CN113466189B - 一种基于双酶活性抑制作用的马拉硫磷比色检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米材料及分析化学领域，具体包括基于铱仿生纳米催化剂的双重模拟酶活性的高选择性协同抑制作用的马拉硫磷比色检测应用。铱仿生纳米催化剂的双重酶活性实现了良好的协同催化作用。本发明利用制备得到的铱仿生纳米催化剂与马拉硫磷的高度专一抑制作用实现了马拉硫磷的定性定量分析。该发明可应用于农药残留分析、生物医药、食品分析等领域。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料及分析化学技术领域，具体包括基于铱仿生纳米催化剂的双重模拟酶活性的高选择性协同抑制作用的马拉硫磷比色检测应用。
背景技术
仿生纳米催化剂是一种具有酶模拟特性的纳米材料。与生物酶不同，仿生纳米催化剂具有耐恶劣环境、高稳定性、易于合成和低成本等优点。目前，各种仿生纳米催化剂已成功应用于生物传感、癌症治疗和环境治理等领域。然而，仿生纳米催化剂用于农药分析的报道较少。在已报道的基于仿生纳米催化剂的农药分析中，仿生纳米催化剂的选择性较差，并且仍然需要天然酶（如乙酰胆碱酯酶）的使用，分析步骤相对复杂。因此，开发基于仿生纳米催化剂的一锅无酶的高选择性农药检测方法仍然是一个具有挑战性的问题。
目前，仿生纳米催化剂已经被报道可以模拟氧化酶，过氧物酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和碱性磷酸酶。由于制备简单、成本低、活性高，仿生纳米催化剂已广泛应用于可视化农药的测定。以往文献报道的农药比色检测方法都仅采用仿过氧化物酶活性和仿氧化酶活性中的一种，同时基于仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶和仿氧化酶双重活性的农药分析方案鲜有报道。
铱是一种稀有元素，化学性质稳定，是最耐腐蚀的金属，铱对酸的化学稳定性极高，不溶于酸。可用来制造多孔喷丝板、指南针轴承、计重秤高温坩埚和火花塞电触头等。未有基于铱的农药检测。
马拉硫磷作为高效广谱毒性有机磷农药，广泛用于植物病、虫、害的防治。其主要原理是能抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，引起神经毒性。但有机磷农药和氨基甲酸酯类农药也可经消化道、呼吸道及完整的皮肤和黏膜进入体内，使得乙酰胆碱在体内富集进而导致人体中毒。目前，用比色方法专一检测马拉硫磷的报道较少，因此构建一锅、无酶、高灵敏、高选择性比色检测马拉硫磷的平台尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于铱仿生纳米催化剂的双重模拟酶活性的高选择性协同抑制作用的马拉硫磷比色检测应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种仿生纳米催化剂材料及其应用，所述仿生纳米催化剂材料铱仿生纳米催化剂具有仿过氧化物酶和仿氧化酶活性。
优选是，所述仿过氧化物酶和仿氧化酶材料铱仿生纳米催化剂合成过程为：
（1）将IrCl3水溶液滴加到剧烈搅拌的聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，在室温下搅拌12h，得黄色溶液；
（2）将步骤（1）所得黄色溶液在100 ℃下回流2 h；
（3）将上述溶液进行减压蒸馏以完全除去溶剂，蒸干溶液后所得的黑色固体即为铱仿生纳米催化剂。
进一步的优选，所述双重酶模拟活性材料铱仿生纳米催化剂可作为仿过氧化物酶和仿氧化酶催化剂，用于基于双重酶模拟活性的应用。
再进一步优选是，所述铱仿生纳米催化剂材料的双重酶模拟活性可被马拉硫磷同时抑制，用于对马拉硫磷进行定性/定量检测，步骤如下：
（1）铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、不同浓度的马拉硫磷（0−5 μM）孵育10分钟；
（2）将上述混合液与TMB（0.5 mmol/L）和H2O2（1 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（100 mM，pH 4.0）混合。在37 °C下孵育15分钟后；
（3）观察溶液颜色变化来实现定性检测，利用分光光度计检测有机显色剂氧化物的相应吸光值来实现定量检测。
