CN114058038B - 一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：将半胱氨酸和邻硝基苄基小分子缩合改性多糖和丙烯酸改性明胶、过氧化氢和1‑乙基‑(3‑二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐于PBS缓冲液中混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于20～35℃下静置反应12～48h，形成多糖‑明胶初步交联的水凝胶前体溶液；混合液A中改性多糖、丙烯酸基改性明胶、过氧化氢、1‑乙基‑(3‑二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数分别为(1～3％)、(3％～8％)、(0.2％～0.8％)、(0.05％～0.2％)；将初步交联的水凝胶前体溶液于波长260～430nm光照条件下交联反应得到所述水凝胶材料，成胶速度快、凝胶力学强度，可用于动脉等快速止血。

Description

一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法
技术领域
本发明属于属于医学止血材料技术领域，具体涉及一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法。
背景技术
创伤手术医疗领域不可控制的出血是致死率最高的主要因素。造成无法有效止血主要原因是：主动脉破裂的修复和心脏穿透伤的缝合止血是极高难度的手术挑战，然而，这在外科手术单元之外是无法操作的，有很大的局限性。随着材料科学的最新进展，许多实验化学试剂已被测试用于快速伤口密封，例如纤维蛋白胶，明胶，胶原，氧化纤维素，沸石，肽，聚合物和水凝胶，然而，虽然出现了一些适用于主动脉和心脏创伤的止血和密封的材料，但大多止血性能低，止血速度慢，湿组织表面粘连差，粘接力弱或不灵活甚至在生物组织难降解产生有毒物质难以应用。
随着现代医学的发展以及大众消费水平的提高，医用止血材料正逐渐成为材料和探学领域研究的热点。医用止血材料是一类可以对病患伤口进行快速凝血作用的材料，因为出血是大多数普通创伤后的主要并发症，出血过多会不可避免的引起机体的休克，如果无法及时止血则最终导致个体的死亡，因此受伤后能够及时止血的话对挽救生命从而进一步保证病人健康具有重要意义。水凝胶是一类高度含水的具有三维网络交联结构的聚合物材料，由于其具有优异的生物相容性及一定的机械强度，可以高度拟合生物组织的微环境，因此，水凝胶类材料是很有发展前景的一类医用止血材料。
本发明得到的水凝胶材料具有极好的界面粘合作用力、止血速度、组织相容性及促进伤口愈合能力，解决了医用组织胶水在动态、湿性、大出血组织界面处的止血和封闭问题，与此同时降低了生物毒性，易在伤口愈合后降解成为体内的营养分子被体内吸收或者排除体内，具有光明应用前景。
发明内容
本发明解决的技术问题为：提供一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，得到的水凝胶材料的成胶速度快、凝胶力学强度，可实现快速封堵和长效抵抗流体冲击，可用于动脉等快速止血。
本发明提供的具体解决方案如下：
本发明提供了一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、将半胱氨酸和邻硝基苄基小分子缩合改性多糖和丙烯酸基改性明胶、过氧化氢和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐于PBS缓冲液中混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于20～35℃下静置反应12～48h，形成多糖-明胶初步交联的水凝胶前体溶液；所述邻硝基苄基小分子含有羟基基团、疏基基团或胺基基团，所述混合液A中改性多糖、丙烯酸基改性明胶、过氧化氢、1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数分别为(1～3％)、(3％～8％)、(0.2％～0.8％)、(0.05％～0.2％)；
S2、将初步交联的水凝胶前体溶液于波长260～430nm光照条件下交联反应得到止血水凝胶材料。
基于本发明的技术方案，具有如下有益效果：
(1)以半胱氨酸和邻硝基苄基混合缩合改性多糖为骨架单元结构，在氧化剂过氧化氢和缩合剂1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的作用下，进一步与含有双键结构的丙烯酸基改性明胶之间反应，偶联形成二硫键，同时二者之间生成酰胺键，最终形成以多糖-蛋白为骨架、酰胺键穿插，多糖与蛋白质偶联“搭桥”交联的初始交联网络结构(初步交联的水凝胶前体溶液)；然后在波长为260～430nm的光照射后，丙烯酸基改性明胶上的双键发生自身交联，形成第一层交叉交联网络；邻硝基苄基类光扳机分子改性修饰的多糖的苄基位在光照下生成羰基，羰基与丙烯酸基改性明胶上的氨基反应交联，形成第二层交联网络，从而极大的增强了胶体的力学，且体系中的亚胺结构可与生物组织上的氨基酸发生席夫碱反应，与基体组织生成化学键，从而增加粘接力，形成一个复杂的、具有较强相互作用的水凝胶止血体系。在使用时，在特定波长紫外照射下，利用生成的活性羰基与组织界面(皮肤或组织)发生席夫碱反应建立起化学粘接，从而建立材料之间强力交联连接，以及建立材料与动态、湿性组织的强力交联连接，同时，骨架单元中设计的双键交联点，在活性自由基作用下产生双键交联，从而显著提高了成胶速度和凝胶力学强度，从而实现快速封堵和长效抵抗流体冲击，可用于动脉等快速止血。
