CN113293615B - 用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途，其中纤维膜的制备方法为：先制备聚合物纤维膜基体，然后在该聚合物纤维膜基体上先后接枝聚2‑甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和富羧基聚合物，以形成具有双层高分子刷的纤维膜，接着在富羧基聚合物基团上连接光敏分子，最后固定3‑氨基苯硼酸得到功能纤维膜，其中光敏分子具有在光照下发生顺反异构转变的性质，当其发生构象转变时使APBA基团脱离纤维膜。制得的纤维膜具有仿细胞外基质的纤维结构和类细胞膜的磷脂双分子层结构，易于使循环肿瘤细胞捕获，并具有光敏特性，能实现循环肿瘤细胞的高效率和高纯度捕获以及高活力释放。

Description

用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法、纤维膜及用途
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及纤维膜材料及其用途，具体涉及一种功能纤维膜的制备方法、纤维膜、用途及富集循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
据报道，90％以上癌症患者的死亡是由肿瘤转移引起的，肿瘤转移是一个非常复杂的过程，部分肿瘤细胞从原发恶性肿瘤病灶脱落，通过淋巴系统侵袭周围组织或进入血液循环系统向远端器官转移，这些细胞被称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)。CTCs不仅可以提供肿瘤病灶的基因组变化信息，还能从细胞形态、迁徙能力、药物刺激响应等方面为肿瘤的转移机制研究提供基础。研究证明CTCs可以用于癌症的早期诊断，目前已在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌等多种癌症中发现CTCs。以CTCs为靶标的检测是一种微创检测，只需要通过简单的抽血检测，而不需要通过痛苦的侵入性检查就可实现快速、动态地监测癌症患者病程，这一检测方法的使用有望及早发现癌症以便于早期诊疗，提高癌症患者的生存率。由于针对CTCs的检测不仅要进行细胞计数，还需要进行后续鉴别和研究，因此应当对CTCs细胞进行捕获和释放。
血液中CTCs的检测和研究主要面临三个方面的挑战：一是CTCs在血液中浓度很低，尤其在癌症的早期阶段，每毫升血液中可能只有1个CTC，难以检测和捕获，现有各种方法的捕获效率低，这是限制针对CTCs的检测方法在临床检测和应用中的重要原因之一；二是由于血液样品中各种蛋白和血细胞的存在，捕获CTCs的纯度较低；三是为了将捕获后的CTCs用于下游其它研究时，CTCs还应当被释放，目前发展的CTCs释放主要有酶解、温控、化学竞争和温控释放，上述方法在释放过程中都难以避免地对细胞造成一定的损伤。此外，同一种肿瘤在转移过程中，CTCs可能会经历上皮-间质转化，在此过程中CTCs表面的上皮粘附分子(EpCAM)和人表皮生长因子(HER2)表达水平降低或者消失，不同肿瘤的CTCs也存在异质性，这进一步增加其检测和应用的难度。
目前已有一些文献报道利用微纳米材料的较大比表面积，在其表面接枝促细胞黏附的功能分子以提高对CTCs捕获能力的研究。然而，捕获效率低、纯度低和释放活性低的问题仍然存在，并且实际应用时还存在捕获和释放操作不便的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法。
其技术方案如下：
一种功能纤维膜的制备方法，其关键在于按以下步骤进行：
S1：制备聚合物纤维膜基体；
S2：在所述聚合物纤维膜基体上接枝聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)，以形成具有第一层高分子刷的纤维膜；
S3：在所述步骤S2所得纤维膜的PMPC基团上接枝富羧基聚合物，所述富羧基聚合物的分子链上具有至少一个羧基，以形成具有第二层高分子刷的纤维膜；
S4：在所述步骤S3所得纤维膜的富羧基聚合物基团上连接光敏分子，以形成光敏基团修饰的纤维膜；
S5：在所述步骤S4所得纤维膜的光敏基团上连接3-氨基苯硼酸(APBA)，得到所述功能纤维膜；
所述光敏分子具有在光照下发生顺反异构转变的性质，所述光敏基团发生构象转变时使APBA基团脱离纤维膜。
富羧基聚合物的主要作用在于为后续APBA的固定提供大量羧基作为反应活性位点。
