CN111494411A - 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111494411A
CN111494411A CN202010435029.8A CN202010435029A CN111494411A CN 111494411 A CN111494411 A CN 111494411A CN 202010435029 A CN202010435029 A CN 202010435029A CN 111494411 A CN111494411 A CN 111494411A
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
cisplatin
platinum
assembled
tetravalent platinum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010435029.8A
Other languages
English (en)
Inventor
刘鉴峰
王倩
杨翠红
杨丽军
黄帆
刘金剑
任春华
张玉民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Original Assignee
Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Radiation Medicine of CAMMS filed Critical Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority to CN202010435029.8A priority Critical patent/CN111494411A/zh
Publication of CN111494411A publication Critical patent/CN111494411A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用。将顺铂通过化学反应生成氧化顺铂并进一步通过与赖氨酸残基反应共价修饰于酪氨酸磷酸化的自组装短肽上，构建出四价铂药物。该四价铂药物可在肿瘤细胞表面高表达的磷酸酶作用下，原位自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。被细胞摄取的含铂纳米纤维在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽作用下，释放出二价铂药物，发挥治疗功效。水凝胶的形成促进了肿瘤细胞对铂类药物的摄取并增加了其在肿瘤细胞中的滞留时间。与传统的顺铂相比，该四价铂药物对肿瘤细胞的杀伤作用不受细胞耐药性的影响且系统毒性明显降低。

Description

一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种原位自组装四价铂药物及其制备方法及其在逆转肿瘤顺铂耐药中的应用。
背景技术
顺铂作为最早应用于临床的二价铂类药物，具有广谱抗癌作用，对卵巢癌、非小型细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症均有很好的治疗效果。但是，顺铂在临床使用过程中出现的药物耐受以及较高的毒副作用等问题极大地限制了其应用范围。为了解决上述问题，科学家在顺铂的基础上推出了分别以卡铂和奥沙利铂为代表的二代和三代二价铂类药物，尽管在一定程度上改善了顺铂存在的一些弊端，但是其耐药性和毒副作用等问题并没有被完全克服。因此，亟需开发更有效的铂类药物，在发挥肿瘤治疗作用的同时降低毒副作用。
与二价铂相比，四价铂配合物易于进行化学修饰，且具有动力学惰性等优势，往往能够有效地减少铂类化合物的系统毒性，并逆转顺铂耐药。肿瘤细胞摄取后，四价铂被肿瘤细胞中高表达的谷胱甘肽等还原性物质还原为二价铂才能发挥治疗功效，而正常细胞中由于还原性物质表达水平较低，四价铂不会被还原成二价铂，因此其对正常组织几乎没有毒性。借助特殊的方法，提高四价铂类药物在肿瘤部位的富集，增加肿瘤细胞摄取，可在发挥四价铂优势的基础上进一步降低其系统毒性以及降低顺铂药物耐受对肿瘤治疗的影响。
目前，利用病变部位异常表达的信号分子在原位形成组装体，使原本在血液循环过程中没有攻击性的小分子在肿瘤微环境作用下发生响应而发挥作用的手段在肿瘤的治疗中展现出了极大的应用前景。这种原位自组装策略兼具小分子药物与纳米药物的优点，可形成在肿瘤部位滞留时间长、渗透性强以及系统毒性低的多功能纳米药物。
由于多肽具有良好的生物相容性、可降解性、灵活的响应性以及特殊的生物功能等优点，基于多肽的原位自组装，尤其是酶催化的原位自组装，备受研究者关注。碱性磷酸酶（ALP）在部分肿瘤细胞，如Hela细胞的细胞膜上高表达，具有优良的去磷酸化性质。研究表明，将荧光分子FITC共价修饰于酪氨酸磷酸化的短肽序列Fmoc-KFFYp上，可以通过细胞膜表面高表达的ALP对其去磷酸化，实现肿瘤原位自组装，进而控制荧光信号的开关，对肿瘤细胞进行示踪。同样，将药物酪丝缬肽共价修饰于磷酸化的短肽上，可以在细胞膜表面ALP的作用下原位形成纳米纤维结构，增加了肿瘤细胞对药物的摄取，提高了药物的滞留时间，增强了药物的肿瘤杀伤效果。
