KR20180126355A - 바이오 센서 및 그의 제작 방법 - Google Patents

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Abstract

바이오 센서의 제작방법이 개시된다. 본 제작방법은, 카테콜기를 함유한 분자 및 효소를 포함한 산성 용액을 마련하는 단계 및 산성 용액에 전극을 침지하고 전극에 전압을 인가하여 카테콜기를 함유한 분자와 효소가 반응하여 생성된 구조체를 전극에 부착하는 단계를 포함한다.

Description

바이오 센서 및 그의 제작 방법 { BIO SENSOR AND MANUFACTURING METHOD THEREOF }
본 개시는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 대한 것으로, 더 상세하게는 연속적인 측정에도 재현성을 보장할 수 있는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 대한 것이다.
생물학적 유체(biological fluids)에서 분석물(analyte)의 정량 결정은 생리학적 이상의 진단 및 치료에 유용하다. 예를 들면, 당뇨병을 진단하고 예방하는 데 있어서 글루코오스(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 체크해야 한다.
종래엔 전기화학적 방법을 이용한 바이오 센서가 주로 이용되었다. 전기화학적 바이오 센서는 효소를 전극에 고정한 효소 전극을 이용하여, 측정 대상 물질과의 효소 반응을 통한 전기화학적 신호를 검출해내는 방법으로 측정 대상 물질의 양을 측정하는 장치이다.
바이오 센서는 다양한 방식으로 측정 대상 물질의 양을 측정할 수 있는데, 그 중 채혈이 요구되는 방식에선, 채혈 방식의 숙련도에 따라 혈당 측정치가 달라질 수 있다는 점, 단속적인 측정 몇 번으로 혈중 측정 대상 물질의 농도 변화를 완벽하게 감지해내기는 불가능하다는 문제가 있었다.
이에 따라 최근엔 채혈을 하지 않고도 정확하게 측정 대상 물질의 농도를 모니터링할 수 있는 장치가 개발되었고, 대표적으로 바이오 센서 자체를 완전히 체내에 이식시키는 완전 이식형과, 피하조직에 삽입 가능한 바늘 모양 센서를 삽입하는 최소 침습(minimally invasive) 방식이 있었다.
한편, 최소 침습 방식의 바이오 센서는 혈관 대신 피하 조직에 삽입됨으로써 혈액과의 직접 접촉을 피할 수 있으므로, 생체적합 재료로 제작되어 수일 동안 동작할 수 있으며, 전문가의 수술 없이 환자에 의해서도 삽입될 수 있다는 장점이 있었다.
하지만 이러한 최소 침습 방식의 바이오 센서로 체액에서 글루코오스를 측정할 경우 피부에 지속적으로 삽입된 상태로 존재하기 때문에 장기간 사용에 따라 효소가 전극에서 체액으로 이탈되는 문제가 발생하여 부정확한 수치가 측정되는 문제가 있었다.
따라서, 효소가 전극에 잘 고정되어 있어 연속적 측정에도 우수한 재현성을 보일 수 있는 바이오 센서의 개발이 요구되었다.
본 개시는 상술한 문제를 해결하기 위해 고안된 것으로, 본 개시의 목적은 연속적인 측정에도 재현성을 보장할 수 있는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 관한 것이다.
이상과 같은 목적을 달성하기 위한 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 제작방법은, 카테콜기를 함유한 분자 및 효소를 포함한 산성 용액을 마련하는 단계 및 상기 산성 용액에 전극을 침지하고 상기 전극에 전압을 인가하여 상기 카테콜기를 함유한 분자와 상기 효소가 반응하여 생성된 구조체를 상기 전극에 부착하는 단계를 포함한다.
이 경우, 상기 산성 용액의 pH는, pH 4 내지 pH 6일 수 있다.
한편, 상기 구조체는, 산성 환경에서 상기 카테콜기를 함유한 분자를 전기화학적으로 산화시켜 유도한 퀴논메타이드기를 포함한 분자와 상기 효소가 결합하여 생성된 것일 수 있다.
한편, 상기 부착하는 단계는, 순환전류전압법(Cyclic voltammetry)으로 상기 전극에 전압을 인가할 수 있다.
한편, 상기 부착하는 단계는, 상기 전극에 펄스 형태의 전압을 인가할 수 있다.
