CN1966523A - 毒死蜱单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

毒死蜱单克隆抗体的制备方法是一种针对特定农药的单克隆抗体的制备方法，其制备方法首先通过亲核取代反应在毒死蜱的吡啶环上第6位氯原子上引入一个偶联桥，并与大分子载体蛋白结合制备人工完全抗原；将毒死蜱人工完全抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，经杂交瘤抗体检测和多次克隆后得到能稳定分泌毒死蜱抗体的阳性杂交瘤细胞，且分泌抗体同属IgG1亚类；利用抗体效价较高的细胞株分泌的单克隆抗体，建立毒死蜱间接竞争ELISA试验，最低检测限可达0.03μg/mL，该抗体与与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷等有机磷类农药没有交叉反应，特异性强，可用于毒死蜱的免疫检测。

Description

毒死蜱单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明是一种针对特定农药的单克隆抗体的制备方法，属于农药污染现场免疫监测试剂制造的技术领域。

背景技术

上个世纪中叶以来，随着各种农药在农业生产、食品储藏及日常生活中的广泛应用，有关农药残留物引起的水源、食品、农作物、环境等污染的报告日益增多，这些农药及其代谢产物中有许多属于持久性有机物(POPs)、“三致”物质和环境内分泌干扰物(EDCs)，对环境和人类的危害严重而持久，农药污染问题因而成为急需监测、治理的焦点之一。我国是世界第二大农药生产国，同时也是第一大农药消费国，近几年国内农药年消费量均为50～60万吨左右，农药污染问题尤为严重。

杀虫剂是我国农药消费和生产的主体，总产量一直占农药总产量的75％左右。在杀虫剂中，有机磷类杀虫剂产量占70％。随着国内高毒农药品种的禁用，以前广泛使用的甲胺磷、久效磷、甲基对硫磷、对硫磷等高毒品种近几年逐渐被毒死蜱、甲基毒死蜱、嘧啶磷、甲基嘧啶磷等中低毒品种取代，这些新型农药的污染监测问题也随之而来。毒死蜱(Chlorpyrifos)，化学名称为O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，别名乐斯本或陶斯松(Lorsban，Dursban)。其纯品为白色或灰白色颗粒结晶，具微弱的硫醇味，相对分子量为350.62，熔点为42.5℃～43.0℃，易溶于大多数有机溶剂。目前在我国农作物病虫害的防治中发挥了很大作用，但它同时也对农田环境及其有益生物产生了影响，新近的流行病学调查发现毒死蜱与肺癌的发生可能存在某些联系，而且有研究显示其极可能具有内分泌干扰作用。另外，对食品和农产品，一些国家制定的技术法规和标准越来越高，对进口食品和蔬菜水果的农药残留量的安全卫生要求越来越高，限量指标越来越严格。毒死蜱在我国蔬菜残留量的限量标准是1mg/kg，而日本制定毒死蜱的残留限量标准时，将从我国进口量较大的菠菜中的毒死蜱残留量定为0.01mg/kg，欧洲的标准也达到0.05mg/kg。鉴于此，能否及时监测农药在环境中或蔬菜水果中的残留含量就显得至关重要，同时，对农药检测方法的精度和效率也提出了很高的要求。目前农药的检测多采用气相和液相色谱法，不仅仪器昂贵、提取纯化费时费力，还需要专业人员操作，给技术普及带来困难，显然难以用于农药的现场监测。

近年来基于单克隆抗体制备技术的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)在包括农药污染物在内的检测领域引起了广泛的关注，并且展开了深入的研究和一定范围的应用。它具有的突出优点是：(1)来自统一细胞的McAb可以大量产生，质地均一，易于标准化管理，可以用于制备免疫分析试剂盒，使操作简便、快速；(2)由于McAb是作用于同一抗原决定簇的、完全均一的单一抗体，不易产生交叉反应，使检测具有较高的特异性；(3)通过杂交瘤技术得到特异的抗体，不易被无关抗体干扰，因此有较高的灵敏度。这一技术的推广使免疫检测成为农药检测中一种简便、快速、灵敏、特异、样品通量大、检测费用低廉、适用现场监测的分析方法。