因此，利用四价铂的可修饰性，将其共价修饰于磷酸化的短肽序列上，构建ALP响应的原位自组装四价铂药物有望成为逆转肿瘤顺铂耐受、降低顺铂系统毒性的有效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种原位自组装四价铂药物的制备方法并探讨其在逆转肿瘤顺铂耐药中的应用。
本发明的原位自组装四价铂药物具备以下优势：1）在肿瘤细胞表面高表达的ALP作用下原位自组装形成纳米纤维结构，增加药物在肿瘤部位的富集，提高细胞对药物的摄取，减少细胞对药物的外排，有效克服肿瘤对顺铂药物的耐受；2）在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽作用下响应性释放二价铂类药物，其通过与DNA进行有效结合，达到抗肿瘤的目的；3）肿瘤细胞膜表面原位自组装与肿瘤细胞内谷胱甘肽响应性药物释放相互协同，能够有效降低化疗药顺铂对机体造成的系统毒性。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种原位自组装四价铂药物，具有如下的结构式：
Figure 195135DEST_PATH_IMAGE001
本发明进一步公开了原位自组装四价铂药物的制备方法，其特征在于：将原材料顺铂通过化学反应生成氧化顺铂并进一步通过与赖氨酸残基反应共价修饰于酪氨酸磷酸化的萘普生（Npx）封端的短肽Npx-ffkyp (Npx-D-Phe-D-Phe-D-Lys-D-Tyr (H2PO3))上，构建出四价铂药物。该四价铂药物可在肿瘤细胞表面高表达的磷酸酶作用下，原位自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。与传统的顺铂相比，该四价铂药物对肿瘤细胞的杀伤作用不受细胞耐药性的影响且系统毒性明显降低。
典型的原位自组装四价铂药物制备方法如下：
将双丁二酸化铂、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐置于圆底烧瓶中，用3 mL无水二甲基亚砜溶解，并于室温条件下搅拌12小时之后，将萘普生封端的短肽Npx-ffkyp加入上述混合物中，并使用N,N-二异丙基乙胺调节混合物的pH至8–9，室温下继续搅拌24小时；最后，以含有0.1%三氟乙酸的水-甲醇溶液作为流动相，使用高效液相色谱对产物进行纯化。对液相分离出来的产物溶液进行冻干处理，即得最终的四价铂药物；其中双丁二酸化铂：N-羟基丁二酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：短肽Npx-ffkyp的物质的量比为1:2.1:2.1:2。
本发明更进一步公开了原位自组装四价铂药物在制备逆转杀伤顺铂耐药肿瘤细胞方面的应用。特别是在制备降低肿瘤细胞毒性方面的应用。实验结果显示，顺铂对顺铂耐药肿瘤细胞的细胞毒性作用受细胞耐药性影响而大打折扣，但是原位组装四价铂药物的肿瘤细胞杀伤作用不受细胞耐药性的干扰，对顺铂耐药细胞仍然具有较高的毒副作用。
本发明更加详细的描述如下：
一种可原位自组装的四价铂药物，其特征在于：将原材料顺铂通过化学反应生成氧化顺铂并进一步通过与赖氨酸残基反应共价修饰于酪氨酸磷酸化的萘普生（Npx）封端的短肽Npx-ffkyp (Npx-D-Phe-D-Phe-D-Lys-D-Tyr (H2PO3))上，构建出四价铂药物。
该四价铂药物可在肿瘤细胞表面高表达的磷酸酶作用下，原位自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。被细胞摄取的含铂纳米纤维在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽作用下，释放出二价铂药物，发挥治疗功效。水凝胶的形成促进了肿瘤细胞对铂类药物的摄取并增加了其在肿瘤细胞中的滞留时间。与传统的顺铂相比，该四价铂药物对肿瘤细胞的杀伤作用不受细胞耐药性的影响且系统毒性明显降低。
优选原位自组装四价铂药物的制备方法。其特征在于步骤如下：
将双丁二酸化铂（26.7 mg, 0.05 mmol）、N-羟基丁二酰亚胺（12.1 mg, 0.105 mmol）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（20.2 mg, 0.105 mmol）置于圆底烧瓶中，用3 mL无水二甲基亚砜溶解，并于室温条件下搅拌12小时。之后，将萘普生封端的短肽Npx-ffkyp（89.6 mg, 0.1 mmol）加入上述混合物中，并使用N,N-二异丙基乙胺调节混合物的pH至8–9，室温下继续搅拌24小时。最后，以含有0.1%三氟乙酸的水-甲醇溶液作为流动相，使用高效液相色谱对产物进行纯化。对液相分离出来的产物溶液进行冻干处理，即得最终的四价铂药物。
在其中一些实施例中，所述双丁二酸化铂制备方法包括如下步骤：
1）将顺铂（500 mg, 1.67 mmol）、过氧化氢（30 w/v, 4 mL）以及10 mL蒸馏水置于圆底烧瓶中，50℃下搅拌3小时后，将圆底烧瓶置于4℃下放置过夜；
