JPS62240849A

JPS62240849A - 酵素電極

Info

Publication number: JPS62240849A
Application number: JP61084586A
Authority: JP
Inventors: Isao Taniguchi; 功谷口; Koichi Takizawa; 滝澤　耕一
Original assignee: Omron Tateisi Electronics Co
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-04-11
Publication date: 1987-10-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、臨床検査又は薬品製造、食品加工等におい
て、被測定検体中の生化学物質濃度を酵素反応を利用し
て電気的に測定するための酵素電極に関する。

（ロ）従来の技術従来、臨床検査等において、被測定検体中の生化学物質
濃度の測定手段として、酵素を利用して測定対象の生化
学物質を反応させ、その生成物の濃度を電気的に測定す
ることが行われている。

従来、上記測定のために使用される酵素電極としては、
作用電極及び対照電極よりなるものが知られている。こ
の作用電極は、白金よりなる下地電極に、測定対象とな
る生化学物質を基質とする酵素を固定化した高分子膜と
、この酵素による酵素反応の生成物の一つを選択して透
過する選択性透過膜とを形成してなるものである。

この作用電極は、対となる対照電極と共に、被測定検体
中に浸漬される。酵素電極と対照電極間には一定電圧を
印加し、両電極間に流れる電流をｆｌｌｌ定しくアンペ
ロメトリー）、その値より被測定検体中の生化学物質濃
度を定量するものである。

例えば、被測定検体中のグルコース（Ｇｊｌｃ）濃度測
定には、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）
　、選択性透過膜としては過酸化水素（ＨｚＯｚ）選択
性透過膜が使用される。ＧＩＣは、ＣＯＤにより、以下
の反応式に示す化学変化を受け、被測定検体中のＧβＣ
濃度に比例したＨ２０□このＨ，Ｏ□が、下地電極と対
照電極間に０．７■の電圧が印加されると、下地電極表
面で酸化され、両電極間にＨ２ｏｘ　ｙ１度に比例した
電流が流れる。この電流値により、間接的にグルコース
濃度が決定される。なお、Ｈ，Ｏ，選択性透過膜は、被
測定検体中のアスコルビン酸や尿酸等の干渉物質（これ
らは０．７　Ｖ前後の電圧で酸化還元反応を起こす）が
下地電極表面に移動するのを防止する。

これら干渉物質は、下地電極表面において酸化還元反応
を起こし、測定誤差の原因となるものである。

上記従来の酵素電極は、電流測定（アンペロメリー）に
使用されるものであるが、一方、電位測定（ポテンショ
メトリー）使用される酵素電極も提案されている。

この従来のポテンショメトリー用酵素電極は、内部に標
準液を入れた絶縁物質の管の下端にイオン選択性透過膜
を設け、さらに前記標準液中に電極を浸漬してなるもの
である。この酵素電極は、酵素反応に伴うイオン濃度変
化をイオン選択性透過膜を介して被測定検体中と標準液
中のイオン濃度差で捉え、被測定検体中の測定対象生化
学物質濃度を上記電極と対照電極間の電位差として計測
するものである。

（ハ）発明が解決しようとする問題点上記従来のアンペロメトリー用の酵素電極は、電流測定
を行うものであるため、以下に列記する不都合があった
。

第１に、酵素電極の小型化・微小化が困難である不都合
があった。アンペロメトリーにおいては、作用電極に対
して対照電極が一定面積比以上に大きくなければ安定し
た電流変化が得られず、ＳＺＮ比が低下する。また、作
用電極及び対照電極の汚れによる電極面積の減少に対処
するためにも、ある程度の大きさが作用電極及び対照電
極に必要とされていた。

第２に、酵素電極が接続される測定回路が複雑なものと
なる不都合があった。これは、酵素固定化膜、電極抵抗
等の高インピーダンス部分を通して信号を取出している
ため、その信号が小さく、外来雑音や高入力抵抗による
障害を受けやすく、これら障害の除去手段が測定回路に
要求されるからである。また測定回路は、両電極間に印
加電圧を加える機能も必要とされる。

