CN110054696B - 一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞的分离和分析领域，具体涉及一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用。本发明提供的贻贝仿生多肽复合磁珠利用苯硼酸与3,4二羟基苯丙氨酸的硼亲和反应将一端含肿瘤细胞特异性识别序列的贻贝仿生多肽固定于苯硼酸基高分子聚合物修饰的磁性微球表面，用于循环肿瘤细胞的捕捉与释放。本发明的原料简单易得，成本低，制备工艺简单，反应条件温和，不易造成贻贝仿生多肽的变质、降解等，具有较强的实用性。

Description

一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于细胞的分离和分析领域，具体涉及一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用。
背景技术
循环肿瘤细胞（CTCs）是一种存在于外周血循环系统的肿瘤细胞，原发或继发病灶的肿瘤细胞经自发或诊疗操作而进入外周血循环系统，是肿瘤转移灶的直接来源。富集与分离循环肿瘤细胞作为一种液体活检技术，在肿瘤的诊断、治疗与预后监测方面具有重要的临床意义，对富集的肿瘤细胞进行再培养及单细胞研究，有利于在分子水平上对循环肿瘤细胞进行分析，阐明CTCs水平的肿瘤异质性。
循环肿瘤细胞在每毫升血样中的含量为一个到几十个，与复杂的血液样本相比，数量极为稀少，如何从血液样本中分离富集高纯度、高活性、高捕获率的循环肿瘤细胞是肿瘤细胞富集的难点及重点。常见的肿瘤细胞富集方法可大致分为物理方法和生物化学方法，物理方法基于肿瘤细胞较正常细胞尺寸、密度、介电性、变形性等参数的差异，设计合适的筛分、密度梯度离心、外加电场、流体场等实现肿瘤细胞与正常细胞的分离与纯化。生物化学方法主要依赖于肿瘤细胞表面高表达的一些特异性蛋白或抗原，在材料表面固定能够特异性识别高表达蛋白或抗体的生物识别因子，实现对肿瘤细胞的捕捉、富集与分离。常见的富集方法如密度梯度离心法、基于细胞体积大小的滤膜过滤法、基于肿瘤标记物的免疫磁珠法、基于微流控芯片的CTC-Chip技术等CTCs富集技术。
其中，免疫磁珠法是目前最常用的CTCs分离和富集的技术，免疫磁珠法是基于细胞表面抗原分子与连接在基质表面的特异性单抗结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外加磁场的作用下发生力学位移，将含有靶抗原的目标细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的，具有简便易行、分离纯度高、活性高的优点，具体根据抗原种类的不同，可分为阳性富集与阴性富集。
近年来，用于循环肿瘤细胞富集的磁珠多为纳米磁珠，粒径为10-200nm，富集分离后的细胞表面存在大量的磁珠，且较难释放，容易被细胞内吞，不利于后期对捕获的细胞进行再培养及后续分析研究，因此，开发一种能够集富集、分离、释放循环肿瘤细胞为一体的磁珠具有重要的研究意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用，通过本发明所述的贻贝仿生多肽复合磁珠能够一体化的实现对循环肿瘤细胞的富集、分离与释放。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种贻贝仿生多肽复合磁珠，所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的内核为磁性微球，其内核外依次包覆丙烯酰胺基硅烷化层、苯硼酸基高分子聚合物层、贻贝仿生多肽层；所述的贻贝仿生多肽层通过贻贝仿生多肽链的3,4二羟基苯丙氨酸（DOPA）与苯硼酸基高分子聚合物层中的苯硼酸进行动态共价反应固定到苯硼酸基高分子聚合物层表面。
所述的贻贝仿多肽链具体包括链结合段(DOPA)n、链增长段(Y)m以及可对循环肿瘤细胞进行特异性识别的链识别段X。
所述的链结合段(DOPA)n的3，4二羟基苯丙氨酸与苯硼酸发生动态共价反应，链长1≤n≤6；所述链增长段(Y)m中Y为色氨酸S、甘氨酸G或其组合，链长1≤m≤6；所述链识别段X，包括RGE、RGD、WxEAAYQrFL及对肿瘤细胞具有特异性识别功能的多肽序列。
进一步地，所述的贻贝仿生多肽层可通过小分子单糖溶液进行释放，进而实验循环肿瘤细胞的释放；所述的小分子单糖为果糖、葡萄糖。
本发明中所述磁性微球为Fe3O4磁性微球或二氧化硅包覆的Fe3O4磁性微球，本发明所述磁性微球的制备方法为本领域技术人员所熟知的现有技术，对所述的磁性微球的来源不做限制，所述的磁性微球可通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可采用市售商品，得到的磁性微球只需要满足具有良好的磁性，并且可以与有机或无机高分子形成核壳结构即可。