2）通过真空抽滤的方式收集滤饼，分别用冷水、冷乙醇、冷乙醚洗涤3次，最后经真空干燥，得产物氧化顺铂；
3）将氧化顺铂（200 mg, 0.6 mmol）分散于5 mL无水二甲基甲酰胺中，加入丁二酸酐（240 mg, 2.4 mmol），70℃下搅拌24小时；
4）对混合液进行减压浓缩，得到浅黄色液体，加入丙酮置于–20℃下重结晶；通过真空抽滤的方式收集滤饼，并用冷乙醚反复多次洗涤，得双丁二酸铂。
在其中一些实例中，萘普生封端的短肽Npx-ffkyp的合成采用经典的多肽固相合成法，由于固相合成法极其成熟，在本步骤中就不过多赘述。
在其中一些实例中，涉及含铂药物的实验操作，均需在避光的条件下进行。
本发明更进一步公开了该四价铂药物的自组装性能在体外和细胞水平上的验证；该四价铂药物在杀伤顺铂耐药肿瘤细胞方面的应用以及该四价铂药物的系统毒性评估。所述的原位自组装在体外ALP作用下以及ALP高表达的Hela细胞表面均能有效实现；所述的四价铂药物与顺铂相比，对肿瘤细胞的杀伤作用基本不受肿瘤细胞耐药性的影响，可有效地杀死顺铂耐药细胞；连续三周给予健康小鼠后，顺铂会明显降低小鼠血液中白细胞水平，但是该四价铂药物对白细胞水平没有任何影响。
本发明公开的原位自组装四价铂药物的制备方法及其在逆转肿瘤顺铂耐药中的应用所具有的积极效果在于：
1）多肽生物相容性良好、易于降解，符合药用辅料对安全性的最基本要求；
2）原位自组装明显提高药物在肿瘤部位的富集，增加肿瘤细胞对药物的摄取，延长药物在肿瘤中的滞留时间；
3）肿瘤细胞膜表面原位自组装与肿瘤细胞内谷胱甘肽响应性药物释放相互协同，能够有效降低化疗药顺铂对机体造成的系统毒性；
4）对肿瘤细胞的杀伤作用不受肿瘤细胞耐药性的干扰，为临床解决顺铂耐药问题提供了新的手段。
综上，本发明构建的原位自组装四价铂药物具有很好的应用前景。
附图说明
图1为该四价铂药物的合成过程；
图2为该四价铂药物体外以及细胞水平ALP响应成胶验证（A. 加入ALP前后的照片对比；B. 水凝胶的流变学性质考察；C. 水凝胶微观结构的透射电子显微镜照片；D. 500 μM与100 μM该四价铂药物分别与Hela细胞共孵育12小时，细胞表面照片（磷酸盐缓冲液为对照组）；E. 100 μM孵育后，细胞表面胶状物质的微观结构透射电子显微镜照片）；
图3为水凝胶在体外条件下的谷胱甘肽响应性药物释放曲线；
图4为该四价铂药物Npx-fp对Hela细胞以及Hela顺铂耐药细胞的杀伤作用。（A. 普通Hela细胞；B.顺铂耐药Hela细胞；C. 四价铂药物Npx-fp对顺铂耐药Hela细胞的促凋亡作用）；
图5为该四价铂药物Npx-fp对健康小鼠连续注射三周后的血常规分析；
图6为原位自组装四价铂药物结构式。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明所用的原料：顺铂、萘普生（Npx）、9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D构型苯丙氨酸、D构型Fmoc保护的赖氨酸、D构型Fmoc保护的磷酸化酪氨酸、丁二酸酐、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、乙醚、乙醇、双氧水均有市售。
实施例1
原位自组装四价铂药物的制备方法，参见附图1，主要包括如下步骤：
1) 将双丁二酸化铂(Pt(OOCCH2CH2COOH)2, 26.7 mg, 0.05 mmol)，N-羟基丁二酰亚胺（NHS, 12.1 mg, 0.105 mmol），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl,20.2 mg, 0.105 mmol）置于圆底烧瓶中，使用3 mL无水二甲基亚砜（DMSO）溶解，并于室温条件下搅拌12小时。
2) 将萘普生封端的短肽Npx-ffkyp（89.6 mg, 0.1 mmol）加入上述混合物中，并使用N,N-二异丙基乙胺(DIEA)调节混合物的pH至8-9，继续室温搅拌24小时。最后，以含有0.1%三氟乙酸的水-甲醇溶液作为流动相，使用高效液相色谱对产物进行纯化。对液相分离出来的产物溶液进行冻干处理，即得最终的四价铂药物(Npx-fp)。
核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.47-7.98 (m, 9H),7.93-7.50 (m, 9H), 7.52-6.78 (m, 32H), 6.51 (s, 6H), 4.43 (t, J = 39.7 Hz,8H), 3.16-2.56 (m, 22H), 2.27 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 1.67-1.21 (m, 18H)。
质谱数据如下：HR-MS: Mcal =2290.07, Mexa =2290。
实施例2
实施例1中所述双丁二酸化铂制备方法包括如下步骤：
1）将顺铂（500 mg, 1.67 mmol）、过氧化氢（30 w/v, 4 mL）以及10 mL蒸馏水置于圆底烧瓶中，50℃下搅拌3小时后，将圆底烧瓶置于4℃下放置过夜；
2）通过真空抽滤的方式收集滤饼，分别用冷水、冷乙醇、冷乙醚洗涤3次，最后经真空干燥，得产物氧化顺铂；
