JP2659220B2 - 除草剤の免疫学的検知方法 - Google Patents
除草剤の免疫学的検知方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は環境に関連がある物質、特に地下水や飲料水
中の除草剤の免疫学的検知方法に関する。
中の除草剤の免疫学的検知方法に関する。
最近、肥料の硝酸塩、ドライクリーニング操作からの
塩素化溶剤、除草剤（殺虫剤）、殺虫剤及びそれらの分
解生成物によって地下水が汚染され、しかもこの汚染さ
れた地下水から、しばしば飲料水が大きな出費なしに精
製されているという驚くべき報告がなされている。この
方法では、殺虫剤アトラジン及びその代謝生成物が飲料
水中で最も問題となる物質である。
塩素化溶剤、除草剤（殺虫剤）、殺虫剤及びそれらの分
解生成物によって地下水が汚染され、しかもこの汚染さ
れた地下水から、しばしば飲料水が大きな出費なしに精
製されているという驚くべき報告がなされている。この
方法では、殺虫剤アトラジン及びその代謝生成物が飲料
水中で最も問題となる物質である。
アトラジンは科学名２−クロロ−４−エチルアミノ−
６−イソプロピルアミノ−1,3,5−トリアジンを有する
悪臭を放つ白色の粉末であって、およそ30年間世界的に
除草剤として使用されてきた。このアトラジンは光合成
を妨げ、そのため“雑草”を迅速に枯らす。また、アト
ラジンは特にトウモロコシ畑の除草剤として使用され、
そして西独の全トウモロコシ畑の90％はアトラジンで処
理され、その結果、アトラジンは使用された物質のトッ
プの座にあり、その使用量は年間およそ1000トンにな
る。アトラジンとは別に、ほかのトリアジン除草剤も使
用され、地面及び表流水中のその存在が証明された。表
１は最も重要なトリアジン除草剤を構造を示す。
６−イソプロピルアミノ−1,3,5−トリアジンを有する
悪臭を放つ白色の粉末であって、およそ30年間世界的に
除草剤として使用されてきた。このアトラジンは光合成
を妨げ、そのため“雑草”を迅速に枯らす。また、アト
ラジンは特にトウモロコシ畑の除草剤として使用され、
そして西独の全トウモロコシ畑の90％はアトラジンで処
理され、その結果、アトラジンは使用された物質のトッ
プの座にあり、その使用量は年間およそ1000トンにな
る。アトラジンとは別に、ほかのトリアジン除草剤も使
用され、地面及び表流水中のその存在が証明された。表
１は最も重要なトリアジン除草剤を構造を示す。
長い間、これらのトリアジン化合物は使用後永久に分
解されて土壌粒子と結合し、その結果、地下水に対する
危険は除外されると考えられていた。しかし、この化合
物は非常に安定であり、活性成分の半分が土壌中で分解
されるのに要する時間は２〜５ケ月であることがわかっ
た。ローム及び粘土が少ししかない土壌と同様に、砂質
土壌においては、分解物は言うまでもなく、その活性成
分は地下水中に比較的容易に洗い流され、そのためトリ
アジンの残留物が地下水中に数年後に現れる可能性があ
る。
解されて土壌粒子と結合し、その結果、地下水に対する
危険は除外されると考えられていた。しかし、この化合
物は非常に安定であり、活性成分の半分が土壌中で分解
されるのに要する時間は２〜５ケ月であることがわかっ
た。ローム及び粘土が少ししかない土壌と同様に、砂質
土壌においては、分解物は言うまでもなく、その活性成
分は地下水中に比較的容易に洗い流され、そのためトリ
アジンの残留物が地下水中に数年後に現れる可能性があ
る。
飲料水の規制及び「人間消費用水質に関する欧州共同
体指針」は飲料水中のこれらの物質の許容限界値を提示
する。即ち、個々の物質の最大限界値は0.0001mg/（1
00ng/）までであり、これらの物質の合計は濃度0.000
5mg/（500ng/）を超えてはならない。
体指針」は飲料水中のこれらの物質の許容限界値を提示
する。即ち、個々の物質の最大限界値は0.0001mg/（1
00ng/）までであり、これらの物質の合計は濃度0.000
5mg/（500ng/）を超えてはならない。
正確な分析のためには、検出限界はこの値の１又は２
桁低い数値であるべきである。しかしながら、問題とな
る大多数の物質及びその低い限界値は化学分析に対して
大きな問題を提起する。物理化学的な分析方法（GC、GC
−MS、HPLC）は、化学物質の同定及び定量のために大規
模な濃縮操作を必要とし、したがって、非常に費用がか
かりまた時間がかかる。その上、それらの分析方法はそ
の化合物の毒性についていかなる知見も与えない。現代
の生化学的分析方法は、細胞成分が試験物質として使用
される、いわゆる“イムノアッセイ”と称せられる免疫
学的試験方法によって代表される。イムノアッセイは、
水質分析の分野の中では、高感度迅速試験であり、常に
敏速、経済的かつ効果的な環境監視を保障する。
桁低い数値であるべきである。しかしながら、問題とな
る大多数の物質及びその低い限界値は化学分析に対して
大きな問題を提起する。物理化学的な分析方法（GC、GC
−MS、HPLC）は、化学物質の同定及び定量のために大規
模な濃縮操作を必要とし、したがって、非常に費用がか
かりまた時間がかかる。その上、それらの分析方法はそ
の化合物の毒性についていかなる知見も与えない。現代
の生化学的分析方法は、細胞成分が試験物質として使用
される、いわゆる“イムノアッセイ”と称せられる免疫
学的試験方法によって代表される。イムノアッセイは、
水質分析の分野の中では、高感度迅速試験であり、常に
敏速、経済的かつ効果的な環境監視を保障する。
イムノアッセイは抗原−抗体反応に基づく物質の定量
的測定のための高感度試験方法である。抗体は、先ず第
一に実験用動物に免疫することによって誘導され、更に
それらの動物の血清又は抗体を形成するリンパ球から抽
出され、次に、充填材としてたとえばアガロースを充填
してなるアフイニティーカラムを経て精製される。抗体
は高等動物生命の天然の防御システムの一つである。こ
の防御機能は、特定の抗体が自然感染又は予防接種によ
る人工感染に基づいて誘導されるという事実に基づいて
いる。一定の大きさの分子が抗体の形成にとって必須で
ある。もし特定の抗体形成が非常に小さな分子、たとえ
ば植物保護剤に対して開始されるとするならば、この非
常に小さな分子（ハプテン）はたとえばタンパク質（ヘ
モシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、チ
ログロブリン、ポリリジンなど）のような高分子担体分
子と免疫する前に結合されなければならない。
的測定のための高感度試験方法である。抗体は、先ず第
一に実験用動物に免疫することによって誘導され、更に
それらの動物の血清又は抗体を形成するリンパ球から抽
出され、次に、充填材としてたとえばアガロースを充填
してなるアフイニティーカラムを経て精製される。抗体
は高等動物生命の天然の防御システムの一つである。こ
の防御機能は、特定の抗体が自然感染又は予防接種によ
る人工感染に基づいて誘導されるという事実に基づいて
いる。一定の大きさの分子が抗体の形成にとって必須で
ある。もし特定の抗体形成が非常に小さな分子、たとえ
ば植物保護剤に対して開始されるとするならば、この非
常に小さな分子（ハプテン）はたとえばタンパク質（ヘ
モシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、チ
ログロブリン、ポリリジンなど）のような高分子担体分
子と免疫する前に結合されなければならない。
化学物質の測定には、抗原として化学物質を含有して
いる試料を抗体に添加するときに起る抗原−抗体結合が
使用される。古典的なイムノアッセイは、測定すべき抗
原と、抗体との結合部位に周辺で同一の特定の放射性標
識抗原とを競合させて行なう。つい最近、エンザイムイ
ムノアッセイ（EIA）が、ラジオイムノアッセイ（RIA）
に比べて著しく増加した。この方法においては、放射性
抗原が酵素−抗原結合体によって置き換えられ、次にこ
の結合体は未反応の抗体結合部位に対して試料抗原と競
合することができる。この競合EIAにおいては、前もっ
て決定されている量の酵素標識抗原は、基体、たとえば
ポリスチレン表面と吸着的に又は共有的に結合している
抗体の結合部位に対し試料抗原と競合する。低濃度の試
料抗原に対しては、多くの酵素トレーサーが結合する
（高基質転換）が、他方、高濃度の試料抗原に対して
は、ほんの少しの酵素のトレーサーしか結合しない（低
基質転換）。それゆえ、結合した酵素トレーサーの量は
試料抗原濃度のパラメーターとなる。
いる試料を抗体に添加するときに起る抗原−抗体結合が
使用される。古典的なイムノアッセイは、測定すべき抗
原と、抗体との結合部位に周辺で同一の特定の放射性標
識抗原とを競合させて行なう。つい最近、エンザイムイ
ムノアッセイ（EIA）が、ラジオイムノアッセイ（RIA）
に比べて著しく増加した。この方法においては、放射性
抗原が酵素−抗原結合体によって置き換えられ、次にこ
の結合体は未反応の抗体結合部位に対して試料抗原と競
合することができる。この競合EIAにおいては、前もっ
て決定されている量の酵素標識抗原は、基体、たとえば
ポリスチレン表面と吸着的に又は共有的に結合している
抗体の結合部位に対し試料抗原と競合する。低濃度の試
料抗原に対しては、多くの酵素トレーサーが結合する
（高基質転換）が、他方、高濃度の試料抗原に対して
は、ほんの少しの酵素のトレーサーしか結合しない（低
基質転換）。それゆえ、結合した酵素トレーサーの量は
試料抗原濃度のパラメーターとなる。
洗浄手段によって非結合酵素トレーナーの分離後、基
質の転換に基づいて、結合した酵素標識抗体の量を測定
すること、即ち試料中の抗原濃度を測定することが可能
である。酵素トレーサーの結合に対する測定値は、基質
の転換量の吸光度である。
質の転換に基づいて、結合した酵素標識抗体の量を測定
すること、即ち試料中の抗原濃度を測定することが可能
である。酵素トレーサーの結合に対する測定値は、基質
の転換量の吸光度である。
上述の技術的方法を用いることにより、特定の抗体が
さまざまの殺虫剤に対して誘導され、またこの問題とな
る物質の迅速的でかつ極めて特異的であって、それ故に
経済的な測定の目的を有するイムノアッセイが開発され
る。しかしながら、このようなイムノアッセイにおいて
は、明瞭な同定及び定量は交差反応が生じるゆえに不可
能であるということもしばしば事実である。交差反応に
よって意味されるものは、抗体は異なる構造の分子中に
共通な官能性を認識し、したがって、一つの活性部類中
にこれらの分子を分類するが、個々の分子を区別するこ
とは不可能であるということである。このことは、小さ
い分子（抗原）の場合に非常に明瞭に見い出される。な
ぜなら、これらの分子は、担体マトリックス（タンパク
質）に結合しなければならず、それゆえ、全分子でな
く、担体マトリックスから離れた側面のみが認識領域と
して挙動するからである。したがって、担体マトリック
スに近い側面に対して類似した構造を有する分子はイム
ノアッセイ分析に際し、しばしば区別され得ない。他
方、多くの場合においては、抗体を産生させるために特
に使用された抗原だけでなく、使用された抗原と類似し
た化学構造を有し、又は使用された抗原活性と類似した
生物学的活性を有する化合物も測定できるため、交差反
応の効果は望ましい。交差反応を計画的に使用する試験
では、同じ活性部類に属する異なる物質が検知できる。
このことは、以前に調べたことのない化合物の毒性評価
に非常に効果がある。生態毒性学的に（ecotoxicologic
ally）以前に調べたことのない化合物の潜在的な危険性
が上述の活性部類の分類により予測されてすぐに見分け
がつけられ、したがって、動物試験及びバイオアッセイ
を必要最小限に減少させることができる。
さまざまの殺虫剤に対して誘導され、またこの問題とな
る物質の迅速的でかつ極めて特異的であって、それ故に
経済的な測定の目的を有するイムノアッセイが開発され
る。しかしながら、このようなイムノアッセイにおいて
は、明瞭な同定及び定量は交差反応が生じるゆえに不可
能であるということもしばしば事実である。交差反応に
よって意味されるものは、抗体は異なる構造の分子中に
共通な官能性を認識し、したがって、一つの活性部類中
にこれらの分子を分類するが、個々の分子を区別するこ
とは不可能であるということである。このことは、小さ
い分子（抗原）の場合に非常に明瞭に見い出される。な
ぜなら、これらの分子は、担体マトリックス（タンパク
質）に結合しなければならず、それゆえ、全分子でな