第３に、作用電極に干渉物質の影響を排除するための選
択性透過膜が必要となり、作用電極の構造が複雑化し、
その製作が困難となる不都合があった。また、被測定検
体中の干渉物ｘｉ度が高くなった場合には、選択性透過
膜の膜厚を大きくしても、その影響を完全に排除できな
い不都合があった。

第４に、生化学物質濃度の測定範囲が狭いという不都合
があった。

第５に、測定回路の電源を投入してから作用電極と対照
電極間の出力（バックグラウンド）が安定する時間（エ
ージング）が長いという不都合があった・一方、従来のポテンショメトリー用の酵素電極は、電位
測定によるため、測定回路を簡略化できるものの、以下
に列記する不都合を有している。

第１に、イオン選択性透過膜が必要であり、かつその外
側（被測定検体側）には酵素を固定化した高分子膜を設
けなければならないため、作用電極の構成が複雑で、製
造困難である不都合があった。

第２に、応答が遅（、また長時間使用すると電極出力の
ドリフトが生じる不都合があった。

第３に、作用電極の使用耐久性が低く、実用性に欠ける
不都合があった。

第４に、作用電極のイオン選択性透過膜の拡散律速によ
り、被測定検体中の生化学物質の濃度測定範囲が狭いと
いう不都合があった。

この発明は、上記不都合に鑑みなされたもので、電極の
構成を簡略且つ小型化し、電位測定により測定回路を簡
略化し、干渉物質の影響を排除し、生化学物質濃度測定
範囲を拡張することを可能とする酵素電極の提供を目的
としている。

（ニ）問題点を解決するための手段上記不都合を解決するだめの手段として、この発明の酵
素電極は、下地電極表面にポリチラミンＣＰ−（２−ア
ミノエチル）フェノール〕膜を形成し、このポリチラミ
ン膜中に被測定検体中の測定対象生化学物質を基質とす
る酵素と、この酵素反応に伴い酸化又は還元される酸化
還元物質とを固定化してなる作用電極と、この作用電極
と共に被測定検体中に浸漬される対照電極とよりなるも
のである。

（ホ）作用この発明の酵素電極は、以下に述べる作用を存する。

先ず、被測定検体中の測定対象物質が、前記ポリチラミ
ン膜中の測定対象生化学物質を基質とする酵素により酵
素反応を受ける。この酵素反応の生成物として生じた酸
化剤又は還元剤が、同じくポリチラミン膜中に固定化さ
れている酸化還元物質を酸化又は還元する。

この時、作用電極と対照電極間には、酸化又は還元され
た酸化還元物質と、未反応の酸化還元物質との、ポリチ
ラミン膜中での濃度差に比例した電位差、すなわち酸化
還元電位が生じる。この電位差は、酵素反応に関与した
測定対象生化学物質の量にも比例しており、さらには、
被測定検体中の測定対象生化学物質の濃度に比例してい
る。従って、作用電極と対照電極間に生じる電位差に基
づいて、被測定検体中の測定対象生化学物質の濃度を定
量することができる。

（へ）実施例本発明の実施例を、第１図乃至第４図に基づいて以下に
説明るす。

この実施例は、本発明の酵素電極をグルコース濃度測定
に適用したものであり、第２図は、この実施例における
作用電極１０の縦断面図である。

この作用電極１０は、下端が閉塞されているガラス管（
例えば試験管）１１の底１１ａに、白金よりなる下地電
極１２が貫通状態で装着・支持される。なお、下地電極
１２は白金に限定されず、他の金属でもよい。下地電極
１２上端にはリード１３が接続され、ガラス管１１の上
端開口部１１より上方に引出される。さらにガラス管ｌ
ｌ内は、エポキシ樹脂等の合成樹脂１４が充填される。