3）将氧化顺铂（200 mg, 0.6 mmol）分散于5 mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入丁二酸酐（240 mg, 2.4 mmol），70℃下搅拌24小时；
4）对混合液进行减压浓缩，得到浅黄色液体，加入丙酮置于–20℃下重结晶；通过真空抽滤的方式收集滤饼，并用冷乙醚反复多次洗涤，得双丁二酸化铂。
参见附图2，给出了该四价铂药物Npx-fp体外以及细胞水平ALP响应成胶验证，步骤如下：
1）将1 mg Npx-fp完全溶解于200 μL磷酸盐缓冲溶液中，用碳酸氢钠调节其pH为7.4，使化合物的最终浓度为0.5wt% (5 mg/mL)。将2 U ALP加入其中后，置于37℃环境中静置2小时。如图2A所示，透明的溶液状液体在加入ALP之后形成了非流动性的凝胶状胶体；
2）将体积约为3 mL的按上述步骤形成的凝胶轻轻地置于测试台上，按设定好的程序测试胶体在0.1 rad/s–100 rad/s的范围内弹性模量（G’）和黏性模量G’’。如图2B所示，在测试的时间范围内，弹性模量明显高于黏性模量，具有明显的黏弹性，表明凝胶的形成；
3）在室温条件下，将10 μL的凝胶滴于300目的碳支持膜铜网上，静置10 分钟，用滤纸吸去多余的样品，再使用5 μL醋酸双氧铀对其进行染色，静置10分钟后，吸去多余染色剂。待铜网自然晾干后，真空干燥12小时后用透射电子显微镜（加速电压为100 kV）检测。如图2C所示，凝胶的微观形貌为互相缠绕的三维纤维状；
4）Hela细胞按每孔20万个的密度接种于六孔板中，正常培养24小时后，弃去原有培养基。分别将含有500 μM与100 μM的新鲜培养基加入其中与细胞共孵育12小时，以PBS作为对照组。12小时后，弃去上层液体，用PBS缓慢清洗细胞表面后，对细胞表面进行相机拍照。同时，将300目的碳支持膜铜网正面覆于细胞表面对细胞表面液体进行蘸取后取出。静置10分钟，弃去多余液体。利用5 μL醋酸双氧铀对其进行染色，静置10分钟后，吸去多余染色剂，待铜网自然晾干后，真空干燥12小时后用透射电子显微镜（加速电压为100 kV）检测。如图2D所示，细胞与PBS共同孵育后，细胞表面干净光滑，但是与四价铂药物Npx-fp共孵育后，细胞表面存在明显的凝胶状物质；对100 μM实验组表面胶状物质进行验证，如图2E所示，胶状物质为纤维状，表明四价铂药物原位自组装的成功实现。
参见附图3，给出了水凝胶在体外条件下谷胱甘肽响应药物释放曲线。步骤如下：
1）准备好两组各含200 μL凝胶的成胶小瓶；提前准备好足量GSH浓度分别为5 mM和5 μM的PBS溶液；
2）在一组小瓶的凝胶顶部加入200 μL含5 mM谷胱甘肽的PBS溶液，另一组小瓶中加入200 μL含5 μM谷胱甘肽的PBS溶液。这一时间点记为0时；
3）在之后的特定时间点1 时、2 时、4 时、8 时、12 时、24 时、48 时分别取出每组凝胶上的全部PBS缓冲液，并对应补充新鲜的含谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液；
4）利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定每个时间点的铂的含量，换算成二价铂的浓度，计算各个时间点二价铂的累积释放率；
5）图3即为实验重复三次后得到的四价铂药物形成的水凝胶在不同谷胱甘肽刺激下二价铂累积释放曲线。在较低的谷胱甘肽作用下，水凝胶对二价铂药物的释放较少，但是在接近肿瘤细胞谷胱甘肽水平的缓冲液中，释放速度明显加快，由此证明原位自组装四价铂类药物具有很好的谷胱甘肽响应释放能力。
参见附图4A、4B，通过比较四价铂药物Npx-fp对普通Hela细胞以及顺铂耐药Hela细胞的杀伤效果，来评估Npx-fp逆转顺铂耐药能力，步骤如下：
1）用含10％胎牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔8000个细胞的浓度将细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，细胞在正常条件下培养24小时；
2）以PBS为无药物处理组，分别加入含不同浓度梯度的顺铂和四价铂药物的无血清培养基，每个药物的不同浓度设置三个复孔；
3) 药物处理48小时后，每孔加含0.5 mg/mL MTT的基础培养基100 μL。继续孵育3-4小时后，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加150 μL DMSO；
4) 在酶标仪上测定各孔570 nm处吸光度，设定630 nm吸收为参比，记录结果；
5) 以PBS处理组为细胞正常生长组，顺铂与四价铂药物Npx-fp对普通Hela细胞以及顺铂耐药Hela细胞的杀伤效果如图4A、4B所示。顺铂与四价铂药物对普通Hela细胞的杀伤作用没有明显差别。但是，在Hela耐药的细胞上，四价铂药物Npx-fp具有更低的半数抑制浓度。受细胞耐药性的影响，顺铂对顺铂耐药细胞受肿瘤细胞耐药性的影响较大，而Npx-fp对细胞的杀伤作用基本不受耐药性的干扰。
参见附图4C，对比了不同实验组对顺铂耐药Hela细胞的促凋亡作用，主要步骤如下：