作为优选，上述富羧基聚合物为聚甲基丙烯酸(PMAA)；
所述光敏分子为四甲氧基偶氮苯(mAzo)和羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)的络合物。当mAzo发生顺反构像变化时，mAzo与CM-β-CD之间的络合连接被破坏，CM-β-CD将从mAzo基团上脱落。
作为优选，上述聚合物纤维膜基体为静电纺丝聚己内酯纤维膜。
作为优选，上述静电纺丝聚己内酯纤维膜的纤维直径在几个微米以下，优选为几十到几百纳米。
作为优选，上述步骤S2具体包括以下过程：
S21：将洁净的所述静电纺丝聚己内酯纤维膜进行氨解反应，得到氨解PCL纤维膜，记作PCL-NH2纤维膜；
S22：将所述PCL-NH2纤维膜进行溴代反应，得到溴代的PCL纤维膜，记作PCL-Br纤维膜；
S23：在氧化剂、还原剂和配体组成的催化体系下，所述PCL-Br纤维膜与MPC单体溶液通过表面原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在所述PCL-Br纤维膜上接枝PMPC高分子刷，得到所述具有第一层高分子刷的纤维膜，记作PCL-PMPC纤维膜，然后清洗、干燥备用。
作为优选，上述步骤S3具体为：在氧化剂、还原剂和配体组成的催化体系下，所述PCL-PMPC纤维膜与MAA单体溶液通过表面原子转移自由基聚合反应，在所述PCL-PMPC纤维膜上接枝PMAA高分子刷，得到所述具有第二层高分子刷的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA纤维膜，然后清洗、干燥备用。
作为优选，上述步骤S4具体包括：
S41：取PCL-PMPC-PMAA纤维膜，浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的PBS溶液中振荡反应进行活化；
接着将活化后的PCL-PMPC-PMAA纤维膜浸泡在mAzo饱和溶液中，继续振荡反应，得到mAzo修饰的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜，然后清洗、干燥备用；
S42：将所述PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜浸泡在0.2mg/mL的CM-β-CD的水溶液中振荡反应，得到与CM-β-CD结合的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜。
作为优选，上述PCL-PMPC-PMAA纤维膜进行活化反应时EDC浓度为0.1M，NHS浓度为0.2M，PBS溶液pH＝6，活化反应时间为1h；
活化后的PCL-PMPC-PMAA纤维膜浸泡在mAzo饱和溶液中反应时间为12h；
步骤S42中振荡反应时间为12h。
作为优选，上述步骤S5具体为：取所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜，先用乙醇胺封闭PMAA基团上未与mAzo反应的羧基，然后将所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸入EDC/NHS的PBS溶液中振荡反应进行活化；
接着将活化后的所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸泡在10mg/mL的APBA溶液中，振荡反应得到APBA修饰的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA。
作为优选，上述EDC/NHS溶液中EDC浓度为0.1M，NHS浓度为0.2M，PBS溶液pH＝6；
活化后的所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸泡在APBA溶液中反应时间为12h。
本发明的目的之二在于提供一种由上述制备方法制得的纤维膜。
本发明的目的之三在于提供一种上述纤维膜在循环肿瘤细胞的捕获和释放中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种富集循环肿瘤细胞的方法。其技术方案为：
一种富集循环肿瘤细胞的方法，其关键在于包括，将含有循环肿瘤细胞的样品与上述的纤维膜共孵育90min以上，以使循环肿瘤细胞被所述纤维膜捕获。所述共孵育90min优选为90min。