从20世纪80年代开始，美国环境保护局(EPA)开始研究免疫检测技术在环境污染监测方面的应用，到1999年，EPA的固体废弃物部门共批准了包括氯丹、DDT等农药在内的17种物质的免疫检测方案。世界粮农组织已向许多国家推荐此项技术，美国化学会也将免疫分析与气相色谱、液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。农药的免疫检测技术也引起了我国相关研究人员和科研机构的兴趣和重视。由南京农业大学主持，中国农科院等单位参加的“十五”863课题“农药残留免疫监测技术研究及检测试剂盒研制”已开发出甲胺磷、对硫磷等农药的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体，针对这些农药建立了可检测环境中农药残留的ELISA方法，研制了农药残留现场快速检测的金标免疫试纸条和室内快速准确检测的ELISA试剂盒。目前国内外对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、有机氯类、三嗪类等几大类中的大多数的农药品种都进行了McAb的研究。国内外市场上已出现了可用于多种农药污染物的免疫检测试剂盒，大大方便了农药的监测工作。以ELISA为主的免疫检测技术正成为初步筛检农药污染物的有效手段，尤其是对农药暴露评价和现场检测以及大量样品的快速分析更显示出了独特优势，在农药污染的检测和环境风险评价中具有重要的意义。

目前，国外虽有关于毒死蜱农药残留的免疫测定研究的报道，而国内仅有的报道是用兔抗血清制成的毒死蜱多克隆抗体，没有毒死蜱单克隆抗体制备成功的报道。由于多克隆抗体特异性差，存在交叉反应，难以满足对毒死蜱残留进行监控分析的需要，因此如果能筛选到分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株，大量制备出毒死蜱的单克隆抗体，建立毒死蜱的免疫分析方法，则可以更有效的对毒死蜱残留进行监控，实现毒死蜱的快速、特异、灵敏的现场监测。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，以毒死蜱为研究对象，通过合成毒死蜱人工抗原制备毒死蜱的单克隆抗体，建立检测毒死蜱的酶联免疫试验，用于毒死蜱暴露的快速检测。

技术方案：毒死蜱(Chlorpyrifos)的相对分子量为350.62，属于小分子环境污染物(micromolecule environmental pollutant)，单独作用时不能刺激机体产生抗体，不具有免疫原性，只有与大分子载体结合成完全抗原后才能刺激机体产生其特异性的抗体。在合成完全抗原时，为了有利于半抗原暴露在外面，增加免疫机体产生抗体的能力，常在目标分子和大分子载体之间加一个偶联桥，最好的偶联桥是中等大小，3～6个碳原子的直链结构。毒死蜱的吡啶环上第6位氯原子(即图1中位点I处)易通过亲核取代反应被取代，从而引入新的基团；桥分子则选择含3个直链碳原子的3-巯基丙酸，因为3-巯基丙酸分子上有一个巯基基团，在碱性条件下可与毒死蜱分子反应后生成半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯，其羧基基团能方便的与蛋白质载体偶联合成完全抗原。在碱性条件下，将毒死蜱与3-巯基丙酸加热回流反应后通过碳二亚胺法以牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白合成毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原，经紫外光谱法和钼兰比色法鉴定后免疫Balb/c小鼠，制备脾细胞悬液，在48％～52％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以HAT培养基选择性培养融合细胞，经多次筛选和克隆后得到能稳定分泌毒死蜱抗体的阳性杂交瘤细胞，所分泌抗体经检测属于IgG1亚类。间接ELISA检测发现阳性杂交瘤细胞的培养上清液与载体蛋白OVA、BSA反应呈阴性，与合成的包被抗原反应呈阳性，间接竞争ELISA检测发现毒死蜱能与细胞上清液内的抗体进行特异性结合，表明该单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗毒死蜱的。用扩增培养后的细胞株诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了毒死蜱单克隆抗体，紫外分光光度法测定其抗体含量。以方阵法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，建立毒死蜱的间接竞争ELISA试验，结果显示试验IC₅₀值为0.135μg/mL，线性检测范围为0.04～0.42μg/mL，最低检测限为0.03μg/mL；选择杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷三种农药进行交叉反应试验，特异性研究表明获得的单克隆抗体与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷没有交叉反应。