く、担体マトリックスから離れた側面のみが認識領域と
して挙動するからである。したがって、担体マトリック
スに近い側面に対して類似した構造を有する分子はイム
ノアッセイ分析に際し、しばしば区別され得ない。他
方、多くの場合においては、抗体を産生させるために特
に使用された抗原だけでなく、使用された抗原と類似し
た化学構造を有し、又は使用された抗原活性と類似した
生物学的活性を有する化合物も測定できるため、交差反
応の効果は望ましい。交差反応を計画的に使用する試験
では、同じ活性部類に属する異なる物質が検知できる。
このことは、以前に調べたことのない化合物の毒性評価
に非常に効果がある。生態毒性学的に（ecotoxicologic
ally）以前に調べたことのない化合物の潜在的な危険性
が上述の活性部類の分類により予測されてすぐに見分け
がつけられ、したがって、動物試験及びバイオアッセイ
を必要最小限に減少させることができる。
本発明は免疫学的測定方法の有効利用を図るという目
的に基づいており、この方法によりトリアジン系の除草
剤及びそれと化学的に類似した構造を有し、又は生物学
的に類似した活性を有する化合物は一つの活性部類に属
するものとして適切に測定されるが、これに反応して、
本発明の方法は、複雑な混合物においてさえ前記個々の
化学物質を明白に同定することが可能である。
的に基づいており、この方法によりトリアジン系の除草
剤及びそれと化学的に類似した構造を有し、又は生物学
的に類似した活性を有する化合物は一つの活性部類に属
するものとして適切に測定されるが、これに反応して、
本発明の方法は、複雑な混合物においてさえ前記個々の
化学物質を明白に同定することが可能である。
上記の目的は下記の式 ［式中 X1、X3、X5は炭素又は窒素であり； X2、X4、X6は炭素であり； R1は基HN（CnH2n+1）（但しｎは０〜８の整数であ
る）、 Ｎ（CmH2m+1）２（但しｍは１〜８の整数である）、 HN−CnH2nY（但しＹはシアノ、アミノ又はCOOH基であ
り、ｎは１〜８の整数である）、 CXH2XZ（但しＺはシアノ、アミノ又はCOOH基であり、ｘ
は１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基、OH基又はHN−C6H4Cl基であ
り； R2は基HNCqH2q+1（但しｑは０〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）（但しｒは１〜８の整数である）、 HN−CqH2qY（但しＹはシアノ、アミノ、アジド又はCOOH
基であり、ｑは１〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）Ｚ（但しＺはシアノ、アミノ、アジド又
はCOOH基又はCqH2q基であって、ｒは１〜８の整数であ
り、またｑは１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基又はOH基であり； R3はハロゲン、 SCnH2n+1（但しｎは０〜８の整数である）、 OCnH2n+1）（但しｎは０〜８の整数である）、 シアノ、アミノ、カルボキシル又はCHO基であり、しか
も置換基R3はR1及びR2に対してメタの位置にあるか又は
R1及びR2に対してオルト又はパラの位置にあってもよ
い］ を有する化合物の免疫学的測定方法において、上記の化
合物（Ｉ）（抗原）を、置換基R1又はR2又はR3のいずれ
かによってマトリックスと結合させて化合物（Ｉ）の分
子の一部分のみを露出させ、次いで、これを用いて実験
動物を免疫することによって、化合物（Ｉ）の分子の各
々の露出部分に対応する抗体Ａ、Ｂ又はＣを抽出し、化
合物（Ｉ）の免疫学的検出のために、化合物（Ｉ）を含
有すると推定される試料を、試験シリーズにおいて、前
記抗体Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも２種と同時に反
応させ、又は異なる連続順で前記抗体Ａ、Ｂ又はＣのう
ちの少なくとも２種と反応させ、そしてそれぞれの試験
シリーズにおいて提供される抗原−抗体結合に基づいて
化合物（Ｉ）の定性的又は定量的測定をすることを特徴
とする免疫学的測定方法により達成された。
る）、 Ｎ（CmH2m+1）２（但しｍは１〜８の整数である）、 HN−CnH2nY（但しＹはシアノ、アミノ又はCOOH基であ
り、ｎは１〜８の整数である）、 CXH2XZ（但しＺはシアノ、アミノ又はCOOH基であり、ｘ
は１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基、OH基又はHN−C6H4Cl基であ
り； R2は基HNCqH2q+1（但しｑは０〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）（但しｒは１〜８の整数である）、 HN−CqH2qY（但しＹはシアノ、アミノ、アジド又はCOOH
基であり、ｑは１〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）Ｚ（但しＺはシアノ、アミノ、アジド又
はCOOH基又はCqH2q基であって、ｒは１〜８の整数であ
り、またｑは１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基又はOH基であり； R3はハロゲン、 SCnH2n+1（但しｎは０〜８の整数である）、 OCnH2n+1）（但しｎは０〜８の整数である）、 シアノ、アミノ、カルボキシル又はCHO基であり、しか
も置換基R3はR1及びR2に対してメタの位置にあるか又は
R1及びR2に対してオルト又はパラの位置にあってもよ
い］ を有する化合物の免疫学的測定方法において、上記の化
合物（Ｉ）（抗原）を、置換基R1又はR2又はR3のいずれ
かによってマトリックスと結合させて化合物（Ｉ）の分
子の一部分のみを露出させ、次いで、これを用いて実験
動物を免疫することによって、化合物（Ｉ）の分子の各
々の露出部分に対応する抗体Ａ、Ｂ又はＣを抽出し、化
合物（Ｉ）の免疫学的検出のために、化合物（Ｉ）を含
有すると推定される試料を、試験シリーズにおいて、前
記抗体Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも２種と同時に反
