RU1838787C

RU1838787C - Способ определени триазиновых гербицидов

Info

Publication number: RU1838787C
Application number: SU884356223A
Authority: RU
Inventors: Пфайффер Вольфганг; Х.Диттель Рудольф; Мис Вольфганг
Original assignee: Др.Пфайффер Биоаналютик Кг
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-18
Publication date: 1993-08-30
Also published as: ATE114817T1; CA1339721C; DE3723726A1; HU199191B; EP0300381B1; EP0300381A2; ES2068817T3; JPH01199164A; DE3852227D1; HUT49411A; JP2659220B2; EP0300381A3; DD285421A5; US5100776A

Description

Изобретение относитс к иммунологи- чес кому способу определени веществ в ок- ру)ающей среде, в частности средств дл зациты растений в питьевой или грунтовых водах.

| Атразин представл ет собой белый порошок без запаха. Химическое название его 2-Х1ор-4-этиламино-6-изопропиламино-1,3, ,5-1риазин. В течение вот уже 30 лет он ши зоко используетс в качестве гербицида. Механизм действи его заключаетс в по- даЕлении фотосинтеза, в результате чего сорн ки быстро засыхают, Атразин ис- по; ьзуетс , в частности, дл уничтожени сорн ков на кукурузных пол х. Так, в ФРГ 90 э всех площадей, зан тых под кукурузу, обрабатываетс атразином,который,таким образом, при годовом расходе 1000 т занимает первое место среди других гербицидов . Нар ду с атразином примен ютс и другие гербициды, производные триазина, присутствие которых обнаружено в грунтовых и поверхностных водах.

Долгое врем считалось, что производные триазина после обработки ими растений постепенно разлагаютс и св зываютс с частицами почвы, и загр знение ими грунтовых вод, таким образом, исключено. На практике однако оказалось, что эти соединени вл ютс стабильными: врем , за которое в почве распадаетс половина активного вещества, составл ет 2-5 мес цев . Из песчаных, а также глинистых и суглинистых почв активное вещество довольно легко вымываетс грунтовыми водами, в результате чего остатки триазина могут обнаруживатьс в грунтовых водах и через

00

со

00 4 00 XI

СО

несколько лет. При этом дл отдельных веществ верхний предел составл ет 0,0001 мг/л (100 нг/л), а суммарное содержание этих веществ не должно превышать 0,0005 мг/л (500 нг/л).

Дл точного аналитического определени чувствительность анализа должна быть ..до двух пор дков ниже этого значени . Из- за большого количества веществ, которые нужно определ ть, и низких предельных концентраций возникает однако серьезна проблема определени их химическими методами . Физико-химические методы анализа (газова хроматографи ,. сочетание газовой громатографии и масс-спектромет- рии, высокопроизводительна жидкостна хроматографи } дл идентификации и количественного определени химических веществ требуют трудоемких методов концентрировани . Кроме того, они очень дороги и трудоемки. К .тому же эти методы не дают возможности судить о токсичности анализируемых соединений.

Современные биохимические методы анализа представл ют собой иммунологи- ческие тесты (так называемый иммуно-эна- лиз), в которых в качестве испытуемых соединений используютс части клеток. Им- мунологические методы анализа дл анализа вод вл ютс высокочувствительными и наиболее быстрыми и дают возможность быстро, эффективно и с сравнительно небольшими затратами осуществл ть мониторинг окружающей среды.

Иммунотесты представл ют собой высокочувствительные системы дл количественного определени вещесто. основанные на реакции антиген-антитело. Дл осуществлени иммуноанализа вначале индуцируют антитела путем иммунизации лабораторных животных и затем получают их из сыворотки этих животных или продуцирующих их лимфоцитов. Очистку антител осуществл ют на колоннах дл аффинной хроматографйи, содержащих в качестве материала-наполнител , например агарозу. Антитела представл ют собой одну из природных защитных систем высших животных организмов. Защитна функци основана на том, что при прививке естественной или искусственной инфекции индуцируютс специфические антитела. Предпосылкой образовани антител вл етс определенна величина молекул. Дл индуцировани образовани специфических антител по отношению к очень маленьким молекулам, например средствам дл защиты растений, их гаптены перед иммунизацией необходимо закрепить на молекуле-носителе с высоким молекул рным весом, например белке

(гемоцианмн, альбумин бычьей сыворотки, альбумин йца, тироглобулин, полилизин и

ДР-).

