CN105131119A - 杂交瘤细胞株f3a2，其产生的单克隆抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测有机磷农药甲基对硫磷的单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株F3A2可以用于制备高效识别甲基对硫磷的单克隆抗体，采用鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析法测得的效价为1.2×104。该抗甲基对硫磷单克隆抗体灵敏度高，对甲基对硫磷的50％抑制浓度(IC50)为21.2ng/mL，与甲基对硫磷结构类似的农药如杀螟硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱、辛硫磷等有机磷农药的交叉反应率均小于0.1％，可用于有机磷农药甲基对硫磷残留的快速检测。

Description

杂交瘤细胞株F3A2，其产生的单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及可分泌用于检测有机磷农药甲基对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体及应用。
背景技术
甲基对硫磷俗称甲基1605，学名O，O-二甲基-O-(4一硝基苯基)硫代磷酸酯，一种有机磷杀虫剂。工业产品为带蒜臭的黄棕色油状液体，纯品为白色结晶，熔点36～36.5℃，难溶于水，易溶于有机溶剂，加热会异构化，高温或遇碱易分解。急性毒性LD50值：对大白鼠经口为14～24mg/kg，对兔经皮为300～400mg/kg，属高毒级农药。因其杀虫谱广，杀虫效果好，在防治农业害虫中有较大的应用，因此，该农药的残留对环境以及人畜安全具有潜在的威胁。
目前，化学农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。
免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，便携而有利于进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。已在医疗、食品等多个领域有较大的应用。本发明利用甲基对硫磷免疫半抗原合成人工免疫原，免疫BALB/C小鼠后利用杂交瘤细胞技术筛选出可分泌高效识别农药甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株F3A2。通过酶标抗甲基对硫磷单克隆抗体建立针对农产品中有机磷农药甲基对硫磷的高灵敏度免疫检测方法(ELISA)：对甲基对硫磷的50％抑制浓度(IC50)为21.2ng/mL，与甲基对硫磷结构类似的农药如杀螟硫磷、对硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱、辛硫磷等有机磷农药的交叉反应率均小于0.1％，针对甲基对硫磷在蔬菜、水和土壤中的添加回收率在95％-110％之间，可用于有机磷农药甲基对硫磷残留的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可稳定分泌抗有机磷农药甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
本发明的另一目的是建立可用于农产品中甲基对硫磷残留快速检测的高灵敏免疫检测方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明提供提供了杂交瘤细胞株F3A2，该细胞株已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201510。
识别有机磷农药甲基对硫磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201510的杂交瘤细胞株F3A2分泌产生。该抗甲基对硫磷单克隆抗体可以高效、特异性识别倍硫磷，对甲基对硫磷的50％抑制浓度IC50为21.2ng/mL。
本发明提供的杂交瘤细胞株F3A2是通过将甲基对硫磷人工免疫原常规免疫BAlB/C小鼠，利用杂交瘤细胞技术将效价最好的小鼠脾细胞与SP2/0进行融合，并利用ELISA方法对获得的阳性克隆孔进行筛选，最终筛选出阳性值与竞争效果最好的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，克隆后再次进行筛选，如此反复筛选3-5次之后，最终筛选获得杂交瘤细胞株F3A2。
本发明提供的抗甲基对硫磷单克隆抗体来自于BALB/C小鼠腹腔。该小鼠经过液体石蜡预处理后，注射杂交瘤细胞株F3A2，并采集该小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，收集得到抗甲基对硫磷单克隆抗体，并应用于甲基对硫磷的免疫检测方法的建立。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株F3A2可以分泌高效识别甲基对硫磷的单克隆抗体，该抗体在酶联免疫吸附方法(ELISA)中测得的效价可达1.2×104。
(2)本发明提供的识别甲基对硫磷单克隆抗体灵敏度高、特异性好，在建立的免疫检测方法中对甲基对硫磷的抑制中浓度IC50为21.2ng/mL，与甲基对硫磷结构类似的农药如如杀螟硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱、辛硫磷等交叉反应均在0.1％以下。
具体实施方式
实施例1：杂交瘤细胞株F3A2的筛选
1.动物免疫
将甲基对硫磷人工免疫原免疫6周龄的BAlB/C小鼠。第一次免疫将甲基对硫磷免疫原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠腹腔注射。第二次免疫将甲基对硫磷免疫原与等体积的福氏不完全佐剂乳化，注射方式与第一次免疫相同，间隔3周。第三、四、五次免疫分别于第二次免疫程序一致，且间隔均为2周。从第3次免疫后，每次免疫后7-8天，小鼠尾部静脉采血，分离血清，利用间接ELISA检测小鼠血清效价。最后一次免疫后，对血清进行效价监测之外同时对血清灵敏度进行评价。选择效价、灵敏度均相对较高的血清所对应的小鼠进行加强免疫，免疫剂量为前面的2倍，不加福氏佐剂，注射方式相同。
甲基对硫磷人工免疫原为甲基对硫磷免疫半抗原与牛血清蛋白的偶合物，杀螟硫磷免疫半抗原的分子结构为：
2.细胞融合
最后一次加强免疫3天后取其脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-12天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；