此外，本发明还提供了一种上述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）制备丙烯酰胺基磁性微球：将磁性微球和3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（MPTS）溶于甲醇或乙醇的醇溶液中，摇床反应完成后在外加磁场作用下洗涤，得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）制备苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球：取步骤（1）中制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球，加入功能单体和亲水单体，利用紫外光引发聚合或氧化还原引发自由基聚合接枝到丙烯酰胺基硅烷化磁性微球表面，经氮气脱氧后，室温下氧化还原反应，外加磁场作用下洗涤后得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）制备贻贝仿生多肽复合磁珠：取贻贝仿生多肽溶液和步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球加入到PBS（pH=7.2~7.4）缓冲溶液中平板摇床反应后，经磁分离洗涤后制备得到贻贝仿生多肽复合磁珠。
进一步地，本发明步骤（1）中所述的磁性微球为Fe3O4磁性微球或二氧化硅包覆的Fe3O4磁性微球。
本发明步骤（1）中所述的磁性微球、3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯和醇溶液的用量比为40mg：250~750uL：4.5mL。
进一步地，本发明步骤（2）中所述的功能单体为具有苯硼酸基官能团的功能性单体，所述的功能单体为3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）或4-（2-丙烯酰氨基乙基氨基甲酰基）-3-氟苯硼酸（CFPBA）；所述的亲水单体为HEAA、HEMA或HPMA；所述的紫外光引发聚合中光引发剂为2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（HHMP），所述的氧化还原引发自由基聚合中引发剂为过硫酸铵（APS）和N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED）。
具体的，本发明步骤（2）所述苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的一种制备方法为：
分别称取步骤（1）合成的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体和光引发剂溶解于甲醇或N,N’-二甲基甲酰胺（DMF）中，经氮气脱氧20~30min, 高压汞灯150~300W紫外光引发聚合物10~30min，经外加磁场作用下甲醇、水反复清洗次，室温真空干燥后获得苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；所述的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体、光引发剂的用量比为20mg ：20~60mg：213~639mg：2.5~7.5mg；
本发明步骤（2）所述的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的另一种制备方法为：分别称取步骤（1）合成的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体、APS、TEMED溶解于蒸馏水中，经氮气脱氧20~30min，常温摇床反应后，在外加磁场作用下用甲醇、水反复清洗，室温真空干燥获得苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；所述的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体、APS，TEMED、蒸馏水的用量比为20mg ：20~60mg：213~639mg：0.5~2.5mg ：0.5~2.5uL：3~5mL；
进一步地，本发明步骤（3）中所述的贻贝仿生多肽溶液为将合成的贻贝仿生多肽FITC-(DOPA)4-(G)5-RGES、(DOPA)4-(S)5-WxEAAYQrFL或(DOPA)4-(G)5-RGDS溶解于二甲基亚砜，所述的贻贝仿生多肽溶液的浓度为20mg/mL。
步骤（3）中所述的贻贝仿生多肽溶液和苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的质量比为1：4~20。
再一方面，本发明还提供了上述技术方案所述的贻贝仿生多肽复合磁珠或上述技术方案所述的方法制备的贻贝仿生多肽复合磁珠在循环肿瘤细胞的非诊断和治疗目的的富集、分离与纯化中的应用。
具体的，所述应用为将一定量的贻贝仿生多肽复合磁珠加入到待分离循环肿瘤细胞样本中，室温下平板摇床20~60次/分钟震荡30~120min后，在外加磁场作用下获得富集的循环肿瘤细胞，加入20~120mmol/L的单糖溶液震荡10~40min，将贻贝仿生多肽复合磁珠从富集的循环肿瘤细胞表面洗脱，分离得到纯化后高活性、高纯度的循环肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为:
本发明利用苯硼酸与3,4二羟基苯丙氨酸的硼亲和反应将一端含肿瘤细胞特异性识别序列的贻贝仿生多肽固定于苯硼酸基高分子聚合物修饰的磁性微球表面，利用贻贝仿生多肽一端的特异性识别序列，经外加磁场作用，可将循环肿瘤细胞从正常细胞中富集、分离；利用苯硼酸与顺式二醇的可逆共价作用在小分子单糖（葡萄糖/果糖）作用下可对富集的循环肿瘤细胞进行释放；本发明制备的贻贝仿生多肽复合磁珠表面含有大量的羟基官能团，在循环肿瘤细胞溶液中具有良好的分散性以及抗吸附性，不容易发生团聚，有利于提高其抗非特异性吸附，并且接枝贻贝仿生多肽的接枝率高，结合稳定；本发明制备的贻贝仿生多肽复合磁珠具有磁响应性能好、捕获效率高、释放后细胞活性高的特点；本发明的原料简单易得，成本低，制备工艺简单，反应条件温和，不易造成贻贝仿生多肽的变质、降解等，具有较强的实用性。