更进一步优选是，所述有机显色剂为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）、2,2'-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、邻苯二胺、4-氨基安替比林。
本发明的效果是：
1.本发明的合成的铱仿生纳米催化剂具有仿过氧化物酶和仿氧化酶双重酶模拟活性，这两种酶模拟活性的催化机理不同，导致两种酶活性具有协同作用，达到了“1 + 1>2”的效果。
2.铱仿生纳米催化剂的双重酶模拟活性可以被马拉硫磷同时抑制，显示出双酶活性的协同抑制作用。
3.马拉硫磷能特异性抑制铱仿生纳米催化剂的双重酶模拟活性，说明铱仿生纳米催化剂对马拉硫磷有良好的选择性。
4.本发明利用铱仿生纳米催化剂的双重酶模拟活性和马拉硫磷对铱仿生纳米催化剂的双重酶模拟活性的双重抑制作用，实现马拉硫磷的高选择性高灵敏比色检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的马拉硫磷的定量检测标准工作曲线。
具体实施方式
为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。
实施例1
仿过氧化物酶和仿氧化酶材料铱仿生纳米催化剂的制备：
将3 mg的IrCl3•3H2O均匀地分散在4 mL的超纯水中，然后在剧烈搅拌下将上述溶液滴加到等体积的含有18.6 mg PVP的水中。将混合物在室温搅拌过夜。溶液的颜色变为黄色。接下来，将上述混合物在100 ℃下回流2 h。减压蒸馏除去溶剂，得到的铱仿生纳米催化剂结构为平均粒径为10 nm的球形。
实施例2
铱仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶活性分析：
实验体系a：催化反应体系为包括H2O2（1 mmol/L）、上述实施例获得的铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）。在室温（25 °C）下反应30分钟后，利用紫外分光光度计检测其300−800 nm内的吸光值。另做对照实验b，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应30分钟后检测吸光值。
实验体系a显示出明显的峰，说明铱仿生纳米催化剂在pH 4.0处具有明显的仿过氧化物酶的活性；对照试验b在650 nm附近无明显的峰，说明若无铱仿生纳米催化剂作催化剂将无明显反应。
实施例3
铱仿生纳米催化剂的仿氧化酶活性分析：
实验体系a：催化反应体系为包括上述实施例获得的铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）。在室温（25 °C）有氧条件下反应30分钟后，利用紫外分光光度计检测其300−800 nm内的吸光值。另做对照实验b，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应30分钟后检测吸光值。
实验体系a显示出明显的峰，说明铱仿生纳米催化剂在pH 4.0处具有明显的仿氧化酶的活性；对照试验b在452 nm附近无明显的峰，说明若无铱仿生纳米催化剂作催化剂将无明显反应。
实施例4
铱仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶活性机理分析：
实验体系a：催化反应体系为包括不同质量浓度的铱仿生纳米催化剂、H2O2（1mmol/L）的醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）、5 μL HE溶液（2.5 mg/mL）。孵育40分钟，用荧光分光光度计对混合物的荧光进行监测。另做对照实验b，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应40分钟后检测荧光强度。实验体系c：催化反应体系为包括不同质量浓度的铱仿生纳米催化剂、H2O2（1 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（pH 4.0,100 mM）、20 μL TA溶液。孵育40分钟，用荧光分光光度计对混合物的荧光进行监测。另做对照实验d，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应40分钟后检测荧光强度。