作为优选，上述方法还包括，将捕获有循环肿瘤细胞的纤维膜转移至等渗溶液中，于620nm红光下照射10min以上，以使捕获在纤维膜上的循环肿瘤细胞被释放。等渗溶液为能维持细胞正常渗透压的溶液,可以是PBS溶液、生理盐水或细胞培养基等。红光照射后，CM-β-CD从mAzo基团上脱落，使得与CM-β-CD连接的APBA基团随之脱落，而循环肿瘤细胞通过与APBA之间的特异性作用被捕获在纤维膜上，APBA脱离纤维膜后，肿瘤细胞也随之从纤维膜上释放。
附图说明
图1为mAzo及其合成原材料的FTIR图谱，其中：a为mAzo，b为3,5-二甲氧基苯胺，c为2,6-二甲氧基苯胺；
图2为mAzo溶解在DMSO溶液中的光吸收图谱，说明在620nm的红光照射后其由反式(trans mAzo-NH2)转变为顺式(cis mAzo-NH2)；
图3为PCL纤维膜表面接枝两层高分子刷的过程示意图；
图4为PCL-PMPC-PMAA纤维膜的SEM图片和纤维直径分布图；
图5为纤维膜基体及接枝改性后纤维膜的XPS谱图，各组分别为：(a)PCL纤维膜的XPS谱图；(b)PCL-PMPC纤维膜的XPS谱图；(c)PCL-PMPC-PMAA纤维膜的XPS谱图；(d)PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜的XPS谱图；(e)PCL-PMC-PMAA-Azo-CD纤维膜的XPS谱图；(f)PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜的XPS谱图；
图6为PCL纤维膜及不同改性的纤维膜水润湿性测试结果，各组分别为：(a)PCL纤维膜，(b)PCL-NH2纤维膜，c)PCL-Br纤维膜，d)PCL-PMPC纤维膜，e)PCL-PMPC-PMAA纤维膜，f)PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜，g)PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜，h)PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜；柱状图代表平均接触角，柱子上方的插图分别为各组水浸润效果图片；
图7为HeLa细胞分别与(a)PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜和(b)PCL纤维膜共孵育后捕获效率随孵育时间变化关系；
图8为不同细胞浓度的细胞悬浮液与PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜共孵育后的Hela细胞捕获效率；
图9为被捕获在纤维膜上的HeLa细胞经不同时间红光照射后的释放效率；
图10为未经红光照射和红光照射10min后HeLa细胞的存活率；
图11为不同细胞浓度的模拟血液样本与PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜共孵育后，样本中HeLa细胞的捕获效率。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
(一)四甲氧基偶氮苯(mAzo)的制备和表征
原料均为市售化学纯产品。配置质量分数为21％的稀盐酸，再称取2,6-二甲氧基苯胺(1.54g,10mmol)溶于以上稀盐酸，再将溶液冷却至0-5℃，在6.67mL RO水中缓慢加入亚硝酸钠(0.69g，10mmol)并搅拌20min，温度仍然保持在0-5℃，形成重氮盐溶液。然后将上述重氮盐溶液缓慢加入混有3,5-二甲氧基苯胺(1.54g,10mmol)的20mL冰水混合物悬浮液中，接着向其中缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8-9，搅拌过夜。以体积比为1:4的甲醇/乙酸乙酯为洗脱液，用色谱法对粗产物进行过滤纯化，得到产物mAzo。
分别取原料3,5-二甲氧基苯胺、2,6-二甲氧基苯胺和产物，参照常规方法进行傅立叶变换红外吸收光谱(FTIR)分析。如图1，两种原料和产物在3410cm-1处均有氨基峰，而产物在1764cm-1处出现了有别于原料的氮氮双键的特征峰，表明产物成功制备。
将制得的mAzo溶解在DMSO溶液中配制为0.08mg/mL的mAzo溶液，使用紫外-可见光分光光度计(UV-vis)测试mAzo溶液的光吸收特性。然后使用LED红光光源(620nm)照射一段时间后，再次测试其光吸收特性。红光照射前和照射后的光吸收图谱如图2所示，可以看到两个光吸收图谱特征峰发生明显改变，经与报道的顺式mAzo和反式mAzo的吸收谱比对，确认在620nm红光照射后，反式mAzo的构象发生转变，变为顺式mAzo，进一步确认了产物的成功制备及其光敏活性。