한편, 상기 부착하는 단계는, 상기 전극에 기설정된 정전압을 인가할 수 있다.
한편, 상기 카테콜기를 함유한 분자는, 홍합접착단백질(mussel adhesive protein)에서 유래한 것일 수 있다.
한편, 본 실시 예에 따른 바이오 센서의 제작방법은 피부에 침습될 수 있는 니들 형상의 전극을 제작하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 효소는, 글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
한편, 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서는, 전극 및 상기 전극의 표면에 부착되며 퀴논메타이드기를 포함한 분자와 효소가 결합되어 형성된 구조체를 포함한다.
이 경우, 상기 퀴논메타이드기를 포함한 분자는, 산성 환경에서 카테콜기를 함유한 분자를 전기화학적으로 산화시켜 유도한 것일 수 있다.
한편, 상기 전극은, 피부에 침습될 수 있도록 니들 형상을 가질 수 있다.
한편, 상기 효소는, 글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 전극을 도시한 도면,
도 2는 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 구성을 설명하기 위한 도면,
도 3은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 제작 방법을 설명하기 위한 흐름도,
도 4는 L-Dopa또는 도파민의 전기화학적 산화 및 효소의 공유 결합을 나타낸 도면,
도 5는 본 개시의 또 다른 실시 예에 따른 외부 장치와 통신 기능을 갖춘 바이오 센서를 설명하기 위한 도면,
도 6은 Mgfp-3와 글루코오스산화효소 혼합물의 전기화학적 산화에 대한 순환전류전압법(Cyclic voltammetry)에 따른 측정 결과,
도 7의 (a)는 대기 조건에서 자연적으로 산화된 Mgfp-3와 글루코오스산화효소가 반응하여 전극 표면 상에서 거친 계면으로 형성된 것을 보여주는 SEM(Scanning electron microscope) 이미지,
도 7의 (b)는 최적화된 산성 조건에서 전기화학적으로 산화된 Mgfp-3와 글루코오스산화효소가 반응하여 전극 표면 상에서 매끄러운 계면으로 형성된 것을 보여주는 SEM 이미지,
도 8은 본 개시의 일 실시 예에 따른 센서 모듈의 구성을 설명하기 위한 도면,
도 9는 종래의 센서 및 본 개시에 따른 센서의 글루코오스 농도(0에서 400mg·dL-1)에 대한 검정 곡선,
도 10은 글루코오스가 순차적으로 증감되는 경우의 센서의 전류 응답(Amperometric current response)을 나타낸 그래프,
도 11은 7일 동안 센서의 장기 안정성(long-term stability)을 테스트한 결과이고,
도 12는 본 개시의 센서로 글루코오스 측정시 AA(Ascorbic acid), AP(Acetaminophen), DA(Dopamine), UA(Uric acid)에 대한 방해 영향을 설명하기 위한 도면이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 개시를 더욱 상세하게 설명한다. 그리고 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단된 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 그리고 후술 되는 용어들은 본 개시에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관계 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 또한, 첨부된 도면은 본 개시의 이해를 돕기 위하여 실제 축척대로 도시된 것이 아니라 일부 구성요소의 치수가 과장되게 도시될 수 있다.
바이오 센서는 분석하고자 하는 물질에 대해 특이적 인식 능력을 갖는 생물학적 물질, 예를 들어 효소를 이용하여, 전기화학적 방법으로 대상물질을 측정할 수 있는 기구이다. 바이오 센서라는 용어를 사용하였으나, 센서, 측정장치, 측정기구 등 다양하게 불릴 수 있다. 그리고 측정 대상에 따라 과산화수소 센서, 글루코오스 센서, 혈당 센서 등 다양한 이름으로 불릴 수 있다.
바이오 센서의 전극 표면에서 일어나는 생화학적 산화, 환원 반응에 의하여 전자의 이동이 발생하고, 이러한 전자의 이동에 의하여 발생하는 전류를 모니터링함으로써 시료 내의 대상물질의 농도를 측정할 수 있다.
바이오 센서는 작동 전극(working electrode) 및 상대 전극(counter electrode)(또는 상대/기준 전극(counter or counter/reference electrode))을 포함할 수 있다. 또는, 바이오 센서는 작동 전극, 상대 전극, 및 분리된 기준 전극을 포함할 수 있다.