(2)邻硝基苄基类光扳机分子在紫外光照射下不仅仅生成了光生醛基光生羰基，苯环上的硝基也会生成亚硝基，亚硝基对人体具有一定生理毒性，利用特殊设计双键结构与其发生Diels-Alder加成反应成六元环消除亚硝基，极大削弱了其毒性。
在上述方案的基础上，本发明还可以进行如下改进：
进一步，所述丙烯酸基改性明胶为具有多孔球状结构的颗粒物，由含丙烯酸基团的化合物对明胶进行接枝改性得到，包括如下步骤：
将明胶、含丙烯酸基团的化合物以及催化剂甲苯二氯甲烷在有机溶剂中，在55～65℃下反应2-10h小时，然后旋蒸，将旋蒸残留物经过滤、洗涤、冷冻干燥得到具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒；所述THF溶剂中明胶的质量分数为6％～10％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.1％～0.5％，含丙烯酸基团的化合物与明胶的质量比为(0.5～1.5):2，所述有机溶剂选自乙醇、THF、DMSO或DMF中的一种。
该条件下，含丙烯酸基团的化合物对明胶进行改性(生成酰胺键)可得到粒径均匀(50～100μm)且具有多孔结构的丙烯酸基改性明胶颗粒，便于后续与改性多糖高效混合、交联。
优选的，所述有机溶剂为THF，THF作为溶剂反应更加高效、充分，得到的丙烯酸基改性明胶颗粒粒径更加均一。
进一步，所述含丙烯酸基团的化合物为丙烯酸酸酐或甲基丙烯酸酐。
酸酐的活性强，可以实现明胶的改性，且接枝化效率高。
进一步，半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖的制备过程包括如下步骤：
S11、将缩合剂、多糖水溶液、含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液和半胱氨酸水溶液混合得到混合液B，调节混合液B的pH为5～7，搅拌反应12～48h；所述多糖水溶液中多糖的质量分数为1％～2％，所述含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为5％～15％，所述半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为3％～8％，所述混合液B中缩合剂、多糖、邻硝基苄基类光扳机分子以及半胱氨酸的质量分数分别为0.05％～0.2％、0.1％～0.8％、0.2％～1％、0.2％～0.8％；
S12、将反应液加入孔径为0.1～0.5μm的透析袋中，用由NaCl水溶液和乙醇组成得混合透析液进行透析，将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为(4～6):1，NaCl水溶液的中NaCl的浓度为0.5～2mol/L。
进一步，所述缩合剂选自1-羟基-7-氮杂苯并三唑、苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸盐或1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐(EDC-HCl)中的一种。
上述缩合剂有利于邻硝基苄基类光扳机分子中的羟基基团、胺基基团与改性多糖中的羧基缩聚形成酯键、酰胺键，产生化学交联。
进一步，所述多糖为透明质酸或黄原胶。
进一步，S2中的光照时间为10s～90s。
优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01～2mol/L。
进一步，所述邻硝基苄基类光扳机分子的结构如下：
Figure BDA0003334330620000051
R’基团为为C1-C4烷基，R为具有端基羧羟基、端基氨基或端基硫醇基的烷基。
进一步，所述邻硝基苄基类光扳机分子选自如下结构中的任意一种：
Figure BDA0003334330620000052
优选的，所述光照波长为350～430nm。
上述结构的邻硝基苄基类光扳机分子光解速率快，对紫外光，尤其是350～450nm的这种对人体组织穿透性和危害小的波长敏感。在丙烯酸基化的明胶上的双键发生自身交联的同时，也可以与硝基苄基类光扳机分子上的1,3-戊二烯基团既可以与丙烯基基团交联，形成更加牢固的第一层交叉交联网络，又可以消解掉多余的因紫外光活化产生的毒性亚硝基基团，降低毒性。