实施例2
(二)功能纤维膜的制备
一种用于富集循环肿瘤细胞的功能纤维膜的制备方法，步骤为：
S1，聚合物纤维膜基体制备：
配置质量分数为20％的聚己内酯(PCL)溶液(Mn＝80000)，采用静电纺丝法制备静电纺丝纤维膜，电纺丝参数如下：微流控泵控制的流速为0.5mL/h，电压15.5kv，调节针头与接收装置间距离为25cm，环境温度25℃，湿度80％。干燥后备用。取制得的PCL纤维膜样品经扫描电子显微镜(SEM)观测并采集照片，经图像处理软件测得纤维直径为250±50nm。
S2，PCL-PMPC纤维膜制备：
取上述步骤S1制备的PCL纤维膜，裁剪成直径为16mm的圆形薄膜，用体积比为1:1的乙醇/水混合液清洗，室温干燥3-4h备用。配制好60mg/mL的1,6-己二胺/2-丙醇溶液，保存在圆底烧瓶中备用。接着将干燥好的PCL纤维膜在配制好的1,6-己二胺/2-丙醇溶液中反应2h，即得到氨解的PCL纤维膜(PCL-NH2)，使用体积比为1:1的甲醇/水混合液反复清洗3次，真空干燥箱中干燥备用。
然后将上述PCL-NH2纤维膜置于40mL的正己烷溶液中，加入2-溴异丁酰溴(BIBB)和三乙胺各2mL混合均匀，在氮气气氛保护下于0℃反应2h，之后在室温下继续反应22h，即产生溴代的PCL纤维膜(PCL-Br)。反应完成后，使用体积比为1:2的甲醇/水混合液反复清洗3次，并在真空干燥箱中干燥备用。
接着，称取16mg溴化铜(CuBr2)和60mg 2,2-联吡啶(bpy)溶于50mL去离子水(RO水)中，放置在4℃冰箱备用。配制浓度为300mM的单体MPC的溶液用于第一层高分子刷的合成。具体步骤如下：称取0.885g MPC溶于5mL RO水中，搅拌20min，使得单体与水混合均匀，再加入1mL上述配制好的bpy和CuBr2混合溶液，同时将4mL浓度为3mM的抗坏血酸加入上述混合溶液，搅拌10min混合均匀，最后将混合好的溶液与前述PCL-Br纤维膜反应6-7h，即得到接枝了第一层高分子刷的纤维膜，即PCL-PMPC纤维膜，使用RO水反复清洗3次，真空干燥箱中干燥备用。
S3，PCL-PMPC纤维膜制备：
称取16mg CuBr2和60mg bpy溶于50mL RO水中，放置在4℃冰箱备用。以RO水为溶剂，配制10mL 315mM单体MAA的溶液，搅拌20min使得单体与水混合均匀，再加入1mL配制的bpy和CuBr2混合液，混合均匀，同时加入浓度3mM的2mL抗坏血酸,最后将混合溶液与PCL-PMPC纤维膜反应3h，得到双层高分子刷PMPC和PMAA修饰的PCL纤维膜，即PCL-PMPC-PMAA纤维膜，最后用RO水反复清洗，真空干燥箱中干燥备用。
S4，光敏基团修饰的纤维膜制备：
取PCL-PMPC-PMAA纤维膜，室温下浸入0.1M EDC和0.2M NHS的PBS缓冲溶液(pH＝6)中，在摇床上振荡反应1h，以对PCL-PMPC-PMAA纤维膜的PMAA分子链上羧基进行活化，在此期间取实施例1制备的mAzo配制饱和mAzo水溶液,将活化后的PCL-PMPC-PMAA纤维膜浸泡在mAzo的饱和溶液中，摇床振荡反应12h得到mAzo修饰的纤维膜，即PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜，以RO水反复冲洗干净，真空干燥箱中干燥备用。
再将PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜浸泡在0.2mg/mL CM-β-CD的水溶液中，置于摇床上振荡反应12h，得到与CM-β-CD结合的纤维膜，即PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜，以RO水反复清洗干燥，真空干燥箱中干燥备用。
S5，APBA修饰的纤维膜制备：
在固定APBA之前先用1M乙醇胺封闭PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜上的聚甲基丙烯酸基团中未与mAzo反应的羧基。再将PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜于室温下浸泡在0.1MEDC和0.2M NHS的PBS缓冲溶液(pH＝6)中，置于摇床上振荡反应1h。将活化后的PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸泡在10mg/mL的APBA溶液中，摇床振荡反应12h得到APBA修饰的纤维膜，即PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜，以RO水反复清洗，真空干燥箱中干燥备用。