1）按照每孔30万个细胞的细胞数量将顺铂耐药的Hela细胞接种于六孔板中，培养24小时，至融合度约50~60%；
2）以PBS为无药物处理组，分别加入10 μM顺铂与10 μM四价铂药物，继续培养细胞48小时；
3) 药物处理48小时后，弃去培养基，PBS清洗三遍，胰酶消化,终止消化之后，收集细胞，利用PBS清洗细胞三次；
4) 之后按照凋亡试剂盒的步骤要求对细胞进行染色，染色后，使用流式细胞仪对细胞进行检测；
5) 如图4C所示，与PBS对照组相比，顺铂对耐药细胞的促凋亡作用不是很明显，但是四价铂药物Npx-fp明显促进了顺铂耐药细胞的凋亡，这更进一步证明了Npx-fp可以逆转顺铂耐药。
参见附图5，通过对健康小鼠连续注射三周该四价铂药物Npx-fp后的血常规分析来对Npx-fp的系统毒性进行初步评价，具体步骤如下：
1）将9只健康的Balb/c小鼠（6-8周）随机分为三组。三组小鼠分别通过尾静脉注射PBS、顺铂（3 mg/kg）以及Npx-fp（20 mg/kg）。尾静脉注射分三周进行，每周一次。三周后，通过毛细管进行小鼠眼眶取血。每三滴血与30 μL抗凝剂混匀后，利用血细胞分析仪对各项血液学指标进行检测；
2）如图5所示，与PBS组相比，顺铂组会造成小鼠白细胞的明显减少，但是四价铂药物Npx-fp组对白细胞却没有明显影响。血液白细胞降低是顺铂在临床应用的常见问题，四价铂药物Npx-fp能很好的规避这一问题，具有临床应用前景。

Claims (6)

1.一种原位自组装四价铂药物，具有如下的结构式：
Figure 369026DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述原位自组装四价铂药物的制备方法，其特征在于：将原材料顺铂通过化学反应生成氧化顺铂并进一步通过与赖氨酸残基反应共价修饰于酪氨酸磷酸化的萘普生（Npx）封端的短肽Npx-ffkyp (Npx-D-Phe-D-Phe-D-Lys-D-Tyr (H2PO3))上，构建出四价铂药物。
3.权利要求2所述原位自组装四价铂药物制备方法，其特征在于步骤如下：
将双丁二酸化铂、N-羟基丁二酰亚胺、和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐置于圆底烧瓶中，用3 mL无水二甲基亚砜溶解，并于室温条件下搅拌12小时之后，将萘普生封端的短肽Npx-ffkyp加入上述混合物中，并使用N,N-二异丙基乙胺调节混合物的pH至8–9，室温下继续搅拌24小时；最后，以含有0.1%三氟乙酸的水-甲醇溶液作为流动相，使用高效液相色谱对产物进行纯化。
4.对液相分离出来的产物溶液进行冻干处理，即得最终的四价铂药物；其中双丁二酸化铂：N-羟基丁二酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：短肽Npx-ffkyp的物质的量比为1:2.1:2.1:2。
5.权利要求1所述原位自组装四价铂药物在制备逆转杀伤顺铂耐药肿瘤细胞方面的应用。
6.权利要求1所述原位自组装四价铂药物在制备降低肿瘤细胞毒性方面的应用。
CN202010435029.8A 2020-05-21 2020-05-21 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用 Pending CN111494411A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010435029.8A CN111494411A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010435029.8A CN111494411A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111494411A true CN111494411A (zh) 2020-08-07

Family

ID=71876901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010435029.8A Pending CN111494411A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111494411A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112704685A (zh) * 2021-01-21 2021-04-27 南通大学 一种顺铂配位体及其在制备肿瘤纳米诊疗剂中的应用
CN113061159A (zh) * 2021-04-12 2021-07-02 香港城市大学深圳研究院 一种多肽自组装因子及其制备方法和应用
CN113082222A (zh) * 2021-04-20 2021-07-09 中国医学科学院放射医学研究所 一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与应用
CN113117077A (zh) * 2021-03-04 2021-07-16 西南民族大学 一种用于肿瘤联合治疗的铂基单原子纳米酶及其制备方法