进一步，步骤S2中，在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶和氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后再将混合反应体系置于光照下反应；HGF稀释液中HGF的质量分数为10～30％，氯化钙溶液的浓度为100～150μg/ml；混合反应体系中HGF的质量分数为2％～8％，人凝血酶的质量分数为0.1％～0.2％，混合反应体系中人凝血酶与氯化钙的重量比为1:2。
添加生长因子生长因子和止血因子(人凝血酶与氯化钙)后再进行光照交联可以增强材料的止血效果，有助于伤口愈合。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、丙烯酸基改性明胶制备：在装有搅拌器温度计、温度计和回流冷凝管的三口反应烧瓶中，将明胶溶解在DMF溶剂中，然后加入甲基丙烯酸酐，再加入甲苯二氯甲烷做催化剂，通入氮气保护，在55℃下反应6小时后，旋蒸出溶剂后，将残留物经过滤、正己烷洗涤、乙醇洗涤、蒸馏水洗涤产品后冷冻干燥制得具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒，粒径范围为50～100μm；其中，DMF溶剂中，明胶的质量分数为8％，甲基丙烯酸酐的质量分数为4wt％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.2％。
步骤二、改性黄原胶制备：将医用级别黄原胶溶解于蒸馏水中制备得到黄原胶溶液，将式(Ⅰ)所示的含氨基的邻硝基苄基光扳机分子溶于二甲基亚飒后，将其与半胱氨酸水溶液以及黄原胶溶液混合，然后加入缩合剂苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸盐得到混合液B，调节混合液B的pH为5，搅拌反应24h，将反应液加入0.1μm孔径的透析袋中用由1mol/LNaCl和95％乙醇组成乙醇组成得混合透析液进行透析，然后将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基改性黄原胶高分子；其中，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为5:1，黄原胶溶液中黄原胶的质量分数为0.5％，含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为10％，半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为3％；混合液B中，苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸的质量分数为0.05％，黄原胶的质量分数为0.1％，邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为0.2％，半胱氨酸的质量分数为0.2％。
第三步、制备初步交联的水凝胶前体溶液：在PBS缓冲液中加入丙烯酸基改性明胶和改性别黄原胶，并加入过氧化氢溶液和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐，混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于20℃下静置反应24h，形成初步交联的水凝胶前体溶液；其中，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为10％；混合液A中，改性黄原胶的质量分数为1％，丙烯酸基改性明胶的质量分数为3％，过氧化氢的质量分数为0.5％，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数为0.1％。
第四步：交联固化：在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶、氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后在波长为350～430nm的紫外光下照射20s得到水凝胶材料；其中，HGF稀释液中HGF的质量分数为12％，氯化钙溶液的浓度为120μg/ml；混合反应体系中，HGF的质量分数为2％，人凝血酶的质量分数为0.1％，氯化钙的质量为0.2％。
实施例1中氨基的邻硝基苄基小分子结构如下：
Figure BDA0003334330620000081
实施例2
一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、丙烯酸基改性明胶制备：在装有搅拌器温度计、温度计和回流冷凝管的三口反应烧瓶中，将明胶溶解在THF溶剂中，然后加入丙烯酸酐，再加入甲苯二氯甲烷做催化剂，通入氮气保护，在65℃下反应6小时后，旋蒸出溶剂后，将残留物经过滤、正己烷洗涤、乙醇洗涤、蒸馏水洗涤产品后冷冻干燥制得具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒；其中，THF溶剂中，明胶的质量分数为8％，甲基丙烯酸酐的质量分数为4wt％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.2％。