작동 전극은 효소가 고정되어 있는 전극으로, 효소가 고정된 전극 또는 효소 전극이라 명명될 수 있다. 효소는 글루코오스산화효소(glucose oxidase, GOx), 글루코오스탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH), 헥소키나아제(Hexokinase), 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(Glutamic-oxaloacetic transaminase), 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제(Glutamic-pyruvic transaminase)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예로, 검출하고자 하는 물질이 글루코오스인 경우, 전극에 고정된 글루코오스 산화효소와 글루코오스가 반응하면 글루코닉산(gluconic acid)으로 산화된다. 그리고 글루코오스가 산화될 때 산소 또는 산화된 매개체가 과산화수소 또는 환원된 매개체로 바뀌고, 다시 산화되어 원래의 산화된 형태로 되돌아올 때 발생하는 전자의 이동에 의한 전류를 측정하여 글루코오스를 정량할 수 있다.
도 1은 바이오 센서의 전극들 중 효소가 고정된 작동 전극의 일 예를 설명하기 위한 것으로서, 단면도를 도시한 것이다.
도 1을 참고하면, 바이오 센서는 효소를 포함한 구조체(140)가 표면에 증착된 전극(110)을 포함할 수 있다.
전극(110)은 피부 내부로 침습 가능하도록 니들 형상을 가지도록 제작될 수 있다. 피부 내부로 전극(110)을 삽입함으로써 연속적인 혈당 측정이 가능할 수 있다. 다만, 반드시 이러한 형상에 한정되는 것은 아니며, 측정 환경에 맞게 다양한 형상을 가질 수 있다.
전극(110)은 예컨대 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등의 금속 또는 합금으로 이루어진 것일 수 있다.
효소를 포함한 구조체(140)는 전극(110) 상에 배치된다. 구조체(140)는 퀴논메타이드기(quinone methide group)를 포함한 분자와 효소가 결합되어 형성될 수 있다.
구체적으로, 효소를 포함한 구조체(140)는 산성 환경에서 카테콜기(Catechol group)를 함유한 분자를 전기화학적으로 산화시켜 퀴논메타이드기를 포함한 분자를 유도하고, 퀴논메타이드기를 포함한 분자와 효소가 공유결합되어 형성될 수 있다. 카테콜기를 함유한 분자는 예컨대 홍합접착단백질(Mussel Adhesive Protein)에서 유래한 것일 수 있다.
홍합은 접착 단백질을 생산 및 분비함으로써 자신을 바다 속의 바위 등에 단단히 부착시킬 수 있다. 특히, 젖은 상태에서도 접착력을 유지할 수 있다. 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있다.
홍합접착단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않으므로 피부 침습형 바이오 센서에 적용이 가능하며, 효소와 공유 결합을 형성하여 전극(110)에 단단히 부착될 수 있다. 즉, 효소를 전극(110)에 고정시키는 매개체 역할을 할 수 있다.
홍합접착단백질이 기질의 표면에 접착하는 기작은 티로신 잔기의 화학적 수정에 의한다. 홍합접착단백질내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 도파(Dopa)로 변하고, 이 도파의 작용기(functional group)인 카테콜기(catechol group)가 표면에의 접착에 주된 역할을 수행한다.
본 개시에서 이용될 수 있는 홍합접착단백질은 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시에서 이용될 수 있는 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 fp(foot protein)-1 내지 fp-5 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 개시에서는 홍합접착단백질에서 유래한 분자뿐만 아니라 카테콜기를 함유한 어떠한 분자라도 이용될 수 있다. 예를 들어, 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 1,2-다이하이드록시벤조익 애시드 (1,2-dihydroxybezoic acid) 및 3,4-다이하이드록시벤조익 애시드 (3,4-dihydroxybenzoic acid) 등을 작용기로서 포함한 분자가 이용될 수 있다.
카테콜기를 전기 화학적으로 산화시키면 퀴논기가 되고, 퀴논기는 산성 환경에서 퀴논메타이드기로 전환될 수 있다. 효소의 아민기 및 티올기 중 적어도 하나와 퀴논메타이드기를 포함한 분자가 공유 결합되어 생성된 구조체(140)가 전극(110)에 단단하게 부착될 수 있다. 구조체(140)내부에 효소가 공유 결합으로 강하게 결합될 수 있으며, 또한 분자들끼리 서로 가교 결합을 형성한 상태로 전극(110)에 부착될 수 있으므로 바이오 센서의 장기적 사용에도 효소가 외부로 이탈되는 것을 방지할 수 있다.
