EDC与4.3mg NHS，加入0.1mL DMF溶解固体。将上述混合物溶液加入9.7mg杀螟硫磷半抗原A，室温避光搅拌或震荡反应4h活化半抗原。称取50mg LF，加入5mL碳酸盐缓冲液(pH 9.4)配制成 10mg/mL蛋白溶液。边搅拌边逐滴滴加活化后的半抗原，并用pH试纸确定溶液在碱性范围内，室温搅拌过夜。用PBS透析3次，分装后在-20℃冻存。偶联后的杀螟硫磷A-LF作为免疫抗原。
半抗原B与牛血清蛋白(bovine serμm albμmin，BSA)偶联形成检测抗原 B-BSA。具体操作方法如下：称取26.9mg杀螟硫磷半抗原B，加入0.5mL 1,4 二氧六环溶解。称取200mg BSA加入20mL碳酸盐缓冲液(pH 9.4)配制成10 mg/mL蛋白溶液。边搅拌边逐滴滴加活化后的半抗原，并用pH试纸确定溶液在碱性范围内，室温搅拌过夜。用PBS透析3次，分装后在-20℃冻存。偶联后的杀螟硫磷B-BSA作为检测抗原。
2、羊驼免疫方案
用健康的羊驼进行动物免疫，以杀螟硫磷A-LF作为免疫抗原，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mg免疫抗原。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，每次免疫间隔2周，共进行3次加强免疫。
免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。在第三、第四次免疫后，采集50～100mL外周血，用于构建纳米抗体文库。
3、羊驼淋巴细胞的分离
采集羊驼外周血需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：将羊驼外周血与无菌生理盐水在无RNA酶的干净容器中等体积混合稀释。稀释后的外周血用商品化淋巴细胞分离液进行离心，不同密度的血细胞离心后分布淋巴细胞分离液不同深度，其中淋巴细胞在液面下约1/3深度处，形成白色细胞层。由于淋巴细胞分离液的密度受温度影响，且不同实验室的离心机性能有所差异，最佳分离条件需要根据说明书指示自行摸索，参考离心参数为：室温(约25℃)；500g； 30min。采用新鲜血液进行分离、减小每次离心的体积、使用分离淋巴细胞专用的离心管等措施可以提高成功率。淋巴细胞分离后用无RNA酶的胶头滴管或移液器小心收集到灭酶的干净容器中，用无菌生理盐水洗涤细胞表面多余的淋巴细胞分离液，离心收集细胞沉淀。收集的淋巴细胞中加入裂解液TRNsol，每10mL 血液所分离的淋巴细胞大约需要1～2mL TRNsol，用无RNA酶的移液器或胶头滴管反复吹打至淋巴细胞完全裂解于TRNsol中，于-80℃保存备用，可保存至少一年。
4、总RNA的提取
采用商品化RNA提取试剂盒或其他有效的RNA提取方法，从上述保存于 TRNsol裂解液中的淋巴细胞中提取总RNA，根据说明书进行操作即可。
提取总RNA后取少许样品进行核酸电泳并在超微量分光光度计(nanodrop) 中测定RNA浓度。理想的RNA样品应完整无降解，从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，且无基因组DNA混杂，在260nm及280nm下的紫外吸收值比值(A260/280)应该在2.0左右。如果出现基因组DNA污染，应在反转录前用DNA酶去除基因组DNA，并再次通过电泳验证基因组DNA已除去且 RNA没有在此过程中发生降解；如果RNA已经发生降解，则需要重新提取RNA。RNA应尽快反转录成cDNA或短暂保存在-80℃环境。
5、cDNA的合成
采用商品化反转录试剂盒将上一步所得的RNA样品中的mRNA反转录成 cDNA，根据说明书进行操作即可。反转录完成后将产物先混合均匀，再分装于不同的无菌离心管，保存在-80℃环境。
6、纳米抗体目的基因的扩增
采用巢式PCR对目的基因进行两步法扩增，所用到的引物序列如表1所示。
表1羊驼重链抗体基因引物序列
Figure BDA0003020624660000071
Figure BDA0003020624660000081
第一轮PCR用cDNA作为第一轮PCR模板，具体反应参数如表2所示：
表2巢式PCR第一步反应体系及反应条件
Figure BDA0003020624660000082
第一步PCR产物在核酸电泳后会出现1000bp以及750bp两种产物条带，对 750bp条带进行切胶回收，并测定浓度。
第二轮PCR用第一轮PCR回收产物作为模板进行第二轮PCR扩增，由于羊驼的缺失轻链重链抗体有两种亚型(IgG2，IgG3)，进行第二轮扩增时需要用不同的引物对来进行PCR反应。F和R1用于IgG2基因的扩增，F和R2用于 IgG3基因的扩增。
表3巢式PCR第二步反应体系及反应条件
Figure BDA0003020624660000083
Figure BDA0003020624660000091
7、基因文库构建
(1)VHH目标基因及载体的酶切
采用Sfi I酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件： 50℃恒温反应16h。
pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带； VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。
(2)酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16h后用 DNA回收试剂盒清洁回收。
(3)电击转化
取5μL连接产物加入50μL电转感受态E.coil TG1中，轻轻混匀后转移到 0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，电击后立即向电转杯加入950μL预热到37℃的SOC培养基，37℃250rpm摇菌1h复苏细胞。
