CN102372737B - 甲基对硫磷人工半抗原、人工抗原、特异性抗体的制备方法及其用途 - Google Patents
甲基对硫磷人工半抗原、人工抗原、特异性抗体的制备方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲基对硫磷人工半抗原、人工抗原的制备方法及其用途。属于农药免疫化学技术领域。发明以3-巯基丙酸作为功能团试剂，从甲基对硫磷的甲氧基部位引入间隔臂和活性基团，合成了半抗原O-甲基-N-(2-羧乙基)硫代-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯(简称MP)。然后分别通过混合酸酐法和活性酯法与蛋白质偶联制备人工抗原。将免疫原免疫动物制备了对甲基对硫磷高亲和力、高特异性的抗体。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)可用于快速检测样本中痕量的甲基对硫磷残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲基对硫磷人工半抗原、人工抗原、特异性抗体的制备方法及其在酶联免疫吸附分析方法(ELISA)方面的应用。属于农药免疫化学技术领域。
背景技术
农药的大量使用所造成的环境污染问题，已引起人们的高度重视。随着经济的发展和人们环保意识的加强，我国也日益重视对环境、食品中农药残留的监测。加强对农药残留监测研究，对合理使用农药、保护环境和保障人类健康都具有重要的理论和现实意义。传统的农药残留分析方法如液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)等都存在样品前处理复杂，仪器设备昂贵，对技术人员要求高，完成一次分析费时长等问题，迫使人们运用新的原理和方法去开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、安全廉价，且能同时在野外和实验室内进行大批量的筛选试验的分析新技术；免疫化学分析技术正可以满足这些需求，受到农药残留检测工作者的重视，并以其独特的优势逐渐成为农药残留快速检测的热点。这一技术目前已成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域，被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术，美国化学会(AOAC)将免疫分析与气相色谱、液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。
免疫学基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等多种因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可在体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用于建立免疫分析方法，同时适于检测生物大分子和复杂样本中小分子如农药等痕量组分。而与大分子不同，小分子化合物免疫分析有其自身特点：1.小分子化合物(分子量小于1000)一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体。2.小分子化合物虽不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可以在体外定量进行。农药小分子化合物免疫化学分析技术即是依靠以上免疫学原理和生物技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，通过免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，再利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中超微量小分子目标分析物。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工抗原抗体的制备；因此，目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容。
甲基对硫磷(Parathion-methyl)，O，O-二甲基-O-(对硝基苯基)硫代磷酸酯，是由德国法本公司合成的用于防治多种农业害虫的有机磷酸酯类杀虫剂，能抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活力而致死，杀虫谱广；主要用于防治棉花、水稻、果树害虫。由于其毒性较高，近年来已经在蔬菜水果上禁止使用，但在农产品的进出口贸易、食品和环境安全的监督检测中，甲基对硫磷等一类高毒化合物仍然是常规检测的重要污染物。