도 2는 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 구성을 설명하기 위한 도면이다. 도 2를 설명함에 있어서 생략된 내용이라 하더라도 도 1에서 기술된 내용은 도 2에도 적용될 수 있다.
바이오 센서(100)는 메인 기재(substrate)(120), 작동 전극(110), 절연층(130), 전자 전달 매개체(111), 효소를 포함한 구조체(140), 기준 전극(150), 보호층(160)을 포함할 수 있다.
도 2를 참고하면, 메인 기재(120)는 폴리머 필름을 니들 형상으로 절단하여 제작할 수 있다. 메인 기재(120)의 아랫면과 윗면에 작동 전극(110)이 배치된다. 작동 전극(110)을 구성하는 물질은 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등의 금속 또는 합금 중에서 선택될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다. 그리고 작동 전극(110) 상에 절연층(130)이 배치될 수 있다.
작동 전극(110) 상에는 전자 전달 매개체(111) 및 효소를 포함한 구조체(140) 가 고정된다. 전자전달매개체(111)는 효소에서 작동 전극(110)으로의 전자 전달 효율을 높이기 위한 것으로 예컨대 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinine), 퀴논 유도체, 전이금속함유 유기물 및 무기물(헥사아민 루레늄, 오스뮴 함유 고분자, 포타슘페리시안나이드 등) 또는 유기 전도성 염(organic conducting salt), 비오로겐(viologen)이 사용될 수 있다. 한편 도 2에서 전자전달 매개체(111)는 구조체(140) 아래에 배치되는 것이 가능하며, 전자 전달 매개체(111)와 구조체(140)는 구분되는 계면 없이 서로 혼합된 상태로 존재하는 것도 가능하다.
기준 전극(150)은 절연층(130) 상에 배치될 수 있다. 기준 전극(150)은 작동 전극(110)에 일정한 전위가 인가되도록 하며 높은 임피던스에 의하여 이 전극 쪽으로는 전류가 흐르지 않게 된다. 기준 전극(150)은 예컨대 표준수소전극(standard hydrogen electrode, SHE), 칼로멜(Calomel, Hg/Hg2Cl2)전극, 은-염화은(Ag/AgCl) 전극을 사용할 수 있다. 이들은 비교적 일정한 전위차를 가지므로 일정한 전극 전위를 인가할 수 있다. 마지막으로 보호층(160)이 위, 아래로 배치될 수 있다. 보호층(160)은 예컨대 폴리(4-비닐피리딘-코-스티렌)(Poly(4-vinylpyridine-co-styrene); PPS)로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
도 3은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 제작하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 3을 참고하면, 카테콜기를 함유한 분자 및 효소를 포함한 산성 용액을 마련한다(S310). 그리고 산성 용액에 전극을 침지하고 전극에 전압을 인가하여 카테콜기를 함유한 분자와 효소가 반응하여 생성된 구조체를 전극에 부착한다(S320).
카테콜은 전극 표면에 강하게 부착되는데 주요한 역할을 할 뿐만 아니라, 산화되어 퀴논이 되면서 서로 가교되어 전극 표면에서 더욱 견고한 코팅층을 형성할 수 있다.
구체적으로, S320 단계에서 전극에 순환전류전압법(Cyclic voltammetry)으로 전압을 인가할 수 있다. 이 경우, 최대 산화 효율을 갖는 전위(250~400mV)로 사이클이 반복될 수 있다. 또는 펄스 형태의 전압을 인가하거나, 기 설정된 정전압, 즉 일정한 전압을 인가하는 것도 가능하다.
전극에 전압을 인가함으로써 카테콜기가 전기 화학적으로 산화되면서 동시에 효소와의 공유 결합이 이루어진다. 이에 대해 좀 더 구체적으로 설명하기 위해 도 4에 반응과정의 일 예를 도시하였다. 도 4는 카테콜기를 함유한 분자로서 L-Dopa 잔기 또는 Dopamine 잔기를 포함한 분자의 경우를 도시한 것이다.
