JPS60114760A - マルト−スセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明はマルトースを測定する酵素電極に係シ、特に寿
命が長く安定なマルトースセンサに関する。

〔発明の背景〕

マルトースはグルコースの２量体であり、デンプン等の
多糖類がα−アミラーゼ（以下アミラーゼと略称す′る
）等によシ加水分解されたとき生成される。従って、ア
ミラーゼを過剰でかつ所足量の基質の存在する系に作用
させ、そのとき生ずるマルトースのｉｔ測測定ることに
より間接的にアミラーゼの量を測定できる。

アミラーゼは、その基質であるデンプン、デキストリン
、グリコーゲン、ペクチン等の多糖類をマルトースに分
解する酵素であり、人間を含む動物の臓器や植物、微生
物中に存在する。そして血液などの生体液中のアミラー
ゼを定量することによシ各種疾患の診断が可能のため、
近時アミラーゼの定量が特に注目されている。

従来、アミラーゼの定量方法としては、（１）デンプン
がアミラーゼによって次第に分解されるのをヨードデン
プン反応で追跡するアミロクラスチック法、（２）アミ
ラーゼにより分解されて生じたマルトースの還元力を測
定するサツカロジェニック法、（３）色素を交差結合さ
せた不溶性の着色デンプンを基質としてアミラーゼの作
用で遊離した可溶性色素を比色測定するクロモジェニッ
クサブストレート法等がある。しかし、これらの方法は
特に試料が生体液である場合、その中に含まれている各
種の物質、例えば、尿素、尿酸、タンノ（り質、糖、ビ
タミンＣ等が測定妨害物質となり、このため測定精度に
欠ける難点をもち、又、分析操作が煩雑であり、分析時
間も長い欠点を有する。

こうした欠点を解消する方法として、近時酵素法が開発
され、これに属するものとしては、（４）可溶性デンプ
ンを基質としてα−アミラーゼにより生成したマルトー
スをマルトフォスフアリラーゼにより分解し、更にβ−
フオスフオグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸脱
水素酵素、６−フオスフオゲルコン酸脱水素酵素を用い
る３段階の酵素反応を経て、最終的に生じ；／ｃＮＡＤ
Ｈ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）量
を測定スルマルトース・ホスホリラーゼＬ　（５）α−
グルコシダーゼによりマルトースをグルコース総量解し
、このグルコースを測定するα−グルコシダーゼ法等が
ある。これらの酵素法は酵素の基質特異性を利用するた
め、前記（１）〜（３）の方法に比し、測定妨害物質の
影響を受けない長所があるが、しかし、全血の測定は不
可能で分析時間が長く、酵素や補酵素の分析試薬が高価
であシ、又、装置が複雑であるなどの欠点がある。

また最近では、さらに精度向上とその操作方法の簡便さ
よシ、アミラーゼを測定するだめの酵素センサ方法が提
案されている（特願昭５７−７５２２７　）。この方法
の原理は下記の酵素反応により説明される。

（１） （Ｉｎ） すなわち、グルコースを測定する場合には酵素としてグ
ルコースオキシダーゼを用いグルコースの酸化反応を行
なわせると上記（１）式に従って酸素０２が消費され過
酸化水素Ｈ２Ｏ２が生成する。

この酸素又は過酸化水素はグルコースと異なシミ気化学
的な測定の対象となシうるので、消費に伴う酸素量の減
少又は生成に伴う過酸化水素量を電気化学的に測定して
間接的にグルコース濃度の測定が可能となる。マルトー
スの測定では、上記（Ｉ）式に従い試料中のα−アミラ
ーゼの作用によシ糖類（基質）から分解生成したα−マ
ルトースが、（旧式に従って酵素α−グルコシダーゼの
作用により水と反応して２分子のグルコースになシ、こ
のグルコースが（１）式に従って酵素グルコースオキシ
ダーゼの作用により水及び酸素と反応してグルコン酸と
過酸化水素を生成する。この場合、過酸化水素量の生成
又は酸素量の減少を電気化学的に測定することによυ間
接的にグルコース量の測定が可能になることはグルコー
スを測定する場合と同じであるが、ここで測定されるグ
ルコース量は、α−アミラーゼによシ基賀から分解生成
したα−マルトースに由来するグルコースと試料中に当
初から存在するグルコースとの総量である。このグルコ
ース総量に対応するマルトース測定で得られた出力信号
と、当初グルコース量に対応する出力信号の差からα−
アミラーゼを測定するのである。