下地電極１２の底部１１ａより垂下する部分の表面には
、ポリチラミン膜１５が形成されている。

このポリチラミン膜には、酵素としてグルコースオキシ
ダーゼ（ＣＯＤ）及び酸化還元物質としてフェロセン（
実際にはフェロセンアルデヒド）が、チラミン分子と共
有結合の型で固定化される。またポリチラミン膜１５中
には、フェロセンの酸化反応の速度を高めるためのペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）固定化されている。

次に、ポリチラミン膜１５の形成方法並びにこのポリチ
ラミン膜１５にフェロセン、ＣＯＤ及びＰＯＤを固定化
する方法を以下に説明する。

先ず、下地電極１２表面にポリチラミン膜１５を電解重
合により形成する。この電解重合に使用される電解液は
、メタノール１１あたり０．１モルのチラミン及び０．
３モルの水素化ナトリウムを溶解したものである。この
電解液中に作用電極１０の下地電極１２と、対照電極と
して塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣ１）電極と、さらに電解液を
零電位とするためのカウンタ電極として白金電極を浸漬
する。

そして、下地電極１２間と塩化銀電極間に一定電流を流
し、定電流電解を行う。下地電極１２が直径０　、５＋
ａｍ　、長さ５＋ｗｍＯ時は、４００μＡで０．５Ｃ（
電極表面１　ｃｄあたり６．２０に相当）の定電流電解
が行われ、下地電極１２表面にポリチラミン膜１５が形
成される。

上記電解重合により形成されたポリチラミン膜１５には
、フェロセンがチラミン分子との間の共存結合の形で固
定化される。フェロセンを固定化するには、エタノール
１ｅ中に０．１モルのフェロセンアルデヒドを溶解した
フェロセン固定化液に、作用電極１０の下地電極１２を
室温で２日間浸漬する。

さらに、フェロセンが固定化されたポリチラミンｇ１１
５に、ＣＯＤ及びＰ　ＯＤを固定化する。

先ず、ポリチラミンｎ莫１５にグルタルアルデヒド水酸
化ナトリウムでＰＨ８に調整された１０％グルタルアル
デヒド溶液に５乃至６時間浸漬され、ポリチラミン膜１
５とグルタルアルデヒドを反応させる。

次に、０．１Ｍのリン酸緩衝液にＣ　Ｏ　Ｄ５０．６ユ
ニット７ｍｌ　、　Ｐ　Ｏ　０１０．１ユニット７ｍｌ
の比率で溶解した酵素液に作用電極１０の下地電極１２
を浸漬し、冷蔵庫（４℃）で−昼夜静置し、ポリチラミ
ン膜１５に、ＧＯＤ及びＰＯＤを、チラミン分子との共
有結合の形で固定化する。

一方、上記作用電極１０と対となる対照電極２０として
、この実施例では、周知の飽和カロメル電極を使用して
いるが、これに限定されるものではなく、適宜変更可能
である。

第１図は、この実施例に係る酵素電極ｌの使用例を説明
する図である。

２は恒温槽であり、０．１Ｍ，ＰＨ　７．０のリン酸緩
衝液ＢＳが貯溜され、一定温度に維持される。

また、恒温槽２内には回転子３が置かれる。この回転子
３は、恒温槽２下方に設けられるスターラー４により回
転駆動され、リン酸緩衝液ＢＳを撹拌する。

作用電極１０及び対照電極２０は、それぞれリード１３
及び２３により電位計５に接続される。

また、この電位計５にはレコーダ６が接続され、作用電
極１０と対照電極２０との間の電位差の変化が記録され
る。

上記恒温槽２内のリン酸緩衝液ＢＳ中に、ＧｆＣを含む
被測定検体が注入される。この被測定検体は、マイクロ
ピペットにより、所定の量に計量されて注入される。

前記ポリチラミン膜１５では、先ず、ＣＯＤの作用によ
り、Ｇｌｃが次式で示される反応を起こす。

ＣＯＤＣｙ２ｃ＋Ｑ，−−クグルコン酸十Ｈｚｏｚ　−・・・
・・（１）さらに、（１）式の反応の生成物Ｈ，Ｏ□に
より、フェロセン（Ｃｐ２Ｆｅ）の酸化反応が生じる。

この反応の速度は、ＰＯＤの作用により高められる。

Ｈｚ　Ｏｆ　＋２Ｃｐ２　Ｆｅ＋２Ｈ”″この酸化型Ｃ
ｐｚＦｅ”の濃度と還元型（反応前の型）ｃｐ．Ｆｅの
濃度差に比例して、作用電極ＩＯと対照電極２０との間
に電位差、すなわち酸化還元電位が生じる。この電位差
は、リン酸緩衝液ＢＳ中のＧβＣ濃度にも比例している
。

