RU2349599C2 - Биоадгезив мидии - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан адгезивный белок, содержащий белок и повторяющийся по меньшей мере один раз пептид, который присоединен к карбокси- и/или аминоконцам данного белка. Представлен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую описанный адгезивный белок. Описан экспрессирующий вектор, который содержит функциональным образом встроенную нуклеотидную последовательность, кодирующую описанный адгезивный белок. Представлен трансформант, трансформированный описанным вектором, выбранный из группы, состоящей из прокариот, эукариот и клеток, происходящих из эукариот. Раскрыты способы продуцирования и очистки описанного адгезивного белка. Предложен адгезив, содержащий описанный адгезивный белок в качестве активного компонента в эффективном количестве. Раскрыт способ регуляции силы адгезии предложенного адгезива, включающий стадию обработки веществом, выбранным из группы, состоящей из оксиданта, наполнителя и поверхностно-активного вещества, или стадию регулирования концентрации адгезивного белка, который является активным компонентом адгезива. Предложен покрывающий агент, содержащий описанный адгезивный белок в качестве активного компонента в эффективном количестве. Настоящее изобретение позволяет получать адгезивный белок, который можно экономично производить в массовых количествах для использования вместо химических адгезивов. 11 н. и 31 з.п. ф-лы, 33 ил., 1 табл.

Description

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Claims (42)

1. Адгезивный белок, содержащий белок с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и повторяющийся по меньшей мере один раз пептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 25, который присоединен к карбокси- и/или амино-концам данного белка.

2. Адгезивный белок по п.1, где адгезивный белок происходит из адгезивного белка мидии.

3. Адгезивный белок по п.1, где пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, тандемно повторяющуюся от 1 до 10 раз.

4. Адгезивный белок по п.3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12, и аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14.

5. Адгезивный белок по п.1, где белок содержит 6 остатков гистидина.

6. Адгезивный белок по п.5, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 20, и аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 22.

7. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую адгезивный белок по п.1.

8. Полинуклеотид по п.7, где пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, тандемно повторяющуюся от 1 до 10 раз.

9. Полинуклеотид по п.8, где нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид, выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 26-31, тандемно повторяющихся от 1 до 10 раз.

10. Полинуклеотид по п.8, где полинуклеотид выбран из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 11, и нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.

11. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую адгезивный белок по п.5.

12. Полинуклеотид по п.11, где нуклеотидная последовательность, кодирующая адгезивный белок, выбрана из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19, и нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.

13. Экспрессирующий вектор, который содержит функциональным образом встроенную нуклеотидную последовательность, кодирующую адгезивный белок по любому из пп.1-6.

14. Экспрессирующий вектор по п.13, где нуклеотидная последовательность, кодирующая адгезивный белок, выбрана из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 11, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17, нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19, и нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.

15. Экспрессирующий вектор по п.13, где вектор представляет собой pENG151 (KCTC 10766 ВР).

16. Трансформант, трансформированный вектором по п.13, выбранный из группы, состоящей из прокариот, эукариот и клеток, происходящих из эукариот.

17. Трансформант по п.16, где прокариот представляет собой E.coli или Bacillus sp.

18. Трансформант по п.16, где эукариот выбран из группы, состоящей из дрожжей, насекомых, растений и животных.

19. Трансформант по п.16, где клетки, происходящие из эукариот, выбраны из группы, состоящей из растительных клеток, клеток насекомых и клеток млекопитающих.

20. Способ продуцирования адгезивного белка, включающий стадии:
(а) конструирования вектора, который содержит функциональным образом встроенный нуклеотид, кодирующий адгезивный белок по п.1;
(б) конструирования трансформанта путем трансформации вектором клетки-хозяина; и
(в) продуцирования рекомбинантного адгезивного белка путем культивирования трансформанта.

21. Способ по п.20, где пептид происходит из адгезивного белка.

22. Способ по п.21, где адгезивный белок происходит из адгезивного белка мидии.

23. Способ по п.20, где пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, тандемно повторяющуюся от 1 до 10 раз.

24. Способ по п.23, где адгезивный белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12, и аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14.

25. Способ по п.20, где белок содержит 6 остатков гистидина.

26. Способ по п.25, где адгезивный белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 20, и аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 22.

27. Способ очистки адгезивного белка, включающий стадии:
(а) лизиса трансформанта по п.16 и затем центрифугирования для разделения супернатанта и осадка;
(б) приготовления суспензии путем добавления кислотного органического растворителя к осадку и его суспендирования; и
(в) центрифугирования суспензии для отделения супернатанта.

28. Способ по п.27, где кислотный органический растворитель имеет рН от 3 до 6.

29. Способ по п.27, где кислотный органический растворитель представляет собой один или более чем один растворитель, выбранный из группы, состоящей из уксусной кислоты, лимонной кислоты и молочной кислоты.

30. Способ по п.29, где уксусная кислота представляет собой 5-30%-ный (об./об.) водный раствор.

31. Способ по п.27, где супернатант, полученный на стадии (в), дополнительно подвергают гель-фильтрационной хроматографии.

32. Адгезив, содержащий адгезивный белок по любому из пп.1-6 в качестве активного компонента в эффективном количестве.

33. Адгезив по п.32, где от 5 до 100% общего количества остатков тирозина в адгезивном белке модифицировано в 3,4-дигидроксифенил-L-аланин (DOPA).

34. Адгезив по п.32, который прилипает к субстрату, выбранному из группы, состоящей из пластика, стекла, металла, эукариотических клеток, прокариотических клеток и растительных клеточных стенок и липидов.

35. Адгезив по п.32, который наносят на биологический образец.

36. Адгезив по п.32, который дополнительно содержит одно или более чем одно вещество, выбранное из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, оксиданта и наполнителя.

37. Адгезив по п.36, где поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия или додецилбензолсульфонат натрия.

38. Адгезив по п.36, где оксидант представляет собой тирозиназу или Н₂O₂.

39. Адгезив по п.36, где наполнитель выбран из группы, состоящей из коллагена, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, эластина, ламинина, казеина, гидроксиапатита и альбумина, фибронектина и гибрина.

40. Адгезив по п.32, который наносят на субстраты, используемые в подводных условиях.

41. Способ регуляции силы адгезии адгезива по п.32, включающий стадию обработки веществом, выбранным из группы, состоящей из оксиданта, наполнителя и поверхностно-активного вещества, или стадию регулирования концентрации адгезивного белка, который является активным компонентом адгезива.

42. Покрывающий агент, содержащий адгезивный белок по любому из пп.1-6 в качестве активного компонента в эффективном количестве.

Images