取100μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100μL涂布于直径90mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120mm的LB-Amp培养皿，每1mL菌液涂布于2～3 个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。
统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到107cfu以上，此数目即为纳米抗体基因文库的库容量。
将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，混合均匀后加入终浓度为25％的甘油(v/v)，取50μL菌液进行梯度稀释测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存。即为杀螟硫磷与甲基对硫磷纳米抗体基因库。
8、噬菌体救援
根据上述转基因大肠杆菌细胞数测定结果接种10倍库容量以上的细胞于 200mLLB-Amp中，37℃250rpm培养至对数期；加入1mL滴度为1012cfu/mL 以上的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入卡那霉素(50μg/ml)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm 4℃15min离心，取上清，加入1/4体积的PEG/NaCl，冰浴2～3h。12000rpm 4℃15min离心，弃上清，沉淀用1mL TBS重悬，转移到2mL离心管，12000rpm 4℃5min离心，过0.22 μm聚醚砜滤膜。取10μL噬菌体测定滴度，其余加入终浓度50％甘油(v/v)， -80℃保存，即为杀螟硫磷与甲基对硫磷纳米抗体噬菌体库。
实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
一、实验方法
1、纳米抗体的亲和淘选
(1)检测抗原固定化
用PBS将实施例1的检测抗原B-BSA稀释至1μg/mL，加入酶标板微孔中，每孔100μL，4℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入150μL1％BSA-PBS(w/v)溶液37℃静置1h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干备用。
(2)阳性噬菌体筛选
将实施例1中的噬菌体文库中加入BSA，使BSA终浓度为1％(w/v)，将混合物加入3个有固定化抗原的微孔中，每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃去孔中游离的噬菌体，用PBST洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次。加入Gly-HCl(0.1M，pH 2.2)37℃酸洗脱10min，立即用1M Tris溶液中和，重复上述步骤进行第二次酸洗脱。
合并两次酸洗脱液，加入杀螟硫磷标准品至终浓度为1μg/mL，37℃静置30 min进行竞争反应，将微孔中的液体收集到无菌离心管中。此时的噬菌体称为“output”，第一轮筛选完成。
在筛选前后都要进行噬菌体滴度的测定，具体操作方法如下：
取10μL噬菌体进行10倍梯度稀释，选取预期滴度以及前后相邻的两个稀释度(一般input稀释倍数为107、108、109，output稀释倍数为102、103、104)，取10μL稀释液侵染100μL对数期的E.coil TG1，37℃静置30min，涂布 LB-Agar-Amp平板，培养过夜后进行菌落计数并计算噬菌体滴度，计算公式如下：
Figure BDA0003020624660000101
(3)噬菌体扩增
经过筛选的噬菌体扩增后用于下一轮筛选，噬菌体扩增的方法如下：
将一半的output噬菌体加入4mL对数期的E.coil TG1，静置30min。加入 LB培养基至总体积为10mL并加入Amp至工作浓度(10μg/mL)，37℃250rpm 摇菌30min，加入50μL滴度为1012cfu/mL的M13KO7辅助噬菌体，静置30min， 37℃250rpm摇菌1h，加入LB至总体积为100mL，加入Amp及Kana(卡那霉素，kanamycin)工作浓度(Kana工作浓度为50μg/mL)，37℃250rpm摇菌过夜。
将菌液离心，上清转移到新的离心瓶中，加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，混匀后冰浴2h，12000rpm离心20min，将上清弃去并倒扣在吸水纸上尽量除去残余水分，用1mL含1％BSA(w/v)的PBS将白色沉淀重悬，过0.22μm聚醚砜滤膜后于-20℃保存，作为下一轮筛选“input”，重复步骤(2)的筛选方案。
以上筛选步骤一共进行4轮，第2，3，4轮固定化检测抗原B-BSA浓度分别降到1μg/mL，400ng/mL，100ng/mL，竞争反应所用药物浓度分别降到100 ng/mL，10ng/mL，1ng/mL。以上条件可以根据实际免疫情况进行调整，如果血清效价较低，可以适当提高淘筛时的检测抗原B-BSA浓度；如果抑制率较低，则需适当提高竞争反应的药物浓度。
2、阳性克隆的鉴定
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：
(1)抗原固定化
检测抗原B-BSA用PBS稀释至1μg/mL，4℃静置过夜。第二天用PBST 洗涤两次后，用PBS现配2％的脱脂奶粉(w/v)作为封闭液，每孔加入150μL， 37℃封闭1h，弃去封闭液，用PBST洗涤两次。37℃烘干30min，存放于4℃待用。
(2)纳米抗体小量表达
第三、四轮淘筛的output滴度测定平板上随机挑选96个单菌落，接种到每孔装有0.5mL LB-Amp的96孔板中，同时接种一个未被噬菌体侵染的E.coil TG1 单菌落作为阴性对照，37℃培养过夜，作为菌液“母板”。
