CN109270060B

CN109270060B - 一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用

Info

Publication number: CN109270060B
Application number: CN201811265844.3A
Authority: CN
Inventors: 韩磊; 梁欣
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: CN109270060A

Abstract

本发明涉及纳米材料、催化及分析化学领域，具体包括一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用。本发明所提供的铱纳米酶兼具仿过氧化物酶活性和仿葡萄糖氧化酶活性，且两种仿酶活性的最适活性pH相近。本发明利用该铱纳米酶实现了一锅法无酶显色检测葡萄糖，该材料将有望被广泛用于分析化学、生物医药、食品工程和催化等领域。

Description

一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体包括一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用。

背景技术

纳米酶又称纳米模拟酶，泛指具有酶活性的纳米材料，是一种人工酶。近年来，研究人员已经将纳米酶发展成了高度稳定和廉价的天然酶替代物并成功地应用到一系列的反应中。串联酶是生物体内的一种多功能酶，可同时具有多种催化功能，且催化功能是级联的。由于已报道的纳米酶通常只具有一种仿酶活性，如过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、仿葡萄糖氧化酶活性或超氧化物酶活性，且具有仿葡萄糖氧化酶活性的纳米酶报道较少。因此，寻找新的具有仿葡萄糖氧化酶活性和仿串联酶活性的纳米材料具有重要意义。

铱是稀有的贵金属材料，由于其具有高温抗氧化性和热电性能，受到了广泛的关注。研究表明，铱纳米酶具有良好的过氧化物酶活性。然而，与其他众多仿酶纳米材料一样，目前尚未发现铱纳米材料具有仿葡萄糖氧化酶活性。据报道，贵金属中仅金被发现有仿葡萄糖氧化酶活性，而贵金属铜、银、钯和铂已被验证均无仿葡萄糖氧化酶活性。因此，发现新的具有仿葡萄糖氧化酶活性贵金属纳米酶具有重要的学术意义和经济价值。

葡萄糖是人体最主要的能量来源，它被小肠绒毛细胞吸收后经血液循环可输送至体细胞。胰岛素通过促进体细胞从血液中摄取葡萄糖来维持血糖水平稳定。因此，胰岛素分泌不足或受体途径功能缺陷均会导致高血糖。长期高血糖导致糖尿病、中风、失明、肾衰竭、周围神经病变等疾病发生。即时监控血糖以及尿糖的变化有利于糖尿病的早期诊断及有效治疗，因此构建高效、经济、灵敏的葡萄糖检测分析系统意义重大。

目前，葡萄糖的定量分析方法主要有：高效液相色谱法、电化学生物传感法、双酶分光光度法等。高效液相色谱法应用广泛，但设备成本高且不易携带。电化学生物传感法操作简单、线性范围宽、灵敏度高，但其电极修饰过程繁琐、重现性低、稳定性差。双酶分光光度法成本低、操作简单、检测快速、可靠性强，已得到广泛应用。基于葡萄糖氧化酶（GOx，EC1.1.3.4）和辣根过氧化物酶（HRP，EC 1.11.1.7）的分光光度法是目前临床检测血糖中最普遍的方法之一，具有操作简便、特异性和准确性较高等优点，其原理是：GOx催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢（H₂O₂），H₂O₂在HRP催化下，将无色有机底物氧化生成有颜色的产物，产物的量与葡萄糖的量成正比，通过检测溶液的吸光度可以计算得到葡萄糖的浓度。然而，由于天然酶GOx稳定性差及两步反应需在不同pH下进行，增加了检测的步骤。因此，需要寻找同时具有仿葡萄糖氧化酶活性和仿过氧化物酶活性的新型纳米酶材料。但是，基于单一贵金属纳米酶的无酶分光光度法鲜有报道。

综上所述，具有葡萄糖氧化酶、串联酶活性的Ir纳米酶在相关领域具有新颖性，且目前尚未报道基于具有串联酶活性的Ir纳米酶的无酶一锅葡萄糖分光光度检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种纳米酶材料及其应用，所述纳米酶材料Ir纳米酶具有串联酶活性。

优选是，所述具有仿串联酶活性材料Ir纳米酶合成过程为：

(1) 将IrCl₃水溶液逐滴加入到剧烈搅拌的含有聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液中，在室温下搅拌12 h，得浅黄色溶液；(2) 将步骤(1)所得浅黄色溶液在100℃下回流6 h；(3) 将上述溶液进行旋蒸以完全除去溶剂，蒸干溶液后所得的黑色固体即为铱纳米酶。

进一步的优选，所述具有串联酶活性的材料Ir纳米酶可作为催化剂，用于基于仿过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶双重活性的应用。