도 4를 참고하면, 전극에 전압을 가하면 카테콜기가 전기적으로 산화되어 도파퀴논으로 전환되고 산성 환경에서 도파퀴논이 퀴논메타이드로 전환된다. 퀴논메타이드는 친핵성 물질에 의해 쉽게 공격받을 수 있는 형태이므로 여기에 효소가 1,4-Michael 첨가를 통해 공유 결합되어 복합체가 얻어진다. 복합체는 전극의 표면의 특성에 따라 수소 결합, 공유 결합 또는 배위 결합으로 전극에 결합될 수 있다.
이와 같이 전기 화학적 산화 방식을 이용할 경우 자연적인 산화 방식을 이용하는 것보다 이점을 갖는다. 예컨대, 카테콜기가 자연적으로 산화되는 경우엔 자연 산화 속도가 느리기 때문에 퀴논과 퀴논메타이드 및 그 밖의 많은 유도체들이 공존하게 되고 유도체들 간의 화학결합으로 다이머가 형성되는 원치 않는 부반응이 발생하게 된다.
반면에 전기 화학적 산화 방식에선 전체 전기 화학 공정에 단지 몇 분만이 걸릴 뿐이므로 반응 시간을 현저히 단축시킬 수 있어 상기와 같은 부반응이 발생할 가능성이 낮아진다.
또한, 전기 화학적으로 전위가 가해진 영역만 선택적으로 산화될 수 있으므로 원하는 곳에만 효소를 고정시킬 수 있다. 따라서 기준 전극은 영향을 받지 않으므로 단락(short circuit)이 방지될 수 있으며 다수의 공정을 거치지 않으므로 공정이 간소화될 수 있다는 장점이 있다.
한편, 본 발명자들은 전기 화학적 산화를 염기성 환경과 산성 환경에서 모두 실험해 보았고, 산성 환경에서 산화시키면 상술한 것과 같은 원치 않는 부반응이 진행될 확률이 낮아진다는 것을 발견하였다. 발명자들은 S310 단계에서 마련되는 산성 용액의 pH는 효소의 손상을 최대한 억제하기 위해 pH 4 내지 6로 조절되는 것이 바람직하다는 점을 발견하였다.
이와 같이 최적화된 반응 조건에서 짧은 시간 내에 매끈하고 균일하게 전극 표면에 효소층이 형성될 수 있다. 따라서 높은 반응 효율을 얻을 수 있다.
도 5는 본 개시의 일 실시 예에 따른 외부 장치와 통신 기능을 갖춘 바이오 센서를 설명하기 위한 도면이다.
도 5를 참고하면, 바이오 센서(100')는 전극 어레이(210), 전원 구동부(220), 통신부(230) 및 프로세서(240)를 포함한다.
전극 어레이(210)는 한 쌍의 전극을 포함하고, 한 쌍의 전극 사이에서 흐르는 전류를 측정함으로써 대상물질이 정량될 수 있다. 구체적으로 전극 어레이(210)는 작동 전극과 기준 전극을 포함할 수 있고, 작동 전극은 상기 도 1 내지 도 4에서 설명한 것과 같은 효소가 고정된 전극이다.
전원 구동부(power driver)(220)는 전극 어레이(210)에 전압을 제공하기 위한 구성이다.
전원 구동부(220)는 직류(DC) 전압, 교류(AC) 전압 또는 직류 전압과 교류 전압이 중첩된 전압 중 어느 한 형태의 전압을 전극 어레이(210)에 제공할 수 있다.
통신부(230)는 바이오 센서(200)의 측정 결과를 외부 장치로 전송하기 위한 구성이다. 통신부(230)는 다양한 외부 장치와 통신을 수행하기 위한 구성으로, 근거리 통신망(LAN: Local Area Network) 및 인터넷망을 통해 외부 기기에 접속되는 형태뿐만 아니라, 무선 통신(예를 들어, Z-wave, 4LoWPAN, RFID, LTE D2D, BLE, GPRS, Weightless, ZigBee, Edge Zigbee, ANT+, NFC, IrDA, DECT, WLAN, 블루투스, 와이파이(WiFi), Wi-Fi Direct, GSM, UMTS, LTE, WiBRO, Cellular (3/4/5G), 초음파, 등의 무선 통신) 방식에 의해서 외부 기기에 접속될 수 있다. 통신부(230)는 와이파이칩, 블루투스 칩, 무선 통신 칩 등 다양한 통신칩을 포함할 수 있다.
