CN108395483A - 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用 - Google Patents

一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用，将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示的序列。所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、7、8或9所示的序列。所述第三嵌段多肽包含SEQ ID NO.10(RGD短肽)、11(SDE三肽)、12(IKVAV短肽)或13(RADA16‐I自组装多肽)所示的序列。实现了微生物一步法合成融合蛋白，该过程温和高效，成本低廉，设备要求度低，易于后期扩大生产。

Description

一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合 蛋白的合成方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的基因合成、含有融合蛋白基因片段的重组表达载体的构建、在基因工程菌株中的发酵表达、融合蛋白的分离纯化方法、及其在材料修饰方面的应用。
背景技术
生物污损，是指细胞、蛋白质、细菌等生命物质在固体基底表面发生附着、积累、繁殖所导致的材料或器件性能退化，造成器件损耗的过程。在医药、航海、食品等领域，生物污损不仅会增加材料的损耗，还会造成能源消耗、医疗安全等诸多问题。如在免疫诊断行业，生物芯片表面的非特异性蛋白吸附会减弱设备的信噪比，降低检测的精准度；在医疗领域，生物污损造成的危害尤为严重，如人工心脏瓣膜、心脏起搏器、血液透析系统、血管支架、植入导管、人工骨等器件在人体中直接接触组织和体液，由于细菌的粘附以及蛋白质、细胞的吸附，很容易形成生物膜，甚至引起更严重的感染性并发症。因此，构建具有抗污功能的防止生物污损的材料表面具有非常重要的应用价值。
为了在基体材料表面制备有效的抗污涂层，需要将抗污蛋白稳定的连接到材料表面上。近年来，通过对自然界中生物粘附现象的观察和探索，特别是对海洋贻贝足丝蛋白(Mytilus edulis foot protein,Mefp)的研究，开发基于贻贝黏附蛋白的具有广泛适用性的修饰技术已成为研究热点。其中，Mefp蛋白含有大量的3,4-二羟基苯丙氨酸(Dopa)，Dopa的强共价键和配位能力赋予贻贝黏附蛋白超强的黏附力。Dopa作为酪氨酸翻译后修饰的羟基化合物，是一种非天然氨基酸，微生物不能直接合成含Dopa的多肽或蛋白，可以通过翻译后修饰或非天然氨基酸插入的方法获得。
在抗污材料方面，两性离子聚合物(同时含有阳离子基团和阴离子基团，整体上呈现电中性)近年来引起研究者极大地关注，由于其离子效应导致的强水合作用，使两性离子材料表面包覆有一层水化层能有效抵抗非特异性蛋白的吸附、细胞粘附及细菌等微生物的粘附。氨基酸，作为一种天然的两性离子分子，也具有类似两性离子聚合物材料的抗污性质。研究发现交替排列的带正电荷的赖氨酸(Lys/K)和带负电荷的谷氨酸(Glu/E)形成的两性离子类多肽自组装成单分子层，具有高效的抗非特异性蛋白吸附能力材料[Chen S,CaoZ,Jiang S.Ultra-low fouling peptide surfaces derived from natural aminoacids.[J].Biomaterials,2009,30(29):5892-5896]。
基于贻贝黏附蛋白和两性离子多肽构建的两嵌段融合蛋白一端具有广泛的底物黏性，另一端具有两性离子抗污防生物污染的功能。在两嵌段融合蛋白的基础上，可进一步融合功能多肽或蛋白片段，使构建的融合蛋白具备其他特定的功能，得到三嵌段多功能蛋白。比如RGD短肽、SDE三肽、IKVAV短肽、RADA16-I自组装多肽等。RGD是一类含有Arg-Gly-Asp三肽序列的短肽，是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点，参与到许多生物学过程中，如细胞吞噬作用、细胞迁移、信号传递、细胞通讯和淋巴细胞的识别、血小板的聚集等。整合素家族尤其在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。如整合素αvβ3在多种实体肿瘤细胞表面都有高水平的表达，研究表明其主要高表达于新生血管内皮细胞和绝大部分肿瘤细胞，包括神经胶质瘤、肺癌、胰腺癌和黑色素瘤等，而基质蛋白中的RGD三肽序列能与整合素αvβ3特异性结合。基于这个原理，将治疗性效应分子靶向性地导入肿瘤部位，可以有效地减少肿瘤治疗中对正常组织或器官的损害。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有的应用需求，通过基因工程技术获得一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白，获得同时具有高效抗污和特异性黏附功能的融合蛋白(我们将其命名为Mytilus edulis foot protein and Zwitterionicpeptide and Other peptide fusion Protein)。其中，第一嵌段以贻贝足丝蛋白作为锚定功能单元，第二嵌段以两性离子多肽作为抗污功能单元，第三嵌段的其他短肽序列包括RGD短肽或SDE三肽或IKVAV短肽或RADA16-I自组装多肽等。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种具有高效抗污和特异性黏附功能的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的贻贝足丝蛋白氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列；两性离子多肽氨基酸序列包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的序列，第三嵌段功能单元的氨基酸序列包含SEQ ID NO.10(RGD短肽)、SEQ ID NO.11(SDE三肽)、SEQ IDNO.12(IKVAV短肽)或SEQ ID NO.13(RADA16-I自组装多肽)所示的序列。
本发明的第二个目的是提供了上述编码三嵌段多功能融合蛋白的合成方法，其特征在于将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
具体技术方案如下：
一种基于具有粘附-抗污蛋白的三嵌段多功能融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白含有贻贝粘附蛋白、两性离子多肽、RGD短肽/SDE三肽/IKVAV短肽/RADA16-I自组装多肽。
所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列。
所述的第三嵌段功能单元包含SEQ ID NO.10(RGD短肽)、SEQ ID NO.11(SDE三肽)、SEQ ID NO.12(IKVAV短肽)或SEQ ID NO.13(RADA16-I自组装多肽)所示的氨基酸序列。
本发明所述的基于具有粘附-抗污蛋白的三嵌段多功能融合蛋白MZOP的合成方法，其特征在于：将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
优选所述融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17，核苷酸序列为SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。重组表达载体是将三嵌段多功能融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
表达所述融合蛋白的宿主细胞为含有SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21的核苷酸序列的宿主细胞；或者为含有重组表达载体的宿主细胞。优选所述的细胞为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