Дл определени химического вещест- ва используют только такую св зь антиген- антитело, котора возникает при добавлении к антителу пробы, содержащей химическое вещество, вл ющеес антигеном . В классическом иммуноанализе опре

дел емые антигены конкурируют с

аналогичными по специфичности антигенами , меченными радиоактивной меткой, за места св зи на антителе. В последнее врем нар ду с радиоиммунным анализом (РИА)

5 большое значение приобрел ферментный иммунный анализ (ФИА), в котором антиген с радиоактивной меткой замен етс конью- гатом фермент-антиген, который затем может конкурировать за свободные места

0 св зи на антителе с антигенами пробы. При таком конкурирующем ФИА происходит конкуренци между определенным количеством меченного ферментом антигена.и антигеном пробы за места св зи на антителе.

5 которые в свою очередь за счет адсорбционных или ковалентных сил св заны с поверхностью носител , например поверхностью полистирола. При небольшой концентрации антигенов в пробе с антителом св зываетс

0 большое количество ферментной метки (высока степень расхода субстрата) и, наоборот , при высокой концентрации антигенов в пробе с антителом св зываетс лишь небольшое количество ферментной метки

5 (низка степень расхода субстрата). Инги- бирование св зи ферментной метки вл етс , таким образом, функцией концентрации антигенов в пробе. После отделени несв занной ферментной метки путем отмывки

0 можно по степени расхода субстрата определить долю св занного меченного ферментом антигена и тем самым концентрацию антигена в пробе. Мерой количества св занной ферментной метки вл етс абсорбци

5 прореагировавшего субстрата. С помощью вышеописанной техники индуцируют специфические по отношению к различным пестицидам антитела, а иммуноанализ, вл сь быстрым, высокоселективным и тем

0 самым сравнительно недорогим методом анализа, дает решение проблемы определени этих веществ. Нередки однако случаи, когда однозначна идентификаци и количественное определение на основе пере5 крестных реакций с помощью такого иммуноанализа невозможны, Под перекрестной реакцией имеетс в виду вление, за- ключающеес в том, что антитела распознают одинаковые функциональные группы в молекулах различного строени ,

группиру эти различные молекулы по принципу одинакового воздействи . При этом однако нельз сделать различи между отдельными молекулами. Особенно рко этот Эффект про вл етс в случае небольших мо- еку л (антигенов), так как они должны быть в заны с матрицей (белком), и поэтому познавательным регионом вл етс не вс олекула, а лишь ее отвращенна от матри- ы сторона. В результате молекулы с одинаковой структурой у этой отвращенной стороны часто станов тс неразличимыми с помощью иммуноанализа. С другой стороны , во многих случа х перекрестна реакци вл етс как раз желательной, так как с ее помощью можно определ ть не только гнтигены, используемые специально дл получени антитела, но и соединени аналогичного химического строени или с такой же биологической активностью, как и ис- гользуемый антиген. Целенаправленно п римен перекрестные реакции, в ходе од- н ого теста можно определ ть различные, но относ щиес по воздействию к одному классу вещества. Это особенно ценно при необходимости оценки токсичности еще неизученных соединений. Благодар этому свести к минимуму опыта на животных и биологические тесты, так с помощью вышеописанного принципа разделени на классы по действию становитс возможным сделать предварительную опенку экотокси- к элегической опасности еще неисследованных соединений.

Задачей насто щего изобретени вл - е|гс разработка иммунологического спосо- б|а определени , с помощью которого можно было бы определ ть триазиновые гербициды и соединени с аналогичным химическим строением или одинаковой биологической активностью, относ щиес по действию к одному классу, и который бы в то же врем позвол л однозначно идентифицировать отдельные химические соединени в сложных смес х.

Решением указанной задачи вл етс иммунологический способ определени соединений формулы

Ј

, /

5

О

V

/5-

I в которой

| X , X , XJ означают атом углерода или аз|ота

| X , X , X атом углерода; Ri - группу HN(CnH2n i). причем п означает целое число

от 0 до 8, М СпЬ щм причем п означает целое число от 1 до 8, HN-CnH2nY, причем Y означает циано-, амино- или СООН-группу, a h целое число от 1 до 8, CxP2xZ, причем Z 5 означает циано-, амино- или СООН-групиу, а X целое число от 1 до 8, азид, атом галогена , SH-группу, ОН-группу или группу HN- СбН4С1; R2 - группу HNCqH2q-n, причем q означает