实验体系a与对照体系b在590 nm处均没有明显的荧光峰出现，说明反应过程中没有•O2−产生。实验体系c与对照体系d在425 nm处均没有荧光发射峰出现，说明反应过程中没有•OH产生。铱仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶活性可以消耗H2O2，但是不产生•O2−和•OH。
实施例5
铱仿生纳米催化剂的仿氧化酶活性机理分析：
实验体系a：催化反应体系为包括不同质量浓度的铱仿生纳米催化剂、醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）、5 μL HE溶液（2.5 mg/mL）。孵育40分钟，用荧光分光光度计对混合物的荧光进行监测。另做对照实验b，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应40分钟后检测荧光强度。实验体系c：催化反应体系为包括不同质量浓度的铱仿生纳米催化剂、醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）、20 μL TA溶液。在氧气氛围下孵育40分钟，用荧光分光光度计对混合物的荧光进行监测。另做对照实验d，催化反应体系中不加铱仿生纳米催化剂，在与上述实验体系同样条件下反应40分钟后检测荧光强度。
实验体系a在590 nm处显示出荧光峰，峰强度与浓度成正比关系，说明反应过程中产生了•O2−。对照体系b在590 nm处没有明显的峰。实验体系c与对照体系d在425 nm处均没有荧光发射峰出现，说明反应过程中没有•OH产生。铱仿生纳米催化剂的仿氧化酶活性可以激活O2产生•O2−和并一步氧化TMB。
实施例6
铱仿生纳米催化剂的双仿酶活性协同催化效应分析：
实验体系a：催化反应体系为包括H2O2（1 mmol/L）、上述实施例获得的铱仿生纳米催化剂（0−100 μg/mL）、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mM）。在37 ℃下孵育15分钟后，利用紫外分光光度计检测652 nm处的吸光值。
实验体系a显示随着铱仿生纳米催化剂用量的增加，652 nm处的最大吸收峰逐渐增大，说明铱仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶活性和氧化物酶活性共存时具有良好的协同催化效应。这是由于铱仿生纳米催化剂的仿过氧化物酶活性和仿氧化物酶活性的机理不同造成的。
实施例7
铱仿生纳米催化剂的选择性分析:
实验体系a：催化反应体系为包括H2O2（1 mmol/L）、TMB（0.5 mmol/L）、铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）的醋酸缓冲液（100 mM, pH 4.0）和马拉硫磷（5 μmmol/L）。37 ℃下孵育15分钟。用分光光度计测定652 nm处的吸光度。另做对照实验b，催化反应体系中不加马拉硫磷，在与上述实验体系同样条件下反应15分钟后检测吸光值。
另做九组实验，将铱仿生纳米催化剂替换为Fe3O4、Co3O4、MnO2、CeO2、CuO、V2O3、Au、Ag和Pt，在37 ℃下孵育15分钟。用分光光度计测定652 nm处的吸光度。
实验体系a在652 nm处的吸光度值低于对照实验b的吸光值，马拉硫磷不能特异性抑制Fe3O4、Co3O4、MnO2、CeO2和CuO的仿酶活性；马拉硫磷对V2O3、Au、Ag和Pt仿酶活性的抑制作用明显低于铱仿生纳米催化剂；说明马拉硫磷只对铱仿生纳米催化剂特异性抑制。
实施例8
马拉硫磷的定性检测：
铱仿生纳米催化剂具有仿过氧化物酶活性和仿氧化酶活性。马拉硫磷可以特异性抑制铱仿生纳米催化剂的仿酶活性，从而实现马拉硫磷的定量检测。催化反应体系为包含铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、不同浓度的马拉硫磷（0−5 μM）孵育10分钟，将上述混合液与TMB（0.5 mmol/L）和H2O2（1 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（100 mM，pH 4.0）混合。在37 °C下孵育15分钟后。用肉眼观察上述溶液的颜色变化。根据实验证明，铱仿生纳米催化剂换成10~1000 μg/mL中的某一个浓度，H2O2换乘0.1~10 mmol/L中的某一个浓度，TMB换乘0.05~5mmol/L中的某一个浓度，缓冲液换成pH 3.0~6.0中某一个浓度，孵育时间在3~60分钟内的每个时间点，均可实现定性测定。根据实验证明，将TMB换成2,2'-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、邻苯二胺、4-氨基安替比林，可实现不同颜色的显色定性测定。
