CN101962358A - 环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环丙沙星半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以环丙沙星为原料，与氨基丁酸或氨基己酸反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原；通过活泼脂法将半抗原与蛋白质偶联制备得到人工抗原；将人工抗原免疫小鼠，采用细胞融合技术制得对环丙沙星高特异性的单克隆抗体。采用本发明单克隆抗体建立免疫检测可用于环丙沙星现场快速检测，对实现畜禽水产品中环丙沙星残留的快速检测具有重要现实意义。

Description

环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全技术领域，具体涉及环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。

背景技术

环丙沙星(Ciprofloxacin，CPF)，其分子式为C₁₇H₁₈O₃N₃F，分子量为385.82，为白色或类白色的结晶性粉末，味苦，其结构式如式(I)所示：

环丙沙星为第三代喹诺酮类(FQs)的典型代表之一，具有抗菌谱广，毒副作用小，血药浓度高，半衰期长，制剂形式多样，药效价格比高等特点，对各种革兰氏阴性和阳性菌均具有强大的抑菌作用，与青霉素、头孢菌素和氨基类药物均无交叉耐药性等特点，对于治疗炭疽热病症具有特效作用。

FQs药物因其能抑制细菌DNA螺旋酶、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，加之系化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中很快取得广泛应用，尤其在水产养殖中成为最重要的抗感染药物之一。由于致病菌产生耐药性和某些潜在的致癌性质，其残留问题已引起广泛关注。美国和欧盟规定在禽食用组织中方的最高残留限量为环丙沙星和环丙沙星为30μg/Kg；我国农业部标准NY5070-2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》规定环丙沙星和环丙沙星残留限量为50μg/Kg。

FQs药物对动物体以及人体的绝大部分器官和组织都有不同程度的不良反应：由于FQs药物呈脂溶性，可通过血脑屏障进入脑组织，抑制□-氨基丁酸(GABA)与其受体结合而产生神经系统反应。故以神经系统的损伤最为常见，其次是皮肤及其附件的损伤。多数不良反应症状较轻，且可逆，但也有较重甚至危及生命的。动物实验表明，FQs药物可引起幼畜关节炎、跟键炎，也能引起过敏性休克，恶心、呕吐，静脉炎等症状。

对畜禽水产品中环丙沙星残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相等仪器检测方法。然而应用仪器方法时，其灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，测定方法复杂、繁琐，检测通量小，需要培养专业人员进行检测，检测成本昂贵，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。

免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。

人工抗原的合成是半抗原物质免疫分析方法建立的的关键，对于环丙沙星，因为其本身含有羧基，不需要衍生，因此目前都是直接利用该羧基和蛋白质连接。譬如，李岩松等发表了论文“环丙沙星单克隆抗体制备、纯化及鉴定”(中国卫生检验杂志，2008)，采用碳二亚胺法，直接偶联羧基和蛋白质的氨基合成了环丙沙星人工抗原；顾黎等发表了论文“环丙沙星单克隆抗体的制备和性质鉴定”(科技通报，2010)，同样采用碳二亚胺法，直接偶联羧基和蛋白质的氨基；杨先乐等公开了一项专利“一种环丙沙星免疫原的制备方法(申请号200810037474.8)”，采用碳二亚胺法将环丙沙星和载体蛋白偶联。尚未见有研究者在目标物环丙沙星和载体蛋白间使用手臂的报导。

寻找新的环丙沙星半抗原与人工抗原并获得高特异性抗体应用于免疫检测，使得环丙沙星的检测能达到灵敏度高、特异性强，适宜于进行现场检测的目的，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是填补环丙沙星现有检测技术的不足，提供一种环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供所述环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体，所述环丙沙星人工半抗原具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

所述环丙沙星人工抗原，具有式(III)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

本发明提供了所述环丙沙星半抗原的制备方法，是以环丙沙星与氨基丁酸(H₂NCH₂CH₂CH₂COOH)或氨基己酸(H₂NCH₂(CH₂)₄COOH)在NHS、DDC和DMF存在条件下反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原。