0 целое число от 0 до 8, N(CrH2r+i)2, причем г означает целое число от 1 до 8, HN-CqH2qY, причем Y означает циано-, эмино-, азидо- или СООН-группу, a q целое число от 1 до 8. N-CrH2rM Z, причем Z означает цианоами5 но-, азидо- или СООН-группу или группу CqH2q. a r и q целое число от 1 до 8, азид, атом галогена, SH-группу или ОН-группу; Вз - атом галогена, ЗСлН2п+1. причем п означает целое число от 0 до 8, ОСпН2л-н, при0 чем п означает целое число от 0 до 8, циано- карбоксильную, амино- или СНО- группу, причем заместитель Нз может находитьс в мета-положении относительно RI и R2 или в орто- или пара-положении относи5 тельно Ri nR2, отличающийс тем. что закреплением указанного соединени (I) (антигена) на матрице через заместители Ri, R2 или РЗ экспонируетс только часть его молекулы: иммунизацией подопытных жи0 вотных получают антитела А, В, или С, пред- почтительно реагирующие на эту экспонированную часть молекулы соединени (I), и дл иммунологического определени соединени (I) предположительно

5 содержащую его пробу в сери х опытов одновременно или в различной последовательности подвергают взаимодействию с по меньшей мере двум из вышеуказанных антител А, В, или С и на основании образова0 ни в сери х опытов св зи антиген-антитело провод т количественное и качественное определение соединени (I). По предпочтительному варианту осуществлени насто щего изобретени соединение формулы (I)

5 представл ет мета-замещенное шестизвен- ное ароматическое кольцо, содержащее до трех ато мов азота. Наиболее предпочтительными при этом вл ютс производные пиридина, пиримидина или триазина.

0По предпочтительному варианту осуществлени предлагаемого способа дл иммунологического определени три антитела А, В и С используютс в сери х опытов в следующей последовательности: перва сери :

5 ABC; втора последовательность: ВСА; треть последовательность: CAB;

При этом пробу с определ емым веществом по отдельности подвергают взаимодействию с каждым из указанных антител. Дл этой цели исследуемые растворы можно вводить с помощью пипетки в реакционные сосуды или полости пластин дл микротитровани с наход щимис в них соответствующими антителами.

По другому предпочтительному варианту осуществлени способа исследуемую пробу вначале подвергают взаимодействию с первым антителом из каждой серии, затем отдел ют непрореагировавшую надосадоч- ную жидкость и подвергают ее взаимодействию со следующим антителом серии.

В отдельных случа х при проведении предлагаемого способа может оказатьс целесообразным с помощью гибридной техники , путем переработки полученных из подопытных животных сывороток или продуцирующих антитела лимфоцитов получать моноклональные антитела и уже их использовать дл анализа.

Иммунологический способ в соответствии с насто щим изобретением, при исполь- зовании реакционной способности к перекрестным реакци м, нар ду с соединени ми (1) позвол ет проводить анализ и других соединений аналогичного строени , относ щихс к тому же классу соединений, а также соединений отличного строени , которые однако обладают такой же биологической активностью и аналогичным поведением в отношений образовани св зей .. .

Иммунологическое определение с использованием реакции антиген-антитело по способу в соответствии с насто щим изобретением предпочтительно провод т с помощью антигена с радиоактивной меткой или антигена, св занного с ферментом, флуоресцирующим соединением или веществом , генерирующим электрические сигналы (биосенсором), В ходе анализа происходит конкуренци антигена пробы и меченного или св занного антигена (реактива) за места св зи с антителом. После этого несв занный с антителом свободный реактив отмывают и, измер интенсивность радиоактивного излучени , величину, абсорбции , флуоресцентное излучение или электрический сигнал, определ ют тем самым количество св занного реактива и, сле- довательно, концентрацию антигена в растворе.

Иммунологический способ определени в соответствии с насто щим изобрете- нием позвол ет проводить анализ соединений определенного класса активности и в то же врем идентифицировать от- дельные вещества этого класса. Он представл ет собой быстрый, высокоселективный и недорогой способ, с помощью которого можно проводить анализ большого

количества веществ, наход щихс в окружающей среде, чего невозможно, несмотр на автоматизацию, сделать с помощью обычных аналитических методов. Положенные в

основу способа принципы позвол ют проводить оценку экологической токсичности еще неисследованных соединений, классифициру их по активности.

Более подробно изобретение по сн етс на следующих примерах.

Пример. Описаны получение трех различных антител А, В и С, каждое из которых предпочтительно воздействует на одну из частей молекулы гербицида атразина, наиболее характерного представител соединений формулы (I), а также вариант осуществлени предлагаемого в соответствии с насто щим изобретением иммуноло- гического способа определени .