制备工艺：通过亲核取代反应在毒死蜱的吡啶环上第6位氯原子上引入一个偶联桥，并与大分子载体蛋白结合制备人工完全抗原；将毒死蜱人工完全抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在质量百分浓度48％～52％聚乙二醇作用下小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，经杂交瘤抗体检测和多次克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌毒死蜱抗体。

具体的制备工艺为：

a)毒死蜱完全抗原的合成与鉴定：在碱性条件下，将毒死蜱原药与3-巯基丙酸加热回流，使毒死蜱分子吡啶环上第6位氯原子通过亲核取代反应被3个直链碳原子的3-巯基丙酸取代而合成了半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯，并通过碳二亚胺法与大分子载体蛋白结合制备人工完全抗原，紫外光谱法和钼兰比色法验证合成的完全抗原；

b)毒死蜱单克隆抗体细胞株的制备及筛选：用合成的毒死蜱抗原免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在质量百分浓度48％～52％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基选择性培养融合细胞，间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验检测筛选出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌毒死蜱抗体；

c)毒死蜱单克隆抗体的制备纯化：用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了毒死蜱单克隆抗体，紫外分光光度法测定其抗体含量；

d)毒死蜱单克隆抗体的鉴定：阳性杂交瘤细胞分泌的毒死蜱单克隆抗体，经间接ELISA检测结果表明属于IgG1亚类，间接ELISA和间接竞争ELISA证实该类抗体只与毒死蜱有特异性结合，而不与载体蛋白反应，表明单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗毒死蜱的。

亲核取代反应的方法是：

有益效果：本发明的优点是制备了毒死蜱的单克隆抗体，利用该抗体建立的酶联免疫试验，可用于毒死蜱暴露的快速检测。这种抗毒死蜱的单克隆抗体可以弥补现有的多克隆抗体特异性差，存在交叉反应的问题，因此以抗毒死蜱的单克隆抗体建立毒死蜱的免疫分析方法，可以更有效的对毒死蜱残留进行监控，实现毒死蜱的快速、特异、灵敏的现场监测。

具体实施方式

I)毒死蜱完全抗原的合成与鉴定：

在碱性条件下，将毒死蜱原药与3-巯基丙酸加热回流反应，使毒死蜱分子吡啶环上第6位氯原子通过亲核取代反应被3个直链碳原子的3-巯基丙酸取代而合成了半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯，随后通过碳二亚胺法分别以牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白合成了毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原。

用紫外光谱法和钼兰比色法对上述人工合成的抗原进行鉴定，结果表明：人工合成的完全抗原的最大紫外吸收峰与各自原载体蛋白及半抗原相比均发生了变化，2种完全抗原最大紫外吸收峰的位置明显向远紫外区偏移，间接说明了完全抗原的合成是成功的。钼兰比色法测定完全抗原中磷含量并计算出人工合成的免疫抗原和包被抗原中载体蛋白与毒死蜱的结合比分别为1∶64与1∶19。

II)毒死蜱单克隆抗体细胞株的制备及筛选

用合成的免疫抗原按常规免疫方案免疫Balb/c小鼠，经间接ELISA检测小鼠血清效价达到要求后，选择血清效价最高的小鼠用于细胞融合。用48％～52％聚乙二醇融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以HAT培养基选择性培养融合细胞，间接ELISA检测和间接竞争ELISA检测筛选出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