从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母版对应，37℃，180rpm培养3h，每孔加入IPTG (工作浓度1mM)37℃，180rpm培养过夜。母板在4℃保存备用。
(3)酶联免疫鉴定阳性克隆
深孔板4000rpm离心20min，取两块有固定化抗原的酶标板，板1每孔加入50μLPBS，板2加入含有1μg/mL杀螟硫磷标准药物的PBS，并从离心后的 96孔板中吸取上清，在对应编号的酶标孔中每孔加入50μL。37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体。由于表达的抗体带有6His标签和HA标签，用PBST将Anti-HA-HRP二抗稀释5000倍，每孔加入100μL，37℃孵育30min。用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃显色10min；加入50μL终止液(10％H2SO4，v/v)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。
选取在板1中OD值大于阴性对照孔3倍，且具有明显抑制的克隆，记录其对应孔的编号，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。
二、实验结果
第三、四轮筛选的洗脱产物测定平板上随机挑取的96个克隆，利用间接 phageELISA对噬菌体克隆进行阳性筛选，结果显示80个克隆与抗原B-BSA有明显的结合。进一步采用间接竞争phage ELISA对80个克隆进行鉴定，结果显示有40个阳性克隆与半抗原B-BSA的结合受到添加的杀螟硫磷的竞争抑制。将这40个E.coil TG1菌株送至测序公司进行基因测序，根据DNA测序结果及密码子表可获得纳米抗体的氨基酸序列。将序列相同的抗体归为一类，共获得10 株具有不同基因序列的菌株。将筛选所得的阳性克隆表达纳米抗体，通过ELISA 方法对所得不同氨基酸序列纳米抗体进行工作浓度、IC50、特异性分析，对其性能进行对比评价，从中优选纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)用于杀螟硫磷与甲基对硫磷的检测，并制备杀螟硫磷与甲基对硫磷检测试剂盒。
其中经测序得到纳米抗体sm5具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。并且该纳米抗体sm5包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、 CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR1 的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
同时，得到编码所述纳米抗体sm5的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例3以单域抗体形式表达纳米抗体
经过基因测序的携带纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)表达载体的Ecoli.TG1菌株用试剂盒提取其质粒，将其转化到感受态E.coil BL21 (DE3)中并涂布于LB-Agar-Amp平板培养得到单菌落。挑一单菌落接种于10mL LB-Amp中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于 100mL LB-Amp中，37℃，250rpm培养至对数期，加入IPTG至工作浓度，37℃， 250rpm培养过夜。菌液离心并弃去上清，沉淀重新分散于10mLPBS，于-80℃冻结30min，37℃水浴融化，并将此过程重复3遍，超声处理30min，250rpm 震荡2h充分提取蛋白，离心留上清，将上清通过镍-琼脂糖凝胶亲和层析纯化，即得图2所示的纳米抗体。
实施例4基于间接ELISA法的纳米抗体工作浓度确定
1、抗原固定化
按照实施例2中“1、纳米抗体的亲和淘选(1)检测抗原固定化”的方法将杀螟硫磷B-BSA用PBS稀释至0.5μg/mL，在酶标板上进行检测抗原B-BSA固定化。
2、确定抗体工作浓度
实施例3纯化后的纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)先用PBS稀释至100μg/mL，再用PBS进行两倍梯度稀释，得到一系列不同浓度的纳米抗体(500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL，31.3ng/mL，15.6ng/mL， 7.8ng/mL，0(空白对照)，共8个浓度)。酶标板中预先加入每孔50μL PBS，再加入50μL梯度稀释后的纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)，每个纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)浓度共进行3孔重复试验，同时用3个孔进行空白对照(100μL PBS)。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL用PBST稀释5000倍的HRP标记anti-HA二抗。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL TMB 显色液，37℃避光孵育10min，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读450nm OD 值。
OD450 nm在1～1.5之间的纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示) 浓度即为纳米抗体工作浓度。在上述实验条件下，纳米抗体sm5(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的工作浓度为90ng/mL。