3.杂交瘤筛选：
用1000倍稀释的甲基对硫磷包被源包被酶标板，1％明胶封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃。
对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，间接竞争ELISA法的具体操作如下：
(1)包被：用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将包被抗原稀释1000倍加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育2h；
(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；
(3)封闭：每孔加入120μL0.1％明胶，37℃孵育1.5h；
(4)洗板：同(2)；
(5)加入甲基对硫磷和细胞上清混合物：每孔加入浓度为100μg/mL的农药溶液(PBST稀释)25μL，再加入细胞上清25μL，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，并平行设置阳性对照和阴性对照；
(6)洗板：同(2)；
(7)加入酶标二抗体：每孔加入50μL经1∶20000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h；
(8)洗板：同(2)；
(9)显色：每孔加入50μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育10min；
(10)终止：每孔加25μL2mol/L的H2SO4溶液；
(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值；
对农药甲基对硫磷出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗甲基对硫磷抗体的阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔分泌的上清即为所制备的甲基对硫磷单克隆抗体。
为获得大量抗甲基对硫磷单克隆抗体，本发明将获得的杂交瘤细胞株FH3注射到预先用无菌石蜡处理过的BALB/C小鼠腹腔，收集该小鼠的腹水，并利用辛酸-硫酸铵法进行纯化后获得抗甲基对硫磷单克隆抗体。
所获得的杂交瘤细胞株于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号：CCTCCNO：C201510，分类命名：杂交瘤细胞株F3A2。
实施例2：抗体应用
将上述获得的单克隆抗体应用于甲基对硫磷检测的酶联免疫方法的建立，并用于农产品中甲基对硫磷含量的测定，其具体步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将包被抗原稀释1000倍加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育2h；
(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；
(3)封闭：每孔加入120μL0.1％明胶，37℃孵育1.5h；
(4)洗板：同(2)；
(5)加入甲基对硫磷和抗体混合物：每孔加入浓度为100μg/mL的农药溶液(PBST稀释)25μL，再加入细胞上清25μL，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，并平行设置阳性对照和阴性对照；
(6)洗板：同(2)；
(7)加入酶标二抗体：每孔加入50μL经1∶20000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h；
(8)洗板：同(2)；
(9)显色：每孔加入50μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育10min；
(10)终止：每孔加25μL2mol/L的H2SO4溶液；
(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值；
用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值，并计算抑制率。抗体的IC50＝21.2ng/mL。
实施例3：上述ELISA检测方法的评价
1.交叉反应的评价：通过评价该ELISA方法与系列有机磷农药的交叉反应来判断该检测方法的特异性。选择待测的农药包括：杀螟硫磷、对硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱、辛硫磷等。以这些农药为竞争物在该免疫电化学检测方法中获得的IC50值来计算该检测方法的交叉反应大小，具体计算方式如下：
CR(％)＝[IC50(甲基对硫磷)/IC50(受测竞争物)]×100，公式中，设定检测系统对甲基对硫磷的交叉反应率为100％。
2.准确性的评价：通过测试该检测方法对实际样品基质的抗干扰能力来判断该体系的准确性。我们选择青菜、水和土壤作为检测对象。具体检测方法如下：
将甲基对硫磷稀释成系列梯度的甲醇溶液，加入到相应的样品中。每克样品(青菜叶片切割为细丝状)中加入1mL甲基对硫磷甲醇溶液。所有样品静止半小时，稳定后，提取样品的上清液(水样中为混合液)，并用PBST稀释20倍。将该稀释液加入到上述ELISA体系中，并测定相应的回收率。
经评价后，上述甲基对硫磷ELISA体系对与杀螟硫磷结构相近的有机磷农药，如倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等的交叉反应率均在0.1％以内；在青菜、水和土壤中的添加回收率为95％-110％。说明该ELISA方法对甲基对硫磷具有较好的选择性，在青菜、土壤和水中的甲基对硫磷残留检测中具有较好的应用前景。

Claims (3)

1.一种用于检测有机磷类农药甲基对硫磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO：C201510的杂交瘤细胞株F3A2产生，为IgG1型，抗体轻链为Kappa型。
2.产生权利要求1所述的用于检测检测有机磷类农药甲基对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株F3A2，于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201510。
3.权利要求1所述的抗有机磷类农药甲基对硫磷单克隆抗体在农产品中甲基对硫磷残留量测定中的应用。
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