步骤二、改性透明质酸制备：将医用级别透明质酸溶解于蒸馏水中制备得到透明质酸溶液，将式(Ⅱ)所示的含氨基的邻硝基苄基光扳机分子溶于二甲基亚飒后，将其与半胱氨酸水溶液以及透明质酸溶液混合，然后加入缩合剂苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸盐得到混合液B，调节混合液B的pH为7，搅拌反应24h，将反应液加入0.5μm孔径的透析袋中用由1mol/LNaCl和95％乙醇组成的混合透析液进行透析，将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基改性透明质酸高分子；其中，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为5:1，透明质酸溶液中的透明质酸的质量分数为2％，含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为15％，半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为8％；混合液B中，苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸的质量分数为0.2％，透明质酸的质量分数为0.8％，邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为1％，半胱氨酸的质量分数为0.8％。
第三步、制备初步交联的水凝胶前体溶液：在PBS缓冲液中加入丙烯酸基改性明胶和改性透明质酸，并加入过氧化氢溶液和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐，混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于35℃下静置反应24h，形成初步交联的水凝胶前体溶液；其中，所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为10％，混合液A中，改性透明质酸的质量分数为1％，丙烯酸基改性明胶的质量分数为8％，过氧化氢的质量分数为0.8％，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数为0.2％。
第四步：交联固化：在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶、氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后在波长为350～430nm的紫外光下照射90s得到水凝胶材料；其中，HGF稀释液中HGF的质量分数为10％，氯化钙溶液的浓度为150μg/ml；混合反应体系中，HGF的质量分数为2％，人凝血酶的质量分数为0.2％，氯化钙的质量为0.4％。
实施例2中氨基的邻硝基苄基小分子结构如下：
Figure BDA0003334330620000091
Figure BDA0003334330620000101
实施例3
一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、丙烯酸基改性明胶制备：在装有搅拌器温度计、温度计和回流冷凝管的三口反应烧瓶中，将明胶溶解在DMSO溶剂中，然后加入甲基丙烯酸酐，再加入甲苯二氯甲烷做催化剂，通入氮气保护，在60℃下反应6小时后，旋蒸出溶剂后，将残留物经过滤、正己烷洗涤、乙醇洗涤、蒸馏水洗涤产品后冷冻干燥制得具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒；其中，DMSO溶剂中明胶的质量分数为8％，甲基丙烯酸酐的质量分数为3wt％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.15％。
步骤二、改性黄原胶制备：将医用级别黄原胶溶解于蒸馏水中制备得到黄原胶溶液，将式(Ⅲ)所示的含氨基的邻硝基苄基光扳机分子溶于二甲基亚飒后，将其与半胱氨酸水溶液以及黄原胶溶液混合，然后加入缩合剂1-羟基-7-氮杂苯并三唑得到混合液B，调节混合液B的pH为6，搅拌反应24h，将反应液加入0.5μm孔径的透析袋中用由1mol/LNaCl和95％乙醇组成的混合透析液进行透析，将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基改性黄原胶高分子；其中，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为5:1，黄原胶溶液的黄原胶的质量分数为1.5％，含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为10％，半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为6％；混合液B中，苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸的质量分数为0.06％，黄原胶溶液的质量分数为0.5％，邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为0.5％，半胱氨酸的质量分数为0.5％；
