CN102675463B - 一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用。该多菌灵单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.4575的小鼠杂交瘤细胞株MC-3产生的。其制备方法为：（1）在多菌灵的第9位氨基酸残基引入1个氨基，得到经氨基修饰的多菌灵，再将该经氨基修饰的多菌灵与载体蛋白偶联得到完全抗原A；（2）将步骤（1）的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到多菌灵的单克隆抗体。该多菌灵的单克隆抗体可用于检测多菌灵。

Description

一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

多菌灵(carbendazim,CAS:10605-21-7)是一种广谱性的苯并咪唑类杀菌剂，对多种作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。多菌灵为结晶状粉末，熔点为302~307℃(分解)，蒸气压为0.09mPa(20℃)，密度为1.45(20℃)，水中的溶解度为29mg/L(pH4，24℃)，二甲基甲酰胺中的溶解度为5g/L(24℃)，微溶于有机溶剂中，低于50℃至少两年稳定，在碱性溶液中缓慢分解，随pH值升高，分解加快，在酸中稳定。其化学结构式如式Ⅰ所示：

（式Ⅰ）

虽然多菌灵为低毒类农药，但被广泛使用，我出口德国的脱水蘑菇中被多次检出有“多菌灵”残留，在1~10mg/kg左右，其达不到欧盟标准。欧盟于2007年2月26日发布了关于对90/642/EEC法规的修订案。其中关于多菌灵在新鲜菇类中的MRLs（最大残留量），由1mg/kg加严到0.1 mg/kg；干菇类中的MRLs，由10 mg/kg加严到1 mg/kg。我国和其它国家针对多菌灵在食品中的MRLs有明确规定，介于0.09-3 mg/kg之间。因此对于多菌灵的准确检测非常重要。

常用的检测方法有液相色谱法，竞争酶联免疫吸附法（ELISA），胶体金试纸检测等。液相色谱法仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，虽然检测准确，但并不适合广泛推广；胶体金法检测快速，价格便宜，但灵敏度低且容易出现假阳性；与以上两种方法相比，ELISA试剂盒法操作简便、快速，无需专业人员操作，仅需配备基础仪器设备，因此非常适合在食品企业中推广，同时由于其适合大批量样本筛选，因此配合仪器，可广泛应用于检验检疫、商检执法等部门，是非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多菌灵的单克隆抗体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下：

一种多菌灵的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No. 4575的小鼠杂交瘤细胞株MC-3产生。

能分泌抗多菌灵单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC-3，已于2011年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其分类命名为：Balb/C小鼠杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.4575。

本发明还提供一种上述多菌灵的单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）在多菌灵的第9位氨基酸残基引入1个氨基，得到经氨基修饰的多菌灵，再将该经氨基修饰的多菌灵与载体蛋白偶联得到完全抗原A；

（2）将步骤（1）的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到多菌灵的单克隆抗体。

其中，所述步骤（1）中，采用乙二醇法在多菌灵的第9位氨基酸残基引入1个氨基。

所述步骤（1）中，所述完全抗原A中的载体蛋白可为任意一种常用的载体蛋白，例如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）、钥孔血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）等，优选为钥孔血蓝蛋白（KLH）。

所述步骤（2）中，用于免疫的小鼠为Balb/C小鼠；免疫方法为：每只小鼠每次免疫所用的完全抗原A量为40μg~80μg，两次免疫的间隔时间为20~30天；免疫方式为皮下多点注射；

所述步骤（2）中，小鼠骨髓瘤细胞具体可为小鼠骨髓瘤细胞sp2/0。

所述步骤（2）中，筛选阳性杂交瘤细胞株的方法具体为：先用包被抗原筛选1~2次，再用偶联有载体蛋白的无关小分子筛选至少1次；所述包被抗原为所述步骤（1）中的多菌灵与载体蛋白偶联得到的完全抗原B；所述完全抗原B与所述完全抗原A中的载体蛋白不相同。

当完全抗原A中的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白时，所述完全抗原B中的载体蛋白具体可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清白蛋白。

所述偶联有载体蛋白的无关小分子可以为丁酰-BSA，苯菌灵-BSA，甲基硫菌灵-BSA（与多菌灵偶联方法一致）。

本发明利用上述免疫方法和筛选方法，用完全抗原A免疫小鼠，得到了只针对完全抗原上小分子多菌灵的抗体。

所述阳性杂交瘤细胞株为能分泌抗多菌灵单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC-3，其保藏号为CGMCC No. 4575。