PCL纤维膜表面接枝两层高分子刷的过程如图3所示意。纤维膜表面PMPC和PMAA两层分子刷的接枝依靠表面原子转移自由基聚合反应进行，接着PMAA分子链上的羧基被活化，从而与mAzo发生酯化反应，mAzo基团与CM-β-CD之间发生络合反应以将CM-β-CD固定，最后CM-β-CD基团与APBA发生酯化反应，从而将APBA固定。
(三)功能纤维膜的表征
参照现有方法，通过SEM表征PCL纤维膜、PCL-PMPC纤维膜和PCL-PMPC-PMAA纤维膜的形貌，发现纤维形貌始终保持规整。如图4，根据PCL-PMPC-PMAA纤维膜的SEM照片，使用图像处理软件统计得到纤维直径为275±50nm。
参照现有方法，通过X射线光电子能谱(XPS)分析法，取每一步改性后的纤维膜样品进行分析。如图5，最终制得的PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜样品XPS谱图中有B1s的特征峰出现，证明APBA的成功固定。
参照现有方法，研究表面接枝改性对纤维膜表面亲疏水性的影响，使用水接触角(WCA)测试法进行研究。如图6，可以看到PCL纤维膜呈现出明显疏水性，氨解改性和溴代改性后，纤维膜的接触角略有减小，但仍然表现为疏水性。接枝高分子刷后，纤维膜的接触角显著减小，PCL-PMPC纤维膜、PCL-PMPC-PMAA纤维膜、PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜、PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜以及PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜的接触角均为30°度左右，证明了高分子刷接枝改性的成功，也说明接枝高分子刷的纤维膜基底材料浸润性的改变，表现出良好的亲水性。
纤维膜具有较强的亲水性，液体易于浸润，在与待检测的液体样品共孵育时容易被浸润，操作方便，同时高度的亲水性又能够降低非特异性粘附。
实施例3
(四)细胞捕获实验
(1)不同孵育时间、不同细胞浓度对捕获效率的影响
取正常增殖的HeLa细胞，配置成细胞浓度为1×105个/mL的细胞悬浮液备用。将PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜剪裁为与细胞培养板孔底部面积相同的纤维膜样品，平铺在培养板孔底。取1mL细胞悬浮液与PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜和PCL纤维膜分别共孵育，设定孵育时间分别为10min、20min、30min、60min、90min、120min和180min，每个时间点至少准备3个平行样品。达到预定孵育时间后，取出对应的样品，先用PBS轻轻的润洗样品3次，再用2.5％的戊二醛溶液固定样品1h，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色15min。染色完成后用倒置荧光显微镜对样品拍照观察。每个样品至少随机采集不同视野的10张照片，并用ImageJ软件对图像进行处理分析，统计出捕获到的细胞的平均数目。按照统计出的细胞平均数目(Nactual)和每张图片显示的面积(Aimage)，计算出样品捕获的实际密度(Dactual)，然后根据每个孔加入的细胞的总数目(Ntotal)和细胞培养板的孔的面积(Awell)计算出理论的细胞密度(D)，通过如下式(1)计算捕获效率。
捕获效率＝Dactual/D＝(Nactual/Aimage)/(Ntotal/Awell)×100％ (1)
探究孵育时间对捕获效率的影响，如图7所示，可以看出随着孵育时间的延长，两种纤维膜对HeLa细胞的捕获效率逐渐升高，在孵育时间达到90min之后，对Hela细胞的捕获效率基本趋于平稳，PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜的捕获效率达到87.5±4.6％，PCL纤维膜捕获效率为58.8％，表明接枝改性大幅提高了纤维膜的捕获效率。