第三步、制备初步交联的水凝胶前体溶液：在PBS缓冲液中加入丙烯酸基改性明胶和改性黄原胶，并加入的过氧化氢溶液和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐，混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于35℃下静置反应24h，形成初步交联的水凝胶前体溶液；其中，所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为10％，混合液A中，改性黄原胶的质量分数为2％，丙烯酸基改性明胶的质量分数为6％，反应体系中加入的过氧化氢的质量分数为0.5％，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数为0.1％。
第四步：交联固化：在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶、氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后在波长为350～430nm的紫外光下照射20s时间得到水凝胶材料；其中，HGF稀释液中HGF的质量分数为15％，氯化钙溶液的浓度为120μg/ml，混合反应体系中，HGF的质量分数为5％，人凝血酶的质量分数为0.2％，氯化钙的质量为0.4％。
实施例3中氨基的邻硝基苄基小分子结构如下：
Figure BDA0003334330620000111
实施例4
一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、丙烯酸基改性明胶制备：在装有搅拌器温度计、温度计和回流冷凝管的三口反应烧瓶中，将明胶溶解在THF溶剂中，然后加入丙烯酸酐，再加入甲苯二氯甲烷做催化剂，通入氮气保护，在65℃下反应6小时后，旋蒸出溶剂后，将残留物经过滤、正己烷洗涤、乙醇洗涤、蒸馏水洗涤产品后冷冻干燥制得具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒；其中，THF溶剂中明胶的质量分数为8％，甲基丙烯酸酐的质量分数为4wt％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.2％。
步骤二、改性透明质酸制备：将医用级别透明质酸溶解于蒸馏水中制备得到透明质酸溶液，将式(Ⅳ)所示的含羟基的邻硝基苄基光扳机分子溶于二甲基亚飒后，将其与半胱氨酸水溶液以及透明质酸溶液混合，然后加入缩合剂苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸盐得到混合液B，调节混合液B的pH为7，搅拌反应24h，将反应液加入0.5μm孔径的透析袋中用由1mol/LNaCl和95％乙醇组成乙醇组成得混合透析液进行透析，将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基改性透明质酸高分子；其中，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为5:1，透明质酸溶液中的透明质酸的质量分数为0.8％，含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚飒溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为12％，半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为5％；混合液B中，苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸的质量分数为0.1％，透明质酸的质量分数为0.6％，邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为0.8％，半胱氨酸的质量分数为0.6％。
第三步、制备初步交联的水凝胶前体溶液：在PBS缓冲液中加入丙烯酸基改性明胶和透明质酸，并加入过氧化氢溶液和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐，混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于35℃下静置反应24h，形成初步交联的水凝胶前体溶液；其中，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为10％，混合液A中，透明质酸的质量分数为2％，丙烯酸基改性明胶的质量分数为7％，过氧化氢的质量分数为0.6％，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数为0.1％。