CN114209848A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 中国科学技术大学 一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105254932A (zh) * 2015-10-16 2016-01-20 中南大学 基于海藻酸和短肽的互穿网络水凝胶及其制备方法
CN108026271A (zh) * 2015-09-14 2018-05-11 日本化药株式会社 6配位铂络合物的高分子偶联物
CN108126212A (zh) * 2018-01-04 2018-06-08 中国药科大学 一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及应用
US20190111077A1 (en) * 2015-12-04 2019-04-18 Eastern Kentucky University LHRH-Platinum Conjugates for Treating Reproductive Cancers
CN110538328A (zh) * 2018-05-28 2019-12-06 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 多肽复合物和载药纳米粒子及其制法和药物组合物及应用
CN111135187A (zh) * 2018-10-16 2020-05-12 国家纳米科学中心 一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108026271A (zh) * 2015-09-14 2018-05-11 日本化药株式会社 6配位铂络合物的高分子偶联物
CN105254932A (zh) * 2015-10-16 2016-01-20 中南大学 基于海藻酸和短肽的互穿网络水凝胶及其制备方法
US20190111077A1 (en) * 2015-12-04 2019-04-18 Eastern Kentucky University LHRH-Platinum Conjugates for Treating Reproductive Cancers
CN108126212A (zh) * 2018-01-04 2018-06-08 中国药科大学 一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及应用
CN110538328A (zh) * 2018-05-28 2019-12-06 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 多肽复合物和载药纳米粒子及其制法和药物组合物及应用
CN111135187A (zh) * 2018-10-16 2020-05-12 国家纳米科学中心 一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUAN LIU ET AL: "Enzyme-triggered supramolecular self-assembly of platinum prodrug with enhanced tumor-selective accumulation and reduced systemic toxicity", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
INDRAJIT MAITY ET AL: "Sonication induced peptide-appended bolaamphiphile hydrogels for in situ generation and catalytic activity of Pt nanoparticles", 《THE ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》 *
JIE GAO ET AL: "Enzyme-Instructed Self-Assembly (EISA) and Hydrogelation of Peptides", 《ADVANCED MATERIAL》 *
樊代明主编: "《肿瘤研究前沿》", 31 December 2006, 第四军医大学出版社 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112704685A (zh) * 2021-01-21 2021-04-27 南通大学 一种顺铂配位体及其在制备肿瘤纳米诊疗剂中的应用
CN112704685B (zh) * 2021-01-21 2021-09-14 南通大学 一种顺铂配位体及其在制备肿瘤纳米诊疗剂中的应用
CN113117077A (zh) * 2021-03-04 2021-07-16 西南民族大学 一种用于肿瘤联合治疗的铂基单原子纳米酶及其制备方法
CN113117077B (zh) * 2021-03-04 2022-08-09 西南民族大学 一种用于肿瘤联合治疗的铂基单原子纳米酶及其制备方法