本发明所述环丙沙星半抗原的制备包括以下步骤：

(1)按投料摩尔比为1∶1∶1将环丙沙星、氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)和脂溶性碳二亚胺(DDC)置于烧杯中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜；

(2)将经步骤(1)得到的反应物离心取上清得A液；所述离心操作优选10000r/min离心10min；

取与环丙沙星等摩尔量的氨基丁酸或氨基己酸溶于少量蒸馏水中，得B液；

(3)将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，离心取上清液，调节上清液pH值，将析出的沉淀过滤，收集上清液；

步骤(3)所述离心操作优选10000r/min离心10min；

步骤(3)优选采用饱和NaHCO₃将上清液调pH值至8.0～9.0；

(4)将步骤(3)制得的上清液调节pH值，收集沉淀，得到环丙沙星半抗原。

步骤(4)优选采用1M稀盐酸将上清液调pH值为5～6；

本发明所述人工抗原的制备可采用活泼脂法，根据本领域设计思想，也可以采用本领域其他常规方法制备。采用活泼脂法制备本发明所述抗原的具体步骤如下：

(1)将等摩尔的权利要求1所述的环丙沙星半抗原、DDC、NHS溶解于DMF中，室温避光反应过夜；

(2)将步骤(1)所得反应物离心取上清液，将上清液加入到含有载体蛋白的硼酸缓冲液中，将混合物在4℃下反应过夜；

(3)待步骤(2)反应完成后，将反应后混合液装入透析袋，透析得到所述人工抗原。

本发明所述环丙沙星特异性单克隆抗体制备，其具体步骤如下：

实验选用8周龄左右的健康雌性Balb/c小鼠作为免疫对象，基础免疫剂量为0.1～0.2mg/只，加强免疫剂量为03～0.5mg/只。人工抗原与等量佐剂充分混匀，采用背部皮下多点注射，每隔15d加强免疫一次，第3次免疫后7～10天内，尾部采血，测定抗血清效价和特异性，待其抗血清效价和特异性合格后，进行一次不含佐剂的加强免疫，免疫后第3天进行细胞融合；用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性抗环丙沙星单克隆抗体。

环丙沙星特异性单克隆抗体可应用于环丙沙星残留的免疫检测方面，尤其是畜禽水产品中环丙沙星残留的现场快速检测方面。

本发明的有益效果是：

本发明以环丙沙星为原料，环丙沙星与氨基丁酸或氨基己酸(优选氨基丁酸)反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原，本发明环丙沙星半抗原能更充分的暴露给动物免疫系统；将本发明半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，采用本领域常规技术将本发明人工抗原免疫小鼠，采用细胞融合技术制得对环丙沙星高特异性的单克隆抗体，使用所述单克隆抗体建立免疫检测可应用于环丙沙星现场快速检测，而且灵敏度更高，检测限达到了0.05ng/mL，对实现畜禽水产品中环丙沙星残留的快速检测具有重要现实意义。

附图说明

图1环丙沙星标准曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例中环丙沙星等药剂除非特别说明，都是常规市购实验室用试剂。

实施例1：半抗原合成

称取环丙沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将其混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜。将反应物10000r/min离心10min，取上清，称之为A液。取氨基丁酸10.3mg(0.1mmoL)，溶于1mL蒸馏水中，即B液。将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调至碱性(pH值8～8.5)，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用稀盐酸(1mol/L)将上清液调至酸性(pH值5～6)，收集沉淀，即为环丙沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例2：半抗原合成

称取环丙沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将其混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜。将反应物10000r/min离心10min，取上清，称之为A液。取氨基丁酸10.3mg(0.1mmoL)，溶于1mL蒸馏水中，即B液。将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调至pH值为8.2，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用1mol/L稀盐酸将上清液调pH值为5.5，收集沉淀，即为环丙沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例3：半抗原合成