応させ、又は異なる連続順で前記抗体Ａ、Ｂ又はＣのう
ちの少なくとも２種と反応させ、そしてそれぞれの試験
シリーズにおいて提供される抗原−抗体結合に基づいて
化合物（Ｉ）の定性的又は定量的測定をすることを特徴
とする免疫学的測定方法により達成された。
本発明の方法の好ましい態様において、式（Ｉ）の化
合物は芳香族であって３個までの窒素原子を含有するメ
タ置換六員環を構成する。この目的に対して特別に都合
がよいものはピリジン、ピリミジン又はトリアジンであ
る。
合物は芳香族であって３個までの窒素原子を含有するメ
タ置換六員環を構成する。この目的に対して特別に都合
がよいものはピリジン、ピリミジン又はトリアジンであ
る。
本発明の方法の好ましい態様は、免疫学的測定のため
に３個の抗体Ａ、Ｂ及びＣが下記の連続順の試験シリー
ズに使用されることである。
に３個の抗体Ａ、Ｂ及びＣが下記の連続順の試験シリー
ズに使用されることである。
１番目の試験シリーズ:ABC ２番目の試験シリーズ:BCA ３番目の試験シリーズ:CAB 測定されるべき物質を含有する試料は、使用において
抗体のおのおのとそれぞれしかも別々に都合よく反応さ
せられる。これは検査さるべき溶液を相当する抗体で被
覆されている反応容器中に、又はこのように被覆された
マイクロタイタープレートの穴中にピペットで加えると
いう方法でなされる。
抗体のおのおのとそれぞれしかも別々に都合よく反応さ
せられる。これは検査さるべき溶液を相当する抗体で被
覆されている反応容器中に、又はこのように被覆された
マイクロタイタープレートの穴中にピペットで加えると
いう方法でなされる。
別の好ましい代替手段は、試験さるべき試料をそれぞ
れの試験シリーズの第１の抗体と最初に反応させ、次い
で、反応しなかった上澄みを分離し、上澄みを試験シリ
ーズの次の抗体とそれぞれ反応させるということであ
る。
れの試験シリーズの第１の抗体と最初に反応させ、次い
で、反応しなかった上澄みを分離し、上澄みを試験シリ
ーズの次の抗体とそれぞれ反応させるということであ
る。
特別の場合には、本発明の方法を使用するときは、実
験用動物から得られる血清の調製中でハイブリドーマ技
術によって抗体を産生するリンパ球からモノクローナル
抗体を抽出し、次いでこの測定方法の抗体としてそのモ
ノクローナル抗体を使用することが好都合である。
験用動物から得られる血清の調製中でハイブリドーマ技
術によって抗体を産生するリンパ球からモノクローナル
抗体を抽出し、次いでこの測定方法の抗体としてそのモ
ノクローナル抗体を使用することが好都合である。
本発明の免疫学的試験方法は、化合物（Ｉ）とは別
に、この部類の化合物に属する構造的に類似した化合物
及び構造的に異なる別の化合物ではあるが同じ生物学的
活性を有し、かつ類似した結合挙動を示す化合物を、交
差反応生によって測定することを可能にする。
に、この部類の化合物に属する構造的に類似した化合物
及び構造的に異なる別の化合物ではあるが同じ生物学的
活性を有し、かつ類似した結合挙動を示す化合物を、交
差反応生によって測定することを可能にする。
抗原／抗体反応の免疫学的測定は、放射性標識され
た、又は酵素、けい光体又は電気信号を発する物質（バ
イオセンサー）と結合した相当する抗原を用いることに
よって、本発明の方法において都合よく達成される。試
料抗原及び標識又は結合抗原（検知剤）は、抗体の結合
部位に対して競合をひき起こし、次に、抗体に結合され
ていない遊離の抗原（検知剤）は洗い流され、最終的に
放射線、吸収、螢光又は電気信号を測定することによっ
て、結合された抗原（検知剤）の量、即ち、溶液中の抗
原の濃度が検出される。
た、又は酵素、けい光体又は電気信号を発する物質（バ
イオセンサー）と結合した相当する抗原を用いることに
よって、本発明の方法において都合よく達成される。試
料抗原及び標識又は結合抗原（検知剤）は、抗体の結合
部位に対して競合をひき起こし、次に、抗体に結合され
ていない遊離の抗原（検知剤）は洗い流され、最終的に
放射線、吸収、螢光又は電気信号を測定することによっ
て、結合された抗原（検知剤）の量、即ち、溶液中の抗
原の濃度が検出される。
本発明の免疫学的測定方法は、前もって決定された部
類の活性の物質を検知すること、及び同時にこの活性部
類の異なる物質を同定すること、を可能にする。
類の活性の物質を検知すること、及び同時にこの活性部
類の異なる物質を同定すること、を可能にする。
また、この試験方法は迅速に、極めて正確にかつ低費
用で操作すること、及び従来の分析方法を使用した場合
に自動化にも狗らず不可能であった環境分析における高
いサンプル量を扱うこと、を可能にした。さらに、この
方法は、その毒性に関して以前に調べたことのない化合
物を活性部類に分類することによって、生態学的に評価
されうるような方法に設計できる。
用で操作すること、及び従来の分析方法を使用した場合
に自動化にも狗らず不可能であった環境分析における高
いサンプル量を扱うこと、を可能にした。さらに、この
方法は、その毒性に関して以前に調べたことのない化合
物を活性部類に分類することによって、生態学的に評価
されうるような方法に設計できる。
本発明は以下の実施例に基づいて更に詳細に説明され
る。
る。
実施例１ 以下に、式（Ｉ）の化合物の好ましい一例である除草
剤アトラジンの一側面に対して、それぞれ選択的に向け
られる３種の異なる抗体A,B及びＣの調製、及び本発明
の免疫学的試験方法の実行方法を記述する。
剤アトラジンの一側面に対して、それぞれ選択的に向け
られる３種の異なる抗体A,B及びＣの調製、及び本発明
の免疫学的試験方法の実行方法を記述する。
アトラジン分子の側面 に対して選択的に向けられる抗体Ａの調製のために、先
ず第一にトリアジンアメトリンのメチルチオエーテル基
がペルオキシ酸でスルホキシド化され次いで変性したア
メトリンの血清アルブミンと直接結合される。類似した
方法で、アトラジン分子の側面 に対して選択的に向けられる抗体Ｂの産生のために、ト
リアジンシマジンのエチルアミノ基の一つがタンパク質
に対してカルボジイミド方法によって結合される。
ず第一にトリアジンアメトリンのメチルチオエーテル基
がペルオキシ酸でスルホキシド化され次いで変性したア
メトリンの血清アルブミンと直接結合される。類似した