附图说明
图1为实施例1中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠在光学显微镜下的形貌图；
图2为实施例1中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠在在荧光显微镜下的形貌图；
图3为实施例2的步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球富集的荧光标记MCF-7细胞在荧光显微镜下的荧光图；
图4为实施例2中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠富集的荧光标记MCF-7细胞在荧光显微镜下的荧光图；
图5为实施例3中荧光标记MCF-7细胞从贻贝仿生多肽复合磁珠表面释放脱落后的荧光显微图片；
图6为实施例4的步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球富集荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60在荧光显微镜下的荧光图；
图7为实施例4中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠富集荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60在荧光显微镜下的荧光图；
图8为正常细胞和实施例5中经贻贝仿生多肽复合磁珠富集与释放后的MCF-7细胞在96孔板生长1到5天的光学显微镜形貌图；
图9为实施例6中白细胞和肿瘤细胞的荧光显微镜鉴定结果图；
图10为从模拟肿瘤血液样本中分离循环肿瘤细胞的细胞捕获数量直方图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1
在该实施例中，通过下列步骤制备荧光标记的贻贝仿生多肽复合磁珠；
（1）丙烯酰胺基修饰磁性微球的制备：取40mg二氧化硅包覆的Fe3O4微性微球（市售，粒径3um）和500uL 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯分散于4.5mL甲醇溶液中，37℃下反应12h，外加磁场（116mT）作用下经甲醇、蒸馏水洗涤后制得丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备：取20mg步骤（1）制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球和20mg功能单体CFPBA与312mg亲水单体HEMA以及2.5mg过硫酸铵（APS），0.5uL N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）溶解到3mL蒸馏水中配置成水溶液，经30min氮气脱氧后，室温氧化还原反应12小时，外加磁场（116mT）作用下经乙醇、蒸馏水洗涤得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）荧光标记的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备：取5ul荧光标记贻贝仿生多肽溶液（FITC-(DOPA)4-(G)5-RGES,20mg/mL），100uL步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球(4mg/mL)，加入到745uLPBS（pH=7.2）缓冲溶液中，37℃下搅拌反应12h，经磁分离洗涤得到荧光标记的贻贝仿生多肽复合磁珠。
对上述制备的荧光标记的贻贝仿生多肽复合磁珠进行显微镜检测，得到的光学显微镜下形貌图如图1所示，荧光显微镜下形貌图如图2所示，通过图1和图2可以看到，制备的贻贝仿生多肽复合磁珠分散性较好，粒度均匀，表面接枝荧光标记贻贝仿生多肽，荧光强，亮度均匀，说明贻贝仿生多肽复合磁珠具有良好的接枝能力，接枝密度高，分散性好。
实施例2
在该实施例中，通过下列步骤制备贻贝仿生多肽复合磁珠；
（1）丙烯酰胺基修饰磁性微球的制备：取40mg二氧化硅包覆的Fe3O4微性微球（市售，粒径3um）和250uL 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯分散于4.5mL的乙醇溶液中，37℃下反应24h，外加磁场（116mT）作用下经甲醇、蒸馏水洗涤得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备：取20mg步骤（1）制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球和60mg功能单体AAPBA与639mg亲水单体HEAA以及2.5mg光引发剂2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（HHMP）于3mL 甲醇溶液中，经30min氮气脱氧后，紫外光引发聚合10min，外加磁场（116mT）作用下经甲醇、蒸馏水洗涤得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）贻贝仿生多肽复合磁珠的制备：取5uL订制合成的贻贝仿生多肽溶液（(DOPA)4-(S)5-WxEAAYQrFL，20mg/mL），250uL步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球(4mg/mL)，加入到745uL PBS（pH=7.4）溶液中，37℃下搅拌反应12h，经磁分离洗涤得到贻贝仿生多肽复合磁珠。