第四步：交联固化：在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶、氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后在波长为350～430nm的紫外光下照射30s时间得到水凝胶材料；其中，HGF稀释液中HGF的质量分数为12％，氯化钙溶液的浓度为110μg/ml，混合反应体系中，HGF的质量分数为4％，人凝血酶的质量分数为0.2％，氯化钙的质量为0.4％。
实施例4中氨基的邻硝基苄基小分子结构如下：
Figure BDA0003334330620000131
水凝胶材料的的性能测试
一、水凝胶材料的凝血时间测试
(1)精确称取实施例1制备的水凝胶材料0.10g，送至内径为0.8cm的洁净干燥试管底部，将新西兰兔置于保定器内，从新西兰兔采集未抗凝新鲜全血3mL，自血液进入采血针时立即启动秒表，加入1mL新鲜全血于试管中立即用漩涡混合器混匀3s，将试管置于37℃电热恒温水浴锅，每隔5s倾斜一次试管，观察血液流动状态，直至血液不流动，记录全血凝固时间(coagulationtime，CT)，平行测定3次，空白对照组为未抗凝新鲜全血。
(2)Celox止血颗粒凝血时间的测试
使用市购得到的Celox止血颗粒，按照上述(1)中的方法进行凝血时间测试。
结果表明，本发明实施例1制备的凝胶材料的体外凝血时间(CT)平均为30s，对照组Celox凝血时间为90s，空白对照组凝血时间300s。
二、水凝胶粘附力测试
(1)取新鲜猪肠衣若干，将其裁剪成3.5cm X2.5cm大小的肠衣片，然后利用502胶水将其固定在6.5cm X2.5cm大小的钢化玻璃片上，取上述钢化玻璃片，在其中一片粘结肠衣面上涂抹150μL的实施例1中制备的水凝胶前体溶液。然后，将另一片玻璃片置于此片玻璃片上方，使上下两片粘附肠衣的位置完全相对，此时，擦去多余的被挤出的水凝胶前体溶液。然后利用395nm LED光源(20mW/cm2)对肠衣部位进行光照5min，使水凝胶前体溶液在两片肠衣之间原位成胶，成胶完全后，将玻璃片的一端垂直固定，另一端通过细绳连接上能够盛水的容器。随后不断向容器中加入定量水，直到两片玻璃片断开为止。其后，记录下此时水和容器的质量，将其转化成重力也就是玻璃片断裂时的拉力F，利用以下公式计算水凝胶的组织粘附力：水凝胶组织粘附力＝F/A其中A为肠衣的粘接面积。测得实施例1制备的水凝胶材料的粘附力为289mmHg(38.5kPa)，远远高于常规收缩血压(60～160mmHg)，具有优异的粘结、止血效果。
三、水凝胶力学性能测试
(1)力学性能测试(包括拉伸测试和压缩测试)采用GT-TCS-2000拉力机，拉伸测试样品为长20mm，宽3mm，厚2mm的哑铃型试样，测试速度为5mm/min，压缩测试样品为直径l0mm，高3mm的圆柱形试样，测试速度为lmm/min，测得实施例1中制备的水凝胶材料的拉伸强度为1.8MPa，韧性为2.2MJ/m2。
四、水凝胶材料生物相容性测试
通过水凝胶材料的细胞毒性测试和体内免疫炎症反应测试、溶血率来评价水凝胶的生物相容性。
(1)细胞毒性测试：通过CCK-8试剂盒进行细胞毒性检测。首先，在96孔板中种植成纤维细胞HDFs，细胞密度为5X103细胞/孔，然后加入培养基，在370C/5％CO2条件下培养24h。然后，将实施例1制备的水凝胶材料溶解于细胞培养液中，加入到培养有细胞的孔板中，继续培养24h，然后将孔中的细胞液吸出，向每个孔中加入100μL的培养基和10μL的CCK-8溶液，继续孵育细胞2h。最后，用酶标仪检测每个孔中450nm的吸光度计算细胞存活率。细胞存活率计算如下：Cell Viability(％)＝(实验组吸光度的平均值/控制组吸光度的平均值)X100％，测得细胞存活率为99％，无细胞毒性。
(2)体内免疫炎症反应测试：以实施例1制备的水凝胶为例，将水凝胶材料植入兔子皮下，对兔子进行腹壁缺损修复，在第14天、30天和120天进行一次组织切片通过免疫组织化学染色在腹壁缺损处检测观察，研究分析细胞增殖和炎症反应。结果表明，几乎无炎症反应，制得的凝胶材料有良好的生物相容性。
(3)溶血率测试：
1)2％红细胞悬液的制备：取新鲜大鼠血3～10mL，1000～1500r/min离心10min，除去上清液，沉淀的红细胞再用PBS按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用PBS缓冲液配成2％的混悬液(用PBS缓冲液将2mL红细胞稀释至100mL)，供试验用。
2)阴性对照组：取4个离心管，分别加入PBS 0.9mL，每管加2％红细胞悬液0.1mL，轻轻混匀后置37℃水浴孵育1h，1000r/min离心5min，吸取上清移至96孔板，用酶标仪在波长545nm处测吸光度A值，取平均值作为阴性对照组A值。
3)阴性对照组：取4个离心管，分别加入Triton X-100溶液(2％，w/v)0.9mL，每管加2％红细胞悬液0.1mL，轻轻混匀后置37℃水浴孵育1h，1000r/min离心5min，吸取上清移至96孔板，用酶标仪在波长545nm处测吸光度(A)值，取平均值作为阳性对照组A值。
4)实验组：取4个离心管，分别加入加入实施例1制备的水凝胶材料0.9mL，每管加2％红细胞悬液0.1mL，轻轻混匀后置37℃水浴孵育1h，1000r/min离心5min，吸取上清移至96孔板，用酶标仪在波长545nm处测吸光度(A)值，取平均值作为实验组A值。