方法で、アトラジン分子の側面 に対して選択的に向けられる抗体Ｂの産生のために、ト
リアジンシマジンのエチルアミノ基の一つがタンパク質
に対してカルボジイミド方法によって結合される。
最後にアトラジンの側面 に選択的に応答する抗体Ｃが、イソプロピルアミノ基の
一つを経て除草剤プロパジンと担体マトリックスとの結
合によって産生される。
一つを経て除草剤プロパジンと担体マトリックスとの結
合によって産生される。
上記のように調製された結合体は、実験用動物（ウサ
ギ）に抗体Ａ、Ｂ及びＣを産生させるために接種され、
次いで、既知の方法又は式（Ｉ）に示された置換基によ
るアフィニティクロマトグラフィーによって、免疫され
た動物の血清から抽出される。
ギ）に抗体Ａ、Ｂ及びＣを産生させるために接種され、
次いで、既知の方法又は式（Ｉ）に示された置換基によ
るアフィニティクロマトグラフィーによって、免疫され
た動物の血清から抽出される。
得られた抗体はマイクロタイターの穴のポリスチレン
表面上に吸着される。次に、抗体は炭酸塩緩衝液（Na2C
O3/NaHCO3;50ミリモル／;pH9.6）に溶解され、次い
で、それぞれ0.25mlの得られた溶液をマイクロタイター
プレートの個々の穴中へピペットで加える。さらに、室
温で一夜インキュベーションを行ない、次いで翌日TBS
緩衝液で洗浄を行なう。よく覆をかぶせたプレートを−
20℃で貯蔵した。分析のために、検査すべき180μの
水溶液（検査される物質の濃度は１μg/〜200mg/で
ある）を穴中へ入れ、次いで、抗体種により選択される
それぞれ50μの酵素トレーサー、アルカリホスファタ
ーゼの結合体及びトリアジンを穴中へ添加する。測定を
抗体Ａについて行なうならば、アメトリンが酵素と結合
されるが、抗体Ｂ又は抗体Ｃが存在するならばシマジン
又はプロパジンが使用される。
表面上に吸着される。次に、抗体は炭酸塩緩衝液（Na2C
O3/NaHCO3;50ミリモル／;pH9.6）に溶解され、次い
で、それぞれ0.25mlの得られた溶液をマイクロタイター
プレートの個々の穴中へピペットで加える。さらに、室
温で一夜インキュベーションを行ない、次いで翌日TBS
緩衝液で洗浄を行なう。よく覆をかぶせたプレートを−
20℃で貯蔵した。分析のために、検査すべき180μの
水溶液（検査される物質の濃度は１μg/〜200mg/で
ある）を穴中へ入れ、次いで、抗体種により選択される
それぞれ50μの酵素トレーサー、アルカリホスファタ
ーゼの結合体及びトリアジンを穴中へ添加する。測定を
抗体Ａについて行なうならば、アメトリンが酵素と結合
されるが、抗体Ｂ又は抗体Ｃが存在するならばシマジン
又はプロパジンが使用される。
溶液はマイクロタイタープレートの短時間の水平振と
うによって混合される。さらに20℃で１時間インキュー
ベーション後、TBS緩衝液（50ミリモル／トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン１ミリモル／MgC
l2、50ミリモル／NaCl、HClによりpH7.8、0.05％のポ
リオキシエチレン ソルビタン モノオレアート）で洗
浄することによって抗体の結合部位に結合していない全
ての抗原（分子）を取り除いた。結合した酵素トレーサ
ーの定量的測定のため、それぞれ125μのホスファタ
ーゼ基質の溶液（1mg ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト/ml炭酸塩緩衝液）を個々の穴に加えた。酵素反応は2
0℃で進行するが、高温インキュベーションによって加
速することが可能である。個々の穴内の溶液の吸光度
は、波長405nmで垂直光線分光光度計によって測定され
る。もし一層高い感度を望むなら、４℃での一夜インキ
ュベーションが推奨される。しかし、試薬、装置及び空
間的な部分（unit）について特別の要求なしにppt範囲
の再現性のある結果が達成できないことを思い出さなけ
ればならない。
うによって混合される。さらに20℃で１時間インキュー
ベーション後、TBS緩衝液（50ミリモル／トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン１ミリモル／MgC
l2、50ミリモル／NaCl、HClによりpH7.8、0.05％のポ
リオキシエチレン ソルビタン モノオレアート）で洗
浄することによって抗体の結合部位に結合していない全
ての抗原（分子）を取り除いた。結合した酵素トレーサ
ーの定量的測定のため、それぞれ125μのホスファタ
ーゼ基質の溶液（1mg ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト/ml炭酸塩緩衝液）を個々の穴に加えた。酵素反応は2
0℃で進行するが、高温インキュベーションによって加
速することが可能である。個々の穴内の溶液の吸光度
は、波長405nmで垂直光線分光光度計によって測定され
る。もし一層高い感度を望むなら、４℃での一夜インキ
ュベーションが推奨される。しかし、試薬、装置及び空
間的な部分（unit）について特別の要求なしにppt範囲
の再現性のある結果が達成できないことを思い出さなけ
ればならない。
試料の抗体濃度の計算は、以下の背景に基づいてい
る。酵素トレーサーは、試料抗原と共にインキュベーシ
ョンした後に残されたままになっている遊離の抗体の結
合部位と先ず第一に結合する。このように高濃度の試料
抗原の存在においては、ほんの少しの酵素トレーサーし
か結合しないが、他方、低濃度の試料抗原が存在する場
合は、多くの酵素トレーサーが結合される。結合した酵
素トレーサーの量は、それゆえ試料の抗原濃度のパラメ
ーターとなる。反応した基質の吸光度（無色から黄色へ
の呈色反応）は酵素トレーサーの結合の測定値として用
いられる。計算： 未知試料（Ｂ＝AB−AUB）とゼロ試料（BO＝ABO−AUB）
の吸収比率： B/BO＝（AB−AUB）／（ABO−AUB） （B/BO）：抗原の不在下に結合する酵素トレーサー（B
O）に対する抗原の存在下に結合する酵素トレーサー
（Ｂ）の比率 ABO:抗原（除草剤）の存在下に結合する酵素トレーサー
に対する尺度としての吸収（405nm） AB:試料中に未知濃度の抗原（除草剤）の存在下に結合
する酵素トレーサーに対する尺度としての吸収（405n