프로세서(240)는 바이오 센서(100)의 전반적인 동작을 제어하기 위한 구성이다.
프로세서(240)는 전극 어레이(210)에 전압을 제공하도록 전원 구동부(220)를 제어할 수 있다. 구체적으로, 프로세서(240)는 대상 물질을 측정하기 위한 측정 전압을 전극 어레이(210)에 제공하도록 전원 구동부(220)를 제어할 수 있다.
여기서 측정 전압이란 대상물질만을 산화시키기에 적합한 전압 값으로서, 시료 내의 다른 물질이 산화하여 전류 성분에 참가하는 것을 막을 수 있다. 예컨대, 대상 물질이 글루코오스인 경우, 프로세서(240)는 0 초과 1V 이내의 측정 전압을 제공하도록 전원 구동부(220)를 제어할 수 있다.
프로세서(240)는 인가된 측정 전압에 대응하여 전극 어레이(210)에 흐르는 전류를 생성 신호로서 감지하고, 이를 이용한 연산을 수행하여 대상 물질의 농도를 산출할 수 있다. 또는 대상 물질의 농도를 직접 산출하는 대신 측정된 전류 값을 외부 장치로 통신부(230)를 통해 전송하고, 외부 장치에서 대상 물질의 농도가 산출되는 것도 가능하다.
일 실시 예에 따르면, 프로세서(240)는 ADC(Analog Digital Converter), 연산부, 메모리를 포함할 수 있다. ADC를 통해 전류 값을 입력받고 이는 디지털 값으로 변환될 수 있다. 연산부는 ADC에서 출력한 디지털 전류 값을 이용하여 대상 물질의 농도 값을 출력한다. 그리고 산출된 농도 값은 메모리에 저장될 수 있다. 메모리에 저장된 농도 값은 통신부(230)를 통해 외부 장치로 전송될 수 있다.
이 경우 외부 장치는 스마트폰과 같은 장치일 수 있다. 따라서 사용자는 스마트폰 등을 통하여 혈당 측정 결과를 확인할 수 있게 된다.
이하에선 구체적인 실시 예 및 실험 예를 통해 본 개시를 설명하도록 한다. 다만, 아래의 실시 예 및 실험 예는 본 개시의 이해를 돕기 위한 예시 목적일 뿐, 아래의 실시 예 및 실험 예에 의해 본 개시가 한정되는 것은 아니다.
<실시 예> 혈당 센서 제작
제작 과정은 도 2를 참고하여 설명하도록 한다. CO2 레이저로 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 필름을 절단해서 높이와 폭이 각각 1.5 mm 및 700 ㎛인 니들 형상의 메인 기재(120)를 마련하고, 메인 기재(120)의 아래와 윗면에 작동 전극(110)으로서 카본을 실크-스크린 인쇄 방식으로 인쇄하였다. 그리고 작동 전극(110) 상에 절연층(130)을 배치하였다. 그리고 기준 전극(150)으로서 Ag/AgCl를 사용하였다.
효소에서 전극으로의 전자 전달 효율을 높이기 위해 전자 전달 매개체(111)로서 페로센카르복실산을 작동 전극(110)에 전착(electrodeposition)시켰다. 구체적으로, 페로센카르복실산(10mM)을 아세토니트릴 내의 100 mM의 TBAP에 용해시킨 다음, 전극들을 용액에 침지하고 -0.2 V 내지 1.2V의 전위 범위(vs. Ag/AgCl)에서 25 회 반복 사이클을 적용하여 전착을 수행하였고, 0.1 V 내지 0.6V의 전위(15 사이클)를 적용해서 100 mM의 인산 완충액(pH 7.4)으로 세척되었다. 그 다음, 전자 전달 매개체(111)가 고정된 작동 전극(110)을 증류수에 10분간 담근 후 실온에서 1 시간 동안 건조시켰다.
효소를 신속하고 선택적으로 고정하기 위해, 본 개시에선 홍합 접착 단백질의 도파 잔기(Dopa residue)를 전기 화학적으로 산화시켰다. 홍합 접착 단백질의 한 종류인 Mgfp-3(Mytilus galloprovincialis foot protein-3)(GenBank NO.: AAS00463)을 고분자 매트릭스로서 선택하였다.