再进一步优选是，所述仿过氧化物酶材料Ir纳米酶在酸性条件下作为具有串联酶活性的催化剂，用于对葡萄糖进行定性/定量检测，步骤如下：

(1) 将包含不同浓度的葡萄糖（0−0.5mmol/L）溶液、所述Ir纳米酶（40 µg/mL）、有机显色剂（0.6 mmol/L）分别加入到醋酸缓冲液（pH 4.0，100 mmol/L）中，然后在25 ℃下孵育30分钟；(2) 通过观察溶液颜色变化来实现定性检测，颜色越深说明待测溶液中葡萄糖的浓度越大；(3) 利用分光光度计检测有机显色剂的氧化物的相应吸光值，因其与葡萄糖的化学定量关系而实现定量检测。

更优选是，所述的Ir纳米酶可用于检测葡萄糖，所述有机显色剂为2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）、邻苯二胺（OPD）或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）；所述检测葡萄糖时，不需要生物酶（葡萄糖氧化酶）的添加。

本发明的效果是：

1. 本发明合成了具有仿葡萄糖氧化酶活性的Ir纳米酶，首次公开Ir具有仿葡萄糖氧化酶活性。

2. 本发明合成了具有串联酶活性的Ir纳米酶，即所述Ir纳米酶同时具有仿过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶双重活性。

3. 本发明合成了具有串联酶活性的Ir纳米酶并且最适pH在4.0左右，在弱酸性条件（pH 3.5−5.0）下同时表现出仿过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶的活性。

4. 本发明利用Ir纳米酶的串联酶活性，实现了对葡萄糖的一锅无酶分光光度法检测。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Ir纳米酶的透射电子显微镜图；

图2为本发明实施例提供的Ir纳米酶的仿过氧化物酶活性效果图；

图3为本发明实施例提供的Ir纳米酶的仿葡萄糖氧化酶活性效果图；

图4为本发明实施例提供的Ir纳米酶仿过氧化物酶活性的pH优化效果图；

图5为本发明实施例提供的Ir纳米酶仿葡萄糖氧化酶活性的pH优化效果图；

图6为本发明实施例提供的葡萄糖检测的定性检测照片；

图7为本发明实施例提供的葡萄糖检测的定量检测标准工作曲线；

具体实施方式

为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

Ir纳米酶的制备：

将IrCl₃(8.4 mmol/L, 4 mL)逐滴加入到剧烈搅拌的含有聚乙烯醇（18.6 mg, 4mL）的乙醇溶液。然后在室温下搅拌12 h，得澄清的浅黄色溶液，再在100℃下回流6 h。将所得棕色溶液蒸发以完全除去溶剂，蒸发所得黑色固体即为Ir纳米酶。图1为通过透射电子显微镜观察到的Ir纳米酶的TEM图像。

实施例2

Ir纳米酶的仿过氧化物酶活性验证：

实验体系a：催化反应体系为包含H₂O₂（1.2 mmol/L）、上述实例获得的Ir纳米酶（40µg/mL）、有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L）。在室温（25℃）下反应30分钟后，利用紫外分光光度计检测其500−800 nm内的吸光值；

另做两个对照试验：其中一个对照实验b的催化反应体系中不加Ir纳米酶，在与上述实验体系同样条件下反应30分钟后检测吸光值；另一个对照实验c的催化反应体系为Ir纳米酶（40 µg/mL）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L），在与上述实验体系同样条件下静置30分钟后检测吸光值；

如图2所示，实验体系a显示出明显的峰，说明Ir纳米酶在pH 4.0处具有明显的仿过氧化物酶的活性；对照试验b在650 nm附近无明显的峰，说明若无Ir纳米酶作催化剂将无明显反应；对照试验c在650 nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是Ir纳米酶自身的响应峰。

实施例3

Ir纳米酶的仿葡萄糖氧化酶活性验证：

实验体系a：催化反应体系为包含葡萄糖（1.2 mmol/L）、上述实例获得的Ir纳米酶（40 µg/mL）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 10 mmol/L），在室温（25 ℃）下反应30分钟后，离心取上清液。向上清液中加入有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）、HRP（20 µg/mL）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L）。继续在室温（25 ℃）下反应30分钟后，利用紫外分光光度计检测其500−800 nm内的吸光值；

另做两个对照试验：其中一个对照实验b的催化反应体系中不加Ir纳米酶，在相同条件下反应之后检测其吸光值；另一个对照实验c的催化反应体系包括Ir纳米酶（40 µg/mL）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L），在同样条件下反应后检测吸光值；