本发明的上述融合蛋白的基因序列是根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。
优选本发明的融合蛋白的合成方法，将贻贝粘附蛋白和两性离子多肽利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化三嵌段多功能融合蛋白。包括以下步骤：
⑴人工合成三嵌段多功能融合蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示；
⑵将合成的三嵌段多功能融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，在融合蛋白基因5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点，构建重组表达载体；
⑶将构建成功的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板筛选转化子；
⑷大肠杆菌BL21(DE3)pLysS发酵表达三嵌段多功能融合蛋白；
⑸MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白的分离纯化。
本发明的第三个目的是提供三嵌段多功能融合蛋白在材料表面修饰和生物医学方面的应用。
进一步地，MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白用于修饰肿瘤药物载体，在纳米药物载体表面负载融合蛋白，KE蛋白片段有效降低非特异性蛋白吸附，减小对健康组织或细胞的损伤。同时RGD肽结构特异性识别在肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞过度表达的整合素αvβ3，实现肿瘤药物的靶向作用。
基于具有粘附-抗污功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白(MP-KE)，在此基础上可根据特定的需要设计第三嵌段X多肽序列，第三嵌段X短肽序列不局限于RGD短肽序列，还包括IKVAV短肽、SDE三肽、IRADA16-I自组装多肽等不同的多肽序列。
进一步地，IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)是一种来源于层粘连蛋白A链的整合素结合肽，能够自组装成纳米纤维凝胶，这些短肽能促进神经突的伸长，具有良好的神经生物活性，是一种优良的神经生物材料。
进一步地，SDE为丝氨酸-天冬氨酰-谷氨酸负电性三肽，此三肽广泛存在于低密度脂蛋白(LDL)受体配体结合域7个重复序列的羧基末端，对LDL受体特异性识别LDL起着重要作用，可用于减缓由于人体血液中LDL进入血管壁中并被氧化成氧化型的低密度脂蛋白是引起的动脉粥样硬化。
进一步地，RADA16-I是一种自组装多肽水凝胶材料，在较高的离子盐浓度条件下自组装成适合细胞3D贴附生长的凝胶状纳米纤维支架结构。这种自组装多肽水凝胶材料具有类似髓核组织的超高含水量，可注射到椎间盘内成胶，募集、激活退变椎间盘内的间充质干细胞，进而修复再生退变的椎间盘。
附图说明
图1为重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD示意图；
图2为重组表达载体pET-28a-MP-KE-SDE示意图；
图3为重组表达载体pET-28a-MP-KE-IKVAV示意图；
图4为重组表达载体pET-28a-MP-KE-RADA16-I示意图；重组表达载体pET-28a-MP-KE中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点、融合蛋白编码基因及六聚组氨酸标签。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明以具体实施例提供一种基于具有粘附-抗污蛋白的三嵌段多功能融合蛋白MP-KE-X(我们将其命名为MP-KE-X(Mytilus edulis foot protein andlysine(K)-glusate(E)zwitterionic peptide and X fusion protein)).其中，X包含RGD三肽、IKVAV短肽、SDE三肽、IRADA16-I自组装多肽。下面以X为RGD三肽为例，说明具体实施过程。MP-KE-RGD其优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。其中贻贝黏附蛋白MP的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。两性离子多肽KE的氨基酸序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9。RGD短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。
本发明中的融合蛋白MP-KE-RGD基因根据大肠杆菌表达偏好进行密码子优化，使融合蛋白能够在大肠杆菌中过量稳定表达。
本发明提供含有上述融合蛋白MP-KE-RGD基因的重组表达载体，其特征在于将贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD(我们将其命名为pET-28a-MP-KE-RGD)，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
本发明提供含有上述融合蛋白MP-KE-RGD基因的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为含有上述的重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD的宿主细胞，优选的，所述的细胞为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
本发明提供一种产生上述融合蛋白MP-KE-RGD的方法，其特征在于将贻贝粘附蛋白MP、KE两性离子多肽和RGD整合素识别多肽利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD，再将pET-28a-MP-KE-RGD质粒载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白MP-KE-RGD的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化三嵌段多功能融合蛋白MP-KE-RGD。
进一步的，上述的产生融合蛋白MP-KE-RGD的方法包括以下步骤：
⑴人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
①贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因序列的确定。
在不改变贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化，得到核苷酸序列。
②贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因的合成。
将上述优化的基因序列交于金唯智公司，人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因。
⑵将合成的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，在融合蛋白基因5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点，构建重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD。
以pET-28a作为基因的载体，在人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD基因的同时，在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点直接构建重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD。