作用電極１０と対照電極２０との間の電位差（以下電極
電位という）は、電位計５により検出され、レコーダ６
にその経時変化が記録゛される。

第３図は、異なるＧｌｃ濃度に対する電極電位の経時変
化を示す図である。また、第４図は、測定開始時より所
定時間経過後における分あたりの電極電位変化（ｍｖ／
ｍｉｎ）より、Ｇｌｃｇ１度を求める検量線を示してい
る。第４図に示されている電極電位変化（ｍｖ／ＩＩＩ
ｉｎ）は、測定開始後１０分経過した時の電極電位変化
（ｍいをＩ　Ｑ　（ｍｉｎ）で割ったものに相当する。

この検量線を用いることにより、未知検体中のＧ　Ｉ　
Ｇ　濃度を求めることができる。

なお、測定終了後の作用電極１０は、以下に示す２つの
手段のうち、いずれかの手段により再生される。第１の
手段は、作用電極１０と対照電極２０に印加電圧（０．
６ｖ）を加えて、酸化型ＣｐｚＦｅ”を還元型Ｃｆ’ｚ
Ｆｅに電気的に還元する。

第２の手段は、作用電極１０をフェリシアン化カリ等の
還元剤溶液に浸漬し、酸化型ＣｐｚＦｅ”を還元型Ｃｐ
，Ｆｅに還元する。

上記酵素電極１は、未知検体中の生化学物質濃度を知る
だけでなく、未知検体中の酵素活性度を測定することに
も応用できる。以下、ＣＯＤの酵素活性度測定への応用
例を説明する。

この応用例に使用される作用電極ｌＯ°のポリチラミン
膜１５°は、フェロセン及びＰＯＤを固定化したもので
ある。この作用電極１０゛は、前記対照電極２０と共に
、恒温槽２内のリン緩衝液ＢＳ中に、第１図に示すもの
と同様に浸漬される。このリン酸緩衝液ＢＳ中には、マ
イクロピペットでＧｌｃ及びＣＯＤを含む一定量の被測
定検体が注入される。

被測定検体中には、ＣＯＤの作用により、（１）式の反
応で生成したＨ２Ｏ２（その濃度はＣＯＤ活性度に比例
している）が含まれているが、このＨ。

０□がポリチラミン膜１５’中のフェロセン（ＣｐｓＦ
ｅ）を酸化する〔（２）式〕。この時、作用電極１０′
間と対照電極２０間には、還元型Ｃ１［）ｚＦｅと酸化
型Ｃｔ）ｚＦｅ”の濃度差に比例した電位差が生じる。

この電位差より、リン酸緩衝液Ｉｔｓ中のＨ２Ｏｚ？Ｍ
度、さらには被測定検体中のＣＯＤ活性度を知ることが
できる。

第５図は、異なる■１□０□濃度に体する電極電位の経
時変化の様子を示す図である。電極電位変化測定開始時
よりある程度時間が経過した後は、Ｈ，Ｏ□濃度に対応
する一定の値となる。第６図はこの関係を、横軸にｌＩ
２０□濃度（Ｍ）を、縦軸に電極電位変化（ｍｖ）を取
り、示している。この図を用いて電極電位変化（ｍｖ）
よりＨｚＯｚ？３度を決定することができ、ひいては被
測定検体中のＧＯＤ活性度を知ることができる。