甲基对硫磷的常规残留分析方法是气相色谱法或液相色谱法，但由于其对于人力、物力的较高要求，很难满足快速检测的需要。因此开展农药残留的快速检测研究具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲基对硫磷人工半抗原、人工抗原及其特异性抗体的制备方法，以及应用这些抗体所建立的酶联免疫分析方法。该方法有效解决了传统残留检测分析方法耗时长、设备贵、对人员及场地要求高等缺陷，具有广泛的应用前景。
本发明根据甲基对硫磷的结构特征，从磷酸酯甲氧基部位引入间隔臂和活性基团，合成半抗原：O-甲基-S-(2-羧乙基)-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯(简称MP)，再分别与几种蛋白载体结合，合成人工抗原。选取其中结合比较高的人工抗原MP-AE-BSA作为免疫原进行免疫，获得高效价抗体，并由此建立了酶联免疫分析检测方法。经过添加回收实验测定数据表明，该方法符合农药残留分析的要求。
具体实施方式
本发明的总体技术方案如下：
半抗原的合成→人工抗原的制备→特异性抗体的制备→ELISA方法建立与
鉴定→实际样本的分析
1.甲基对硫磷人工半抗原的合成
农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体，因此，半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具有待测物的特征结构，特别是立体化学特征，另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性的抗体。1)半抗原通常由待测物衍生化制备，或由原料合成，待测物的代谢或降解产物往往是有用的半抗原；2)除待测物特征结构外，在半抗原的末端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联的活性基团；3)在活性基团与载体之间，必须有一定长度的间隔臂，以便使半抗原突出于载体表面，易为有机免疫系统识别；4)间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团；5)半抗原的设计应考虑到农药原型和有毒理学意义的待测物，以及测定对象是单一的农药或某一类农药；6)从机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程，半抗原诱导的抗体的选择性和亲和性尚难预测，多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。
本发明中以3-巯基丙酸为功能团试剂，从甲基对硫磷的甲氧基部位引入间隔臂和活性基团。具体合成方法如下：
分别称取质量比为4∶3的PSCl3和无水甲醇，于15℃下将无水甲醇逐滴加入PSCl3，反应1h后用水洗涤反应液，得浅黄色油状物I→分别称取质量比为4∶3的油状物I和对硝基苯酚，搅拌下加入三正丁胺，反应20min后滴加6mol/L氢氧化钠溶液，反应1h→过滤，用乙醚提取，乙醚相依次用质量分数为5的氢氧化钠水溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析，用石油醚/乙醚(7∶1，体积比)淋洗，得淡黄色油状物II→分别称取质量比为2∶1的3-巯基丙酸和黄色油状物II溶于10～20mL二甲亚砜中，缓慢加入少量氢氧化钠或氢氧化钾固体，搅拌使其溶解；油浴缓慢升温至100℃，保温2h后撤去油浴，待冷却至室温后，加入20mL蒸馏水，以稀盐酸调节pH值为3.0～5.0；用二氯甲烷3×30mL提取，收集有机相，用水3×15mL洗涤有机相，无水MgSO4干燥，蒸去溶剂即得产物：O-甲基-S-(2-羧乙基)-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯(MP)。
制得甲基对硫磷人工半抗原MP结构式为：
2.甲基对硫磷人工抗原的合成
人工抗原的合成主要是将农药小分子半抗原与载体蛋白通过化学反应共价结合，通常是采用适当的双官能团试剂使半抗原与载体蛋白质偶联。偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行；选择载体蛋白应尽量考虑使背景干扰减少到最低程度。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。
本发明采用牛血清白蛋白(BSA)和钥孔嘁蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，分别以活性酯法(AE)和混合酸酐法(MA)使半抗原与载体蛋白偶联，制备了相应的甲基对硫磷人工抗原；并采用紫外吸光度法测定人工抗原的蛋白含量，灰化定磷法测定结合物中磷的含量，然后计算结合比。
免疫原的合成采用活性酯法。将50～80μmol半抗原MP溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入等当量的二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mL的牛血清白蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应4h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8％生理盐水透析，分装保存于-20℃冰箱中。