CN113061159A (zh) * 2021-04-12 2021-07-02 香港城市大学深圳研究院 一种多肽自组装因子及其制备方法和应用
CN113082222A (zh) * 2021-04-20 2021-07-09 中国医学科学院放射医学研究所 一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与应用
CN113082222B (zh) * 2021-04-20 2022-09-20 中国医学科学院放射医学研究所 一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与应用
CN114209848A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 中国科学技术大学 一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用
CN114209848B (zh) * 2021-12-27 2024-02-23 中国科学技术大学 一种具有运输siRNA功能的铂肽共聚物的制备方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111494411A (zh) 一种原位自组装四价铂药物及其制备方法与应用
CN107802840B (zh) 一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法
CN110368374A (zh) 一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN107417752B (zh) 一类具有抗癌活性的化合物及其制备方法和应用
CN101831000A (zh) 乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化及其纳米粒子的制备方法
CN113292608B (zh) 一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用
CN108126212B (zh) 一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及应用
Xu et al. Facile construction of noncovalent graft copolymers with triple stimuli-responsiveness for triggered drug delivery
CN108524529B (zh) 基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用
CN104784700B (zh) 一种药物共载复合物、胶束及胶束的制备方法
CN111249234B (zh) 一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法与应用
CN110840844A (zh) 生物素与葡萄糖共同修饰的乳腺癌靶向脂质体的制备和应用
DE60320591T2 (de) Tumorselektives und biologisch abbaubares polyphosphazen-platin(ii)-konjugat-antitumormittel und verfahren zu dessen herstellung
WO2020057086A1 (zh) 一种Fe 3+/2+-NO供体混价配位聚合物及其应用
CN103319710A (zh) 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法
JPWO2012153576A1 (ja) 内表面疎水化有機ナノチューブ、および同ナノチューブを用いた薬剤カプセル化物
CN112891533B (zh) 一种近红外光可调控的一氧化氮供体型纳米囊泡、制备方法及用途
KR20180138357A (ko) 키토산-플루로닉 복합체 및 이를 포함하는 나노운반체
CN108721636B (zh) 联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料及其制备方法和应用
CN108358995B (zh) CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
CN112279887A (zh) 氨基酸衍生物及其制备方法和应用、一种抗肿瘤胶束及其制备方法
CN105395491B (zh) 一种含阿霉素七肽多孔微球的制备方法
CN115844822B (zh) 一种口服载药胶束组合物及其制备方法
CN110025577A (zh) 一种多肽药物口服靶向系统M27-39@FA-MCNs复合体及其制备方法和应用
CN109568592B (zh) 一种纳米凝胶ng1及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination