JPH01199164A - 除草剤の免疫学的検知方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は環境に関連がある物質、特に地下水や飲料水中
の除草剤の免疫学的検知方法に関する。

最近驚くべき報告がなされている。それは、肥料の硝酸
塩、ドライクリーニング操作からの塩素化溶剤、除草剤
（殺虫剤）、殺虫剤及びそれらの分解生成物によって地
下水が汚染し、しかもこの汚染された地下水から、しば
しば飲料水が大きな支出なしに精製されていることであ
る。この方法において、殺虫剤アトラジン及びその代謝
生成物は飲料水における最大の問題のある物質を構成す
る。

アトラジンは化学名２−クロロ−４−エチルアミノ−６
−イツブロビルアミノー１，３．５−）リアジンを有す
る悪臭を放つ白色の粉末であって、およそ３０年間世界
的に除草剤として使用されてきた。それは光合成を妨げ
てそれによって“雑草°′を迅速に枯らす。アトラジン
は特にトウモロコシ畑の殺雑草剤として使用され、そし
て西独の全トウモロコシ畑の９０％はアトラジンで処理
され、その結果アトラジンは使用された物質のトップの
座にあり、年間およそ１０００）ンになる。アトラジン
とは別に、ほかのトリアジン除草剤も使用され、地面及
び表流水中のその存在が証明された。

表１は最も重要なトリアジン除草剤の構造を示す。

表１　トリアジン−除草剤 アメトリン：Ｒ１＝Ｓ−ＣＨ３゜ Ｒ２＝ＮＨＣＨ（ＣＨ３＞　２　。

Ｒ３＝ＮＨＣ２Ｒ５ アトラドン：Ｒ’　＝ＯＣＲ３。

Ｒ２＝ＮＨＣＨ（ＣＨ３）２　。

Ｒ３＝ＮＨＣ２Ｒ５ アトラジン：Ｒ’＝（Ｊ！。

Ｒ２＝ＮＨＣ２Ｒ５。

Ｒ３＝ＮＨＣＨ（ＣＨ３）２ アジプロトリン：Ｒ１＝Ｓ　　ＣＨ３。

Ｒ２＝ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）２　。

テルブチラジン：Ｒ’＝ＣＩ。

Ｒ２，Ｒ３はチルプリンと同様 、　　　１ チルブリ／：　Ｒ＝Ｓ−ＣＨ３゜ Ｒ−ＮＨＣ（ＣＨ３）３　。

Ｒ３＝ＮＨＣ２Ｒ５ 長い間、これらのトリアジン化合物は使用後永久に分解
されて土壌粒子と結合され、その結果、地下水に対する
危険は除外されると想定された。

しかしこの化合物は非常に安定であって、活性成分の半
分が土壌中で分解されるのに要する時間は２〜５ケ月に
昇ることがわかった。ローム及び粘土が少ししかない土
壌と同様に砂質土壌においては、活性成分は地下水中に
比較的容易に洗い流され、そのためトリアジンの残留物
が地下水中に数年後に現れる可能性がある。

飲料水の規制及び１”人間消費用水質に関する欧州共同
体指針」は飲料水中のこれらの物質の許容限界値を提示
する。個々の物質に対し最大限界は０、　ＯＯＯ１ｒ＋
＋ｇ／Ｉ　（１００ｎｇ／、ｅ　＞までであり、これら
の物質の合計は濃度０．０００５ｍｇ／１５００ｎｇ／
Ｉ）を越えてはならない。

正確な分析のなめには、検出限界はこの値の１又は２桁
低い大きさであるべきである。しかしながら、問題の大
多数の物質及び低い限界値は化学分析に対して大きな問
題を提起する。物理化学的な分析方法（ＧＣ，ＧＣ−Ｍ
Ｓ、ＨＰＬＣ）は化学物質の同定及び定量のために大規
模な濃縮操作を必要とし、そしてそれらは非常に費用が
かかりまた時間がかかるー。その上にそれらはその化合
物の毒性についてどのような知見も与えない。現代的な
生化学的分析方法は細胞成分が試験物質として使用され
る、いわゆる“免疫分析′”と称せられる免疫学的試験
方法によって代表される。免疫学的分析方法は水質分析
の分野において高感度迅速試験を構成し、そしてしばし
ば敏速な、経済的かつ効果的な環境監視を保障する。

免疫分析は抗原−抗体反応に基づく物質の定量的検出の
ための高感度試験方法である。抗体は先ず第一に実験室
動物の免疫感作によって誘導され、そして抗体を生成す
る血清又はリンパ球から抽出され、そして充填物として
たとえばアガロースを含有しているアフィニティーカラ
ムを経て精製される。抗体は高等動物生命の天然の防御
的なシステムの一つを表わす。防御的機能は、特定の抗
体が自然感染又は予防接種による人工感染に基づいて誘
導されるという事実に基づいている。一定の大きさの分
子が抗体の生成にとって必須である。

もし特定の抗体生成が非常に小さな分子、たとえば植物
保護剤に対して開始されるならば、これら（ハプテン）
はたとえばタンパク質（ヘモシアニン、ウシ血清アルブ
ミン、オボアルブミン、千ログロブリン、ポリリジンな
ど）のような高分子量担体分子との免疫感作前に結合さ
れなければならない。

化学物質の検知のなめに、抗原として化学物質を含有し
ている試料を抗体に添加するときに起る抗原−抗体反応
が使用される。古典的な免疫分析において検知されるべ
き抗原は抗体の結合位置の周りで同じ特性の放射性標識
した抗原と競争する。

つい最近、酵素免疫分析（ＥＩＡ）は放射免疫分析（Ｒ
ＩＡ）に比べて著しく増加した。この方法において放射
性抗原は酵素−抗原抱合体によって！き換えられ、この
抱合体は抗体の束縛のない結合位置に対して試料の抗体
とその時競争することができる。この競争ＥＩＡにおい
て、前もって決定された量の酵素標識された抗原は、そ
の部分が基質、たとえばポリスチレン表面と吸着的に又
は共有的に結合される抗体の結合位置に対し試料の抗原
と競争する。低濃度の試料抗原に対して多くの酵素トレ
ーサーが結合する（高基質転換）が、他方高濃度の試料
抗原に対してほんの少しの酵素トレーサーが結合する（
低基質転換）。それゆえ結合した酵素トレーサーの量は
試料抗原濃度の口数である。

洗浄手段によって非結合酵素トレーサーの分離後、基質
の転換に基づいて、結合した酵素標識抗体のシェアを検
知すること、及びしたがって試料中の抗原濃度を検知す
ることが可能である。酵素トレーサーの結合に対する測
定大きさは基質の転換量の吸収作用である。

上述の技術的方法を用いて、特定の抗体がさまざまの殺
虫剤に対して誘導され、またこの問題のある物質の、迅
速かつ極めて特定的であって、それ故に経済的な検知の
目的をもつ免疫分析において開発される。しかしながら
、そのような免疫分析において明瞭な同定及び定量は交
差反応ゆえに不可能であるということはしばしば事実で
ある。

交差反応によって意味されるものは、抗体は異なる構造
の分子中に共通の官能性を認識し、そして一つの活性部
類中にこれらの分子を分類するが、個々の分子を区別す
ることは不可能であるという現象である。これらは担体
マトリックス（タンパク質）そしてそれゆえ認識領域と
して行動する、担体マトリックスから離れた側面だけの
、分子全体でないマトリックス上で結合されなければな
らないがゆえに、この効果は小さな分子（抗体）の場合
に非常に明瞭に見出される。そむけられる側面に対して
類似した構造をもつ分子はその時免疫分析においてしば
しば区別され得ない。他方、多くの場合において、抗体
の生産に対して特別に使用された抗原だけでなく、類似
した化学構造を有する又は使用された抗原の活性と類似
した生物学的活性をもつ化合物も検知できるがゆえに、
交差反応の効果は望ましくさえある。交差反応を慎重に
使用する試験によって、同じ活性部類に属する異なる物
質が検知できる。このことは以前に調査されたことのな
い化合物の毒性評価に非常に効果がある。生態毒物学的
に（ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｙ）以前に
調査されていない化合物の潜在的な危険が上述の活性部
類の分類によって最前面において既に見分けがつけられ
るがゆえに、動物試験及びバイオアッセイはしたがって
必要最小に減少させられる可能性がある。

本発明は免疫学的検知方法を利用できるようにするとい
う目的に基づいており、それによって化学的に類似した
構造をもち又は生物学的に類似した活性をもつトリアジ
ン系の除草剤及び化合物は一つの活性部類に属するので
適切に検知でき、しかも他方複雑な混合物においてさえ
個々の化学物質を明白に同定することもまた可能である
。

（以下余白） 上記の目的は下記の式 ［式中 Ｘｌ、Ｘ３、Ｘ５は炭素又は窒素であり；Ｘ２、Ｘ４、
Ｘ６は炭素であり； Ｒは基ＨＮ（ＣＨ）（但しｎは ｎ　　２ｎ＋１ ０〜８の整数である）、 Ｎ（ＣｍＨ２ｍ＋１）２　（但しｍは１〜８の整数であ
る）、 ＨＮ−Ｃ９Ｈ２９Ｙ（但しＹはシアノ、アミノ又はＣ０
ＯＨ基であり、ｎは１〜８の整数である）、 Ｃ９Ｈ２９Ｙ（但しＺはシア人アミノ又はＣ０ＯＨ基で
あり、Ｘは１〜８の整数である〉、 アジド、ハロゲン、ＳＨ基、ＯＨ基又はＨＮ−Ｃ６Ｈ４
Ｃぶ基であり； Ｒは基ＨＮＣＨ（但しｑは０〜８ ｑ　　２ｑ＋１ ゛　の整数である）、 Ｎ（ＣＨ）（但しｒは１〜８の ｒ　　２ｒ＋１ 整数である）、 ＨＮ−Ｃ９Ｈ２９Ｙ（但しＹはシア人アミノ、アジド又
はＣ０ＯＨ基であり、ｑは１〜８の整数である）、 Ｎ　（Ｃｒ、Ｈ２ｒ＋１　）　Ｚ　（但しＺはシアノ、
アミノ、アジド又はＣ０ＯＨ基又は Ｃ９Ｈ２ｑ基であって、ｒは１〜８の整数であり、また
ｑは１〜８の整数である）、アジド、ハロゲン、ＳＨ基
又はＯＨ基であり； Ｒ３はハロゲン、 ５ＣｎＨ２ｏ＋□（但しｎは０〜８の整数である）、 ０ＣｎＨ２ｎ＋、（但しｎは０〜８の整数である）、 シアノ、アミノ、カルボキシル又はＣＨＯ基であり、し
かも置換基Ｒ３はＲ１及びＲ２に対してメタの位置にあ
るか又はＲ及びＲ２に対してオルト又はパラの位置にあ
ってもよい］を有する化合物の免疫学的検知方法におい
て、置換基Ｒ又はＲ又はＲ３により指定された上記の化
合物（１）（抗原）をマトリックスとカップリングする
ことによって、化合物（Ｉ）の分子の一部だけがさらさ
れ、そして後で実験室動物の免疫感作によって化合物（
Ｉ）Ａ、Ｂ又はＣの分子のこのさらされた一部に好んで
反応する抗体が抽出され、そして化合物＜Ｉ）の免疫学
的検知のために、おそらくそれを含有する試料が同時に
試験シリーズにおいて上記の指定された抗体Ａ、Ｂ又は
Ｃの少なくとも二つと又は指定された抗体の異なる連続
順で反応させられ、そしてそれぞれの試験シリーズのた
めに提出される抗原−抗体結合に基づいて定性及び定量
的測定が化合物（Ｉ＞に関して達成されることを特徴と
する免疫学的検知方法により達成された。

本発明の方法の好ましい態様において、式（Ｉ）の化合
物は芳香族であって３個までの窒素原子を含有するメタ
置換六員環を構成する。この目的に対して特別に都合が
よいものはピリジン、ピリミジン又はトリアジンである
。

本発明の方法の好ましい態様は、免疫学的検知のために
３個の抗体Ａ、Ｂ及びＣが下記の連続順の試験シリーズ
に使用されることである。

１番目の試験シリーズ：ＡＢＣ ２番目の試験シリーズ：　ＢＣＡ ３番目の試験シリーズ：ＣＡＢ 検知されるべき物質を有する試料は使用において抗体の
おのおのとそれぞれしかも別々に都合よく反応させられ
る。これは検査さるべき溶液を相当する抗体で被覆され
ている反応容器中に、又はこのように被覆されたミクロ
タイター板のキャビティ中にピペットではかり入れると
いう方法でなされる。

別の好ましい代替手段は試験さるべき試料をそれぞれの
試験シリーズの第１の抗体と最初に反応させ、それから
反応しなかった上澄みを分離しそしてこれを試験シリー
ズの次の抗体とそれぞれ反応させるということである。

特別の場合には、本発明の方法を使用するとき、実験室
動物又はハイブリドーマ技術によって抗体を生成するリ
ンパ球から得られる血清の調製中にモノクローナル抗体
を抽出し、次いで検知工程においてそれを抗体として使
用することが好都合である。

本発明の免疫学的試験方法は、化合物（Ｉ）とは別に、
この部類の化合物に属する構造的に類似した化合物及び
構造的に異なる別の化合物ではあるが、同じ生物学的活
性を有しそして類似した結合行動を示す化合物を、交差
反応性によって検知することを可能にする。

抗原／抗体反応の免疫学的検知は、放射性標識された、
又は酵素、けい光物質又は電気信号を発する物質（バイ
オセンサー）に結合される相当する抗原を用いることに
よって本発明の方法において都合よく達成される。試料
の抗原及び標識された又は結合された抗原（検知剤）は
抗体力結合位置に対して競争をひき起され、それから抗
体に結合されていない遊離の検知剤は洗い流され、そし
て最後に放射線、吸収、螢光又は電気信号の測定によっ
て、結合された検知剤の量、したがって溶液中の抗原の
濃度が検出される。

本発明の免疫学的検知方法は前もって決定された部類の
活性の物質を検知すること、及び同時にこの活性部類の
異なる物質を同定することを可能にする。

この試験方法は迅速に、極めて正確にそして低費用で操
作すること及び従来の分析方法を使用した場合に自動化
にも拘らず不可能であった環境分析における高いサンプ
ル量を扱うことを可能にした。

この方法はその毒性に関して以前に検査されなかった化
合物を活性部類に分類することによって生態学的に評価
されうるような方法に設計される。

本発明は以下の実施例に基づいて更に詳細に説明される
。

実施例１ 以下に、式（１）の化合物の好ましい一例である除草剤
アトラジンの一側面に対してそれぞれそして好ましく向
けられた３種の異なる抗体Ａ、　Ｂ及びＣの調製、及び
本発明の免疫学的試験方法の実行方法を記述する。

アトラジン分子の側面 に対して好んで向けられる抗体Ａの調製のために、先ず
第一にトリアジンシマジンのメチルチオエーテル基が過
酸でスルホ酸化され次いで変性されたアメトリンがウシ
の血清アルブミンと直接結合される。類似した方法で、
アトラジン分子の側面Ｈ５°２ に対して選択的に向けられる抗体Ｂの発生のために、ト
リアジンシマジンのエチルアミノ基の一つがタンパク質
に対してカルボジイミド方法によって結合される。

最後にアトラジンの側面 （ＣＨ３＞　２　ＨＣ に好んで応答する抗体Ｃがイソプロピルアミノ基の一つ
を経て除草剤プロパジンと担体マトリックスとのカップ
リングによって生成される。

上記のように調製された抱合体は実験室動物（ウサギ）
に抗体Ａ、Ｂ及びＣを発生するために接種され、それか
ら既知の方法又は式（Ｉ）に示された置換基によるアフ
ィニティクロマトグラフィーによって、免疫された動物
の血清から抽出される。

得られた抗体はミクロタイターキャビティのポリスチレ
ン表面上に吸着される。この終りに、抗体は炭酸塩綬街
液（Ｎ　ａ２　Ｃ０３／　Ｎ　ａ　ＨＣ０３：５０ミリ
モル／１２　；　ｐ８９．６　＞に溶解され、そしてそ
れぞれ０．２５ｍ１の得られた溶液はミクロタイター板
の個々のキャビティ中ヘビペットではかり入れられる。

続いて室温で一夜インキュベーションを行ない、そして
翌日ＴＢＳＭｆｒ液で洗浄を行なう。よく覆をかぶせた
板をそれから一２０℃で貯蔵した。分析のために、検査
すべき１８０μｍの水溶液（検査される物質の濃度は１
μｔ／１〜２００■／１である）をキャビティ中へ入れ
、そして抗体の型によって選ばれるそれぞれ５０μ℃の
酵素トレーサー、アルカリホスファターゼの抱合体及び
トリアジンをキャビティ中へ添加する。

検知が抗体Ａについて行なわれるならば、アメトリンが
酵素と結合されるが、抗体Ｂ又は抗体Ｃが存在するなら
ばシマジン又はプロパジンが使用される。

溶液はミクロタイター板の短時間の水平振とうによって
混合される。さらに２０℃で１時間インキュベーション
後、ＴＢＳ緩衝液（５０ミリモル／テトリス（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン１ミリモル／、１Ｍｇｃｊ２
２．５０ミリモル／ｌＮａＣ１、ＨＣＩによりｐ）（７
，８，０，０５％のポリオキシエチレン　ソルビタン　
モノオレアート）で洗浄することによって抗体の位置に
結合していない全ての分子を取り除いた。結合した酵素
トレーサーの定量的検知のため、それぞれ１２５μｌの
ホスファターゼ基質の溶液（１■　ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート／ｍｌ炭酸塩綬街液）は個々のキャビティ
に注いだ。酵素反応は２０℃で起るが、高温インキュベ
ーションによって加速されることが可能である。個々の
キャビティ内の溶液の吸収は波長４０５ｎｍで垂直光線
光度計によって測定される。もし−層高い感度の領域へ
移動することを望むなら、４℃での一夜インキュベーシ
ョンが推奨される。しかし試薬、装置及び空間的な部分
（ｕｎｉｔ）について特別の要求なしにｐｐｔ範囲の再
現性のある結果が達成できないことを思い出さなければ
ならない。

試料の抗体濃度の計算は以下の背景に基づいている。酵
素トレーサーは、試料の抗原と共にインキュベーション
後桟されたままになっている遊離の抗体の結合位置と先
ず第一に結合する。このように高濃度の試料抗原の存在
においては、はんの少しの酵素トレーサーしか結合しな
いが、他方低濃度の試料抗原に関しては多くの酵素トレ
ーサーが結合される。結合した酵素トレーサーの量はそ
れゆえ試料の抗原濃度の函数である。反応した基質の吸
収量（無色から黄色への呈色反応）は酵素トレーサーの
結合の測定大きさとして用いられる。

計算： 未知試料（Ｂ”ＡＢ　　ＡＵＢ＞とゼロ試料（ＢＯ＝Ａ
８０−ＡｌＢ）の吸収比率： Ｂ／ＢＯ＝（ＡＢ　　ＡＵＢ）／＜ＡＢＯＡＩＲ）（Ｂ
／ＢＯ）：抗原の不在下に結合する酵素トレーサー（Ｂ
Ｏ）に対する抗原の存在下に結合する酵素トレーサー（
Ｂ）の比率 ＡＢＯ：抗原（除草剤）の存在下に結合する酵素トレー
サーに対する尺度としての吸収（４０５ｎｍ）ＡＢ：試
料中に未知濃度の抗原（除草剤）の存在下に結合する酵
素トレーサーに対する尺度としての吸収＜４０５ｎｍ） ＡｕＢ＝キャビティの壁を被覆する抗体の不在下に結合
する酵素トレーサーに対する尺度としての吸収（４０５
ｎｍ） もしＢ／ＢＯが除草剤濃度の対数に対してｙ軸に記入さ
れるならばＳ字状の曲線が生じる。より良い取扱いのた
めの直線化に対してはｙ軸も対数化されるべきこと（ｌ
ｏｇｉｔ　／ｌｏｇ変換）が提案される。評価のために
は正規分布の積分の上に抑制度＜１−Ｂ／ＢＯ）を変換
することが良いことがわかった。実際にはプロパビリテ
ィペーパーに頻度の代わりに抑制％（コＯＯＸ　（１−
Ｂ／ＢＯ））を記入する。それによってＳ字状曲線が直
線化される。

試料抗原の検知方法は個々の試験シリーズにおいて、試
料抗原が別々に又は連続して使用された抗体のおのおの
と反応するように行なわれる。後者の方法においては、
結果は各試験シリーズにおいて、種々の抗体が好んで向
けられる、さらされた部分が異なった分子中に存在する
ならば、同じ抑制が検知の間じゆう観察されるというこ
とである。しかしながら、もし少なくとも二つのさらさ
れた側面が一つの分子中に含まれるならば偏差が存在す
る。これは二つの最初に指定された側面を持つ分子は溶
液からのほかのものについてと同様に一つの側面に結合
する抗体によって取り除かれ、そして次のキャビティへ
の溶液の移動後それはもはや結合に対して利用できない
という事実によって説明される。もしこれが全ての結合
可能性に対して行なわれるなら、以下の抑制マトリック
ス（表２）が結果として生じ、それから基本構造は多重
プロセスで引き出すことが可能である。

表２＝抑制マ ＡＢＣＢＣＡ　　　　ＣＡＢ ＋＋＋　　　　＋＋＋　　　　＋＋＋ ＋−−十−−＋−− ＋−＋　　＋＋−＋＋− ＋＋−＋＋−＋−＋ ＋＋−＋−＋　　十＋− ＋は酵素トレーサー結合の抑制 −は酵素トレーサー結合の非抑制 ′トリックス 釘瞥％拝ゑ・（４匙）（訃１ ここに示した抑制マトリックスは、なおいっそう複雑な
分子又は分子混合物を分析するために、ほかの抗体の使
用によってＣを超えて容易に拡張されうる。

実施例２ トリアジンの交差反応性は、それらの活性分類に関して
これらの化合物を分類することを可能にするために、表
３に表示される物質について研究した。免疫感作は、特
にアルキル、イソプロピル及びエチル基がアトラジンに
対して高い特異性を得るためにさらされるような方法で
行なわれる。

下記の表において個々の物質の抑制値（％）を表示する
。抗体に対する抗原の強い結合は酵素的検知システムの
同様に強い抑制をひき起す。抑制の強度から、抗原と抗
体の間の相互作用の程度が認められうる。

ＸＯｎ　寸■いへｎ寸トー 套、／−ト贈ムト介 表３に示した抑制値は所定の濃度範囲（２ｐｐｂ）にお
いて抗体の選択性はそんなに強く特徴づけられないが、
光学化学系■でも効果を獲得する表示された化合物は免
疫学的検知方法において同様に識別される可能性がある
ことを示す。

免疫分析の発明概念を用いて、交差反応性の計算された
使用法によって混合物中に個々に存在する物質の構造に
関する結論を取り出すことが可能である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）、下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中 Ｘ＾１、Ｘ＾３、Ｘ＾５は炭素又は窒素であり；Ｘ＾２
   、Ｘ＾４、Ｘ＾６は炭素であり； Ｒ＾１は基ＨＮ（Ｃ＿ｎＨ＿２＿ｎ＿＋＿１）（但しｎ
   は０〜８の整数である）、 Ｎ（Ｃ＿ｍＨ＿２＿ｍ＿＋＿１）＿２（但しｍは１〜８
   の整数である）、 ＨＮ−Ｃ＿ｎＨ＿２＿ｎＹ（但しＹはシアノ、アミノ又
   はＣＯＯＨ基であり、ｎは１〜８の 整数である）、 Ｃ＿ｘＨ＿２＿ｘＺ（但しＺはシアノ、アミノ又はＣＯ
   ＯＨ基であり、ｘは１〜８の整数で ある）、 アジド、ハロゲン、ＳＨ基、ＯＨ基又は ＨＮ−Ｃ＿６Ｈ＿４Ｃｌ基であり； Ｒ＾２は基ＨＮＣ＿ｑＨ＿２＿ｑ＿＋＿１（但しｑは０
   〜８の整数である）、 Ｎ（Ｃ＿ｒＨ＿２＿ｒ＿＋＿１）（但しｒは１〜８の整
   数である）、 ＨＮ−Ｃ＿ｑＨ＿２＿ｑＹ（但しＹはシアノ、アミノ、
   アジド又はＣＯＯＨ基であり、ｑは １〜８の整数である）、 Ｎ（Ｃ＿ｒＨ＿２＿ｒ＿＋＿１）Ｚ（但しＺはシアノ、
   アミノ、アジド又はＣＯＯＨ基又は Ｃ＿ｑＨ＿２＿ｑ基であつて、ｒは１〜８の整数であり
   、またｑは１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、ＳＨ基又はＯＨ基であ り； Ｒ＾３はハロゲン、 ＳＣ＿ｎＨ＿２＿ｎ＿＋＿１（但しｎは０〜８の整数で
   ある）、 ＯＣ＿ｎＨ＿２＿ｎ＿＋＿１（但しｎは０〜８の整数で
   ある）、 シアノ、アミノ、カルボキシル又はＣＨＯ基であり、し
   かも置換基Ｒ＾３はＲ＾１及びＲ＾２に対してメタの位
   置にあるか又はＲ＾１及びＲ＾２に対してオルト又はパ
   ラの位置にあってもよい］を有する化合物の免疫学的検
   知方法において、置換基Ｒ＾１又はＲ＾２又はＲ＾３に
   より指定された上記の化合物（ I ）（抗原）をマトリ
   ックスとカップリングすることによって、化合物（ I
   ）の分子の一部だけがさらされ、そして後で実験室動物
   の免疫感作によって化合物（ I ）Ａ、Ｂ又はＣの分子
   のこのさらされた一部に好んで反応する抗体が抽出され
   、そして化合物（ I ）の免疫学的検知のために、おそ
   らくそれを含有する試料が同時に試験シリーズにおいて
   上記の指定された抗体Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも二つと
   又は指定された抗体の異なる連続順で反応させられ、そ
   してそれぞれの試験シリーズのために提出される考慮中
   の抗原−抗体結合に基づいて定性的及び定量的測定が化
   合物（ I ）に関して達成されることを特徴とする免疫
   学的検知方法。
2. （２）式（ I ）の化合物が３個までの窒素原子を含有
   するメタ置換芳香族六員環化合物であることを特徴とす
   る請求項１記載の方法。
3. （３）、化合物（ I ）がピリジン、ピリミジン又はト
   リアジンであることを特徴とする請求項２記載の方法。
4. （４）、免疫学的検知のために、３個の抗体Ａ、Ｂ及び
   Ｃが下記の連続順を有する試験シリーズに使用されるこ
   とを特徴とする請求項１又は２記載の方法。 １、試験シリーズ：ＡＢＣ ２、試験シリーズ：ＢＣＡ ３、試験シリーズ：ＣＡＢ
5. （５）、試料がそれぞれ使用された抗体のおのおのと別
   々に反応させられることを特徴とする請求項１〜４のい
   ずれかに記載の方法。
6. （６）、試料が先づそれぞれの試験シリーズの第１の抗
   体と反応させられ、それから非反応上澄みが分離され、
   そしてこれが試験シリーズの次の抗体とそれぞれ反応さ
   せられることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記
   載の方法。
7. （７）、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と
   する前述の請求項の１項又はそれ以上の項に記載の方法
   。
8. （８）、化合物（ I ）とは別に、交差反応によって、
   この類の化合物に属する構造的に類似した化合物及び構
   造的には異なるが同じ生物学的活性と類似した結合挙動
   を有する化合物も含まれることを特徴とする前述の請求
   項の１項又はそれ以上の項に記載の方法。
9. （９）、免疫学的検知が放射性同位体、酵素、螢光体又
   は電機信号を放射する物質を用いて行なわれることを特
   徴とする前述の請求項の１項又はそれ以上の項に記載の
   方法。