所述方法中还可包括纯化所述单克隆抗体的步骤，将上述腹水分离纯化后，即获得抗多菌灵的单克隆抗体。

为提高单克隆抗体的纯度，可用免疫亲和层析方法对其进行纯化，尤以HiTraprProtein A FF 1mL免疫亲和层析柱纯化效果好。

本发明的单克隆抗体可用于多菌灵的免疫检测中。

所述多菌灵的免疫检测方法可为酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法等

所述单克隆抗体与样品发生相互作用的条件，可依据检测方法进行确定。

本领域技术人员知晓，对于固相反应而言，可以讲本发明所述单克隆抗体固定于固相载体，也可以将待测样品固定于固相载体上。反应通常在室温或37℃水浴中进行。

本发明正是采用间接竞争ELISA检测方法，其中最关键步骤是能够筛选出特异结合多菌灵的单克隆抗体，同时与其他结构相近的小分子药物（菌灵，甲基硫菌灵）无交叉，满足抗原抗体竞争反应剂量依赖性（随着游离抗原的加入固相抗原与抗体的结合下降）。本发明制备的小鼠单克隆抗体来自单一细胞的克隆，质地均一，且可以大量生产，具有极高的稳定性，并且能够特异的与多菌灵结合，与其他结构相近的小分子无交叉反应，该单克隆抗体不仅能应用于多菌灵的酶标记抗体、荧光标记抗体、胶体金标记抗体等；而且在后续的竞争实验中，满足剂量依赖性的要求，为间接竞争ELISA试剂盒的研发推广奠定了基础。

附图说明

图1  SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，

1：蛋白marker； 2：小鼠单克隆抗体；

图2  抗原抗体竞争反应对数曲线。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

骨髓瘤细胞sp2/0种子来源于北京康为世纪生物科技有限公司。6周龄的Balb/C纯系雌性小鼠购自北京维通利华实验动物中心。胎牛血清(上海洛神，Lot 20090525)，细胞融合用PEG 4000（sigma），50×HAT储液(sigma，H0262，093K8931)，50×HT（sigma H0317，Lot 064K8927），1640培养基（Gibco，Lot ）DMSO（Amresco 0231），石蜡油（国药试剂公司）。BSA (Sigma,A7638)，OVA(Sigma，A5378)。

实施例1  杂交瘤细胞株MC-3 CGMCC No. 4575 的获得及其产生的抗多菌灵的单克隆抗体的鉴定

一、杂交瘤细胞株MC-3 CGMCC No. 4575 的获得

1、多菌灵氨基修饰

将多菌灵采用乙二醇法对多菌灵进行氨基修饰。具体方法如下：取5mg 多菌灵溶于0.65mL二甲基甲酰胺，在2分钟内加入350μL  0.05mmol/L的高碘酸钠，室温避光反应30分钟，加入130μL 1mol/L 的乙二醇，摇匀5分钟即可得到氨基修饰的多菌灵ML。

2、多菌灵完全抗原ML-KLH的制备

取氨基修饰的多菌灵ML 1130μL，加入650μL 15mg/mL的钥孔血蓝蛋白，即KLH（配制缓冲液为pH8.2的 0.1mol/L的碳酸氢钠），室温反应1小时，加入总体积0.7倍体积的0.4mol/L的硼氢化钠，4℃反应30分钟，0.1mol/L  pH9.3的碳酸缓冲液透析过夜，收集偶联产物，即得到多菌灵完全抗原ML-KLH。

3、免疫动物

选取6周龄的雌性Balb/C小鼠，采用低剂量长程免疫法进行免疫，方法为：皮下多点注射，40ug ML-KLH/只，共免疫4次，初次免疫加弗氏完全佐剂(0.1mL/只)，后三次加强免疫加弗氏不完全佐剂(0.1mL/只)，免疫间隔时间为30天。在第三次加强免疫后的第10天，对小鼠进行尾部静脉取血，用间接ELISA法测定效价，其中，包被的ML-BSA（ML-BSA的偶联方法同ML-KLH）的浓度为2μg/mL。对抗血清效价达到1×10⁵以上的小鼠，进行一次冲击免疫，即每只小鼠采用10ulML-KLH+90μL生理盐水进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行细胞融合。

4、细胞融合

（1）免疫脾细胞的制备

将步骤2冲击免疫三天后的Balb/C小鼠处死，无菌状态下取出脾脏，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加无血清1640培养基制成单细胞悬液，用200目钢网过滤，去除大的细胞团块后，离心，用无血清1640培养基洗涤并重悬脾细胞，计活细胞数。

（2）SP2/0骨髓瘤细胞的处理

取指数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，离心，用无血清1640培养基洗一次并悬浮于其中，计活细胞数。

（3）免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合

将步骤（2）的SP2/0骨髓瘤细胞与步骤（1）的免疫脾细胞融合，具体过程包括以下步骤：

a. 聚乙二醇(PEG)的配制（50% PEG）：PEG 5.0g置于15mL玻璃离心管中，高压灭菌20分钟，冷却至50℃后加入无血清1640培养基5mL，混匀，分装1.0mL/管，4℃保存。

b. 取含15mL胎牛血清、HAT培养液50mL（50×HAT原液，sigma，H0262）的完全培养液（1640培养基）和50% PEG分别放入37℃水浴箱中预热，令将一只盛水的烧杯同时放入水浴箱中备用。

c. 分别吸取含4.0×10⁷个骨髓瘤细胞SP2/0和2.0×10⁸个脾细胞的悬液加入50mL离心管中，充分混匀，并加无血清1640培养基至30mL。

d. 1000rpm离心8min，弃去上清液，用吸管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状。

e. 将离心管置于预温的烧杯中，用1mL移液管吸取1.0mLPEG，将吸管插入管底，继而轻轻搅动沉淀，并缓缓滴加PEG，1min内加完，再在水浴中静置45s。

f. 立即滴加37℃预温德完全培养液15mL，使PEG稀释而失去作用。滴加方法是在1min内加1mL，次1min内加2mL，接下来1mL内加5mL，最后1min内加完剩余培养液。注意，当PEG溶液加入后，即可见细胞凝集成小团块状，此时操作宜轻柔，以免干扰细胞融合过程。

g. 补加无血清1640培养基至45mL，800rpm离心10min，弃上清。

h. 将细胞沉淀轻悬于预温德HAT培养液中，加到5块已有饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板内，每孔加100μL。继而将培养板移至37℃、5%CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养。

5、融合细胞的筛选及克隆化培养

约3天后，当杂交瘤细胞长满孔底1/4-1/2时，培养基变黄，此时用常用的ELISA法检测培养基上清液中的抗体，具体方法包括以下步骤：

（1）吸取96孔板每孔的上清100μL，采用ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选（一筛），具体方法为：

用50mM碳酸缓冲液（pH9.6）稀释包被抗原至2mg/L，加入到96孔酶联板中进行包被，每孔100μL，4℃包被12-24小时；充分洗涤后用含1%BSA的PBS封闭，每孔200μL；每孔加入各个克隆孔上清液100μL，37℃温育30min，充分洗涤后加入100μL  1:5000的酶标二抗（HRP-山羊抗小鼠IgG），37℃温育20min后，加入底物显色，10min后终止，读取A_450nm，A_450nm值为阴性对照2.1倍的为阳性杂交瘤细胞。对于一筛呈阳性的克隆株，进一步培养后，按照同样方法进行第二次筛选。

其中，包被抗原为ML-BSA，它按照下述方法制备：

取氨基修饰的多菌灵ML 1130μL，加入650μL  15mg/mL的牛血清白蛋白，即BSA（配制缓冲液为pH8.2的 0.1mol/L的碳酸氢钠），室温反应1小时，加入总体积0.7倍体积的0.4mol/L的硼氢化钠，4℃反应30分钟，0.1mol/L  pH9.3的碳酸缓冲液透析过夜，收集偶联产物，即得到多菌灵包被抗原ML-BSA。

（2）吸取细胞上清，用新鲜的HT培养基（50×HT储液 sigma H0137）重悬细胞，转移至含Balb/C小鼠腹腔细胞的HT培养基制成的24孔培养板内，待细胞生长至培养板1/4~1/2时，采用与步骤（1）相同的ELISA法对阳性克隆株进行再次确定（二筛）。

（3）将2次ELISA检测均为阳性的克隆细胞吸出，转移至含Balb/C小鼠腹腔细胞的HT培养基制成的24孔（每孔0.9mL HT培养基）营养板的3~4个孔内，进行再克隆。然后吸取上清，采用与步骤1相同的ELISA法对阳性克隆株进行再次克隆（三筛）。

（4）对于三筛后的阳性克隆株，采用ML-BSA、丁酰-BSA（检测偶联载体的交叉反应）再进行一次筛选，包被浓度均为2μg/mL，4℃过夜包被，其他条件同上。选取对丁酰-BSA阴性，对ML-BSA阳性的克隆株。结果得到5株阳性克隆。将5株细胞，收取细胞上清检测竞争反应，选取竞争反应明显的细胞株，克隆号为MC-3，于2011年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.4575。

二、单克隆抗体的获得及亚型鉴定

1、获取抗体腹水

选取10周龄Balb/C小鼠，接种细胞前7~14天，预先腹腔注射液体石蜡0.5mL/只。用生理盐水调整杂交瘤细胞株MC-3 CGMCC No.4575浓度至2.0×10⁶个/mL，腹腔接种杂交瘤细胞，接种细胞为1.0×10⁶个/只，7~10天后采集腹水。

2、腹水的纯化：用0.01M, pH7.2 PBS平衡protein G亲和柱至基线平稳，将腹水样品上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳；加入0.1M甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度；用0.01M, pH7.2 PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M, pH7.2 PBS环境中。SDS-PAGE 检测结果如图1所示。（1：蛋白marker （Cat#：CW0142)； 2：小鼠单克隆抗体，上样量为8μg抗体纯度高于95%）。

3、抗体亚型鉴定

采用单克隆抗体亚型检测试剂盒（Southern Biotech Cat No. 530005）对步骤2获得的抗体进行免疫球蛋白亚型的鉴定，具体方法为：用ML-BSA以2μg/mL 包被在96孔酶联板（每孔0.1mL），4℃过夜，弃包被液，洗涤3次，按0.2ml/孔的量加入封闭液（含1%BSA的PBS），37℃孵育1小时后，弃封闭液，洗涤3次，用PBS以1:1000比例稀释多菌灵单克隆抗体，按0.1mL/孔的量加入到酶联板内，37℃孵育1小时后洗涤3次，加入用PBS以1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的各类抗体（小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM）37℃孵育半小时后洗涤3次，按0.1mL/孔的量加入辣根过氧化物酶底物反应液（1mg/mL TMB），37℃反应10分钟，出现蓝色即为阳性结果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H₂SO₄终止反应。结果表明杂交瘤细胞MC-3分泌的抗体为IgG1亚类。

这里配制缓冲液均使用双蒸水，化学试剂纯度为分析纯或更高。最后配制的缓冲液采用0.45μm的滤器过滤。

实施例2  用杂交瘤细胞株MC-3分泌的单克隆抗体建立间接竞争ELISA方法

1．多菌灵标准品的配制：多菌灵标准品，采用高纯水分别配制如下浓度(单位为ppm)的标准溶液：10、5、1、0.5、0.1、0。

2. 抗体溶液配制：将实施例1制备的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，然后将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释成工作浓度1:20000，再加入1%的牛血清白蛋白(BSA)。

3. 洗涤液配制（10×PBST）：含0.2%（体积百分含量）吐温-20和80g/L氯化钠的0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。使用时，将该溶液用纯水稀释10倍再用。

4. 底物溶液配制B液：使用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液，每1mL缓冲液中加入50μL 0.1%的H₂O₂溶液，灌装入试剂瓶中。

5. 显色剂溶液配制A液：用丙酮配制成10mg/mL的四甲基联苯胺溶液，用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，显色时，用B液将A液稀释20倍后使用。

6. 终止液配制：2mol/L H₂SO₄溶液或1mol/L HCL溶液。

7. 酶标板是包被了包被抗原的96孔聚苯乙烯微量反应板。

酶标板的包被：包被抗原采用实施例1中的ML-BSA，包被浓度为2ug/mL，取100μL包被抗原加入反应孔中，4℃过夜，倒出孔内液体，用洗涤液1×PBST洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干，在已包被抗原的酶标板小孔中加入150μL  1%BSA（质量百分含量）封闭，37℃孵育2h，用洗涤液1×PBST洗涤3~5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干。

加待测样品：在1.5ml离心管中将标准品各取50μL，然后加入50μL工作浓度的辣根过氧化酶标记的单克隆抗体，充分混合均匀后取100μL加入96孔酶标板中，37℃孵育30分钟；洗板3次，拍干；显色：加入用B液稀释A液至工作浓度，100μL /孔，37℃显色5~10min；终止：加入2M硫酸或者1M 盐酸 50μL /孔，终止反应；读数：以450nm波长(终点法)测定各孔OD值，以不加抗体的孔作为空白调零。

以各浓度的吸光度A为纵坐标，以对应的多菌灵浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线。结果如图2所示，分析结果表明半抑制浓度为0.689ppm。

Claims (2)

1.多菌灵的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No. 4575的小鼠杂交瘤细胞株MC-3产生。

2.能分泌抗多菌灵单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC-3，其保藏编号为CGMCC No. 4575。

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