⑶将构建成功的重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板筛选转化子。
感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS与重组表达载体质粒pET-28a-MP-KE-RGD混合均匀，通过冰孵-热激-冰孵的化学方法使感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS吸收重组表达载体质粒pET-28a-MP-KE-RGD，复苏后将菌液涂布在含有卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板进行转化子的筛选。
⑷大肠杆菌BL21(DE3)pLysS发酵表达贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD。
大肠杆菌BL21(DE3)pLysS转化子在LB抗性平板上划线活化，挑取单菌落进行种子液培养，取1ml种子液转接入含有50-100ml LB培养基的摇瓶中扩大培养大肠杆菌，发酵表达融合蛋白MP-KE-RGD。转接培养当大肠杆菌菌液浓度为OD600＝0.6-0.8时用0.4-1.5mM的IPTG进行诱导，25-40℃，200-300rpm培养6-18h后在4℃，6000-10000rpm下离心20-40min收集大肠杆菌菌体。菌体用PBS缓冲液重悬至菌液，菌液在冰水浴下超声破碎30-60min，输出功率100-300W，破碎2-8s，停歇2-8s。离心后收集上清和沉淀，并将上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
⑸贻贝粘附蛋白/两性离子多肽/整合素识别多肽融合蛋白MP-KE-RGD的分离纯化。
①融合蛋白MP-KE-RGD上清的分离纯化：
大肠杆菌发酵结束后离心收集菌体，将菌体重悬于binding buffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、20-40mM咪唑，pH7.0-7.4)中，在冰水浴下超声破碎30-60min，输出功率100-300W，破碎2-8s，停歇2-8s。离心后收集含有融合蛋白MP-KE-RGD的上清，上清用0.22μm膜过滤除去固体颗粒。
融合蛋白MP-KE-RGD中有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni2+通过配位键等结合，溶液中咪唑能竞争与Ni2+结合，因此高浓度咪唑溶液能洗脱结合在镍柱上的蛋白。选用GE公司的5mlHistrap柱对融合蛋白MP-KE-RGD上清进行亲和层析分离。Histrap柱经过水、binding buffer清洗后将过膜的融合蛋白MP-KE-RGD上清按0.2-2ml/min流速上柱，使融合蛋白MP-KE-RGD结合在柱上。用wash buffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、100-350mM咪唑，pH7.0-7.4)以1-5ml/min流速洗涤柱中的杂蛋白。洗涤结束后用elutionbuffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0-7.4)洗脱柱上结合的融合蛋白MP-KE-RGD。洗脱液用高纯水超滤换液脱盐后冻干。
②融合蛋白MP-KE-RGD沉淀的分离纯化：
用包涵体洗涤液(2-3M尿素、0.2-1.0％Triton-X-100、20-80mM PBS、4-6mM EDTA)洗涤包涵体2次，每次30-60min，去除包涵体外的杂蛋白。用25-75％乙酸重悬包涵体，25-40℃，200-300rpm处理1-5h提纯包涵体中融合蛋白。提纯上清于4℃透析12-36h后超滤冻干。
最后，将最终的纯化蛋白MP-KE-RGD进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度。
实施例1：MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白的重组表达载体的构建和菌株的构建
MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白的优选氨基酸序列为SEQ ID NO.14，优选核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
在SEQ ID NO.18基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点，3’端加入HindIII限制性酶切位点。人工合成该基因序列并进行PCR扩增，反应总体积50μl，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μl，浓度10mmol/L的dNTP加1μl，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNApolymerase，2U/μl，加0.5μl。反应条件为98℃5s、55℃45s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(950bp)一致。
将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，双酶切，用T4连接酶将双酶切后的产物连接到pET-28a表达载体中，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如说明书附图1所示。
将感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS从-80℃取出，并在冰上融化。将构建正确的重组表达载体pET-28a-MP-KE-RGD与感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS按比例(每管50μl大肠杆菌感受态细胞和0.5ng重组表达载体质粒)混合均匀后在冰上孵育30min，42℃热激45s后迅速在冰上静置3min。每管加入无菌LB培养基450μl，并在37℃，150rpm条件下复苏2h，复苏后取100μl菌液均匀涂布在含有卡那霉素和氯霉素的双抗性LB固体培养基平板上进行抗性筛选。37℃恒温培养，直到生长出大肠杆菌的单菌落。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，100℃煮沸2min后加入PCR反应体系进行菌落PCR。
PCR产物进行琼脂糖电泳验证转化结果，电泳图在950bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落于37℃，250rpm过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在950bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。同时提取的质粒进行测序。将测序结果与如SEQID NO.18所示的基因序列进行比对，相似性大于99％，认为该基因片段即为融合蛋白MP-KE-RGD基因。菌落PCR、质粒双酶切和测序均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。
实施例2：MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达
将转化成功的大肠杆菌在含有卡那霉素和氯霉素的双抗性LB固体培养基平板上划线，37℃过夜培养活化。挑取单菌落于5ml含有50μg/ml(终浓度)的卡那霉素和氯霉素已经灭菌的LB液体培养基的试管中，于37℃200rpm震荡培养过夜。按1:100比例转接大肠杆菌种子液于500ml摇瓶中，其中含有200ml终浓度为50μg/ml卡那霉素和氯霉素的无菌LB液体培养基。用紫外分光光度计测量大肠杆菌的生长曲线，在大肠杆菌转接后2h30min当菌液浓度为OD600＝0.8时，用0.8mM(终浓度)的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达融合蛋白MP-KE-RGD，在37℃，250rpm条件下继续培养12h后收集大肠杆菌菌体。