包被原的合成用混合酸酐法。将80～100μmol半抗原MP溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应2h，取反应液500～800μL加入到8～10mL20mg/mL的钥孔嘁蓝蛋白(KLH)碳酸缓冲溶液中，然后磁力搅拌下反应3h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。
甲基对硫磷人工半抗原分别以活性酯法和混合酸酐法与蛋白质合成甲基对硫磷人工抗原的分子结构式为：
1)蛋白含量的测定
取0.1mL蛋白质结合物溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释10倍，取稀释液0.5mL，加新配制的Folin-酚试剂A0.4mL，10min后加入Folin-酚试剂B0.5mL，30min后于500nm处比色，与标准对照，测得蛋白浓度。
其中，免疫原MP-AE-BSA的蛋白浓度为4.38mg/mL；包被原MP-MA-KLH的蛋白浓度为1.29mg/mL。
2)结合比的计算
蛋白偶联物中磷的含量与蛋白含量的比值(摩尔比)，即为结合比。用下式计算：
经计算，免疫原MP-AE-BSA的结合比为1∶34；包被原MP-MA-KLH的结合比为1∶99。
3.抗体的制备
选取成年的新西兰大白兔，观察一周后进行基础免疫。免疫剂量为1.0mg/kg，免疫抗原(MP-AE-BSA)用生理盐水稀释，加入等体积弗氏试剂，乳化后，进行背部多点皮内注射。
三周后，进行加强免疫，免疫剂量为1.0mg/kg，加入等体积弗氏不完全佐剂，背部多点皮下注射。以后每三周按同样的剂量和方法免疫一次。从第三次免疫开始，每次免疫一周，从兔子的耳缘静脉采血，测定抗体效价及特异性。实施例1：半抗原MP的合成
称取52.0gPSCl3，于15℃下逐滴加入39.0g无水甲醇，反应1h后用水洗涤反应液，得浅黄色油状物I→称取I40.0g，加入对硝基苯酚30.0g，搅拌下加入3mol三正丁胺，反应20min后滴加6mol/LNaOH溶液40mL，反应1h。过滤，用乙醚提取，乙醚相依次用质量分数为5的NaOH水溶液和蒸馏水洗涤，无水MgSO4干燥，柱层析，用石油醚/乙醚(7∶1，体积比)淋洗，得淡黄色油状物II→称取3-巯基丙酸6.2g和黄色油状物II3.1g溶于10mL二甲亚砜中，投入三口烧瓶，缓慢加入1.0gNaOH，磁力搅拌使其溶解；油浴缓慢升温至100℃，保温2h后撤去油浴，待冷却至室温后，加入20mL蒸馏水，以稀盐酸调节pH值为3.0～5.0；用二氯甲烷3×30mL提取，收集有机相，用水3×15mL洗涤有机相，无水MgSO4干燥，蒸去溶剂即得产物：O-甲基-S-(2-羧乙基)-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯(MP)。
产物(MP)鉴定：取上述合成的产物分别经ESI-MS、1H-NMR确定结构：ESI-MS中丰度最大的为产物分子离子峰m/z306，1HNMR(CDCl3，400MHz)1.27～1.46(m，2H，CH2)，2.68～2.92(m，2H，CH2S)，3.63～3.88(d，3H，CH3)，7.21～8.25(m，4H，Ar-H)，11.89(br，1H，-COOH)。
从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。
实施例2：半抗原MP的合成
称取52.0gPSCl3，于15℃下逐滴加入39.0g无水甲醇，反应1h后用水洗涤反应液，得浅黄色油状物I→称取I40.0g，加入对硝基苯酚30.0g，搅拌下加入3mol三正丁胺，反应20min后滴加6mol/LNaOH溶液40mL，反应1h。过滤，用乙醚提取，乙醚相依次用质量分数为5的NaOH水溶液和蒸馏水洗涤，无水MgSO4干燥，柱层析，用石油醚/乙醚(7∶1，体积比)淋洗，得淡黄色油状物II→称取3-巯基丙酸6.2g和黄色油状物II3.1g溶于20mL二甲亚砜中，投入三口烧瓶，缓慢加入2.0gNaOH，磁力搅拌使其溶解；油浴缓慢升温至100℃，保温2h后撤去油浴，待冷却至室温后，加入20mL蒸馏水，以稀盐酸调节pH值为3.0～5.0；用二氯甲烷3×30mL提取，收集有机相，用水3×15mL洗涤有机相，无水MgSO4干燥，蒸去溶剂即可。
实施例3：半抗原MP的合成
称取52.0gPSCl3，于15℃下逐滴加入39.0g无水甲醇，反应1h后用水洗涤反应液，得浅黄色油状物I→称取I40.0g，加入对硝基苯酚30.0g，搅拌下加入3mol三正丁胺，反应20min后滴加6mol/LNaOH溶液40mL，反应1h。过滤，用乙醚提取，乙醚相依次用质量分数为5的NaOH水溶液和蒸馏水洗涤，无水MgSO4干燥，柱层析，用石油醚/乙醚(7∶1，体积比)淋洗，得淡黄色油状物II→称取3-巯基丙酸6.2g和黄色油状物II3.1g溶于10mL二甲亚砜中，投入三口烧瓶，缓慢加入1.0gKOH，磁力搅拌使其溶解；油浴缓慢升温至100℃，保温2h后撤去油浴，待冷却至室温后，加入20mL蒸馏水，以稀盐酸调节pH值为3.0～5.0；用二氯甲烷3×30mL提取，收集有机相，用水3×15mL洗涤有机相，无水MgSO4干燥，蒸去溶剂即可。