この酵素電極はグルコースオキシダーゼとα１−グルコ
シダーゼが固定しである固定化酵素膜と、これらの酵素
の触媒作用によって起った化学反応の増減物を電気化学
的に測定することのできるトランスジューサから成る。

この方法は従来の方法に比べると非常に優れており、測
定精度も高く分析時間も短かく、かつ分析装置も簡便で
、発色試薬等の分析試薬も不要なため非常に有望な方法
である。しかし、この方法での測定は、従来のトランス
ジューサを使用したのでは十分な効果が発揮できない。

すなわち、前記トランスジューサとしては、一致にガル
バニ型の酸素電極（以下０２電極と略す）やポーラ口型
の過酸化水素電極（以下Ｈ２Ｏ２電極と略す）が使用さ
れる。この中でも、Ｈ２Ｏ２電極は０２電極と比較する
とトランスジューサとして優れている。この理由は前述
した■式の反応において、減少する０２を検知する０２
電極に比較して、増加するＨ２Ｏ２を検知するＨ２Ｏ２
電極の方が信号／雑音比が高く、また安定でもあるから
である。そこでトランスジューサとしてはＨ２Ｏ２電極
が賞月される。Ｈ２Ｏ２電極は一般に金や白金よ構成る
アノードと、銀よ構成るカソードから構成されている。

前述したように、マルトースセンサはこの電極の感応面
にα−グルコシダーゼとグルコースオキシダーゼを固定
化した酵素膜を装着したものである。このときカソード
が銀よ構成る通常のＨ２Ｏ２電極を使用すると、カソー
ドよシ微量の銀が溶出し、これが酵素膜中の固定化酵素
、特にα−グルコシダーゼを失活させることを見出し、
本発明に至った。

α−グルコシダーゼは固定化された状態でも、濃度ｉｏ
−’ダラム当量／を程度のＡｇ＋を含む環境におかれる
と数時間で失活する。一方、Ｈ２０＊電極より溶出する
Ａｇ＋の濃度は、室温においては１０−５〜１０−６グ
ラム当ｆｊ／４である。このため、銀をカソードに使用
したＨ２Ｏ２電極全トランスジューサとして用いたマル
トースセンサではその内筒はたかだか１日である。

〔発明の目的〕

本発明は上記のことを鑑みてなされたものであシ、その
目的とするところは寿命が長く、安定で高感度なマルト
ースセンサを提供することにある。

〔発明の概要〕

本発明のマルトースセンサは、α−グルコ７ダーゼとグ
ルコースオキシダーゼを固定化した酵素膜とカソードと
してイくラジュームを・匣用したＨ２Ｏ２電極と〃）ら
成ることを特徴とする。

本発明ではパラジウムをカソードとしたＨ２Ｏ２電極を
用いるが、この理由は、（１）パラジウムは銀と比較し
て溶解度が小さいため酵素の活性を損わないこと、（２
）パラジウムイオンは銀イオンよシα−グルコシダーゼ
の活性を損わず、七の失活きせる程度は１／１０〜１７
５０程度であること、（３）パラジウムは、他の金属、
例えば金、白金、イリジウム、オスミウムなどと異シ、
過酸化水素電極として用いられたとき安定に作用するた
めである。

しかしく３）についての正確な理由は不明である。

パラジウムを使用したカソードの形状としては、クラー
ク型のＨ２Ｏ２電極のカソードの形状をそのまま用いる
ことができる。パラジウムの純度は、９９％以上の高純
度であることが望ましい。

本発明に用いられる酵素膜は、α−グルコシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼを固定化した膜ならすべて使用で
きる。これらの酵素の固定化法及び製膜法などは公知の
技術　例えば「固定化酵素」（千畑一部編、講談社すイ
エンティフィク。

１９７５）に記載されているような技術が使用できる。

以下、本発明を図面によって説明する。第１図は、本発
明の一実施例であるマルトースセンサの概略図である。

図中１はリード線、２はセンサの外筒、３は絶縁物、４
は白金アノード、５はパラジウムのカソードで１〜５ま
ででＨ２０□電極を構成している。

６はＨ２Ｏ２電極の感応面７に対し電解液８を介して酵
素膜９をＨ２Ｏ２電極に止めるためのＯ−リングである
。酵素膜９中にはα−グルコシダーゼとグルコースオキ
シダーゼが固定化されている。試料中のグルコースは酵
素膜９に接触すると前記（Ｉｎ）式の反応を起こす、同
様にしてマルトースは酵素膜９に接触することによシ（
旧、（■）式の反応を起す。これらの反応の結果生成し
たＨ２０□は、Ｈ２Ｏ２電極により電流値に変換され、
グルコースやマルトースの量が測定できる。