m） AUB:穴の壁を被覆する抗体の不在下に結合する酵素トレ
ーサーに対する尺度としての吸収（405nm） もし、B/BOが除草剤濃度の対数に対してｙ軸に記入さ
れるならば、Ｓ字状の曲線が生じる。より取扱い易い直
線を得るには、ｙ軸も対数化すること（logit/log変
換）が提案される。評価のためには、正規分布の積分の
上に抑制度（１−B/BO）を変換することが良いことがわ
かった。実際には、プロバビリティペーパーに頻度の代
わりに抑制％（100×（１−B/BO））を記入する。それ
によってＳ字状曲線が直線化される。
る。酵素トレーサーは、試料抗原と共にインキュベーシ
ョンした後に残されたままになっている遊離の抗体の結
合部位と先ず第一に結合する。このように高濃度の試料
抗原の存在においては、ほんの少しの酵素トレーサーし
か結合しないが、他方、低濃度の試料抗原が存在する場
合は、多くの酵素トレーサーが結合される。結合した酵
素トレーサーの量は、それゆえ試料の抗原濃度のパラメ
ーターとなる。反応した基質の吸光度（無色から黄色へ
の呈色反応）は酵素トレーサーの結合の測定値として用
いられる。計算： 未知試料（Ｂ＝AB−AUB）とゼロ試料（BO＝ABO−AUB）
の吸収比率： B/BO＝（AB−AUB）／（ABO−AUB） （B/BO）：抗原の不在下に結合する酵素トレーサー（B
O）に対する抗原の存在下に結合する酵素トレーサー
（Ｂ）の比率 ABO:抗原（除草剤）の存在下に結合する酵素トレーサー
に対する尺度としての吸収（405nm） AB:試料中に未知濃度の抗原（除草剤）の存在下に結合
する酵素トレーサーに対する尺度としての吸収（405n
m） AUB:穴の壁を被覆する抗体の不在下に結合する酵素トレ
ーサーに対する尺度としての吸収（405nm） もし、B/BOが除草剤濃度の対数に対してｙ軸に記入さ
れるならば、Ｓ字状の曲線が生じる。より取扱い易い直
線を得るには、ｙ軸も対数化すること（logit/log変
換）が提案される。評価のためには、正規分布の積分の
上に抑制度（１−B/BO）を変換することが良いことがわ
かった。実際には、プロバビリティペーパーに頻度の代
わりに抑制％（100×（１−B/BO））を記入する。それ
によってＳ字状曲線が直線化される。
試料抗原の測定方法は、個々の試験シリーズにおい
て、試料抗原が別々に又は連続して使用された抗体のお
のおのと反応するように行なうことができる。後者の方
法においては、この結果は各試験シリーズにおいて、種
々の抗体が選択的に向けられる露出された部分が異なっ
た分子中に存在する場合は、同じ抑制が測定を通して観
察されるということである。しかしながら、少なくとも
二つの露出された側面が一つの分子中に含まれる場合
は、偏差が生ずる。このことは、二つの最初に特定した
露出された側面を有する分子が溶液から一方の露出され
た側面に結合した抗体と同様に他方の露出された側面に
結合する抗体に基づき除外されるため次の穴への溶液の
移動後、除外された分子は、もはや抗体の結合に対して
利用できないという事実によって説明される。このこと
から、全ての結合可能性に対して行なわれる場合は、以
下の抑制マトリックス（表２）が結果として生じ、この
結果から、結合可能性のある側面の基本構造は多重プロ
セスで引き出すことが可能となる。
て、試料抗原が別々に又は連続して使用された抗体のお
のおのと反応するように行なうことができる。後者の方
法においては、この結果は各試験シリーズにおいて、種
々の抗体が選択的に向けられる露出された部分が異なっ
た分子中に存在する場合は、同じ抑制が測定を通して観
察されるということである。しかしながら、少なくとも
二つの露出された側面が一つの分子中に含まれる場合
は、偏差が生ずる。このことは、二つの最初に特定した
露出された側面を有する分子が溶液から一方の露出され
た側面に結合した抗体と同様に他方の露出された側面に
結合する抗体に基づき除外されるため次の穴への溶液の
移動後、除外された分子は、もはや抗体の結合に対して
利用できないという事実によって説明される。このこと
から、全ての結合可能性に対して行なわれる場合は、以
下の抑制マトリックス（表２）が結果として生じ、この
結果から、結合可能性のある側面の基本構造は多重プロ
セスで引き出すことが可能となる。
ここに示した抑制マトリックスは、なおいっそう複雑
な分子又は分子混合物を分析するために、ほかの抗体を
使用することによりＣを超えて容易に拡張されうる。
な分子又は分子混合物を分析するために、ほかの抗体を
使用することによりＣを超えて容易に拡張されうる。
実施例２ トリアジンの交差反応性は、それらの活性分類に関し
てこれらの化合物を分類することを可能にするため、表
３に表示される物質の分類の代表例について調べた。免
疫は、特にアルキル、イソプロピル及びエチル基がアト
ラジンに対して高い特異性を得るために露出するような
方法で行なわれる。下記の表に、上記個々の物質の分類
の重要な代表例の抑制値（％）を示す。抗体に対する抗
原の強い結合は酵素的測定システムと同様に強い抑制を
ひき起す。抑制の強度から、抗原と抗体の間の相互作用
の程度を認めることができる。
てこれらの化合物を分類することを可能にするため、表
３に表示される物質の分類の代表例について調べた。免
疫は、特にアルキル、イソプロピル及びエチル基がアト
ラジンに対して高い特異性を得るために露出するような
方法で行なわれる。下記の表に、上記個々の物質の分類
の重要な代表例の抑制値（％）を示す。抗体に対する抗
原の強い結合は酵素的測定システムと同様に強い抑制を
ひき起す。抑制の強度から、抗原と抗体の間の相互作用
の程度を認めることができる。
表３に示した抑制値は所定の濃度範囲（2ppb）におい
て抗体の選択性はそれほど強く特徴づけられないが、光
学化学系IIでも効果を獲得する表示された化合物は免疫
学的測定方法においても同様に認識される可能性がある
ことを示す。
て抗体の選択性はそれほど強く特徴づけられないが、光
学化学系IIでも効果を獲得する表示された化合物は免疫
学的測定方法においても同様に認識される可能性がある
ことを示す。
イムノアッセイの発明概念を用いて、交差反応性の計
算された使用法によって混合物中に個々に存在する物質
の構造に関する結論を取り出すことが可能である。