实施例4：人工抗原的合成
4.1免疫原的制备
免疫原的合成采用活性酯法。将0.01mmol半抗原MP、1.73mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.015mmol)、3.09mg二环己基碳二亚胺(DCC)(0.015mmol)溶解在0.2mL无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，室温下搅拌反应18h，将反应液5000rpm离心10min，弃沉淀，上清液为活性酯。称取10mg牛血清白蛋白(BSA)溶于1mL碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH9.6)中，4℃搅拌下缓慢逐滴加入0.1mL活性酯，约1h加完；继续搅拌4h，反应液装入透析袋，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析72h，换6次液；透析后离心，弃沉淀，上清液分装保存于-20℃冰箱中。
4.2包被原的制备
包被原的合成用混合酸酐法。称取0.02mmol半抗原MP溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入7.1μL正三丁胺和4μL氯甲酸异丁酯，在室温下反应1h，取反应液500μL加入到10mL20mg/mL的钥孔嘁蓝蛋白(KLH)碳酸缓冲溶液中，然后磁力搅拌下反应3h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析3次(每隔4小时换液一次)，然后在0.01M磷酸盐缓冲溶液中透析4天，分装保存于-20℃冰箱中。
4.3人工抗原结合比测定
将偶联物溶液以0.01MpH7.4的PBS稀释，使其OD值在0.5～1.0之间，同样配制0.5mg/mL载体蛋白溶液和0.05mg/mL的半抗原溶液(以1％甲醇稀释)，以稀释液做空白，分别对蛋白质溶液、半抗原溶液、偶联物溶液进行紫外扫描。结果经计算，免疫原MP-AE-BSA的结合比为1∶34；包被原MP-MA-KLH的结合比为1∶99。
实施例5：抗体的制备
5.1免疫动物制备抗血清
选取半周岁左右健康新西兰大白兔，体重为2～3kg，观察一周后进行基础免疫。实验免疫剂量：基础免疫为1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量MP-AE-BSA复合物，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下兔疫6点，大腿肌肉注射2点。三周后进行加强免疫，以后每三周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫一周，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。
五免后血清效价达到要求，在五免后第10天进行采血。本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。将采集的血液在室温下静置2h，然后置于4℃冰箱中过夜并尽量倾斜使之充分收凝；次日，待血块收缩后，用毛细吸管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15min，分离出血清。
从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，效价可达到45000倍。
5.2抗体的纯化与鉴定
采用50％饱和硫酸铵沉淀法。具体操作如下：
(1)用无菌生理盐水将血清稀释一倍，在搅拌条件下缓慢加入等量饱和硫酸铵，于4℃冰箱中放置过夜；次日取出以3000rpm离心30min后取沉淀。
(2)向沉淀物中加入原血清2倍的生理盐水，待充分溶解后，再加入半量的饱和硫酸铵(即33％饱和度)，进行第二次沉淀，静置，离心，弃去上清液；如此重复两次，是沉淀物达到完全白色为止。
(3)沉淀物以原血清量1/5～1/10的生理盐水溶解，置透析袋中用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析脱盐，每6小时换液一次，共换液8次。透析后3000rpm离心15min，弃去沉淀得到抗体。
实施例6：甲基对硫磷酶联免疫分析方法的建立
6.1甲基对硫磷酶联免疫分析方法的原理