将细胞浓度为1×105个/mL的Hela细胞悬浮液稀释为不同梯度浓度的细胞悬液，分别取细胞浓度为1×102个/mL、1×103个/mL、1×104个/mL、5×104个/mL的细胞悬浮液与PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜样品共孵育90min之后，按照式(1)计算不同细胞浓度液体样品的细胞捕获效率。如图8所示，各组细胞捕获效率均在80％以上。
(2)被捕获细胞释放效率
与浓度为1×105个/mL的细胞悬浮液共孵育后，将捕获了HeLa细胞的PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA纤维膜样品在LED(620nm的红光)光源系统下分别照射5min、10min、20min和30min，每个时间点至少准备3个平行样品。用PBS轻轻的润洗样品3次，之后用2.5％的戊二醛固定样品1h，最后用DAPI对细胞核染色约15min。染色完成后用倒置荧光显微镜对样品进行观察。每个样品至少随机采集10张照片，并用ImageJ对图像进行处理分析，统计出释放后的样品表面残留细胞的平均数目。捕获到的细胞平均数目与未释放细胞的平均数目差值即为释放细胞平均数目，释放细胞平均数目与捕获细胞平均数目之比即为释放效率。如图9，在10min以内，随着红光照射时间的延长，释放效率逐渐增加，10min后释放效率趋于稳定，约为94.1％，超过10min之后随着光照时间延长释放效率不再增加。
(3)被释放细胞的活力
将培养板上未经红光照射(Control)的Hela细胞和捕获在纤维膜上经红光照射10min后释放的Hela细胞(After release)进行细胞活死染色。两组的荧光图几乎没有差异，都只有极其少量的死细胞。两组细胞继续增殖培养，并在培养4h、24h、48h后进行细胞活死染色，根据荧光图分别统计细胞存活率。如图10所示，红光照射后继续培养48h细胞存活率为93.6±3.6％，而未经红光照射的对照组细胞存活率为93.9±2.5％，证明620nm的红光用于CTCs的释放能够保证细胞的高活性。
(4)模拟血液样本中癌细胞的捕获
为了进一步贴近临床实验，按照抗凝剂(CPDA-1)使用标准，抗凝剂与血液按体积比1：9的比例收集健康志愿者的新鲜血液，裂解血液中的红细胞，用10mL PBS重悬。再加入Hela细胞，配制成含有不同浓度癌细胞(CTCs)的模拟血液样本，细胞浓度分别为100个/mL、500个/mL、1000个/mL、2000个/mL和3000个/mL。采用如4.1中描述的方法进行细胞捕获试验，计算捕获效率。如图11，当模拟血液样本中癌细胞浓度为100个/mL时，可以捕获到84±4个，表明本发明的功能纤维膜具有较高检测灵敏性。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)利用纤维膜具有较大的比表面积、模仿细胞外基质(ECM)的能力、制备简单等优点，以其为基体来捕获CTCs细胞，能够为细胞提供良好的吸附微环境；
(2)具体使用的PCL材料已被证实具有良好的生物相容性，安全可靠，并且易于进行表面改性；
(3)纤维表面接枝的PMPC高分子刷具有与细胞膜相似的结构，能有效保护和维持各种细胞的生理活动，具有极好的血液相容性，是与蛋白质和细胞等生物成分进行相互作用的极佳表面，能够有效减少各种蛋白质和细胞的非特异性吸附，使得本发明的纤维膜用于血液样品中CTCs捕获时，能有效提高捕获纯度；
(4)纤维膜表面接枝PMAA，能够提供大量羧基用于固定与细胞粘附相关的功能基团，为纤维膜与CTCs细胞的接触提供大量结合位点，并提高纤维亲水性；
(5)纤维膜表面经3-氨基苯硼酸修饰，提高了对CTCs细胞的特异性捕获性能；
(6)使用光敏分子作为偶联剂来固定3-氨基苯硼酸，充分利用其光敏感特性，易于实现被捕获细胞的释放；
(7)具体使用的四甲氧基偶氮苯和羧甲基-β-环糊精的络合物作为光敏分子，其对620nm的红光敏感，该波段红光具有生物友好性、能量低、健康风险小和穿透性强的特点，该光照条件下对细胞活性无影响，能够实现被捕获细胞的高活性释放。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
S1：制备聚合物纤维膜基体；
S2：在所述聚合物纤维膜基体上接枝聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)，以形成具有第一层高分子刷的纤维膜；