实施例9
马拉硫磷的定量检测：
对于制作标准曲线，催化反应体系为包含铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、不同浓度的马拉硫磷（0−5 μM）孵育10分钟，将上述混合液与TMB（0.5 mmol/L）和H2O2（1 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（100 mM，pH 4.0）混合。在37 °C下孵育15分钟后。用紫外分光光度计在652nm处测定吸光度并通过线性拟合绘制出马拉硫磷的标准曲线。如图1所示，线性范围0.01–5pM，回归方程为y=-0.283x+1.0749（R2=0.9983），检出限（LOD，3 nM）。
对于未知样品中马拉硫磷的定量检测，催化反应体系为包含铱仿生纳米催化剂（20 μg/mL）、含有未知浓度的马拉硫磷样品，孵育10分钟，将上述混合液与TMB（0.5 mmol/L）和H2O2（1 mmol/L）的醋酸盐缓冲液（100 mM，pH 4.0）混合。在37 °C下孵育15分钟，用紫外分光光度计在652 nm处测定吸光度。将所得吸光度套入标准工作曲线回归方程算出浓度值，回收率为98.5-103.4%，相对标准偏差（RSD）均在4%以内。根据实验证明，铱仿生纳米催化剂换成10~1000 μg/mL中的某一个浓度，H2O2换成0.1~10 mmol/L中的某一个浓度，TMB换成0.05~5 mmol/L中的某一个浓度，缓冲液换成pH 3.0~6.0中某一个浓度，孵育时间在3~60分钟内的每个时间点，均可实现定量测定。根据实验证明，将TMB换成2,2'-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、邻苯二胺、4-氨基安替比林，检测波长更换成相应氧化产物的吸收波长也可实现定量测定。
Claims (2)
1.一种基于铱仿生催化剂的双重模拟酶活性的高选择性协同抑制作用的马拉硫磷比色检测方法，其特征在于，所述铱仿生催化剂同时具有仿过氧化物酶和仿氧化酶双重活性，马拉硫磷可以同时抑制此双重酶模拟活性且马拉硫磷对此双重酶模拟活性的同时抑制的效果比对两种模拟酶活性的各自抑制效果的加和更强，马拉硫磷对此双重模拟酶活性的抑制作用具有高度专一性而其他农药对此双重模拟酶活性的抑制作用不明显，从而实现马拉硫磷的高选择性高灵敏定性定量比色检测；具体步骤如下：
(1)将待测的马拉硫磷溶液与所述铱仿生催化剂孵育；
(2)将上述孵育后的混合液、过氧化氢、有机显色剂分别加入到pH 4.0的醋酸缓冲液中，然后孵育数分钟；
(3)通过观察溶液颜色变化来实现马拉硫磷的可视化定性检测，颜色越浅说明待测溶液中马拉硫磷的浓度越大；
(4)利用分光光度计或酶标仪检测溶液中有机显色剂的氧化物的相应吸光值，利用其与马拉硫磷的定量关系而实现马拉硫磷的高通量定量检测；
所述铱仿生催化剂的制备方法具体如下：
(1)将IrCl3水溶液滴加到剧烈搅拌的聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，在室温下搅拌12h，得黄色溶液；
(2)将步骤(1)所得黄色溶液在100℃下回流2h；
(3)将上述溶液进行减压蒸馏以完全除去溶剂，蒸干溶液后所得的黑色固体即为铱仿生催化剂。
2.根据权利要求1所述一种基于铱仿生催化剂的双重模拟酶活性的高选择性协同抑制作用的马拉硫磷比色检测方法，其特征在于：所述的有机显色剂为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、2，2'-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、邻苯二胺、4-氨基安替比林；所述检测马拉硫磷时不需要其他仿酶纳米材料或天然酶的参与。
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| 串联纳米酶：一锅法无酶葡萄糖比色检测;韩磊等;《中国化学会第十三届全国分析化学年会论文集（一）》;工程科技Ⅰ辑;第699页 * |
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