Дл получени антитела А, предпочтительно воздействующего на часть молекулы атразина

- К 1

Н5Сг 5н((ЗДг

(П)1

вначале провод т реакцию сульфоксидиро- вани метилтиоэфирной группы триазина аметрина нздкислотой и затем непосредственно закрепл ют модифицированный таким образом аметрин на альбумине бычьей сыворотки. Аналогичным образом дл пол- учени антитела В, предпочтительно реагирующего на часть молекулы атразина

40

-ДСЧ

H-BT njr ci ш)

чА

одну из этиламино-групп триазина симази- на с помощью карбодиимидного способа

45 св зывают с белком. И, наконец, антитело С. предпочтительно реагирующее на часть молекулы атразина может быть получено путем св зывани гербицида пропэзина с матрицей через изопропиламиновые группы.

50„ ч,

-xCWfe

(CHjj

H-f (Ю

гт

Полученные вышеописанным образом коньюгаты ввод тс дл индуцировани антител А, В и С подопытным животным (кроликам ), которые затем получаютс из сыворотки иммунизированных животных

известными способами, в частности с помощью аффинной хроматографии, с исполь- ованием заместителей в соответствии с юрмулой (1).

Полученные антитела абсорбируют на оверхности полистирола полостей пластин ,л микротитровани . Дл этого растворл- эт антитела в карбонатном буфере Ма2СОз/№НСОз 50 ммоль/л; рН 9,6), до- 1авл ют в полости пластины дл микротит- Овэни пипеткой по 0,25 мл полученного створа, оставл ют пластины на ночь при омнатной температуре и на следующий ,ень промывают их TBS-буфером. Хорошо одготовленные пластины хран т сухими ри -20°С. Дл анализа в полости внос т 80ул пробы исследуемого водного раство- а (концентраци определ емого вещества т 1 мкг/л до 200 мг/л) и добавл ют по 50 лкл ферментной метки, представл ющей обой конъюгат щелочной фосфатазы и три- зина, природа которого определ етс в за- исимости от выбранного антитела. Если нэлиз провод т с антителом А, то с ферментом св зывают аметрин. При работе же антителом В или С примен ют соответст- енно симазин или пропазин.

Резким встр хиванием микротитро- альной пластины в горизонтальной плоско- ти смешивают растворы. После инкубации течение еще часа при 209С удал ют путем этмывки TBS-буфером (50 ммол/л трис/ок- :иметил/-аминометана, 1 ммол/л MgCla, 50 ммол/л NaCI, рН 7,8 за счет HCI, 0,05 % полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) все не св занные с антителом молекулы. Дл количественного определени св занного меченного фермента в полости добавл ют по 125 мкл раствора субстрата фосфатазы (1 мг n-нитрофенилфосфата на мл крабонатного буфера). Ферментна реакци протекает при 20°С. Ее однако можно ускорить инку- эацией при повышенной температуре. Поглощение раствора в полост х определ ют |с помощью фотометра с вертикальным пучком света, при длине волны 405 км. | Дл того, чтобы повысить чувствительность , рекомендуетс оставл ть пластины на ночь при 4°С. При этом однако следует считатьс с тем, что если не предъ вл ть специальных требований к чистоте реактивов , приборов и помещени , то невозможно добитьс воспроизводимых результатов при концентраци х пор дка м.т. | Расчет концентрации антигена в пробе | производ т исход из следующих сообра- |жений. Меченный ферментом антиген св зываетс прежде всего с теми местами |антитела, которые остаютс свободными |после инкубации его с антигеном пробы.

Так, при высокой концентрации антигенов пробы св зываетс лишь небольшое количество ферментной метки. При низкой же концентрации антигенов пробы, наоборот,

св зываетс большое количество фермент- ной метки. Количество св занной ферментной метки вл етс , таким образом, функцией концентрации антигена в пробе. Мерой количества св занной ферментной

0 метки служит величина абсорбции прореагировавшего субстрата (цветна реакци с переходом от бесцветного к желтому цвету). Расчет. Отношение абсорбции определ емой () и нулевой проб

5 (BOABQ-AVB)

B/BO(AB-AVB);(ABO-AVB).