S3：在所述步骤S2所得纤维膜的PMPC基团上接枝富羧基聚合物，所述富羧基聚合物的分子链上具有至少一个羧基，以形成具有第二层高分子刷的纤维膜；
S4：在所述步骤S3所得纤维膜的富羧基聚合物基团上连接光敏分子，以形成光敏基团修饰的纤维膜；
S5：在所述步骤S4所得纤维膜的光敏基团上连接3-氨基苯硼酸(APBA)，得到所述功能纤维膜；
所述光敏分子具有在光照下发生顺反异构转变的性质，所述光敏基团发生构象转变时使APBA基团脱离纤维膜。
2.根据权利要求1所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于：所述富羧基聚合物为聚甲基丙烯酸(PMAA)；
所述光敏分子为四甲氧基偶氮苯(mAzo)和羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)的络合物。
3.根据权利要求2所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于：所述聚合物纤维膜基体为静电纺丝聚己内酯纤维膜。
4.根据权利要求3所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于所述步骤S2具体包括以下过程：
S21：将洁净的所述静电纺丝聚己内酯纤维膜进行氨解反应，得到氨解PCL纤维膜，记作PCL-NH2纤维膜；
S22：将所述PCL-NH2纤维膜进行溴代反应，得到溴代的PCL纤维膜，记作PCL-Br纤维膜；
S23：在氧化剂、还原剂和配体组成的催化体系下，所述PCL-Br纤维膜与MPC单体溶液通过表面原子转移自由基聚合反应，在所述PCL-Br纤维膜上接枝PMPC高分子刷，得到所述具有第一层高分子刷的纤维膜，记作PCL-PMPC纤维膜，然后清洗、干燥备用。
5.根据权利要求4所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于所述步骤S3具体为：在氧化剂、还原剂和配体组成的催化体系下，所述PCL-PMPC纤维膜与MAA单体溶液通过表面原子转移自由基聚合反应，在所述PCL-PMPC纤维膜上接枝PMAA高分子刷，得到所述具有第二层高分子刷的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA纤维膜，然后清洗、干燥备用。
6.根据权利要求5所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于所述步骤S4具体包括：
S41：取PCL-PMPC-PMAA纤维膜，浸入EDC/NHS的PBS溶液中振荡反应进行活化；
接着将活化后的PCL-PMPC-PMAA纤维膜浸泡在mAzo饱和水溶液中，继续振荡反应，得到mAzo修饰的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜，然后清洗、干燥备用；
S42：将所述PCL-PMPC-PMAA-Azo纤维膜浸泡在0.2mg/mL的CM-β-CD的水溶液中振荡反应，得到与CM-β-CD结合的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜。
7.根据权利要求6所述的用于富集循环肿瘤细胞的纤维膜制备方法，其特征在于所述步骤S5具体为：取所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜，先用乙醇胺封闭PMAA基团上未与mAzo反应的羧基，然后将所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸入EDC/NHS的PBS溶液中振荡反应进行活化；
接着将活化后的所述PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD纤维膜浸泡在10mg/mL的APBA溶液中，振荡反应得到APBA修饰的纤维膜，记作PCL-PMPC-PMAA-Azo-CD-APBA。
8.一种纤维膜，其特征在于采用如权利要求1～7任意一项所述方法制备得到。
9.如权利要求8所述的纤维膜在循环肿瘤细胞的捕获和释放中的应用。
10.一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于包括：将含有循环肿瘤细胞的样品与权利要求8所述的纤维膜共孵育90min以上，以使循环肿瘤细胞被所述纤维膜捕获。
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