实施例5杀螟硫磷与甲基对硫磷检测试剂盒
一、试剂盒的组成
杀螟硫磷与甲基对硫磷检测试剂盒中包括：酶标板、纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)、检测抗原B-BSA、0.01MpH7.4PBS、PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)、TMB显色液、HRP标记anti-HA二抗、10％H2SO4(v/v) 终止液
二、试剂盒的使用
杀螟硫磷与甲基对硫磷检测试剂盒的使用方法如下：
S1用PBS将检测抗原B-BSA稀释至0.5μg/ml，加入酶标板每孔加0.1ml， 4℃过夜，第二天用PBST洗涤两次后，用PBS现配2％的脱脂奶粉(w/v)作为封闭液，每孔加入150μL，37℃封闭1h，弃去封闭液，用PBST洗涤两次。37℃烘干30min，存放于4℃待用；
S2将待测样品(同时做空白、阴性及阳性孔对照)加入上述酶标板中，每孔加入量50μL，用PBS将纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)稀释至工作浓度(90ng/mL)，每孔加入50μL抗体稀释液，37℃孵育30min，PBST 洗板5次；
S3在吸水纸上拍干后每孔加入100μL用PBST稀释5000倍的HRP标记 anti-HA二抗，37℃孵育30min，PBST洗板5次，拍干孔内液体；
S4每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光孵育10min；
S5每孔加入50μL 10％H2SO4(v/v)终止液，在酶标仪上读450nm OD值。
实施例6检测试剂盒标准曲线的绘制
一、实验方法
将杀螟硫磷与甲基对硫磷标准药物用PBS稀释成不同浓度的标准稀释液，稀释后的标准药物浓度为1000ng/mL，200ng/mL，40ng/mL，8ng/mL，1.6ng/mL， 0.32ng/mL，0.064ng/mL，0，共8个浓度，依次加入实施例5中检测试剂盒已包被的酶标板中，每孔加入量50μL，每个浓度进行3孔重复试验，并准备3孔药物空白组(50μL PBS)。用PBS将纳米抗体稀释至工作浓度(90ng/mL)，每孔加入50μL抗体稀释液。使用所述检测试剂盒进行检测实验后，用酶标仪读取 450nm处的OD值。
将药物空白组OD450值平均值记为B0，将不同标准药物浓度下的OD450 平均值记为Bx，用Excel计算不同药物浓度下的Bx/B0比值以及每组平行数据的标准差。以药物浓度为横坐标，Bx/B0比值为纵坐标，在Origin软件中绘制散点图并进行logistic函数拟合。
二、实验结果
标准曲线如图3所示，根据IC50定义，用origin软件在标准曲线上计算抑制率50％时对应的横坐标值，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示) 对杀螟硫磷的检测灵敏度为5.8ng/mL，对甲基对硫磷的检测灵敏度为7.6ng/mL。根据IC10定义，用origin软件在标准曲线上计算抑制率10％时对应的横坐标值，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)对杀螟硫磷的检出限小于0.076 ng/mL，对甲基对硫磷的检出限为0.098ng/mL。
实施例7检测试剂盒特异性探究
一、实验方法
配制其他7种杀螟硫磷与甲基对硫磷的类似物标准品溶液，使用实施例5 中的检测试剂盒，测定其他7种类似物，用酶标仪读取450nm处的OD值。绘制标准曲线，计算IC50值与交叉反应率，计算公式如下：
Figure BDA0003020624660000151
二、实验结果
表4纳米抗体sm5的ic-ELISA方法检测类似物农药的灵敏度和特异性
Figure BDA0003020624660000152
Figure BDA0003020624660000161
特异性测定结果如表4所示，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示)与杀螟硫磷、甲基对硫磷的交叉反应率分别为100％、76.3％，与乙基对硫磷的交叉反应率为4.5％，与其他6种农药类似物交叉反应率低于1％。结果说明纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)可以特异性识别杀螟硫磷与甲基对硫磷。
实施例8纳米抗体在不同浓度有机溶剂下中的活性测定
一、实验方法
用不同浓度(0％、10％、20％、30％、40％、50％)的乙腈与PBS的混合液 (v/v)，和不同浓度(0％、10％、20％、30％、40％、50％)的丙酮与PBS的混合液(v/v)作为纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和杀螟硫磷标准品稀释液，代替实施例5的检测试剂盒中的PBS。将纳米抗体稀释至工作浓度(90ng/mL)。使用实施例5中的检测试剂盒，分别测定纳米抗体sm5与检测抗原B-BSA以及杀螟硫磷标准药物(20ng/mL)的结合能力，评价纳米抗体对不同有机溶剂、同一有机溶剂不同浓度时的耐受能力。
二、实验结果
测定结果如图4所示，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示) 在低浓度有机溶剂中(30％以下丙酮，20％以下乙腈)与检测抗原B-BSA结合活性受影响较小，但是与小分子待测物的结合活性随着有机溶剂浓度的提升急剧下降。当有机溶剂混合液中丙酮比例达到40％，乙腈比例达到30％时，出现药物无法抑制抗体与检测抗原B-BSA结合，信号值不降反升的现象。说明纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)对乙腈、丙酮等标准检测方法中常用的有机溶剂较敏感，随着有机浓度的提高，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)对抗原的结合活性，尤其是对小分子待测物的结合活性大幅下降，应该尽量避免让纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在10％以上的有机溶剂中工作。