如图3所示，实验体系a显示在650 nm处有明显的峰，说明Ir纳米酶有明显的仿葡萄糖氧化酶的活性；对照试验b在650 nm附近无明显的峰，说明若无Ir纳米酶作催化剂将无明显反应；对照试验c在650 nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是Ir纳米酶自身的响应峰。

实施例4

Ir纳米酶仿过氧化物酶活性的pH优化：

催化反应体系为包含H₂O₂（1.2 mmol/L）、Ir纳米酶（40 µg/mL）、有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）和不同pH的缓冲液（pH 1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH 3.0−6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；pH 6.5−8.0，磷酸盐缓冲液；pH 9.0−10.0，Tris−盐酸缓冲液；pH 11.0−12.0，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液）。在室温（25 ℃）下反应30分钟后，利用酶标仪检测其650 nm处的吸光值。如图4所示，Ir纳米酶在酸性pH下（pH 3.5−5.0）表现出过氧化物酶的活性，并且最适pH在4.0左右，因此Ir纳米酶在pH 4.0时，其仿过氧化物酶活性最好。

实施例5

Ir纳米酶仿葡萄糖氧化酶活性的pH优化：

催化反应体系为包含葡萄糖（1.2 mmol/L）、上述实例获得的Ir纳米酶（40 µg/mL）和不同pH的缓冲液（pH 1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH 3.0−6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；pH6.5−8.0，磷酸盐缓冲液；pH 9.0−10.0，Tris−盐酸缓冲液；pH 11.0−12.0，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液）。在室温（25 ℃）下反应30分钟后，离心取上清液。向上清液中加入有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）、HRP（20 µg/mL）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L）。继续在室温（25℃）下反应30分钟后，利用酶标仪检测其吸光值；

如图5所示，Ir纳米酶在酸性pH下（pH 3.5−5.0）表现出葡萄糖氧化酶的活性，并且最适pH在4.0左右，即Ir纳米酶在pH 4.0时，其仿葡萄糖氧化酶活性最好。

实施例6

葡萄糖的定性检测：

催化反应体系为包含不同浓度的葡萄糖（0 mmol/L 、0.15 mmol/L、0.3 mmol/L）、Ir纳米酶（40 µg/mL）、有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）和醋酸缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L）。在25 ℃下反应30分钟，如图6所示，观察离心管1−3中溶液颜色变化，对照管1中无颜色变化，2-3管蓝色依次加深，证明Ir纳米酶具有仿葡萄糖氧化酶活性，可以用于葡萄糖定性检测。

实施例7

葡萄糖的定量检测：

催化反应体系为包含不同浓度的葡萄糖（Glu，0−0.5 mmol/L）、Ir纳米酶（40 µg/mL）、有机显色剂TMB（0.6 mmol/L）和醋酸缓冲液（pH 4.0, 100 mmol/L）。在25 ℃下反应30分钟，利用酶标仪检测其650 nm处的吸光值并绘制出葡萄糖标准工作曲线。如图7所示，线性范围0−0.2 mmol/L，y=0.009+1.098x (R²=0.995)。

Claims

1.一种具有串联酶活性的铱纳米酶的无酶葡萄糖检测应用，其特征在于：所述铱纳米酶同时具有仿过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶双重活性，即在pH 3.0−6.0之间同时发挥其双重活性，以实现同时串联催化，应用于基于该串联酶活性的无酶葡萄糖检测应用；所述铱纳米酶的合成步骤如下：(1) 将IrCl₃水溶液逐滴加入到剧烈搅拌的含有聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液中，在室温下搅拌12 h，得浅黄色溶液；(2) 将步骤(1)所得浅黄色溶液在100 ℃下回流6 h；(3) 将上述溶液进行旋蒸以完全除去溶剂，蒸干溶液后所得的黑色固体即为铱纳米酶。

2.根据权利要求1所述的一种具有串联酶活性的铱纳米酶的无酶葡萄糖检测应用，其特征在于其应用步骤如下：

(1) 将待测的葡萄糖溶液、浓度为40 µg/mL的权利要求1所述的铱纳米酶、0.6 mmol/L的有机显色剂分别加入到pH 4.0的醋酸缓冲液中，然后在25 ℃下孵育30分钟；(2) 通过观察溶液颜色变化来实现定性检测，颜色越深说明待测溶液中葡萄糖的浓度越大；(3) 利用分光光度计检测有机显色剂的氧化物的相应吸光值，因其与葡萄糖的化学定量关系而实现定量检测。

3.根据权利要求2所述的一种具有串联酶活性的铱纳米酶的无酶葡萄糖检测应用，其特征在于：所述的有机显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐；所述检测葡萄糖时，不需要天然葡萄糖氧化酶的添加。