将20ug上述制得的贻贝仿生多肽复合磁珠与20ug步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球分别加入到1mL 细胞膜绿色荧光染料DIO预染的乳腺癌细胞系MCF-7细胞样本（104cells/mL，采购自北京协和细胞资源中心）中，室温下经20min摇床震荡（60次/min）捕捉后，在外加磁场（116mT）作用下获得富集的荧光标记MCF-7细胞，重新分散于48孔板中。图3为实施例2的步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球富集的荧光标记MCF-7细胞在荧光显微镜下的荧光图；图4为实施例2中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠富集的荧光标记MCF-7细胞在荧光显微镜下的荧光图；如图3、图4可见，苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球对MCF-7的捕获率明显比贻贝仿生多肽复合磁珠的捕获率低很多，由此可见，制备的贻贝仿生多肽复合磁珠具有较高的特异性捕捉性能。
实施例3
在该实施例中，通过下列步骤制备贻贝仿生多肽复合磁珠；
（1）丙烯酰胺基修饰磁性微球的制备：取40mg二氧化硅包覆的Fe3O4微性球（市售，粒径3um）和500uL 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯分散于4.5mL的甲醇溶液中，37℃下反应18h，外加磁场（116mT）作用下经甲醇、蒸馏水洗涤得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备：取20mg步骤（1）制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球和30mg功能单体CFPBA与213mg亲水单体HPMA以及0.5mg过硫酸铵，2.5uLN,N,N’,N’-四甲基乙二胺溶解到5mL蒸馏水中配置成水溶液，经20min氮气脱氧后，室温氧化还原反应12小时，外加磁场（116mT）作用下经乙醇、蒸馏水洗涤得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）贻贝仿生多肽复合磁珠的制备：取5ul贻贝仿生多肽溶液（(DOPA)4-(S)5-WxEAAYQrFL，20mg/mL），500uL步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球(4mg/mL)，加入到745uL PBS（pH=7.3）溶液中，37℃下搅拌反应12h，经磁分离洗涤得到贻贝仿生多肽复合磁珠。
将20ug上述制得的贻贝仿生多肽复合磁珠加入到1mL 细胞膜绿色荧光染料DIO预染的乳腺癌细胞系MCF-7细胞样本（104cells/mL，采购自北京协和细胞资源中心）中，室温下经120min震荡后，在外加磁场作用下获得富集的荧光标记MCF-7细胞，将富集的荧光标记MCF-7细胞重悬于5mL120mmol/L的果糖溶液中，经10min震荡，富集的荧光标记MCF-7细胞从贻贝仿生多肽复合磁珠表面释放脱落，在外加磁场（116mT）作用下去除贻贝仿生多肽复合磁珠，收集上清液，得到释放的荧光标记MCF-7细胞。
图5是荧光标记MCF-7细胞从贻贝仿生多肽复合磁珠表面释放脱落后的荧光显微图片；如图5所示，绝大多数的荧光标记MCF-7细胞随贻贝仿生多肽层一起从苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球表面脱落，可见，制备的贻贝仿生多肽复合磁珠具有较高的释放效率。
实施例4
在该实施例中，通过下列步骤制备贻贝仿生多肽复合磁珠；
（1）丙烯酰胺基修饰磁性微球的制备：取40mg Fe3O4磁性微球（市售，3um）和500uL3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯(MPTS)分散于4.5mL 甲醇溶液中，37℃下反应12h，磁分离洗涤得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备：取20mg步骤（1）中制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球和40mg功能单体AAPBA与426mg亲水单体HEAA以及5.5mg光引发剂2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（HHMP）配置3mL甲醇溶液，经30min氮气脱氧后，紫外光引发聚合30min，经外加磁场（116mT）磁分离洗涤后得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）贻贝仿生多肽复合磁珠的制备：取25ul贻贝仿生多肽溶液（(DOPA)4-(S)5-WxEAAYQrFL，20mg/mL），1250uL步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球(4mg/mL)，加入到3725uL PBS（pH=7. 4）溶液中，37℃下搅拌反应12h，经外加磁场（116mT）磁分离洗涤得到贻贝仿生多肽复合磁珠；