实施例9纳米抗体在不同温度下的活性测定
一、实验方法
用PBS稀释纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和杀螟硫磷标准品，将纳米抗体sm5稀释至工作浓度(90ng/mL)，使用实施例5的试剂盒，分别测定纳米抗体sm5与检测抗原B-BSA以及杀螟硫磷标准药物(20ng/mL)，通过icELISA检测其在不同温度下(4℃，室温，37℃，50℃，60℃)孵育一定时间(10min，20min，30min，40min)与检测抗原B-BSA以及杀螟硫磷标准药物的的结合活性。
二、实验结果
测定结果如图5所示，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示) 在4～50℃下孵育一定时间，与检测抗原B-BSA结合活性有小幅提升，但是与小分子待测物的结合活性大幅下降。说明纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在检测小分子待测物时更适合在温和温度的工作环境，不需要孵育设备。
实施例10纳米抗体在不同pH条件下的活性测定
一、实验方法
用不同pH值(5.4，6.4，7.4，8.4，9.4)的0.01M PBS作为抗体和杀螟硫磷标准品稀释液，代替实施例5的检测试剂盒中的PBS。将纳米抗体稀释至工作浓度(90ng/mL)。使用实施例5中的检测试剂盒，分别测定抗体与检测抗原B-BSA以及杀螟硫磷标准药物(20ng/mL)的结合能力，评价纳米抗体在同一离子浓度，不同pH的PBS溶液中与检测抗原B-BSA以及杀螟硫磷标准药物的的结合活性。
二、实验结果
测定结果如图6所示，pH5.4～9.4范围内，纳米抗体sm5(氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示)与检测抗原B-BSA结合活性随pH上升有下降，但是与小分子待测物的结合活性只在小范围波动。说明总体趋势而言，纳米抗体sm5(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)更适合在弱酸性环境下工作。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Gly Val His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Lys Phe Gly Leu Leu Ile Tyr Gly Val His Glu Arg Pro Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu
115 120 125
Asp Pro His
130
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu
1 5 10 15
Asp Pro His
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Leu Thr Leu Gly Val His Ala
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Ser Ala Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Ala Lys Phe Gly Leu Leu Ile Tyr Gly Val His Glu Arg Pro Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 9
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggggtct tcgctgtggt gcgctgagga gacggtgacc tgggtcccct ggccccagta 60
gtccggcctt tcatggacac cgtatattag tagaccgaat ttggctgcac agtaataaac 120
ggccgtgtcc tcaggtttca ggctgttcat ctgcagatac accgtgttct tggcgttgtc 180
tctggagatg gtgaatcggc ccttcacaga gtctacatag tatgtgctcc caccagcact 240
actacctgcg accaattcgc gctccttccc tgcagcctgg cggtaccagc ccatggcatg 300
tacaccgagg gtgagtccag aggctgcaca ggacagtctc agagagcccc cagcctgcac 360
caagcctccc ccagactcca cgagctgcac ctg 393

Claims (8)

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.一种重组载体，其特征在于，为连接有权利要求2所述基因的载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体或能够表达权利要求1所述纳米抗体。
5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在检测杀螟硫磷和/或甲基对硫磷中的应用。
6.一种非诊断目的的杀螟硫磷和/或甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的纳米抗体。
7.一种检测杀螟硫磷和/或甲基对硫磷的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标抗体、显色剂和终止液。
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