算された使用法によって混合物中に個々に存在する物質
の構造に関する結論を取り出すことが可能である。
Claims (9)
- 【請求項１】下記の式 ［式中 X1、X3、X5は炭素又は窒素であり； X2、X4、X6は炭素であり； R1は基HN（CnH2n+1）（但しｎは０〜８の整数であ
る）、 Ｎ（CmH2m+1）２（但しｍは１〜８の整数である）、 HN−CnH2nY（但しＹはシアノ、アミノ又はCOOH基であ
り、ｎは１〜８の整数である）、 CXH2XZ（但しＺはシアノ、アミノ又はCOOH基であり、ｘ
は１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基、OH基又はHN−C6H4Cl基であ
り； R2は基HNCqH2q+1（但しｑは０〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）（但しｒは１〜８の整数である）、 HN−CqH2qY（但しＹはシアノ、アミノ、アジド又はCOOH
基であり、 ｑは１〜８の整数である）、 Ｎ（CrH2r+1）Ｚ（但しＺはシアノ、アミノ、アジド又
はCOOH基又はCqH2q基であって、ｒは１〜８の整数であ
り、またｑは１〜８の整数である）、 アジド、ハロゲン、SH基又はOH基であり； R3はハロゲン、 SCnH2n+1（但しｎは０〜８の整数である）、 OCnH2n+1（但しｎは０〜８の整数である）、 シアノ、アミノ、カルボキシル又はCHO基であり、しか
も置換基R3はR1およびR2に対してメタの位置にあるか又
はR1及びR2に対してオルト又はパラの位置にあってもよ
い］ を有する化合物の免疫学的測定方法において、 上記の化合物（Ｉ）（抗原）を、置換基R1又はR2又はR3
のいずれかによってマトリックスと結合させて化合物
（Ｉ）の分子の一部分のみを露出させ、次いで、これを
用いて実験動物を免疫することによって、化合物（Ｉ）
の分子の各々の露出部分に対応する抗体Ａ、Ｂ又はＣを
抽出し、化合物（Ｉ）の免疫学的検出のために、化合物
（Ｉ）を含有すると推定される試料を、試験シリーズに
おいて、前記抗体Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも２種
と同時に反応させ、又は異なる連続順で前記抗体Ａ、Ｂ
又はＣのうちの少なくとも２種と反応させ、そしてそれ
ぞれの試験シリーズに存在する抗原−抗体結合に基づい
て、化合物（Ｉ）の定性的又は定量的測定をすることを
特徴とする免疫学的測定方法。 - 【請求項２】式（Ｉ）の化合物が３個までの窒素原子を
含有するメタ置換芳香族六員環化合物であることを特徴
とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】化合物（Ｉ）がピリジン、ピリミジン又は
トリアジンであることを特徴とする請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】免疫学的検知のために、３種の抗体Ａ、Ｂ
及びＣを下記の連続順を有する試験シリーズに使用する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。 1.試験シリーズ:ABC 2.試験シリーズ:BCA 3.試験シリーズ:CAB - 【請求項５】試料がそれぞれ使用される抗体のおのおの
と別々に反応させられることを特徴とする請求項１〜４
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】試料が先づそれぞれの試験シリーズの第１
の抗体と反応し、次に、非反応上澄みを分離し、さら
に、非反応上澄みが試験シリーズの次の抗体とそれぞれ
反応させられることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項７】抗体がモノクローナル抗体であることを特
徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】化合物（Ｉ）とは別に、交差反応によって
この類の化合物に属する構造的に類似した化合物及び構
造的には異なるが、同じ生物学的活性及び類似した結合
挙動を有する化合物をも検出することを特徴とする請求
項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】免疫学的検知が放射性同位体、酵素、蛍光
体又は電気信号を発する物質を用いて行われることを特
徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3723726.8 | 1987-07-17 | ||
| DE19873723726 DE3723726A1 (de) | 1987-07-17 | 1987-07-17 | Verfahren zur herstellung spezifischer, seitendifferenzierender nachweisreagenzien und ihre anwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199164A JPH01199164A (ja) | 1989-08-10 |
| JP2659220B2 true JP2659220B2 (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=6331814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63178890A Expired - Lifetime JP2659220B2 (ja) | 1987-07-17 | 1988-07-18 | 除草剤の免疫学的検知方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5100776A (ja) |
| EP (1) | EP0300381B1 (ja) |
| JP (1) | JP2659220B2 (ja) |
| AT (1) | ATE114817T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339721C (ja) |
| DD (1) | DD285421A5 (ja) |