将100ug上述制备的贻贝仿生多肽复合磁珠与100ug步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球分别加入到1mL 细胞膜红色荧光染料DiI预染的人早幼粒白血病细胞HL60细胞样本（104cells/mL，采购自北京协和细胞资源中心）中，室温下经30min摇床震荡（60次/min）捕捉后，在外加磁场（116mT）作用下富集荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60，将富集的细胞重新分散于48孔板中。
图6为步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球富集荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60在荧光显微镜下的荧光图；图7为制备的贻贝仿生多肽复合磁珠富集荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60在荧光显微镜下的荧光图；由图6、图7可见，步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球和贻贝仿生多肽复合磁珠几乎没有富集到荧光标记后的人早幼粒白血病细胞HL60； 结合实施例2可见，贻贝仿生多肽复合磁珠对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7具有较高的特异性识别能力，而对人早幼粒白血病细胞HL60细胞则不具备特异性识别能力，而有较高的抗非特异性吸附性能，说明贻贝仿生多肽识别序列WxEAAYQrFL对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7具有较高的特异性识别能力，而对于人早幼粒白血病细胞HL60则具有较高的抗非特异性吸附性能。由此可见，制备的贻贝仿生多肽复合磁珠具有较好的特异性选择、识别与分离能力。
实施例5
在该实施例中，通过下列步骤制备贻贝仿生多肽复合磁珠；
（1）丙烯酰胺基修饰磁性微球的制备：取40mg二氧化硅包覆的Fe3O4磁性微球和750uL 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯分散于4.5mL 甲醇溶液中，37℃下反应24h，经外加磁场（116mT）磁分离洗涤得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备：取20mg步骤（1）中制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球和60mg功能单体AAPBA与639mg亲水单体HEAA以及2.5mg光引发剂2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（HHMP）的甲醇溶液，经20min氮气脱氧后，紫外下光照10min，经外加磁场（116mT）磁分离洗涤后得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）贻贝仿生多肽复合磁珠的制备：取25ul贻贝仿生多肽溶液（(DOPA) 4-(G)5-RGDS，20mg/mL），1250uL步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球(4mg/mL)，加入到3725uL PBS（pH=7.4）溶液中，37℃下搅拌反应12h，经外加磁场（116mT）磁分离洗涤得到贻贝仿生多肽复合磁珠；
将500ug上述制备的贻贝仿生多肽复合磁珠加入到5mL乳腺癌细胞系MCF-7细胞样本（104cells/mL，采购自北京协和细胞资源中心）中，室温下经90min摇床震荡（20次/min）捕捉后，在外加磁场(116mT)作用下获得富集的MCF-7细胞，将富集的MCF-7细胞重悬于5mL20mmol/L的葡萄糖溶液中，经30min震荡，富集的MCF-7细胞从贻贝仿生多肽复合磁珠表面释放脱落，经外加磁场作用下，去除贻贝仿生多肽复合磁珠，收集上清液，经离心重悬后，制备104cells/mL的MCF-7细胞悬液，将MCF-7细胞悬液以200uL /孔重新铺板于96孔板内，在37℃，5%CO2环境下于细胞培养箱内培养5天。
图8是经贻贝仿生多肽复合磁珠富集与释放后的MCF-7细胞在96孔板生长的光学显微镜形貌图；如图8所示，经富集与释放循环后的MCF-7细胞仍然具有良好的增殖能力，说明制备的贻贝仿生多肽复合磁珠对细胞基本无损伤，生物活性高，生物相容性好。
实施例6
在该实施例中，模拟循环肿瘤细胞血样的循环肿瘤细胞捕获：