称取环丙沙星38.6mg(约0.1mmoL)，NHS 11.5mg(约0.1mmoL)和DDC 20.3mg(约0.1mmoL)置于圆底烧瓶中，并将其混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜。将反应物10000r/min离心10min，取上清，称之为A液。取氨基己酸0.1mmoL，溶于1mL蒸馏水中，即B液。将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，10000r/min离心10min，取上清液，用饱和NaHCO₃调至pH值为8.5，有沉淀析出，将沉淀过滤，收集上清液。用1mol/L稀盐酸将上清液调pH值为5.0，收集沉淀，即为环丙沙星-氨基丁酸半抗原。

实施例4：人工抗原的合成

称取实施例1制备得到的环丙沙星-氨基丁酸半抗原0.05mmoL，NHS 5.76mg(约0.05mmoL)和DDC 20.64mg(约0.1mmoL)溶于500uLDMF中，室温下避光搅拌过夜。将反应物10000r/min离心10min，取上清，并将其缓慢加入到5mL 0.1moL/L pH 9.0的硼酸-硼酸钠缓冲液中，其缓冲液含有载体蛋白BSA 26.4mg，将混合物在4℃下反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9％的生理盐水透析3d，每天换透析液3～5次，得到透析好的溶液即为环丙沙星-氨基丁酸免疫抗原(CPF-ABA-BSA)。

环丙沙星-氨基丁酸包被抗原制备方法同上，仅将BSA换成等质量的OVA。

环丙沙星-氨基己酸人工抗原的合成方法同环丙沙星-氨基丁酸人工抗原方法，将环丙沙星-氨基丁酸换成等摩尔的环丙沙星-氨基己酸。

实施例5：人工抗原的鉴定

以环丙沙星-氨基丁酸人工半抗原为例，按照分光光度法测定半抗原、载体蛋白以及偶联物的最大吸收值，计算偶联物的偶联比。在200～400nm之间分别对原料、BSA、OVA及偶联物紫外吸收光谱进行扫描，鉴定半抗原与载体蛋白是否发生偶联。同时估算半抗原和载体蛋白偶联比：

经计算结果如下：

CPF-ABA-BSA    18∶1      CPF-ABA-OVA        23∶1

实施例6：免疫动物及多克隆抗体制备

6.1免疫动物制备抗血清

实验选用常规实验动物8周龄左右的健康雌性Balb/c小鼠作为免疫对象，基础免疫剂量为0.2mg/只，加强免疫剂量为0.4mg/只。人工抗原与等量福氏佐剂充分混匀，采用背部皮下多点注射，每隔15d加强免疫一次，第3次免疫后7～10天内，尾部采血，测定抗血清效价和特异性，待其抗血清效价和特异性合格后，进行一次不含佐剂的加强免疫，免疫后第3天进行细胞融合；用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性抗环丙沙星单克隆抗体。

6.2抗体的纯化

纯化抗体可以采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可以采用Protein G/A亲和层析纯化，参照本领域常规技术。

实施例7：环丙沙星酶联免疫方法建立

7.1包被：采用分装的CPF-ABA-OVA进行包被，包被浓度为1μg/mL包被抗原。在96孔酶标板上每孔加入100μL含有包被抗原的包被液，4℃过夜。

7.2封闭：取出包被好的酶标板，使用洗液洗板两次，每孔加入120μL封闭液，与37℃温箱中温育3h。后将封闭液甩干，置烘箱1h。

7.3点板：在封闭好的半条中每孔加入经系列稀释制备的环丙沙星各浓度标准液50μL，再加入抗体稀释液稀释20000倍的酶标抗体50μL。在37℃恒温箱里反应30min。使用洗液洗板6次。

7.4加酶标二抗每孔加入经1∶5000稀释的羊抗鼠辣根过氧化物酶稀释液100μL，放在37℃恒温箱里反应20min。使用洗液洗板6次。

7.5显色：每孔加入底物TMB-过氧化氢溶液100μL，37℃显色10min后用50μL的10％(10∶90，V∶V)的H₂SO₄终止反应。在酶标仪上测定450nm波长下的吸光值。根据抑制率与环丙沙星浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线，见附图1所示。

所述抑制率的计算式为：

抑制率(％)＝1-B/B₀

其中，B为标准溶液的平均吸光值，B₀为0浓度标准溶液的平均吸光度值。所建立的方法，一抗反应30min，二抗反应20min，显色10min即完成检测，非常简单方便。

鸡肉添加回收实验：

称量4份鸡肉，每份2g，置于15mL离心管中，分别向4个离心管中添加0、20、100、600μL浓度为100ng/mL的EF标准品，则4个离心管中鸡肉含EF浓度分别为0、1、5、30ng/g，振荡2min。再向离心管中加入少量PBS，旋涡振荡5min，避光静置15min，加入4mL PBS充分振荡5min，沸水中煮10min，6000r/min离心10min，收集上清液。向提取的上清液中加入适量正己烷，萃取脱脂3次，收集下层液；定容至6mL。用本发明环丙沙星人工抗原和抗体进行检测。

实验结果如下：

表1环丙沙星ELISA基本参数

标2添加回收率

由表1、2可知，本发明方法制备得到的环丙沙星人工半抗原、抗原和抗体灵敏度更高，检测范围4～64，检测限达到了1ng/mL，回收率达到85.7～95.8，获得很好的效果，满足检测需求。

Claims (10)

1.一种环丙沙星人工半抗原，其特征在于是以环丙沙星与氨基丁酸或氨基己酸在NHS、DDC和DMF存在条件下反应制备得到，所述半抗原含4个或6个碳原子手臂，具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6。

2.根据权利要求1所述环丙沙星人工半抗原，其特征在于n＝4。

3.一种权利要求1或2所述环丙沙星人工半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)按投料摩尔比为1∶1∶1将环丙沙星、N-羟基基琥珀酰亚胺和脂溶性碳二亚胺置于反应容器中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜；

(2)将经步骤(1)得到的反应物离心取上清得A液；

取与环丙沙星等摩尔量的氨基丁酸或氨基己酸溶于少量蒸馏水中，得B液；

(3)将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，离心取上清液，调节上清液pH值为碱性，将析出的沉淀过滤，收集上清液；

(4)将步骤(3)制得的调节上清液pH值至酸性，收集沉淀，得到环丙沙星半抗原。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述调上清液为碱性是将上清液pH值调节为8.0～8.5；步骤(4)所述调上清液为酸性是将上清液pH值调节为5.0～6.0。

5.一种环丙沙星人工抗原，其特征在于是将权利要求1或2所述环丙沙星半抗原与蛋白质偶联制备得到，具有式(III)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6；优选n＝4。

6.一种权利要求5所述环丙沙星人工抗原的制备方法，其特征在于采用活泼脂法将环丙沙星半抗原与蛋白质偶联。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将等摩尔的所述的环丙沙星半抗原、DDC、NHS溶解于DMF中，室温避光反应过夜；

(2)将步骤(1)所得反应物离心取上清液，将上清液加入到含有载体蛋白的硼酸缓冲液中，混合物反应过夜；

(3)待步骤(2)反应完成后，将反应后混合液透析得到所述人工抗原。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述硼酸缓冲液为硼酸-硼酸钠缓冲液，pH 9.0，100mM；所述载体蛋白为BSA或OVA，载体蛋白的浓度在20～30mg/mL；所述反应温度为4℃。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述透析采用0.9％的生理盐水透析3天，每天更换换透析液3～5次。

10.一种权利要求5所述抗原的应用，其特征在于应用于制备环丙沙星抗体或环丙沙星免疫检测方面。

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