なお、上記応用例は、直接的にはＦｒｚｏ□濃度を測定
しているものであるから、酵素反応により生成するＨｚ
Ｏ□の濃度測定に限定されるものではなく、例えば食品
等の漂白・殺菌加工における反応液中のＨ，Ｏ□残留量
検査等にも使用可能である。

上記実施例及び応用例においては、酵素としてＣＯＤを
使用しているが、他の酵素（主にオキシダーゼに属する
酵素）を使用し、この酵素の基質となる生化学物質の濃
度を測定することが可能である。また、酸化還元物質と
してフェロセンを用いているが、これに限定されるもの
ではなく、他のフェロ又はフェリ化合物等を使用するこ
とが可能である。更に、上記酸化還元物質の酸化又は還
元反応を促進するためにＰＯＤを使用しているが、これ
を省略したり、あるいはこれに代えて他の酵素や触媒を
使用することも可能であり、適宜変更できる。

（日発明の効果この発明の酵素電極は、下地電極表面にポリチラミン膜
を形成し、このポリチラミン膜中に被測定検体中に含ま
れる測定対象生化学物質を基質とする酵素と、この酵素
による反応に伴い酸化又は還元される酸化還元物質とを
固定化してなる作用電極と、この作用電極と共に被測定
検体中に浸漬される対照電極とよりなるものであり、両
電極間の電位差に基づいて被測定検体中に含まれる測定
対象生化学物質の濃度を測定するものである。従って、
以下の（ａ）〜ｆｈ１項に列記する利点を存する。

（ａ１作用電極及び対象電極を小型化・微小化できる。

（ｂ）電位測定であるため、測定回路が簡単となり、イ
ンテリジェント化も容易である。また、作用電極及び対
照電極を小型化できるため、測定回路にＦＥＴを使用す
ることが可能となる。

ｔｃ＞イオン選択性（透過）１％が不要であり、かつポ
リチラミン膜は電解重合により容易に下地電極表面に形
成できるので、作用電極の製造が容易でかつその構成が
簡単である。

（ｄ）ポリチラミン膜単位面積あたりの酵素及び酸化還
元物質の固定化量が大きく、応答が速い。

（ｆｌポリチラミン膜中では、フェロセン及び酵素がチ
ラミン分子と共有結合しており、フェロセン及び酵素が
強固に固定化され、使用耐久性に優れている。

（ａ酸化還元物質を電極表面に固定化しているため、被
測定検体中の他の酸化還元物質等の影響による誤差が防
止される。

（ｈｌイオン濃度の変化による電位差計測ではないので
、測定精度が優れており、測定に要する時間（電極出力
が安定化するまでの時間も含む）が短い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る酵素電極の使用状
態を説明する図、第２図は、同酵素電極の作用電極の拡
大縦断面図、第３図は、同実施例における電極電位変化
と時間との関係を示す図、第４図は、同実施例ににける
分あたりの電極電位変化と被測定検体中のグルコース濃
度との関係を示す図、第５図は、この発明の応用例にお
ける電極電位変化と時間との関係を示す図、第６図は、
同応用例における電極電位変化と被測定検体中のＨ２０
□濃度との関係を示す図である。１０：作用電極、　　１２：下地電極、１５：ポリチラ
ミン膜、２０：対照電極。特許出願人　　　　　　　　立石電機株式会社代理人　
　　　　弁理士　　中　村　茂　倍率１図第３図り゛ルコーズ５屑／１　　（Ｍ）第５図日子シ閏　（ｍｉｎ＞ＨコＯｘ　　：Ａｎ　　（＋）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下地電極表面に、ポリチラミン膜を形成し、この
ポリチラミン膜中に被測定検体中に含まれる測定対象生
化学物質を基質とする酵素と、この酵素による反応に伴
い酸化又は還元される酸化還元物質とを固定化してなる
作用電極と、この作用電極と共に被測定検体中に浸漬さ
れる対照電極とよりなる酵素電極。
（２）前記酵素は、グルコースを基質とするグルコース
オキシダーゼである特許請求の範囲第１項記載の酵素電
極。
（３）前記酸化還元物質はフェロセンである特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の酵素電極。