实施例3：MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白在大肠杆菌中的分离纯化
大肠杆菌发酵液在4℃，6000rpm条件下离心10min弃去培养基，大肠杆菌菌体用PBS缓冲液洗涤3次后相同条件下离心收集大肠杆菌菌体。用PBS溶液将大肠杆菌菌体稀释到40ml/g菌体湿重，菌液在冰水浴下超声破碎40min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎得到的澄清菌液在4℃，12000rpm下离心30min分别得到上清和包涵体，将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包涵体加入上样缓冲液(loading buffer)并煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。融合蛋白MP-KE-RGD同时存在于上清和包涵体中，因此后续实验采取用亲和层析方法分离上清中的融合蛋白MP-KE-RGD，从包涵体中用乙酸分离纯化融合蛋白MP-KE-RGD。
(1)融合蛋白MP-KE-RGD上清的分离纯化：
大肠杆菌发酵结束后在4℃，6000rpm条件下离心10min离心收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤3次后相同条件下离心收集大肠杆菌菌体。用binding buffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、40mM咪唑，pH 7.4)将大肠杆菌菌体稀释到40ml/g菌体湿重，菌液在冰水浴下超声破碎40min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎得到的澄清菌液在4℃，12000rpm下离心30min得到上清。离心后收集的含有融合蛋白MP-KE-RGD的上清用0.22μm膜过滤除去固体颗粒。
选用GE公司的5mlHistrap柱对融合蛋白MP-KE-RGD上清进行亲和层析分离。将Histrap柱与AKAT prime plus连接好。Histrap柱用10倍柱体积经过膜除气的高纯水洗涤至基线走平，注意赶出导管中的气泡。之后用10倍柱体积经过膜除气的binding buffer清洗Histrap柱至基线走平。将过膜的融合蛋白MP-KE-RGD上清按1ml/min流速上柱，使融合蛋白MP-KE-RGD结合在柱上。上样结束后用经过膜除气的wash buffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、320mM咪唑，pH 7.4)以2ml/min流速洗涤柱中的杂蛋白至基线走平。洗涤结束后用经过膜除气的elution buffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)洗脱柱上结合的融合蛋白MP-KE-RGD，收集吸收峰出现时的洗脱液。Histrap柱依次用8倍柱体积经过膜除气的binding buffer和高纯水洗涤，最后将Histrap柱保存在20％乙醇中。洗脱液用超滤管超滤同时用高纯水换液，除去洗脱液中的盐分，将得到的溶液用冷冻干燥机冻干。
(2)融合蛋白MP-KE-RGD沉淀的纯化和复性：
将得到的包涵体用含有2M尿素、0.6％Triton-X-100、50mM PBS、4mM EDTA的包涵体洗涤液稀释到40ml/g湿重，并在室温下洗涤包涵体2次，每次30min以除去包涵体以外的杂蛋白。洗涤后的包涵体在4℃，12000rpm下离心30min以弃去洗涤液，并用PBS溶液洗去残留的洗涤液。60％乙酸重悬包涵体到120ml/g湿重，在25℃、250rpm条件下震荡处理3h，使大部分包涵体蛋白溶于酸溶液中。处理后的乙酸上清在5％乙酸透析液中4℃下过夜透析18h，中间更换一次透析液。透析结束后，透析袋中的溶液在4℃离心后用超滤管超滤浓缩，并用冻干机冷冻干燥，得到融合蛋白MP-KE-RGD。
纯化得到的融合蛋白MP-KE-RGD溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loadingbuffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于80％。
实施例4：Dopa的体外羟基化
将含有1mg/ml融合蛋白MP-KE-GRD、250U/ml酪氨酸酶、20mM硼酸钠、25mM抗坏血酸的0.1M PBS体系在25℃搅拌并鼓泡反应5h将融合蛋白中酪氨酸残基羟基化为DOPA。反应过程中实时控制反应温度和鼓泡速度。反应结束后溶液透析、超滤并冻干。
水、2mg/ml融合蛋白MP-KE-RGD及修饰后的融合蛋白三种样品溶液分别滴在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。等蛋白样品在膜上结合后将PVDF膜浸泡在含有0.5mg/ml的氮蓝四唑(NBT)的2M甘氨酸钾(pH 10)溶液中并在黑暗条件下25℃和50rpm处理1h。分别用0.2M硼酸钠(pH 8.5)和高纯水将PVDF膜洗涤两次。修饰后融合蛋白位置的PVDF膜呈蓝紫色，说明在该实验条件下修饰后融合蛋白中DOPA发生氧化还原反应，氮蓝四唑(NBT)被还原形成蓝紫色甲瓒。水处理的位置呈无色，融合蛋白MP-KE-RGD处理的位置呈现微黄色的蛋白残留。之后PVDF膜用含有0.1％丽春红S的5％乙酸溶液复染，25℃和50rpm黑暗条件下处理1h后用高纯水洗涤两次。丽春红S复染后，修饰后融合蛋白位置的PVDF膜仍然呈蓝紫色，水处理的位置呈无色，融合蛋白MP-KE-RGD处理的位置呈红色，证明该处有蛋白存在，但是不含DOPA。染色实验说明体外羟基化实验后融合蛋白中含有酪氨酸被羟基化为DOPA。
实施例5：MP-KE-RGD三嵌段多功能融合蛋白在肿瘤靶向给药方面的应用
采用肿瘤移植法制作人乳腺癌模型，取荷瘤小鼠，待瘤长轴达0.8-1.2cm时，颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离肿瘤组织置于玻璃皿容器中，保持容器一直处于碎冰之上，高压灭菌处理过的剪刀剪碎肿瘤组织，并平均分成若干份，每份重量约10g。组织转移专用圆筒状针将组织转移于前肢右腋下，继续饲养，观察肿瘤体积变化。
当肿瘤大小达100mm3左右时，荷瘤小鼠随机分为4组，生理盐水组，拉帕替尼组，MP-KE组，MP-KE-RGD。每组6只，各组按10mg/kg剂量，每两天给药一次，连续尾静脉给药6次。用游标卡尺每天测量肿瘤长轴L)和短轴(W)尺寸，同时称量裸鼠体重。实验第18天处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织并称重，同时剥离其它重要组织，如心，肝，脾，肺，肾，浸泡在福尔马林溶液中待用。计算肿瘤体积和抑瘤率。
实施例6：MP-KE-SDE三嵌段多功能融合蛋白在吸附血浆中LDL方面的应用
MP-KE-SDE三嵌段多功能融合蛋白的合成方法与MP-KE-RGD蛋白类似，其优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，其优选的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，其中SDE短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.11。重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如说明书附图2所示。
采用体外静态吸附来检测带有SDE短肽的三嵌段融合蛋白修饰的聚丙烯酰胺微珠对人血浆中LDL的吸附性能。首先在聚丙烯酰胺微球基材上利用贻贝黏附蛋白MP粘附上MP-KE-SDE三嵌段融合蛋白作为LDL的亲和吸附剂。
配体固定到载体上后，载体上常常还剩余相当量的未结合SDE的活性基团，
它们一方面可能与待分离物质共价结合，另一方面它们所带的电荷会引起离子
交换，因此，需封闭这些活性基团。这一步对制备低非特异性吸附的载体来说
相当重要。但封闭时必须注意封闭的同时不能修饰SDE配体。封闭剂常选择小