小鼠血清效价检测显示被免疫小鼠均产生了抗毒死蜱的抗体，其中产生的抗体效价最高达到1∶20000以上。融合细胞经多次筛选和克隆后得到了阳性杂交瘤细胞，间接ELISA检测发现阳性细胞的培养上清液与载体蛋白OVA、BSA反应呈阴性，与合成的包被抗原反应呈阳性，间接竞争ELISA检测表明毒死蜱能与细胞上清液内的抗体进行特异性结合，间接ELISA检测结果表明该细胞所分泌的抗体属于IgG1亚类。

III)毒死蜱单克隆抗体的制备纯化及毒死蜱免疫检测方法的建立

用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了毒死蜱单克隆抗体，紫外分光光度法测定其抗体含量。以方阵法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，初步建立了毒死蜱的间接竞争ELISA试验，并选择杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷三种农药进行交叉反应试验以研究该毒死蜱单克隆抗体的特异性。

高效价细胞株成功诱导Balb/c小鼠产生腹水，其效价达1∶10000以上。纯化小鼠腹水得到的单克隆抗体经紫外分光光度法测定浓度为4.08mg/mL。分别以1μg/ml、0.4μg/ml作为包被抗原和单克隆抗体的工作浓度，初步建立了毒死蜱的间接竞争ELISA试验，结果显示试验IC₅₀值为0.135μg/mL，线性检测范围为0.04～0.42μg/mL，最低检测限为0.03μg/mL，低于常规气相色谱法对毒死蜱的仪器检出限0.05mg/L。特异性研究表明获得的单克隆抗体与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷没有交叉反应。

毒死蜱作为一种小分子量环境污染物，本身没有免疫原性，因此首先在毒死蜱的吡啶环上第6位氯原子引入3位碳原子的官能团，进一步通过碳二亚胺法与大分子载体蛋白偶联制备成完全抗原，经鉴定完全抗原成功合成后免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在48％～52％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，经多次筛选和克隆后得到能稳定分泌毒死蜱抗体的阳性杂交瘤细胞，经检测其分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定表明该细胞分泌的抗体是特异性抗毒死蜱的。用扩增培养后的高效价细胞株诱导小鼠产生腹水，并用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水分离毒死蜱单克隆抗体。以方阵法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，建立毒死蜱的间接竞争ELISA试验；同时选择杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷三种农药进行交叉反应试验，特异性研究表明获得的单克隆抗体与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷没有交叉反应。

具体实施如下：

I)毒死蜱完全抗原的合成与鉴定

a)合成毒死蜱半抗原：

将3-巯基丙酸溶于无水乙醇后加入NaOH，在磁力搅拌器上加热搅拌直至溶解，再加入毒死蜱原药60℃下回流反应2h，过滤、浓缩。然后用5％NaHCO₃溶液将残留物转移到分液漏斗中，正己烷萃取，弃去有机相。用浓盐酸调水相pH至3左右，二氯甲烷萃取，有机相过无水Na₂SO₄，减压浓缩得棕红色油状物，柱层析过硅胶柱，收集洗脱液(正己烷/乙酸乙酯，1∶2)的流动相，减压浓缩近干。加入少量无水乙醇溶解产物，重结晶后得到浅黄色晶体。

b)合成完全抗原：

取合成的半抗原(200μmol)溶于2mlN，N-二甲基甲酰胺中(浓度100mM)，然后加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下磁力搅拌反应过夜，离心收集上清液。取500μl上清液加入6ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)溶解的10mg/mlBSA溶液中，常温磁力搅拌下反应4h；另取500μl上清液加入到7ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)溶解的15mg/mlOVA溶液中，常温磁力搅拌下反应2h。前者合成物为免疫抗原，后者为包被抗原。

c)纯化合成抗原：

采用交联葡聚糖G-25凝胶柱层析纯化合成抗原，吸取反应产物0.5ml左右，在距离柱表面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍反应产物量体积的PBS，当少量PBS将流入床面时，再连接储液瓶以5滴/min的速度进行洗脱。洗脱产物经冷冻干燥，-20℃保存。

d)紫外吸收光谱鉴定：

分别取等量的牛血清白蛋白、卵清蛋白和合成的免疫抗原、包被抗原溶于PBS缓冲液中，均配制成0.5mg/ml的溶液，毒死蜱半抗原溶于PBS成饱和溶液，然后对其进行200～360nm的紫外扫描。结果显示，合成的免疫抗原和包被抗原与原载体蛋白BSA、OVA相比，合成抗原最大吸收波长发生了明显的变化，向远紫外区偏移；合成抗原与毒死蜱半抗原最大吸收波长也不一致，这表明合成抗原与载体蛋白及毒死蜱半抗原具有不同的吸收光谱。

e)钼兰比色法测定毒死蜱结合比：

将冷冻干燥后的免疫抗原和包被抗原及相应对照BSA、OVA均用双蒸水配成浓度为2.5mg/ml的溶液，各取2ml加入凯氏定氮瓶中并编号，再加入4ml浓硫酸，2滴高氯酸，凯氏瓶口插入冷凝用小漏斗，消煮30min左右，直至溶液由棕黄变成无色。吸取定容后的消煮液2.5ml，加2，4-二硝基酚指示剂2滴，滴加4mol/lNaOH调节酸度直至溶液转变为黄色，再加2mol/lH₂SO₄，使溶液黄色刚好褪去，然后加钼锑抗试剂5ml，最后用水定容至50ml，每个处理设三个重复。同时，用加2.5ml空白试验消煮液的容量瓶为对照调零，700nm波长进行比色。同时以5μg/ml标准溶液(0、1、2、3、4、6、8、10ml)作标准曲线，根据标准曲线求待测液磷浓度并计算透析产物中磷含量及偶联结合比。

以系列浓度的磷标准液的吸光度值为纵坐标，磷浓度为横坐标，作标准曲线，得到吸光度值对磷浓度的回归方程y＝0.4525x-0.0085。根据回归方程求出完全抗原PBS溶液的磷浓度，并计算得到免疫抗原和包被抗原中载体蛋白与毒死蜱偶联结合比分别为1∶64和1∶19。

II)毒死蜱单克隆抗体细胞株的制备及筛选

a)小鼠免疫：

选用健康6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，常规免疫方案分批免疫：将免疫抗原用PBS缓冲液配制成1μg/μL的溶液。第一次免疫，将免疫抗原PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，抽取混匀的乳液进行腹腔多点注射，每只鼠的注射量为200μL，含免疫抗原100μg；两周后进行第二次免疫，注射方法、注射体积及抗原剂量不变，但改用弗氏不完全佐剂；以后按照第二次免疫方案以一周为间隔进行免疫；第三次免疫一周后，从小鼠尾部取10～20μL血，通过间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价；待效价至少达到1∶1000后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐剂对小鼠进行尾静脉注射以强化免疫。

b)杂交瘤细胞的制备：

细胞融合当天取免疫小鼠摘除眼球放血处死，收集血清作为阳性血清对照，制备免疫脾细胞悬液，RPMI-1640培养基调整细胞密度至10⁸个/mL，取少量进行台盼兰染色，镜检活细胞比例应大于80％。将免疫脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞按20∶1混合，加入1mL37℃预热的48％～52％聚乙二醇，将细胞轻轻悬于20mLRPMI-1640培养基中，置于CO₂培养箱待用。用RPMI-1640培养基将饲养细胞配成2×10⁵个/mL的悬浮液，参考融合前Sp2/0的细胞数，将饲养细胞与融合细胞1∶1混合，并转入培养瓶中培养12～24h。最后1000rpm离心5min收集细胞，用50mLHAT培养基悬浮细胞，分装96孔细胞培养板，每孔加入0.2mL。融合后每3～4天半量换液一次。2～3天骨髓瘤细胞明显退化，待骨髓瘤细胞全部死亡，用HT培养基取代HAT培养基，每3～4天半量换液一次。约一周左右出现杂交瘤细胞克隆，细胞大、圆且透亮，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记。待杂交瘤细胞克隆扩增至孔底1/5以上时，取上清液用间接ELISA法检测相应的特异性抗体。

c)毒死蜱单克隆抗体细胞株的筛选及鉴定：

取杂交瘤细胞培养上清夜进行间接ELISA检测，结果有5孔呈阳性，阳性孔与阴性血清孔的吸光度值之比最高达到12。融合结果统计见表5，融合细胞一共接种151孔，其中44孔有杂交瘤细胞生长，融合率为29.13％，阳性细胞孔5孔，阳性率为3.31％。

对筛选出的5孔阳性孔细胞进行竞争抑制实验，挑选出其中阳性吸光度值较高、抑制效果较明显的细胞进行有限稀释法克隆或亚克隆，每次均进行间接ELISA和竞争ELISA试验筛选阳性克隆，最终得到能稳定分泌毒死蜱抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

间接ELISA检测得到的单克隆杂交瘤细胞结果表明：分别以包被抗原、载体蛋白BSA和OVA包被酶标板，细胞株的培养上清与载体BSA和OVA反应均为阴性，故上清液中不含抗载体BSA和OVA的抗体；上清液与包被抗原反应呈阳性，表明上清液中可能含有抗毒死蜱的抗体。间接竞争ELISA检测中，毒死蜱溶液与细胞的培养上清均能发生免疫反应。以毒死蜱浓度为横坐标(对数刻度表示)，抑制率为纵坐标作图，其中抑制率＝(对照孔的吸光度值-不同毒死蜱浓度孔吸光度值)/(对照孔的吸光度值)×100％，可算得毒死蜱对细胞株培养上清的半数抑制浓度IC₅₀约为1.3μg/mL左右，由此说明上清液中含有可与毒死蜱竞争结合的抗体，表明该细胞株就是预期的特异性单克隆抗体分泌细胞株。

分别用0.5μg的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3包被酶标板，取克隆化后的细胞株培养上清检测，ELISA检测亚类鉴定结果表明毒死蜱单克隆抗体细胞株所分泌的抗体均为IgG1型蛋白。

III)毒死蜱单克隆抗体的制备纯化及毒死蜱免疫检测方法的建立

a)毒死蜱单克隆抗体的制备及纯化

取10周龄、雌性Balb/c小鼠2只，于接种前1天腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂待用。取经扩增培养并处于对数生长期的高效价阳性杂交瘤细胞株，1000rpm离心5min收集细胞，10mLPBS悬浮后计数细胞，每只小鼠腹腔注射1.0×10⁷个细胞。接种后10天左右，小鼠腹部明显膨大，产生腹水，此时用一次性注射器无菌采集腹水，2000r/min离心10min后腹水分为三层，用吸管小心收集中层，0.45μm微孔滤器过滤后分装，-20℃冻存备用。

采用正辛酸-硫酸铵沉淀法(caprylic acid-ammonium sulphate precipitation，CAASP)纯化抗体。取上述已经预处理过的腹水1mL注于小烧杯内，加入3mL60mmoL/L乙酸缓冲液(pH4.0)稀释混匀，磁力搅拌下在30min内缓慢滴加33μL正辛酸，浓氨水调pH值至4.5～4.8，继续搅拌30min后，10000g离心30min，弃沉渣，收集上清液经0.45μm的微孔滤器过滤并定量体积后，加入1/10体积的20mmoL/LPBS缓冲液(pH7.4)，浓氨水调pH值至7.4。磁力搅拌下缓慢滴加饱和硫酸铵溶液至饱和度为33％～45％，用浓氨水调液体pH值至7.4，冰浴下磁力搅拌1～2h，随后4℃、10000g离心30min，弃上清液，沉淀用1mL20mmoL/LPBS缓冲液(pH7.4)溶解，4℃、15000g离心30min，除去不溶性沉渣，上清即为纯化提取的毒死蜱单克隆抗体，分装后-20℃冻存备用。纯化小鼠腹水得到的单克隆抗体经紫外分光光度法测定浓度为4.08mg/mL。

b)基于毒死蜱单克隆抗体的毒死蜱免疫检测方法的建立

①毒死蜱的间接竞争ELISA试验

用方阵试验对间接竞争ELISA法的抗原、抗体的工作浓度进行筛选，包被抗原和单克隆抗体的最适工作浓度分别为1μg/ml和0.4μg/ml。

用确定工作浓度的包被抗原包被酶标板，作系列梯度浓度的毒死蜱溶液(10^-3～10²μg/mL)的间接竞争ELISA，根据抑制率与毒死蜱浓度之间的关系作标准曲线，其中横坐标为毒死蜱溶液的浓度并以对数刻度形式表示，纵坐标为相应浓度下毒死蜱对单克隆抗体的抑制率。抑制率与毒死蜱浓度呈负相关，图形为典型的S型曲线，其头、尾部趋于平坦，抑制率在20％～80％之间的中央部分较陡呈直线型，回归方程y＝0.2669Ln(x)+1.0347，(R²＝0.9859)，由回归方程得出毒死蜱对该抗体的半数抑制浓度IC₅₀为0.135μg/mL，线性检测范围为0.04～0.42μg/mL，最低检测限(抑制率为10％时的浓度值)为0.03μg/mL，低于常规气相色谱法对毒死蜱的仪器检出限0.05mg/L。

②毒死蜱单克隆抗体对其它有机磷类农药的交叉反应

以纯化后的单克隆抗体作研究对象，以不同浓度的杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷等与毒死蜱结构相似的有机磷类农药代替毒死蜱，然后以农药浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作标准曲线，分别求出各种农药对单克隆抗体的半数抑制浓度IC₅₀，并求出交叉反应率：交叉反应率＝(毒死蜱对单克隆抗体的IC₅₀/其它试验农药的IC₅₀)×100％；杀螟硫磷、对硫磷、马拉硫磷标准溶液的最大试验浓度分别为139μg/mL、100μg/mL、230μg/mL，试验中未发现这三种农药对毒死蜱单克隆抗体有明显的抑制作用，因此，三种农药对抗体的IC₅₀分别大于139μg/mL、100μg/mL、230μg/mL，以毒死蜱对纯化后单克隆抗体的交叉反应率为100％，计算这三种农药与毒死蜱的交叉反应率分别小于0.09％、0.14％、0.05％。

Claims (3)

1.一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于通过亲核取代反应在毒死蜱的吡啶环上第6位氯原子上引入一个偶联桥，并与大分子载体蛋白结合制备人工完全抗原；将毒死蜱人工完全抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在质量百分浓度48％～52％聚乙二醇作用下小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，经杂交瘤抗体检测和多次克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌毒死蜱抗体。

2.根据权利要求1所述的毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于具体的制备工艺为：

a)毒死蜱完全抗原的合成与鉴定：在碱性条件下，将毒死蜱原药与3-巯基丙酸加热回流，使毒死蜱分子吡啶环上第6位氯原子通过亲核取代反应被3个直链碳原子的3-巯基丙酸取代而合成了半抗原O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯，并通过碳二亚胺法与大分子载体蛋白结合制备人工完全抗原，紫外光谱法和钼兰比色法验证合成的完全抗原；

b)毒死蜱单克隆抗体细胞株的制备及筛选：用合成的毒死蜱抗原免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在质量百分浓度48％～52％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基选择性培养融合细胞，间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验检测筛选出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌毒死蜱抗体；

c)毒死蜱单克隆抗体的制备纯化：用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了毒死蜱单克隆抗体，紫外分光光度法测定其抗体含量；

d)毒死蜱单克隆抗体的鉴定：阳性杂交瘤细胞分泌的毒死蜱单克隆抗体，经间接ELISA检测结果表明属于IgG1亚类，间接ELISA和间接竞争ELISA证实该类抗体只与毒死蜱有特异性结合，而不与载体蛋白反应，表明单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗毒死蜱的。

3.根据权利要求1所述的毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于亲核取代反应的方法是：