采用间接竞争酶联免疫分析方法。其原理是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制得固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体，固相抗原中的农药、待测农药，与抗体进行竞争结合反应。待测农药含量多，则被结合在固相抗原上的抗体少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定。当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应就减弱，抑制率增高；反之，则发色反应增强，抑制率降低。因而可以根据已知量农药的标准线盒待测样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。
6.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法，同时稀释抗血清和固相抗原包被液。在同一包被液浓度下，随着抗血清的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗血清稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得的OD值也呈下降趋势。根据通常选择OD值为1.0(结合率＝1.0)左右的抗血清和包被抗原浓度作为工作浓度。
6.3工作曲线的制作
采用间接ELISA法测定甲基对硫磷对抗原抗体结合反应的抑制率，以抑制率为纵坐标，以甲基对硫磷浓度的对数为横坐标，建立甲基对硫磷对抗原抗体结合反应的抑制曲线和回归方程。根据回归方程计算出线性范围及产生20％和50％抑制作用是所需的甲基对硫磷的浓度。即I20和I50，以I20为方法的检测限。抑制率按下式计算：
6.4抗体的特异性
用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗血清，其中含的抗体分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时，甲抗原可与乙抗原的抗血清反应，而乙抗原也可与甲抗原的抗血清反应，称为交叉反应。抗血清的特异性即是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。交叉反应越小，抗血清的特异性则越好。
利用所建立的ELISA方法，对甲基对硫磷的同系物、结构类似物、代谢物等进行了交叉反应实验，基本操作与标准曲线的测定方法相同，只需将甲基对硫磷标准溶液用各待测化合物溶液代替即可。测得它们抑制50％所需的浓度，再根据下式算出交叉反应率：
与甲基对硫磷结构上类似的化合物有：杀螟硫磷、马拉硫磷、甲基毒死蜱、乐果、对硝基酚、对硫磷等。因此选择以上类似物作亲和性和交叉反应率实验。经测定，杀螟硫磷、马拉硫磷、甲基毒死蜱、乐果对甲基对硫磷抗体均不显示交叉反应，I50＞105ng/mL；与对硝基酚和对硫磷交叉反应率分别为0.5％和14.5％。说明从甲基对硫磷甲氧基部位连接蛋白的免疫原充分突出了甲基对硫磷对硝基苯基磷酸酯的结构，从而使得MP-AE-BSA对各类似农药的交叉反应率均较小，仅仅与结构非常类似的化合物有较高的交叉反应率。从而可知，所制备的抗体的特异性强。
6.5样品测定
6.5.1回收率
在定量样品中添加一定量的农药标样，提取液作适当的稀释后用于ELISA分析，根据ELISA测得的OD值及抑制率从标准曲线上查得农药的含量，然后再换算得样品中农药的含量，进而计算回收率。回收率越高，则说明测得值与真实值接近程度越好，方法越可靠；若回收率较低，则方法的可信度较差。
6.5.2精密度
即方法的重复性。如果一个分析方法测定结果的重复性差，就无法评价其灵敏度、特异性和准确度，也就无法得出具有说服力的结果。在ELISA实验中，常采用批内和批间误差来表示其精密度。
(1)批内误差：以标准曲线的批内平均变异系数来表示。
(2)批间误差：以6块不同板上的测定结果进行平均，求得标准曲线12个剂量的批间平均变异系数即为批间变异系数。
从实验结果可以看出，甲基对硫磷含量高的样品在测定过程中，其重复性较好，批内批间的变异较小，且批内批间相差也较小。
实施例7：甲基对硫磷酶联免疫吸附测定方法建立
7.1间接酶联免疫法工作浓度的确定
(1)包被
从低温冰箱中取出MP-MA-KLH偶联复合物，室温下完全解冻后，配制浓度为8μg/mL，然后倍比稀释至4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL，在96孔酶标板中每孔加入以上所配的抗原包被液100μL，于37℃条件下温育2h。
(2)封闭
取出包被好的反应板，每孔加入200μL洗液，放置3min，再甩掉洗涤液(洗涤液：0.05％吐温-200.01MPBS溶液)，重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。每孔加入封闭液150μL，于37℃条件下封闭0.5h。取出弃封闭掖，洗板。
(3)点板
用0.01MPBS配制抗体冻干粉溶液，浓度分别为4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL，按浓度梯度顺序加入酶标板中，每孔100μL，同时以阴性血清作对照，每个浓度重复三次，于37℃条件下温育0.5h，洗板。
(4)加酶标二抗