采集健康成人外周血血样2mL（来源于健康志愿者，志愿者均知情同意），所有血样中血常规白细胞值位于2×106~1.2×107cells/mL之间，未出现溶血或血块凝结，志愿者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范；取2mL血样，加入2mL 200cells/mL的MCF-7细胞悬液，得到模拟肿瘤血液样本4mL，分别取1mL血样于1.5mL离心管中，共制备3个样本，对模拟肿瘤血液样本中的CTC进行捕获；具体步骤如下：将实施例5中制备的贻贝仿生多肽复合磁珠加入到模拟肿瘤血液样本中，在室温下经90min摇床震荡（20次/min）捕捉后，在外加磁场(1T)作用下富集并用PBS缓冲液洗涤2~3次。将回收的细胞进行固定，封闭，进行细胞核蓝色荧光标记4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、肿瘤细胞MCF-7膜蛋白绿色荧光标记FITC-CK18染色、白细胞膜蛋白红色荧光标记PE-CD45染色，用荧光显微镜鉴定；图9为白细胞和肿瘤细胞的荧光显微镜鉴定结果图；如图9所示，从左至右依次为经蓝色荧光标记DAPI、红色荧光标记PE-CD45以及绿色荧光标记FITC-CK18的白细胞与肿瘤细胞MCF-7在不同荧光通道下的荧光染色图像，第一行细胞的细胞核呈蓝色荧光，细胞膜表面呈现红色荧光，合并图像中呈现淡紫色，不存在肿瘤细胞膜表面特异性蛋白绿色荧光，说明此细胞为白细胞；第二行细胞的细胞核呈蓝色荧光，细胞膜表面呈现绿色荧光，合并图像中可见蓝色荧光外包覆绿色荧光，而不存在白细胞膜特异性蛋白的红色荧光标记，证明其为肿瘤细胞MCF-7。由此可见，贻贝仿生多肽复合磁珠可在模拟肿瘤血液样本中识别、分离肿瘤细胞MCF-7；对上述模拟肿瘤临床血液样本进行贻贝仿生多肽复合磁珠捕捉测试，并记录3次重复捕捉测试时的细胞捕获数量（个/mL）；图10为从模拟肿瘤血液样本中分离循环肿瘤细胞的细胞捕获数量直方图；如图10所示，经过三次重复捕捉测试，从100cells/mL模拟血样中分别分离出22、23、25个MCF-7细胞。说明贻贝仿生多肽复合磁珠对从血液样本中直接分离肿瘤细胞重复性高，具有可行性。如果对血液样本进行前处理，将血样经红细胞裂解液处理，除去红细胞的干扰因素，本发明贻贝仿生多肽复合磁珠对肿瘤细胞的捕获量将大大提高。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据以上说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种贻贝仿生多肽复合磁珠，其特征在于，所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的内核为磁性微球，其内核外依次包覆丙烯酰胺基硅烷化层、苯硼酸基高分子聚合物层、贻贝仿生多肽层；所述的贻贝仿生多肽层通过贻贝仿生多肽链的3,4二羟基苯丙氨酸与苯硼酸基高分子聚合物层中的苯硼酸进行动态共价反应固定到苯硼酸基高分子聚合物层表面；所述苯硼酸基高分子聚合物层利用紫外光引发聚合或氧化还原引发自由基聚合接枝到丙烯酰氨基硅烷化层表面。
2.根据权利要求1所述的贻贝仿生多肽复合磁珠，其特征在于，所述的贻贝仿多肽链具体包括链结合段(DOPA)n、链增长段(Y)m以及链识别段X。
3.根据权利要求2所述的贻贝仿生多肽复合磁珠，其特征在于，所述的链结合段(DOPA)n的3，4二羟基苯丙氨酸与苯硼酸发生动态共价反应，链长1≤n≤6；所述链增长段(Y)m中Y为色氨酸S、甘氨酸G或其组合，链长1≤m≤6；所述链识别段X，包括RGE、RGD、WxEAAYQrFL及对肿瘤细胞具有特异性识别功能的多肽序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备丙烯酰胺基磁性微球：将磁性微球和3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯溶于醇溶液中，摇床反应完成后在外加磁场作用下洗涤，得到丙烯酰胺基修饰磁性微球；
（2）制备苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球：取步骤（1）中制备的丙烯酰胺基修饰磁性微球，加入功能单体和亲水单体，利用紫外光引发聚合或氧化还原引发自由基聚合接枝到丙烯酰胺基硅烷化磁性微球表面，经氮气脱氧后，室温下氧化还原反应，外加磁场作用下洗涤后得到苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；
（3）制备贻贝仿生多肽复合磁珠：取贻贝仿生多肽溶液和步骤（2）中制备的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球加入到PBS缓冲溶液中，平板摇床反应后经磁分离洗涤后制备得到贻贝仿生多肽复合磁珠。
5.根据权利要求4所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的磁性微球、3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯和醇溶液的用量比为40mg：250~750uL：4.5mL。
6.根据权利要求4所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的功能单体为3-丙烯酰胺基苯硼酸或4-（2-丙烯酰氨基乙基氨基甲酰基）-3-氟苯硼酸；所述的亲水单体为HEAA、HEMA或HPMA；所述的紫外光引发聚合中光引发剂为2-羟基-4'-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮，所述的氧化还原引发自由基聚合中引发剂为过硫酸铵和N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺。