分子化合物，要避免因封闭而引入新的活性基团或疏水区。末端具有一个或多
个羟基的封闭剂通常是最佳的选择。本实施例选用三轻甲基氨基甲烷(Tris)作为
封闭剂。其具体实验操作程序如下:
1.配体固定化后，用水洗涤吸附微珠，然后加入等体积1molL/TriS溶液(以HCI调至pH为7.5-8.5)。
2.室温下搅拌反应至少2小时。
3.用蒸馏水、1mol/L NaCI及蒸馏水依次洗涤吸附微珠。
体内静态吸附试验：将两毫升各种吸附微珠和聚丙烯酰胺微珠分别投入一系列50ml带磨口玻塞三角瓶中，再向每个三角瓶中加入4ml血清，并在37℃下(此温度下血中LDL活动性最好易于吸附，且最接近生理状态，恒温振荡2小时。然后测定吸附前、后血清中的TC、HDL和LDL的含量。
根据以下公式计算吸附率：A％＝(C0-C1)/C0X100％
其中C0和C1分别表示吸附前后血清中LDL、HDL和TC的浓度。
实施例7：MP-KE-IKVAV三嵌段多功能融合蛋白在诱导神经干细胞分化生长方面的应用
MP-KE-IKVAV三嵌段多功能融合蛋白的合成方法与MP-KE-RGD蛋白类似，其优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，其优选的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，其中IKVAV多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如说明书附图3所示。
神经干细胞(NSCs)分离自13-15天胎龄的孕鼠大脑皮层，采用的是经典的悬浮培养法。在NSCs完全培养基中，细胞会相互聚集悬浮于培养基中，然后各自分裂，慢慢形成由几十个细胞构成的细胞球，并逐渐增大，3天能达到100μm的直径，6天则能达到200μm以上，细胞球之间还会相互靠拢聚集。一般情况下3-4天换换液，6-7天则需要传一次代，将神经球吹打散并按合适密度重新接种。然后分开的单个细胞会再次聚集、分裂形成新的细胞球，那些分化的细胞则会贴壁，由于传代时只吸出悬浮的细胞，就可以在一定程度上达到纯化NSCs的目的。
细胞增殖和细胞毒性的检测：CCK-8试剂盒是一种基于WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的试剂盒，WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的染料。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
采用氯仿挥发法制备PLA膜(聚羟基脂肪酸酯)，PLA膜用MP-KE-IKVAV三嵌段融合蛋白修饰后，将培养好的神经干细胞种植于膜材料上，三天后用CCK-8试剂盒检测神经干细胞增殖情况。
实施例8：MP-KE-RADA16-I三嵌段多功能融合蛋白在促进椎间盘修复方面的应用
MP-KE-RADA16-I三嵌段多功能融合蛋白的合成方法与MP-KE-RGD蛋白类似，其优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其优选的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，其中RADA16-I多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.13。重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如说明书附图4所示。
融合蛋白成胶：将MP-KE-RADA16-I多肽与10％蔗糖溶液配制成浓度为1％(m/v)的多肽溶液，4℃条件下超声振荡30min以使多肽粉末充分溶解；然后用孔径为0.22μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒后置于4℃保存，备用。将1枚Transwell小室置于24孔培养板内，移液枪吸取备好的1％MP-KE-RADA16-I溶液100ul移入Transwell小室，后向Transwell小室中缓慢滴加L-DMEM并观察其成胶情况。
兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养：取3月龄新西兰大白兔以氯胺酮+速眠新0.5ml肌肉注射麻醉，分别于双侧胫骨平台内下方1cm抽取约3ml骨髓液，迅速置入预装有2ml肝素钠的15ml离心管，摇晃混匀；20℃加入F液5ml，吸管充分吹打，以10cm、2000r/min离心15min；弃上清和脂肪，用含80％FBS的样本稀释液重悬沉淀形成单细胞悬液。将单细胞悬液等体积比缓慢加于兔BMSCs分离液液面上，以10cm、2000r/min离心30min，小心吸取中间单个核细胞层至另一15ml离心管，向离心管加入10ml清洗液，混匀细胞后以1500r/min离心10min，弃上清；再以5ml清洗液重悬所得细胞沉淀，混匀细胞后以10cm、1500r/min离心10min，弃上清；5ml清洗液反复2遍，洗净细胞悬液中的分离液；用含有1％双抗(青霉素/链霉素)、20％FBS的L-DMEM培养液5ml重悬细胞，以1×106个/cm2密度接种于25cm2细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度孵育箱中进行原代细胞培养。
待48h后换培养液，PBS反复冲洗3次以弃去未贴壁细胞，随后每2-3天各换液1次，待原代培养细胞达80％融合时行胰蛋白酶消化传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态，并取第3代细胞进行后续实验。
细胞-蛋白支架复合物制备：将Transwell小室置于每孔加入400μl 10％FBS、1％双抗(青霉素/链霉素)的L-DMEM培养液的24孔培养板内。用10％蔗糖溶液重悬第3代BMSCs制备密度为2.5×106个/ml的细胞悬液，取20μl细胞悬液与100μl1％MP-KE-RADA16-I溶液迅速混匀，立即移入Tanswell小室，向其表面缓慢滴加400μl10％FBS、1％双抗(青霉素/链霉素)的L-DMEM培养液，置入37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内孵育10min；然后缓慢更换培养孔和水凝胶表面的完全培养基，再置入37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内孵育30min；之后每30分钟缓慢更换培养孔及凝胶表面的培养液，至少更换2次以缓冲多肽水凝胶内的pH值。
兔离体椎间盘器官髓核内细胞活性观察：取6月龄新西兰大白兔10只，氯胺酮+速眠新0.5ml肌肉注射麻醉后，6000U肝素钠静脉注射抗血栓，15分钟后处死。无菌条件下手术分离脊柱并获取椎间盘，尽可能剃去椎间盘两侧骨性终板，并剔除椎间盘的前后纵韧带及外层纤维环，生理盐水反复高压冲洗3遍。选取处理好的椎间盘，以10ml注射器从椎间盘后外45°穿刺至髓核中心位置，维持10ml负压抽吸15s，随后于对侧后外45°以微量注射器注入25μl1％MP-KE-RADA16-I多肽溶液作为实验组，未注射多肽椎间盘设为空白对照组(每组3枚椎间盘)。超净台无菌条件下，以含1％双抗(青霉素/链霉素)的PBS液冲洗椎间盘器官2遍后，两组分别置入装有10Ml10％FBS、1％双抗(青霉素/链霉素)L-DMEM培养液的25cm2透气培养瓶，于37℃、5％CO2、饱和湿度孵育箱中竖立培养瓶培养。1、3、7d后取出髓核，避光条件下置于配备好的0.5％FDA/0.2％PI染液，并于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下孵育5min后，以PBS液反复冲洗髓核组织2min，倒置荧光显微镜下观察。于100倍视野下每枚椎间盘随机选取2个视野分别计数死、活细胞数量，计算细胞活性，发现细胞存活率在90％以上。
序列表
SEQ ID NO.1：AKPSYPPTYK
SEQ ID NO.2：
MNNISVAVLVALVLIGSFAVQSDAADYYGPKYGPPRRYGGGNYNRYGRRYGGYKGWNNGWKRGRWGRKYY
SEQ ID NO.3：
SSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS
SEQ ID NO.4：YKYKY
SEQ ID NO.5：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSGGGGSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYK
SEQ ID NO.6：RDRDRDRDRD
SEQ ID NO.7：KDKDKDKDKD
SEQ ID NO.8：RERERERERE
SEQ ID NO.9：KEKEKEKEKE
SEQ ID NO.10：RGDRGDRGDRGD
SEQ ID NO.11：SDESDESDESDESDE
SEQ ID NO.12：IKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAV
SEQ ID NO.13：RADARADARADARADARADA
SEQ ID NO.14：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKGGGGSGGGGSGGGGSKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKERGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGD
SEQ ID NO.15：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKGGGGSGGGGSGGGGSKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDESDE
SEQ ID NO.16：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKGGGGSGGGGSGGGGSKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAVIKVAV
SEQ ID NO.17：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKGGGGSGGGGSGGGGSKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKERADARADARADARADARADARADARADARADARADARADARADARADARADARADARADA
SEQ ID NO.18：
GCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAATCTTCTGAAGAATACAAAGGTGGTTACTACCCGGGTAACACCTACCACTACCACTCTGGTGGTTCTTACCACGGTTCTGGTTACCACGGTGGTTACAAAGGTAAATACTACGGTAAAGCTAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACTCTGGTAAATACAAATACCTGAAAAAAGCTCGTAAATACCACCGTAAAGGTTACAAAAAATACTACGGTGGTGGTTCTTCTGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAACGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGACCGTGGTGAC
SEQ ID NO.19：
GCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAATCTTCTGAAGAATACAAAGGTGGTTACTACCCGGGTAACACCTACCACTACCACTCTGGTGGTTCTTACCACGGTTCTGGTTACCACGGTGGTTACAAAGGTAAATACTACGGTAAAGCTAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACTCTGGTAAATACAAATACCTGAAAAAAGCTCGTAAATACCACCGTAAAGGTTACAAAAAATACTACGGTGGTGGTTCTTCTGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAATCTGACGAA
SEQ ID NO.20：
GCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAATCTTCTGAAGAATACAAAGGTGGTTACTACCCGGGTAACACCTACCACTACCACTCTGGTGGTTCTTACCACGGTTCTGGTTACCACGGTGGTTACAAAGGTAAATACTACGGTAAAGCTAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACTCTGGTAAATACAAATACCTGAAAAAAGCTCGTAAATACCACCGTAAAGGTTACAAAAAATACTACGGTGGTGGTTCTTCTGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTTATCAAAGTTGCTGTT
SEQ ID NO.21：
GCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAATCTTCTGAAGAATACAAAGGTGGTTACTACCCGGGTAACACCTACCACTACCACTCTGGTGGTTCTTACCACGGTTCTGGTTACCACGGTGGTTACAAAGGTAAATACTACGGTAAAGCTAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACTCTGGTAAATACAAATACCTGAAAAAAGCTCGTAAATACCACCGTAAAGGTTACAAAAAATACTACGGTGGTGGTTCTTCTGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAACGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCTCGTGCTGACGCT
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 70
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Met Asn Asn Ile Ser Val Ala Val Leu Val Ala Leu Val Leu Ile Gly
1 5 10 15
Ser Phe Ala Val Gln Ser Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr
20 25 30
Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg
35 40 45
Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg
50 55 60
Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
65 70
<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His
1 5 10 15
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
20 25 30
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
35 40 45
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
50 55 60
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Tyr Lys Tyr Lys Tyr