구체적으로, 2mg/mL의 Mgfp-3 및 200 mg/mL의 GOx를 10mM의 아세테이트 완충액(pH 4)에 용해시켰다. Mgfp-3과 GOx 혼합물은 주사 속도(scan rate) 100 mV/s에서 -0.3 내지 0.7 V (vs. Ag / AgCl)의 전위 사이클을 통해 작동 전극(110) 상에서 전해 중합되었다(도 6).
Mgfp-3의 전기 화학적으로 산화된 도파퀴논(dopa-quinone)은 GOx의 아민 또는 티올과 반응하게 되어 균일한 효소층(도 7의 (b))을 형성하였다. 이와 대비하여, 동일한 혼합물을 사용해서 대기 조건(ambient condition)에서 자발적으로 산화된 것은 고르지 않은 계면을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 (a)). 도 7의 (a)와 같은 거친 계면은 전극과 효소 사이의 전도도를 낮추어 센서의 민감도와 재현성이 떨어지게 된다. 이에 반해 도 7의 (b)와 같은 균일하고 평평한 계면은 전극과 효소 사이의 순조로운 전자 흐름에 기여하여 감도를 향상시킨다.
마지막 단계로서, 전자전달매개체와 GOx가 고정된 전극을 50% 폴리(4-비닐피리딘-코-스티렌)에 담근 후 실온에서 1시간 동안 건조시킨 후 30% 폴리(4-비닐피리딘-코-스티렌)로 다시 코팅하고 12시간 동안 상온에서 건조시켜서 보호층(160)을 형성하였다.
상기의 과정에 따라 완성된 바이오 센서(100)를 이용해서 센서 모듈을 제작하였다. 도 8에 센서 모듈의 구성을 도시하였다.
도 8을 참고하면, 센서 모듈(1000)은 on/off 스위치가 마련된 상면 커버(200), 통신부(300), 베터리(400), 아랫면 커버(500) 및 바이오 센서(100)를 포함한다.
통신부(300)는 MCU(STM32F411, STMicro, 스위스), 소형 퍼텐시오스타트(potentiostat), 아날로그-디지털 컨버터 모듈 (ADS1222, Texas Instruments, 미국), 블루투스 및 근거리 통신(NFC) 모듈을 포함한다. 베터리(400)는 플렉서블한 리튬 이온 폴리머 배터리(FLPB253030R, 루트 제이드, 한국)를 사용하였다.
퍼텐시오스타트는 특정 작동 전위를 센서에 적용하고 포도당 산화에 의해 생성된 전류를 측정한다. 획득된 아날로그 데이터는 트랜스 임피던스 증폭기(전류-전압 변환기)를 사용하여 증폭되고 24 비트의 아날로그-디지털 컨버터(ADC)로 디지털화된다. 송신기는 2.4GHz 블루투스 모듈(CSR1012, CSR, 영국)이 장착된 휴대 전화로 센서의 현재 값을 지속적으로 전송할 수 있으므로 당뇨병 환자에게 저혈당 경고를 제공할 수 있다. NFC(M24LR64, STMicro, 스위스)를 사용해서 송신기 메모리에 저장된 데이터를 ISO15693의 13.56MHz를 사용하는 모바일 장치로 전송할 수 있다.
<시험 예 1> 시간대-전류법을 이용한 글루코오스 검출
도 9는 종래의 센서와 상기 실시 예와 같이 제작된 바이오 센서를 이용하여 작동 전위를 30 mV로 하여 시간대 전류법(chronoamperometry)에 따른 응답 측정하여 얻은 전류 대 글루코오스의 검정곡선(Calibration plot)이다. 도 9는 본 개시에 따른 글루코오스 센서의 감도가 1.93nA/100 mg·dL-1 (R2 = 0.97)인 기존의 글루코오스 센서의 5배인 9.57 nA/100mg·dL-1 (R2 = 0.98)임을 보여준다.
센서 응답 시간은 특정 포도당 농도에 대해서 포화 전류 응답(saturation amperometric response)의 90 %에 도달하는 데 걸리는 시간으로 정의된다. 이 매개 변수는 글루코오스 수준의 변화에 평형을 이루기 위해 글루코오스와 효소 부산물인 글루콘산(gluconic acid)의 확산에 레이어가 부과하는 물질 전달 장벽과 관련이 있다. 도 10은 글루코오스가 순차적으로 증감되는 경우의 센서의 응답을 나타낸다. 각 글루코오스 첨가 단계 후에, 센서 응답 시간은 약 60초이다.