7.根据权利要求4所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于， 步骤（2）所述的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备方法为称取步骤（1）合成的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体和光引发剂溶解于甲醇或N,N’-二甲基甲酰胺中，经氮气脱氧后高压汞灯150~300W紫外光引发聚合物10~30min，经外加磁场作用下甲醇、水反复清洗，室温真空干燥后获得苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；所述的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体和光引发剂的用量比为20mg ：20~60mg：213~639mg：2.5~7.5mg。
8.根据权利要求4所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于， 步骤（2）所述的苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的制备方法为称取步骤（1）合成的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体、APS、TEMED溶解于蒸馏水中，氮气脱氧、常温摇床反应后，在外加磁场作用下用甲醇、水反复清洗，室温真空干燥获得苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球；所述的丙烯酰胺基修饰磁性微球、功能单体、亲水单体、APS，TEMED、蒸馏水的用量比为20mg ：20~60mg：213~639mg：0.5~2.5mg ：0.5~2.5uL：3~5mL。
9.根据权利要求4所述的贻贝仿生多肽复合磁珠的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的贻贝仿生多肽溶液为将合成的贻贝仿生多肽FITC-(DOPA)4-(G) 4-GRGES、(DOPA) 4-(S) 4-WxEAAYQrFL或(DOPA) 4-(G)4-GRGDS溶解于二甲基亚砜，所述的贻贝仿生多肽溶液的浓度为20mg/mL；所述的贻贝仿生多肽溶液和苯硼酸基高分子聚合物修饰磁性微球的质量比为1：4~20。
10.根据权利要求1-3任一项所述的贻贝仿生多肽复合磁珠在循环肿瘤细胞的非诊断和治疗目的的富集、分离与纯化中的应用，其特征在于，将一定量的贻贝仿生多肽复合磁珠加入到待分离的循环肿瘤细胞样本中，室温下震荡后，在外加磁场作用下获得富集的循环肿瘤细胞，加入20~120mmol/L的果糖或葡萄糖溶液震荡，将贻贝仿生多肽复合磁珠从富集的循环肿瘤细胞表面洗脱，得分离后纯化的循环肿瘤细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234718B (zh) * 2021-05-15 2023-01-06 上海墨卓生物科技有限公司 一种用于单细胞测序的具有寡核苷酸序列的双层微球
CN113293615B (zh) * 2021-05-24 2022-02-15 西南交通大学 用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011025158A2 (ko) * 2009-08-25 2011-03-03 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트
CN103180364A (zh) * 2010-12-29 2013-06-26 韩华石油化学株式会社 利用模拟贻贝粘附蛋白的聚合物将纳米颗粒分散到水性介质中的生物相容剂
CN108395483A (zh) * 2018-02-13 2018-08-14 天津大学 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用
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KR101384746B1 (ko) * 2011-08-24 2014-04-14 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질을 이용한 다양한 기능성 생체분자의 표면 고정화

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011025158A2 (ko) * 2009-08-25 2011-03-03 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트
CN103180364A (zh) * 2010-12-29 2013-06-26 韩华石油化学株式会社 利用模拟贻贝粘附蛋白的聚合物将纳米颗粒分散到水性介质中的生物相容剂
CN108395483A (zh) * 2018-02-13 2018-08-14 天津大学 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用
CN109225084A (zh) * 2018-10-18 2019-01-18 郑州安图生物工程股份有限公司 能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法

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