1 5
<210> 5
<211> 201
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Pro
130 135 140
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
165 170 175
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
180 185 190
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
195 200
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile
1 5 10 15
Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val
20 25
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15
Arg Ala Asp Ala
20
<210> 14
<211> 287
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Arg Gly Asp Arg Gly
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
260 265 270
Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
275 280 285
<210> 15
<211> 296
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Ser Asp Glu Ser Asp
245 250 255
Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu
260 265 270
Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser
275 280 285
Asp Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu
290 295
<210> 16
<211> 326
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Ile Lys Val Ala Val
245 250 255
Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile
260 265 270
Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys
275 280 285
Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val
290 295 300
Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala Val Ile Lys Val Ala
305 310 315 320
Val Ile Lys Val Ala Val
325
<210> 17
<211> 311
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Arg Ala Asp Ala Arg
245 250 255
Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg
260 265 270
Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg
275 280 285
Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg
290 295 300
Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
305 310
<210> 18
<211> 861
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 60
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 120
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 180
tcttctgaag aatacaaagg tggttactac ccgggtaaca cctaccacta ccactctggt 240
ggttcttacc acggttctgg ttaccacggt ggttacaaag gtaaatacta cggtaaagct 300
aaaaaatact actacaaata caaaaactct ggtaaataca aatacctgaa aaaagctcgt 360
aaataccacc gtaaaggtta caaaaaatac tacggtggtg gttcttctgc taaaccgtct 420
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 480
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 540
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagg tggtggtggt 600
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 660
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 720
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaacgtggtg accgtggtga ccgtggtgac 780
cgtggtgacc gtggtgaccg tggtgaccgt ggtgaccgtg gtgaccgtgg tgaccgtggt 840
gaccgtggtg accgtggtga c 861
<210> 19
<211> 888
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 60
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 120
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 180
tcttctgaag aatacaaagg tggttactac ccgggtaaca cctaccacta ccactctggt 240
ggttcttacc acggttctgg ttaccacggt ggttacaaag gtaaatacta cggtaaagct 300
aaaaaatact actacaaata caaaaactct ggtaaataca aatacctgaa aaaagctcgt 360
aaataccacc gtaaaggtta caaaaaatac tacggtggtg gttcttctgc taaaccgtct 420
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 480
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 540
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagg tggtggtggt 600
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 660
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 720