где В/ВО - отношение количества св занной ферментной метки в присутствии антигена (В) к количеству св занной фер .0 ментной метки в отсутствии антигена (ВО); ABO абсорбци (при 405 нм) в качестве меры количества св занной ферментной метки в отсутствии антигена (ВО): Ав - абсорбци (при 405 нм) в качестве меры

5 количества св занной ферментной метки в присутствии неизвестной концентрации антигена (гербицида) в пробе; АОВ - абсорбци (при 405 нм) в качестве меры количества св занной ферментной

0 метки в отсутствии париетальных антител. Если нанести значени В/ВО по оси у относительно логарифма концентрации гербицида , то получаетс сигмоидна крива . Дл спр млени кривой дл большего удоб5 ства работы предложено по оси у также откладывать логарифмические значени (логарифмические координаты). Дл оценки однако оказалось целесообразнее выражать степень торможени (1-В/ВО) через интег0 рал нормального распределени . На практике дл этой цели вместо частоты на веро тностную бумагу нанос т процентное торможение (100 /1-В/ВО). В результате происходит спр мление сигмоидной кри5 вой.

Дл определени антигена в пробе в отдельных опытах исследуемую пробу обрабатывают по отдельности или в определенной последовательности каждым из

0 используемых антигенов. В случае последнего способа оказалось, что в каждой серии опытов одна и та же степень ингибировани наблюдаетс , когда экспонированные части молекул, по отношению к которым вл ютс

5 активными различные антитела, наход тс в различных молекулах. Если же по меньшей мере две экспонированные части наход тс в одной молекуле, то наблюдаетс разброс. Это объ сн етс тем, что молекула, содержаща две такие экспонированные части,

вследствие св зывани с антителом как за счет одной, так. и за счет другой части, удал етс из раствора и поэтому после переноса раствора в следующую полость она уже не может прин ть участи в-св зывании. Если рассмотреть все другие возможности св зывани , то можно получить следующую матрицу ингибировани (табл. 1), из которой вытекают основные структуры.

Приведенную матрицу ингибировани можно легко расширить за счет применени других антител, что даст возможность анализировать и более сложные молекулы или смеси молекул.

П р и м е р 2. Дл того чтобы иметь возможность классифицировать триазины по активности, определ ли их реакционную способность к перекрестной реакции по отношению к соединени м, перечислен- ным в табл. 2. Дл обеспечени высокой специфичности к атразину иммунизацию проводили таким образом, чтобы происходило специфическое экспонирование ал- кильиого, мзопропилового и этилового остатков. В нижеследующей таблице приведены значени степени ингибировани (%) основных представителей отдельных классов взществ. Прочна св зь антигена с ан- гит.-:лом обусловливает и сильное ингибирование ферментной системы. Из величины торможени можно определить степень взаимодействи антитела с антигеном.

Приведенные в табл. 2 значени инги- биропэни свидетельствуют о том. что при указанном концентрации (2 части на млрд)

Claims

селективность антител не очень высока, однако перечисленные соединени , которые воздействуют и на фотосистему I I, могут быть определены и иммунологическим методом . С помощью иммуноанализа в соответствии с насто щим изобретением, целенаправленно использу реакционную способность к перекрестной реакции, можно делать выводы о структуре присутствующих в смеси соединений (сравни пример 1). Формула изобретени Способ определени триазиновых гербицидов , включающий постановку иммуно- логической реакции испытуемой пробы с антителами, отличающийс тем, что. с целью повышени селективности и чувствительности способа, используют антител полученные иммунизацией животных соединени ми формулы

R.

N

где RI - группа HN(CnH2n+i), где п - 0-8: N(CmH2m+i)2. где m - 1-8, галоген или группа ОН, R2 - группа HNCqH2q+i. где q - 0-8, N(CRH2R-n)2. где R - 1-8. или галоген; Нз - галоген, 5СпН2п+1, где п - 0-8, аминогруппа или HNCmH2mCOOH, где m - 1-8, причем конъюгировзние производ т черёз-замести- тели Ri, R2 или Яз, а иммунологическую реакцию осуществл ют одновременно или последовательно по меньшей мере с двум антителами.

Таблица 1

Втора сери опытов

Треть сери опытов

ABC

+ 4- +

В С А

+ + +

-+ - +

+ + + + + + + + + - +

+ торможение св зывани ферментной метки

- отсутствие торможени св зывани ферментной метки.

Таблица2

Реакционна способность к перекрестной реакции различных гербицидов при концентрации 2 части на млрд

Матрица ингибировани

AB

+ +

+ - +

+ Независимо друг от друга имеютс все части II. Ill, IV

Все части II, 111, IV содержатс в одной молекуле (I компонент)

Части II и III наход тс в одной молекуле (2 компонента)

Части II и IV наход тс в одной молекуле (2 компонента )

Части III и IV наход тс в одной молекуле (2 компонента)