5)溶血率计算:溶血率(％)＝(实验组A值－阴性对照组A值)/(阳性对照组A值－阴性对照组A值)×100％。测得水凝胶材的溶血率均小于5％，表明制得的凝胶材料有良好的生物相容性。
尽管上面已经详细描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖和丙烯酸基改性明胶、过氧化氢和1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐于PBS缓冲液中混合得到混合液A，将混合液A在氮气保护下于20～35℃下静置反应12～48h，形成多糖-明胶初步交联的水凝胶前体溶液；所述邻硝基苄基类光扳机分子含有羟基基团、疏基基团或胺基基团，所述混合液A中半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖、丙烯酸基改性明胶、过氧化氢、1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐的质量分数分别为(1～3％)、(3％～8％)、(0.2％～0.8％)、(0.05％～0.2％)，
所述丙烯酸基改性明胶由含丙烯酸基团的化合物对明胶进行接枝改性得到，所述含丙烯酸基团的化合物为丙烯酸酐或甲基丙烯酸酐；
所述多糖为透明质酸或黄原胶；所述邻硝基苄基类光扳机分子的结构如下：
Figure RE-FDA0003985732780000011
R’基团为为C1-C4烷基，R为具有端基羧羟基、端基氨基或端基硫醇基的烷基；
S2、将初步交联的水凝胶前体溶液于波长260～430nm光照条件下交联反应得到所述水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸基改性明胶为具有多孔球状结构的颗粒物，由含丙烯酸基团的化合物对明胶进行接枝改性得到，包括如下步骤：
将明胶、含丙烯酸基团的化合物以及催化剂甲苯二氯甲烷在有机溶剂中，在55～65℃下反应2-10h小时，然后旋蒸，将旋蒸残留物经过滤、洗涤、冷冻干燥得到具有多孔球状结构的丙烯酸基改性明胶颗粒；所述THF溶剂中明胶的质量分数为6％～10％，甲苯二氯甲烷的质量分数为0.1％～0.5％，含丙烯酸基团的化合物与明胶的质量比为(0.5～1.5):2，所述有机溶剂选自乙醇、THF、DMSO或DMF中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖的制备过程包括如下步骤：
S11、将缩合剂、多糖水溶液、含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚砜 溶液和半胱氨酸水溶液混合得到混合液B，调节混合液B的pH为5～7，搅拌反应12～48h；所述多糖水溶液中多糖的质量分数为1％～2％，所述含邻硝基苄基类光扳机分子的二甲基亚砜 溶液中邻硝基苄基类光扳机分子的质量分数为5％～15％，所述半胱氨酸水溶液中半胱氨酸的质量分数为3％～8％，所述混合液B中缩合剂、多糖、邻硝基苄基类光扳机分子以及半胱氨酸的质量分数分别为0.05％～0.2％、0.1％～0.8％、0.2％～1％、0.2％～0.8％；
S12、将反应液加入孔径为0.1～0.5μm的透析袋中，用由NaCl水溶液和乙醇组成得混合透析液进行透析，将透析袋中的残留物进行真空干燥，得到半胱氨酸和邻硝基苄基类光扳机分子混合缩合改性多糖，混合透析液中NaCl水溶液和乙醇的体积比为(4～6):1，NaCl水溶液的中NaCl的浓度为0.5～2mol/L。
4.根据权利要求3所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自1-羟基-7-氮杂苯并三唑、苯并三唑-1-基氧化三吡咯烷膦的六氟磷酸盐或1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐中的一种。
5.根据权利要求1所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，S2中的光照时间为10s～90s。
6.根据权利要求1所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述邻硝基苄基类光扳机分子选自如下结构中的任意一种：
Figure RE-FDA0003985732780000031
7.根据权利要求1所述的用于快速止血的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在初步交联的水凝胶前体溶液中加入HGF稀释液、人凝血酶和氯化钙溶液混合得到混合反应体系，然后再将混合反应体系置于光照下反应；HGF稀释液中HGF的质量分数为10～30％，氯化钙溶液的浓度为100～150μg/ml；混合反应体系中HGF的质量分数为2％～8％，人凝血酶的质量分数为0.1％～0.2％，混合反应体系中人凝血酶与氯化钙的重量比为1:2。
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