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaatctgacg aatctgacga atctgacgaa 780
tctgacgaat ctgacgaatc tgacgaatct gacgaatctg acgaatctga cgaatctgac 840
gaatctgacg aatctgacga atctgacgaa tctgacgaat ctgacgaa 888
<210> 20
<211> 978
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 60
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 120
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 180
tcttctgaag aatacaaagg tggttactac ccgggtaaca cctaccacta ccactctggt 240
ggttcttacc acggttctgg ttaccacggt ggttacaaag gtaaatacta cggtaaagct 300
aaaaaatact actacaaata caaaaactct ggtaaataca aatacctgaa aaaagctcgt 360
aaataccacc gtaaaggtta caaaaaatac tacggtggtg gttcttctgc taaaccgtct 420
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 480
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 540
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagg tggtggtggt 600
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 660
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 720
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaatcaaag ttgctgttat caaagttgct 780
gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct 840
gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct 900
gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct gttatcaaag ttgctgttat caaagttgct 960
gttatcaaag ttgctgtt 978
<210> 21
<211> 933
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 60
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 120
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 180
tcttctgaag aatacaaagg tggttactac ccgggtaaca cctaccacta ccactctggt 240
ggttcttacc acggttctgg ttaccacggt ggttacaaag gtaaatacta cggtaaagct 300
aaaaaatact actacaaata caaaaactct ggtaaataca aatacctgaa aaaagctcgt 360
aaataccacc gtaaaggtta caaaaaatac tacggtggtg gttcttctgc taaaccgtct 420
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 480
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tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagg tggtggtggt 600
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 660
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 720
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaacgtgctg acgctcgtgc tgacgctcgt 780
gctgacgctc gtgctgacgc tcgtgctgac gctcgtgctg acgctcgtgc tgacgctcgt 840
gctgacgctc gtgctgacgc tcgtgctgac gctcgtgctg acgctcgtgc tgacgctcgt 900
gctgacgctc gtgctgacgc tcgtgctgac gct 933

Claims (10)

1.一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白含有贻贝粘附蛋白、两性离子多肽和第三嵌段功能单元多肽。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的第三嵌段功能单元多肽为RGD短肽或SDE三肽或IKVAV短肽或RADA16‐I自组装多肽。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的序列。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的第三嵌段功能单元多肽为SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的序列。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列为SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17，对应的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。
7.如权利要求1-6所述基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白合成方法，其特征在于：将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
8.如权利要求7所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于重组表达载体是将融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET‐28a中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
9.如权利要求7所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于表达所述融合蛋白的宿主细胞为含有SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21核苷酸序列的宿主细胞；或者为含有重组表达载体的宿主细胞。
10.如权利要求7所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于将贻贝粘附蛋白、两性离子多肽和RGD短肽/SDE三肽/IKVAV短肽/RADA16‐I自组装多肽。利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化三嵌段多功能融合蛋白。
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