| DE (2) | DE3723726A1 (ja) |
| ES (1) | ES2068817T3 (ja) |
| HU (1) | HU199191B (ja) |
| RU (1) | RU1838787C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| AR242831A1 (es) * | 1988-09-19 | 1993-05-31 | Ciba Geigy Ag | Linea celular de hibridoma sus mutantes y variantes, anticuerpos monoclonales producidas a partir de la misma, procedimiento de obtencion y equipo de ensayo para reaccion inmunologico. |
| DE3929119A1 (de) * | 1989-09-01 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von analyten |
| DE3931360C1 (ja) * | 1989-09-20 | 1991-03-07 | Hoelzle & Chelius Gmbh, 6078 Neu-Isenburg, De | |
| IE890149L (en) * | 1989-10-06 | 1990-07-19 | Du Pont | Sulfonylureas |
| DE4013004C2 (de) * | 1990-04-24 | 1993-10-21 | Elvira Schecklies | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von niedermolekularen organischen Substanzen |
| DE4126692C2 (de) * | 1991-08-13 | 1995-05-11 | Bst Bio Sensor Tech Gmbh | Immunosensor-Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung von Antigenen < 2 000 Dalton |
| DE4314091A1 (de) * | 1993-04-29 | 1994-11-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunologisches Nachweisverfahren für Triazine |
| GB9705376D0 (en) * | 1997-03-14 | 1997-04-30 | Harris William J | Antibody fragment formulations and assay formats for detecting the presence an d concentration of analytes |
| US6635434B1 (en) | 1999-09-17 | 2003-10-21 | Exiqon A/S | Immunoassay for pesticides and their degradation products |
| CN113466189B (zh) * | 2021-05-25 | 2024-03-08 | 青岛农业大学 | 一种基于双酶活性抑制作用的马拉硫磷比色检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4530786A (en) * | 1984-09-04 | 1985-07-23 | Colorado State University Research Foundation | Antibody for the detection and quantification of atrazine |
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- 1987-07-17 DE DE19873723726 patent/DE3723726A1/de not_active Withdrawn
-
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- 1988-07-15 AT AT88111408T patent/ATE114817T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-15 DE DE3852227T patent/DE3852227D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-15 US US07/219,656 patent/US5100776A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-15 ES ES88111408T patent/ES2068817T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-18 RU SU884356223A patent/RU1838787C/ru active
- 1988-07-18 HU HU883763A patent/HU199191B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-07-18 CA CA000572326A patent/CA1339721C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-18 DD DD88318045A patent/DD285421A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-18 JP JP63178890A patent/JP2659220B2/ja not_active Expired - Lifetime
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