将羊抗兔酶标二抗用稀释液配成1∶5000的浓度，每孔加入100μL，在37℃温育0.5h，洗板。
(5)显色
每孔加入底物邻苯二胺溶液(用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液配制)将现配制100μL，37℃避光温育15min。
(6)终止及测定
取出后每孔加入50μL的2M硫酸终止反应；以对照孔调零，用酶标仪测定各孔的OD值。
选择抗体冻干粉浓度1.0μg/mL、包被抗原浓度0.5μg/mL，为最佳包被浓度。
7.2标准曲线的制备
标准曲线制备的操作步骤如下：
(1)包被
从低温冰箱中取出MP-MA-KLH偶联复合物，室温下完全解冻后，稀释至0.5μg/mL，在96孔酶标板中每孔加入以上所配的抗原包被液100μL，于37℃条件下温育2h。
(2)封闭
取出包被好的反应板，每孔加入200μL洗液，放置3min，再甩掉洗涤液(洗涤液：0.05％吐温-200.01MPBS溶液)，重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。每孔加入封闭液150μL，于37℃条件下封闭0.5h。取出弃封闭液，洗板。
(3)点板
将甲基对硫磷的甲醇溶液(1000mg/L)用去离子水倍比稀释至10000mg/L、1000mg/L、500mg/L、100mg/L、50mg/L、5mg/L、1mg/L、0.1mg/L、0mg/L。取出抗体冻干粉，用0.01MPBS缓冲溶液配制成响应工作浓度1.0μg/mL。
在反应板中每孔加入经系列稀释制备出的甲基对硫磷各浓度标准液50μL，再加入抗血清稀释液50μL，对照孔加入阴性血清50μL和抗血清稀释液50μL。每个浓度重复三次，于37℃条件下温育0.5h，洗板。
(4)加酶标二抗
将羊抗兔酶标二抗用稀释液配成1∶5000的浓度，每孔加入100μL，在37℃温育0.5h，洗板。
(5)显色
每孔加入底物邻苯二胺溶液(用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液配制)将现配制100μL，37℃避光温育15min。
(6)终止及测定
取出后每孔加入50μL的2M硫酸终止反应；以对照孔调零，用酶标仪测定各孔的OD值。
根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，由公式计算得甲基对硫磷各浓度的抑制率作图。包被原和抗体浓度分别为0.5μg/mL与1.0μg/mL时，不同浓度甲基对硫磷对抗原抗体结合反应的抑制率曲线如附图，可知在1～500ng/mL范围内甲基对硫磷浓度与抑制率有较好线性关系，线性方程为：B/B0＝-25.6logC+86.4，R2＝0.994，计算得I50＝26.3ng/mL和最低检测限I20＝1.8ng/mL。
实施例8：样本测定
(1)提取方法
选择土壤和河水作为实验样本，对甲基对硫磷进行添加回收率试验。共设定3个添加水平：0.1mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg，另设一个空白样本，每个水平重复3次测定。土壤样本用乙酸乙酯提取，振荡20min后各取一定体积溶液吹干，其中一部分用PEST定容后采用ELISA测定，另一部分用乙酸乙酯定容后采用GC-FPD测定，比较实验结果。河水样本用二氯甲烷萃取3次后，各取一定体积溶液吹干，一部分用PEST定容后采用ELISA测定，另一部分用乙酸乙酯定容后采用GC-FPD测定，计算回收率。
(2)样本的酶联免疫方法测定
方法同标准曲线的制作。已包被好的板每孔加入系列已知添加浓度的样品液50μL，再加配制好的抗体溶液50μL，对照孔加入100μL抗血清，盖好板，37℃温育2h，洗板，后续步骤同前。
经分析可知，该方法在土壤样本和水质样本中的平均回收率分别为92.15％和91.89％，平均变异系数分别为7.58％和6.03％，最低检测限分别为0.004mg/kg和0.003mg/kg(气相色谱法测定甲基对硫磷在土壤和水质样本中残留量的最低检测限分别为0.01mg/kg和0.004mg/kg）。
结果说明，采用ELISA方法测定土壤和河水空白与PBST空白得到的OD值无显著性差异，说明基质空白对抗原抗体结合反应不产生干扰。采用ELISA方法测得土壤和河水中甲基对硫磷的添加回收率及变异系数均与气相色谱测定数据吻合，符合农药残留分析的要求。采用所建立的ELISA方法检测土壤和河水中甲基对硫磷的检测灵敏度比GV稍高，说明所建立的ELISA方法适用于甲基对硫磷残留量的检测；且与气相色谱法相比，ELISA方法的样品前处理快捷简单，能大大提高工作效率。
Claims (2)
1.一种甲基对硫磷人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为：
2.一种甲基对硫磷人工抗原，其特征在于是由权利要求1中所述的甲基对硫磷人工半抗原与蛋白质结合而得到，所述硫磷人工抗原分子结构式为：
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