<시험 예 2> 장기 안정성 테스트
상기 실시 예와 같이 제작된 바이오 센서의 장기 안정성(long-term stability)은 매일 5가지 다른 글루코오스 농도(0 ~ 400mg·dL- 1)를 사용하여 7일 동안 평가되었으며 작동 전위는 안정성을 연장시키기 위해 30mV에서 10mV로 감소되었다(도 11). 테스트 동안, 센서는 모든 글루코오스 농도에 노출시켜 10회 시험하였고, 시험하지 않을 때에는 전위를 가해서 100 mg/dL-1의 글루코오스 표준 용액에 침지되었다. 도 11에서 볼 수 있듯이 1일째의 오차가 다른 날보다 큰 것으로 나타났으나, 30분 후에는 전류 응답이 안정되고 CV 값은 4.82 % 내로 거의 초기값과 같았다.
<시험 예 3> 글루코오스 측정시의 방해물질들에 의한 영향 평가
도 12는 아스코르브산(ascorbic acid; AA), 아세트아미노펜(acetaminophen; AP), 도파민(dopamine; DP) 및 요산(uric acid; UA)과 같은 방해물질들이 존재하였을 때의 상기 실시 예와 같이 제작된 바이오 센서의 글루코오스 산화 전류를 측정한 것이다.
방해물질들은 글루코오스와 유사한 산화 전위를 가지며 글루코오스 응답 신호에 영향을 미칠 수 있다. 모든 방해물질들은 PBS(pH 7.4)에 100μM로 용해시켰고, 시간대 전류법으로 상기 방해 물질들이 존재시 글루코오스의 신호 변화를 관찰하였다. 도 12는 30mV의 인가된 전위에서 대조군 및 시험 샘플에 대한 전류 측정 응답의 변화를 도시한 것이다. 그 결과, 무시할 수 있는 정도의 약 3% 이하의 오차가 관찰되었다.
이상에서는 본 개시의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 개시는 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 개시의 요지를 벗어남이 없이 당해 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 개시의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어 져서는 안 될 것이다.
110: 전극
140: 구조체

Claims (13)

  1. 바이오 센서의 제작방법에 있어서,
    카테콜기를 함유한 분자 및 효소를 포함한 산성 용액을 마련하는 단계; 및
    상기 산성 용액에 전극을 침지하고 상기 전극에 전압을 인가하여 상기 카테콜기를 함유한 분자와 상기 효소가 반응하여 생성된 구조체를 상기 전극에 부착하는 단계;를 포함하는 바이오 센서의 제작방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산성 용액의 pH는,
    pH 4 내지 pH 6인 바이오 센서의 제작방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 구조체는,
    산성 환경에서 상기 카테콜기를 함유한 분자를 전기화학적으로 산화시켜 유도한 퀴논메타이드기를 포함한 분자와 상기 효소가 결합하여 생성된 것인 바이오 센서의 제작방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 부착하는 단계는,
    순환전류전압법(Cyclic voltammetry)으로 상기 전극에 전압을 인가하는 바이오 센서의 제작방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 부착하는 단계는,
    상기 전극에 펄스 형태의 전압을 인가하는 바이오 센서의 제작방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 부착하는 단계는,
    상기 전극에 기설정된 정전압을 인가하는 바이오 센서의 제작방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 카테콜기를 함유한 분자는,
    홍합접착단백질(mussel adhesive protein)에서 유래한 것인 바이오 센서의 제작방법.
  8. 제1항에 있어서,
    피부에 침습될 수 있는 니들 형상의 전극을 제작하는 단계;를 더 포함하는 바이오 센서의 제작방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 효소는,
    글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택되는 바이오 센서의 제작방법.
  10. 바이오 센서에 있어서,
    전극; 및
    상기 전극의 표면에 부착되며 퀴논메타이드기를 포함한 분자와 효소가 결합되어 형성된 구조체;를 포함하는 바이오 센서.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 퀴논메타이드기를 포함한 분자는,
    산성 환경에서 카테콜기를 함유한 분자를 전기화학적으로 산화시켜 유도한 것인 바이오 센서.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 전극은,
    피부에 침습될 수 있도록 니들 형상을 갖는 바이오 센서.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 효소는,
    글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택되는 바이오 센서.
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