〔発明の実施例〕

実施例１ α−グルコシダーゼ（東洋紡製ｘｏｏｍｇ／／、／）２
０ｍｇとグルコースオキシダーゼ（東洋紡製１０ｏｍｇ
　／Ｕ）　２ｈｓｍｇ％アルプミｙ　（３ｉｇｍａ社製
　ＵＳＡ）を２ｍｇ４００μｔのリン酸緩衝液（ｐＨ６
，８，０，１モル／ｌ）に溶かし、この溶液を氷冷し、
ここに５％のグルタルアルデヒド５０μｔを加えすばや
く攪拌し、この１５０μｔを直径４７■、厚さ約２５μ
ｍのポリエステル製不織布の上に塗布し、１５時間風乾
後洗浄し、α−グルコシダーゼとグルコースオキシダー
ゼを固定化した酵素膜を得た。この酵素膜を第１図に示
したような構造のＨｚＯｚｔ極（アノード直径１．５閣
、カソード外径８１Ｍｎ１内佳２．５簡）にＯ−リング
で取付けてマルトースセンサを得た。このセンサを用い
て、濃度１０ｏｍｇ　／ｄｔのマルトースを測定した。

このときの９５係の応答時間は１５秒であった。次に、
このセンサを用いて、各種一度のマルトースをそれぞれ
２０倍に希釈したものを測定し、その検量線を第２図に
示した。

一方力ソードに銀を使用した以外は上記センサと同様な
マルトースセンサを作り、二柚のセンサの寿命を比較し
た。銀をカードに使用したマルトースセンサは１日で相
対感度が０となったがノくラジウムをカソードとしたセ
ンサは３０日後もまだ８０％の相対感度を維持していた
。

実施例２ 実施例１で得たマルトースセンサを用いてアミラーゼを
測定した。すなわち、このセンサを攪拌装置と恒温装置
の付いた測定セルに取付けた。この測定セルを３７Ｃに
保ち、ここにｐＨ７，０゜０．１モル／ｌのリン酸緩衝
液を満たし、ここに試料としてアミラーゼと８０ｍｇ／
ｄｔのグルコースを含む管理血清２０μｔを注入した。

そして試料中のグルコースを測定した後、アミラーゼの
基質として、製置ｏ、ｚｇ／ｌのマルトペンタオースを
含んだ前記リン酸緩衝液２０μｔを加え、アミラーゼで
分解されたマルトースの生成割合を測定した。このとき
のセンサの出力電流の関係を第３図に示す。第３図にお
いて、ｔｌは１５秒、１１３０日後、同一の方法でアミ
ラーゼを測定した時間で測定できる範囲の変化であった
。

実施例３ 実施例２と同様な方法で血清を分析し、同時にこの試料
を従来法で多用されているブルースターチ法（クロモジ
ェニックサブストレート法の一種）で分析し、その結果
を比較した。このときの相関係数は０．９９５　（ｎ＝
２０　）となり従来法とよく一致することがわかった。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれは、マルトースが正
確にじん速に測定可能でしかもその寿命は十分長く、セ
ンサの酵素膜を長時間変える必要がないので経済的であ
った。

したがって、本発明は、特に生体液中のアミラーゼを測
定し、疾病の診断に役立せる臨床検量の分野に極めて有
用である。また、更にはグルコースやマルトースを測定
できることは言うまでもないが、アミラーゼ以外のマル
トース、グルコースを生成する物質も測定可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例のマルトースセンサの概略図
、第２図はマルトースの検量線を示す図、第３図は本発
明のマルトースセンサを用いてアミラーゼを測定したと
きのセンサの出力電流の状態を示す図である。 １・・・リード線、２・・・外筒、３・・・絶縁物、４
・・・白金アノ・−ド、５・・・パラジウムカソード、
６・・・０−リング、７・・・感応面、８・・・電解液
、９・・・酵素膜。 光１図 第　２　日 マ＋Ｌｋ−ス４Ｊ　（ａｎｐ／ｇ） 君　、１　図 昨固

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α−グルコシダーゼとグルコースオキシターゼとを
   固定化し７１ｃ酵素膜と電極とよシなるマルトースセン
   サにおいて、上記電極がパラジウムよりなるカソードを
   有する過酸化水素電極であることを特徴とするマルトー
   スセンサ。 ２、上記パラジウムは純度９９％以上のパラジウムであ
   る特許請求の範囲第１項記載のマル）−スセンサ。 ３、上記過酸化水素電極のアノードが白金である特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載のマルトースセンサ。